BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA BÀI GIẢNG MÔN HỌC CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PROTEIN, AXIT AMIN VÀ AXIT HỮU CƠ BIÊN SOẠN: TRƯƠNG THỊ MINH HẠNH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM – SINH HỌC ĐÀ NẴNG, NĂM 2006 MỤC LỤC PHẦN I: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PROTEIN TỪ VI SINH VẬT Mở đầu - Giới thiệu chung đường hướng sản xuất protein - Nhu cầu protein khả sản xuất protein giới Chương 1: Khái niệm chung vi sinh vật 1.1 Các vi sinh vật tổng hợp protein a xit amin - Tảo - Nấm men vi khuẩn - Nấm mốc xạ khuẩn 1.2 Quá trình dinh dươĩng tế bào vi sinh vật 1.3 Cơ chế sinh tổng hợp protein 1.4.Các yếu tố t6ổng hợp protein Chương 2: Sơ đồ dây chuyền công nghệ thu nhận sản phẩm protein 2.1 Nguyên liệu phương pháp xử lý 2.2 Nuôi cấy vi sinh vật 2.3 Tách protein, cô đặc sấy Chương 3: Sản xuất protein từ nguồn hydrat cacbon 3.1 Nuôi cấy vi sinh vật dịch thủy phân nguyên liệu thực vật 3.2 Nuôi cấy vi sinh vật dịch thủy phân than bùn 3.3 Nuôi cấy vi sinh vật dịch thủy phân gỗ 3.4 Nuôi cấy vi sinh vật nguyên liệu polysacarit chưa thủy phân 3.5 Nuôi cấy vi sinh vật bã rượu từ nguyên liệu hạt rỉ đường - Đặc tính nguyên liệu - Xử lý nguyên liệu - Sơ đồ dây chuyền công nghệ Chương 4: Công nghệ sản xuất protein từ nguồn cacbua dầu mỏ, khí đốt 4.1 Nuôi cấy vi sinh vật nguyên liệu cacbua hydro lỏng 4.2 Nuôi cấy vi sinh vật khí cacbua hidro Chương 5: Sản xuất thức ăn protein từ vi sinh vật 5.1 Protein từ nấm men 5.2 Protein từ tảo vi khuẩn 5.3 Protein từ nấm sợi PHẦN II: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CÁC AXIT AMIN Chương 1: Khái quát chung axit amin 1.1 Đặc tính axit amin, vai trò ứng dụng 1.2 Cơ chế điều chỉnh sinh tổng hợp axit amin 1.3 Các phương pháp sản xuất axit amin Chương 2: Sản xuất lizin 2.1 Tổng hợp lizin từ tế bào vi sinh vật 2.2.Nguyên liệu phương pháp xử lý 2.3 Quá trình sinh tổng hợp lizin 2.4 Tách sấy lizin 2.5 Sơ đồ công nghệ sản xuất lizin Chương 3: Sản xuất axit glutamic 3.1 Một số phương pháp sản xuất axit glutamic 3.2 Tổng hợp axit glutamic từ vi sinh vật 3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp axit glutamic từ rỉ đường Chương : Sản xuất valin triptophan 4.1 Nguồn nguyên liệu 4.2 Nguồn vi sinh vật tổng hợp 4.3 Sơ đồ dây chuyền công nghệ PHẦN III: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CÁC AXIT HỮU CƠ Mở đầu Chương 1: Axit xitric 1.1 Một số khái niệm chung 1.2 Cơ sở lý thuyết trình lên men axit xitric 1.3 Giống vi sinh vật phương pháp nuôi cấy 1.4 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy 1.5 Lên men 1.5.1 Phương pháp lên men bề mặt 1.5.2 Phương pháp lên men bề sâu 1.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình 1.7 Xử lý dịch lên men phương pháp hóa học thu nhận sản phẩm L: Trung hòa Phân giải xitrat caxi - Lọc - Kết tinh - Sấy Chương 2: Axit lactic 2.1.Khái niệm chung 2.2.Vi sinh vật nguyên liệu 2.3 Cơ sở lý thuyết trình lên men lactic 2.4 Sơ đồ công nghệ sản xuất axit lactic 2.4.1 Lên men lactic 2.4.2.Xử lý dịch lên men - lọc 2.4.3 Phân giải lactac canxi 2.4.4 Cô đặc Chương 3: Axit axetic 3.1 Mở đầu - Khái niêm chung 3.2 Nguyên liệu vi sinh vật 3.3 Cơ sở lý thuyết trình lên men axetic 3.4 Các phương pháp lên men axetic 3.5 Chưng cất axit axetic 3.6 Sơ đồ công nghệ sản xuất axit axetic TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Đức Lượng, Công nghệ vi sinh tập 2, Nhà xuất Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, 2002 Lương Đức Phẩm, Hồ Xưởng, Vi sinh tổng hợp, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, Hà Nội,1978 TS Nguyễn Hữu Phúc, Giáo trình công nghệ vi sinh, Thành phố Hồ Chí Minh, 2001 PGS TS Trần Minh Tâm, Công nghệ vi sinh ứng dụng, Nhà xuất nông nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh, 2000 Robert Noyes , Protein food supplement, Noyes Development corporation, Park Ridge, New Jerbey, USA (1969) Richard I Matelles and Steven, Single - Cell Protein, R Tanneebaum Editors, Cambrige, Massachusettes and London, England (1978) PHẦN CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PROTEIN MỞ ĐẦU Vai trò protein người: - Cơ thể người động vật thường xuyên đòi hỏi cung cấp chất dinh dưỡng có thức ăn để tiến hành trao đổi chất, trước hết nhằm trì sống, tăng cường sinh trưởng phát triển - Thức ăn, nước gồm nhóm chất: protein, chất béo, gluxit, vitamin, muối khoáng, chất gia vị, phần quý protein - Protein nguồn nitơ cho người động vật Trong trình tiêu hoá người động vật, protein phân giải thành khoảng 20 axit amin thành phần, có axit amin không thay (hoặc trẻ em, 10 lợn 11 gia cầm) cần phải có sẵn thức ăn Nếu không nhận axit amin thể bị bệnh chết - Thiếu protein dẫn đến nhiều bệnh tật hiểm nghèo: + Bệnh thiếu protein lần phát Châu Phi, có tên gọi quốc tế Kwashiokor, bệnh phổ biến nhiều vùng giới Trẻ em mắc bệnh chậm lớn, còi cọc, phát triển trí tuệ Bệnh điều trị cách thêm vào phần bệnh nhân lượng thích đáng loại protein có phẩm chất tốt cazein Tuy nhiên nhiều tài liệu cho thấy phát triển trí tuệ bệnh không phục hồi ảnh hưởng đến toàn đời bệnh nhân + Về mặt sinh lý, thiếu protein dẫn đến giảm thể trọng Hàng ngày thể người trưởng thành có tới 100 tỉ tế bào chết cần thay Thiếu protein trước hết protein gan, máu chất nhày niêm mạc, ruột huy động để bù đắp Và dẫn đến suy gan, số lượng kháng thể máu giảm đi, sức đề kháng thể bệnh bị yếu + Về nhu cầu protein người, nhiều nhà nghiên cứu cho biết dao động khoảng 80 – 120g/ngày Định nghĩa sinh khối: Sinh khối toàn tế bào vi sinh vật (biomas) thu nhận trình lên men Nó sử dụng nguồn dinh dưỡng protein cho người động vật, đồng nghĩa với protein đơn bào (single cell protein – SCP) Protein đơn bào đa bào: Cụm từ “ protein đơn bào” dùng để nguồn protein tìm từ thể đơn bào (từ vi sinh vật), phân biệt với protein từ động vật thực vật (protein đa bào protein truyền thống) 3.1 Protein đa bào: nguồn dinh dưỡng quan trọng nuôi sống loài người từ trước tới Đây nguồn cung cấp protein quan trọng Tuy nhiên, tốc độ phát triển dân số nhanh nên nguồn protein không đủ để cung cấp cho nhu cầu ngày tăng người Hiện giói có khoảng 2/3 dân số đứng trước thực trạng thiếu đói protein, 1/3 dân số lại cấp số lượng protein dư thừa so với nhu cầu Nguyên nhân: - Sự phân phối không đồng nguồn protein đa bào quốc gia vùng dân cư quốc gia - Trình độ kỹ thuật phát triển nguồn protein đa bào không đồng - Sự khác điều kiện địa lý: vùng sa mạc tự nhiên vùng có điều kiện khí hậu không thuận lợi cho trồng trọt chăn nuôi - Do người gây tình trạng ô nhiễm môi trường, ô nhiễm nguồn nước, rừng thưa, đồi trọc, sông con, khai thác thiếu khoa học làm nguồn thủy hải sản ngày cạn kiệt v v Các giải pháp tăng nhanh nguồn protein đa bào: - Cải biến hệ thống di truyền trồng vật nuôi: thực phẩm chế biến từ nguồn động vật thực vật biến đổi gen gọi thực phẩm biến đổi gen Chương trình GMO (chương trình thể biển đổi gen) gặp nhiều ý kiến phản đối trích cho thực phẩm biến đổi gen tạo bệnh tật cho người động vật Tuy nhiên nhiều nước Mỹ, Trung Quốc số nước phát triển mạnh loại đậu, cà chua, bắp biến đổi gen - Phát triển kỹ thuật di truyền không ngừng nghiên cứu nâng cao kỹ thuật truyền thống trồng trọt chăn nuôi 3.2 Protein đơn bào: Protein đơn bào thuật ngữ loại chất dinh dưỡng có tế bào sản xuất từ vi sinh vật Thuật ngữ không đơn giản protein từ tế bào thể đơn bào, nhiều vi sinh vật thể đơn bào mà khai thác chúng Do đó, thuật ngữ nên hiểu nguồn dinh dưỡng chứa nhiều protein từ vi sinh vật (từ vi khuẩn, nấm men, nấm sợi tảo) Protein đơn bào hướng nghiên cứu mạnh mẽ để giải vấn đề thiếu hụt protein 3.2.1 Lịch sử phát triển: Thuật ngữ protein đơn bào có từ năm 50 kỷ 20 thực tế loài người biết sử dụng loại protein chất có tế bào vi sinh vật từ lâu: làm bánh mì, sữa chua, phomat, bia hoạt động sống vi sinh vật dù không hiểu vi sinh vật Mãi đến kỷ 17, người ta biết đến vi sinh vật sinh vật thứ ba sau động vật thực vật Trước kỷ 20, việc sử dụng vi sinh vật trình chế biến thực phẩm hoàn toàn mang tính truyền thống điều kiện tự nhiên Việc nghiên cứu sản xuất protein đơn bào xa lạ với loài người, với qui mô công nghiệp Đầu kỷ thứ I, nhà máy sản xuất sinh khối nấm men coi nhà máy sản xuất protein đơn bào Đức với phương pháp nuôi Candida utilis gọi “nấm men Torula” Sau đó, mối quan tâm Đức giảm đến năm 1930, Đức mở phục hồi mở rộng sản xuất, suất nấm men 15.000 Tấn/năm, sở nuôi dịch kiềm sunfit, dịch thải công nghiệp xenluloza, làm thực phẩm phục vụ quân đội dân thường, chủ yếu nấu canh làm xúc xích Sau năm 1950, phong trào sản xuất SCP lan rộng khắp Châu Âu, Mỹ Tuy nhiên tất qui mô vừa nhỏ, chủ yếu cho chăn nuôi chiết tách tinh protein để làm thức ăn nhân tạo bổ sung vào nguồn chế biến TP Vào lúc diễn hội nghị lần thứ I SCP Viện Kỹ thuật Massachusett (MIT) năm 1967, đa số dự án nằm thực nghiệm, số hãng British Petroleum (BP) có báo cáo kết trình lên men SCP qui mô công nghiệp (CÔNG NGHIệP) Nhưng đến hội nghị lần thứ II họp vào năm 1973 nhiều hãng nhiều nước khác bắt đầu sản xuất SCP qui mô CÔNG NGHIệP Cũng năm 1973, CÔNG NGHIệP sản xuất SCP có bước phát triển nhảy vọt việc sử dụng hidrocabon dầu mỏ, khí đốt làm nguồn cabon lượng có hiệu Vậy nguyên nhân dẫn đến việc nhiều nước phải sản xuất SCP? Sản xuất SCP nguồn protein có chất lượng cao thay loại bột dinh dưỡng làm từ hạt chứa dầu đậu tương bột cá dành cho động vật giải vấn đề: + Tăng nguồn đậu tương cá, ngũ cốc cho dinh dưõng người + Các nước Châu Âu, Nga, Nhật số vùng khác không trồng đậu tương, SCP giúp cho nước không phụ thuộc vào việc nhập protein + Trong tế bào vi sinh vật, hàm lượng protein tương đối lớn có chất béo, vitamin chất khoáng, suất vi sainh vật vượt xa suất trồng vật nuôi công nghiệp nhiều lần 3.2.2 Đặc điểm sản xuất Protein đơn bào: - Chi phí lao động nhiều so với sản xuất nông nghiệp - Có thể sản xuất địa điểm trái đất, không chịu ảnh hưởng khí hậu thời tiết, trình công nghiệp , dễ khí hoá tự động hoá - Năng suất cao: vi sinh vật có tốc độ sinh sản mạnh, khả tăng trưởng nhanh Chỉ thời gian ngắn thu nhận khối lượng sinh khối lớn; thời gian tính giờ, động vật thực vật, tính tháng hàng chục năm - Sử dụng nguồn nguyên liệu rẻ tiền hiệu suất chuyển hoá cao Các nguyên liệu thường phế phẩm, phụ phẩm ngành khác rỉ đường, dịch kiềm sufit, parafin dầu mỏ v v , chí nước thải trình sản xuất Hiệu suất chuyển hoá cao: hidrat cacbon chuyển hoá tới 50%, cacbuahidro tới 100% thành chất khô tế bào - Hàm lượng protein tế bào cao: vi khuẩn 60 -70%, nấm men 40-50% chất khô v v… Hàm lượng phụ thuộc vào loài chịu nhiều ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy Cần ý hàm lượng protein bao hàm protein không gồm thành phần nitơ phi protein xác định theo phương pháp nitơ tổng số Kjeldal, axit nucleic, peptit thành phần tế bào - Chất lượng protein cao: Nhiều axit amin có vi sinh vật với hàm lượng cao, giống sản phẩm thịt, sữa hẳn protein thực vật Protein vi sinh vật đặc biệt giàu lizin, lợi lớn bổ sung thức ăn chăn nuôi, thức ăn thường thiếu axit amin Trái lại, hàm lượng axit amin chứa lưu huỳnh lại thấp - Khả tiêu hoá protein: có phần hạn chế thành phần phi protein axit nucleic, peptit thành tế bào, nữa, thành vỏ tế bào vi sinh vật khó cho enzim tiêu hoá qua - An toàn mặt độc tố: Trong sản xuất protien đơn bào không dùng vi sinh vật gây bệnh loài chứa thành phần độc nghi ngờ Vì đến SCP dùng dinh dưỡng động vật - Những vấn đề kỹ thuật: Sinh khối vi sinh vật phải để tách xử lý Vấn đề phụ thuộc chủ yếu vào kích thước tế bào Sinh khối nấm men dễ tách li tâm vi khuẩn Ngoài ra, vi sinh vật có khả sinh trưởng mật độ cao cho suất cao, sinh trưởng tốt nhiệt độ cao (có tính chất ưa nhiệt chịu nhiệt) giảm chi phí làm nguội sản xuất, mẫn cảm với tạp nhiễm v v sử dụng nguồn cacbon rẻ tiền, chuyển hoá nhiều tốt dùng sản xuất Vì nấm men sử dụng chủ yếu sản xuất protein đơn bào Như ưu điểm sản xuất protein đơn bào phân lập lựa chọn chủng vi sinh vật có ích thích hợp cho qui trình công nghệ, cho nguyên liệu cách tương đối nhanh dễ dàng CHƯƠNG KHÁI NIỆM CHUNG VỀ VI SINH VẬT Protein vi sinh vật chủ yếu tổng hợp để hình thành enzim Vì phần lớn nằm tế bào, số tách môi trường Yêu cầu chủng vi sinh vật dùng sản xuất: - Thời gian nhân đôi ngắn - Có khả tạo thành 40-70% protein - Tiêu hoá tối đa chất dinh dưỡng môi trường - Không gây bệnh đem vào môi trường độc tố - Có sức bền cao chịu điều kiện nuôi cấy không vô trùng - Dễ tách khỏi dịch nuôi cấy điều kiện tuyển (flotation) li tâm tách Các nhóm vi sinh vật tổng hợp protein: 1.1 Tảo đơn bào đa bào 1.1.1 Vai trò tảo đời sống Tảo theo tiếng Latin Algue có nghĩa cỏ biển, thực nước đất, thân cây, bèo hoa dâu v v có tảo Trong tự nhiên có nhiều loại tảo có hàm lượng protein cao không sử dụng cho người gia súc có độc tố Một số tảo ăn dân gian nhiều địa phương như: Trung Đông á, Nam Mỹ hay dùng tảo lam, Bolovi số nước Nam Mỹ dùng loài Nostae commune (Sphaeronostos commune), Trung Quốc dùng loài Nematonostos Flagelliforme, Châu Phi vớt loại tảo lam đa bào Spirulina maxima ao hồ giàu muối canxi làm thức ăn bồi bổ dùng làm số thuốc chữa bệnh phù chân, đau đường tiêu hoá Từ đó, tảo Spirulina nhiều nước giới đưa vào sản xuất công nghiệp Khoảng năm 1970, nhà khoa học người Pháp phát tảo có khả phát triển nhanh có hàm lượng protein cao nên họ nghiên cứu xây dựng qui định công nghệ sản xuất tảo Đến có loại tảo đơn bào sản xuất qui mô lớn có kinh tế cao là: + Chlorella + Spirulina + Scenedesmus hai loài Chlorella Spirulina sản xuất nhiều 1.1.2 Ưu điểm tảo đơn bào: - Giá trị dinh dưỡng tảo cao phạm vi ứng dụng rộng rãi: + Tảo đơn bào có hàm lượng protein cao (chiếm khoảng 40-55% chất khô), riêng tảo Spirrlina có chứa tới 70% + Protein tảo thuộc loại protein hoàn hảo có chất lượng cao Hàm lượng axit amin protein tảo gần với qui định protein tiêu chuẩn, đặc biệt lizin protein tảo cao hẳn lizin lúa mạch Tổng số axit amin không thay protein cao, có lên đến 42% (bảng bảng 2) + Tảo chứa nhiều protein vitamin (VTM) (nhất VTM B12 C) nên sản xuất làm thức ăn cho người, gia súc, gia cầm tôm cá + Giá trị dinh dưỡng tảo thể chất lượng số lượng VTM có Tảo Chlorella có nhiều VTM A, nhóm VTM B, tế bào tươi có nhiều VTM C Ngoài có nhiều VTM B, K, axit aconitic, axit pantotenic, biotin, lencophorin loại tảo - Cho đến chưa tìm thấy độc tố nguy hiểm tồn sinh khối tảo - Đặc điểm tế bào loài tảo có chất diệp lục (chlorophyll) Chất có vai trò quan trọng việc cố định lượng ánh sáng mặt trời tảo Vì tảo loài sinh vật tự dưỡng, chúng hoàn toàn có khả quang hợp mà giới hiển vi sinh vật khác - Tảo có kích thước tế bào lớn, hoàn toàn đáp ứng tới yêu cầu kỹ thuật, đặc biệt thuận lợi giai đoạn thu nhận - Không bị virus công, sống điều kiện đơn giản - Tảo có khả làm nguồn nước bẩn, giữ vệ sinh môi trường Tảo lam tham gia trình cố định nitơ không khí nhờ tính chất đặc biệt mình, tảo lam lôi ý nhà khoa học lĩnh vực di truyền, tế bào, hoá sinh, lý sinh 1.1.3 So sánh loại tảo Chlorella Spirulina - Tảo Spirulina chứa VTM B12, caroten nhiều hẳn tảo Chlorella, chứa nhiều xantophin chất cần thiết cho gia cầm (để gà CÔNG NGHIệP cho trứng gà có lòng đỏ tươi, thịt gà vàng ngon), Spirulina chứa nhiều loại chất kháng sinh chống vi khuẩn loại nấm, nên bảo quản lâu mà không bị mốc - Hàm lượng protein tảo Spirulina cao nhiều so với tảo Chlorella Protein tế bào Spirulina 60-70%, Chlorella 40-50% - Kích thước tảo Spirulina lớn kích thước tảo Chlorella Mặt khác, tảo Spirulina trình phát triển có xu hướng lên bề mặt tảo Chlorella có kích thước nhỏ lại có xu hướng lắng chìm không khuấy trộn Thu hoạch tảo Spirulina phưong pháp đơn giản, với tảo Chlorella phức tạp giống thu hoạch sinh khối nấm men sinh khối vi khuẩn - Thành tế bào tảo Spirulina mỏng, thành tế bào Chlorella dày Do hệ số tiêu hoá ta dùng tảo Spirulina cao tảo Chlorella Tảo Spirulina phát triển môi trường kiềm Chlorella phát triển môi trường axit yếu - Khi dùng CO2 nguồn cacbon, mà nguồn cacbon điều kiện kiềm đất dễ chuyển hoá sang dạng dễ hấp thụ theo phản ứng sau: CO32- + H2O HCO3 + OH CO32- + CO2 + H2O 2HCO3 Spirulina hấp thụ CO2 theo chiều hướng tốt tảo Chlorella Vì vậy, sản xuất công nghiệp, tảo Spirulina chiếm vị trí ưu 1.2 Nấm men vi khuẩn: 1.2.1 Nấm men: - Trong nguồn protein sản xuất đường vi sinh vật, nấm men nghiên cứu sớm áp dụng rộng rãi giới Con người sử dụng nấm men sản phẩm hoạt động sống chúng từ hàng nghìn năm - Nấm men tên chung để nhóm nấm có cấu tạo đơn bào, sinh sản cách nẩy chồi Nấm men diệp lục sử dụng lượng mặt trời Vì chúng dinh dưỡng hydratcbon, hydrocacbua, trước hết đường - Trong tế bào nấm men có chứa hầu hết chất cần thiết cho sống (protein, gluxit, lipit, enzim, VTM, axit nucleic, chất khoáng) - Không sản phẩm thực vật động vật có thành phần lượng chất có tác dụng đặc hiệu nấm men Tuy nhiên thành phần chất đặc hiệu nấm men không phù hợp hoàn toàn với nhu cầu sinh lý động vật - Nấm men ý nhiều, tế bào chúng có nhiều chất dinh dưỡng có giá trị, mà chúng lại có khả tăng sinh khối đặc điểm sinh lý phù hợp với điều kiện sản xuất công nghiệp - Về đặc điểm lịch sử: Men gia súc sản xuất Đức vào khoảng năm 1880 Lúc người ta dùng men bia (Saccharomyces cerevisiae) Trong chiến thứ I, men gia súc men thực phẩm sản xuất chủ yếu Đức giống Torula utilis Ở Mỹ, từ năm 1946 tổ chức sản xuất sinh khối nấm men Lúc đầu, người ta nuôi cấy nấm men sacaroza để thu hồi sinh khối làm thức ăn cho người Sau lý kinh tế, người ta thay sacaroza dịch thủy phân từ tinh bột xenluza, phế liệu công nghiệp đường, bia, rượu … Năm 1968, Liên Xô nước xây dụng nhà máy sản xuất nấm men từ paraphin dầu mỏ, sau Anh, Pháp , Nhật v…v tiến hành nhanh lĩnh vực sử dụng nguồn nguyên liệu dồi rẻ tiền vào mục đích thu protein nấm men đưa sản lượng nấm men giới ngày tăng - Về giá trị dinh dưỡng: + Nấm men giàu protein VTM, đặc biệt VTM nhóm B + Sinh khối nấm men chứa khoảng 75-80% nước, 20-25% chất khô đó: cacbon 45-50%, nitơ 7-10% (tương ứng với 40-60% protein, hydro 5-7%, oxy 2530%, nguyên tố vô 5-10% (photpho kali chiếm tới 95-97%) tổng lượng tro, số lại canxi, magiê, nhôm, lưu huỳnh, clo, sắt, silic Ngoài có lượng nhỏ nguyên tố mangan, kẽm, molipden, bo, cacbon ) + Trong thành phần quí protein Hàm lượng protein tuỳ thuộc vào loại giống, vào thành phần môi trường điều kiện nuôi cấy Dao động khoảng 40-60% 10 + Về tính chất protein nấm men gần giống protein nguồn gốc động vật Protein nấm men chứa khoảng 20 axit amin không thay (bảng 5) Thành phần axit amin nấm men cân đối so với lúa mì hạt ngũ cốc khác, chút so với sữa, bột cá, bột xương thịt sản phẩm động vật nói chung Sự thay đổi thành phần axit amin thời gian nuôi cấy nghiên cứu cho thấy thành phần axit amin thay đổi giai đoạn phát triển: giai đoạn tiềm phát Sau phát triển, tổng hàm lượng axit amin protein tăng lên 17% so với thời điểm ban đầu Sau tổng hợp axit amin giảm xuống giữ mức độ 40% Đến cuối, tế bào già, chất dự trữ, trước hết glucogen tiêu hao nhiều nên giảm trọng lượng, tỉ lệ axit amin so với trọng lượng chung tế bào tăng lên gần 50% (tăng không thực chất) - Các giống nấm men dùng làm thực phẩm cho người thức ăn gia súc là: Endomyces vernalis, Hansenula anomala, Hansenula suaveolens, Saccharomyces cerevisiae, Candida arbores, Candida tropicalis, Mycotorula lipolytica, Mycotorula japonica, Torulopis utilis, Torulopis utilis var, major, Torulopsis utilis var thermophilis, Monilia candia, Oidium lactic - Các tiêu chuẩn để lựa chọn giống nấm men để sản xuất protein từ nguồn hydrocacon: + Có khả đồng hoá nhiều nguồn cacbon khác nhau, loại pentoza (xiloza, arabinoza) axit hữu + Có thể phát triển tốt môi trường có nồng độ chất khử cao + Có khả phát triển nhanh, có sức đề kháng cao nồng độ CO2 + Sản lượng cao, sinh khối chứa nhiều chất dinh dưỡng có giá trị (hàm lượng protein cao, có nhiều axit amin không thay thế, vitamin ) + Kích thước tế bào tương đối lớn để dễ tách li tâm + Chịu đựng nhiệt độ tương đối cao, làm biến đổi pH môi trường - Trong sản xuất nấm men thường dùng chủng thuộc ba giống Saccharmyces, Candida Torulopsis Khả chuyển hoá ba giống cao đa dạng, qui trình công nghệ tương đối đơn giản 1.2.2 Vi khuẩn: - Vi khuẩn để sản xuất protein thường nuôi cacbua hidro Thường sử dụng giống Pseudomonas, Flavobacterium, Mycobacterium Nocardia - Các giống vi khuẩn có khả đồng hoá ankal (C6-C18) , cacbua hydro béo thơm khác - Đối với nguyên liệu sử dụng metan, sử dụng giống Methylomonas, Methyllococens capsulatus - Ngoài nhiều nơi sử dụng vi khuẩn khí nổ có đại diện giống Hydrogenomonas (H facilia, H entropha) - Đặc điểm vi khuẩn: + Tốc độ sinh trưởng nhanh 11 + Dùng nhiều chất + pH cần giữ 5-7, nguy nhiễm vi khuẩn gây bệnh + Thu hồi li tâm: khó + Thành phần axit amin cân đối hàm lượng axit amin chứa S thấp + Khi dùng vi khuẩn Gram âm để sản xuất SCP cần lưu ý khả sản sinh độc tố chúng 1.3 Nấm mốc xạ khuẩn: - Nói chung người ta dùng nấm mốc xạ khuẩn để sản xuất protein Về mặt dinh dưỡng, protein vi sinh vật giá trị so vói protein vi khuẩn, nấm men Về kĩ thuật nuôi cấy, hệ sợi phát triển thành búi chằng chịt nên trở ngại đến việc sục khí khuấy trộn - Nấm mốc thể đa bào, giàu vitamin nhóm B, chứa chừng 30-60% protein Hàm lượng metionin tryptophan thấp, có axit amin khác tương tự protein tiêu chuẩn FAO Các giống nấm mốc có hàm lượng protein cao Fusarium, Rhizopus, Penicillium, Aspergillus Trong nghiên cứu thu nhận protein từ nấm mốc, người ta ý nhiều đến công trình B.Volesky H.Zajic Hai người phân lập từ nước từ chủng mốc thuộc Graphium, chủng có chứa tới 52% protein, có 16 axit amin, metionin chiếm 1% so với protein thô, lizin chiếm đến 7,7%, axit amin không thay khác có hàm lượng tương đương với protein tiêu chuẩn, trừ izolơxin Chủng mốc có khả đồng hoá etan, metan nuôi môi trường chứa hỗn hợp hai nguyên liệu để thu sinh khối - Giá trị dinh dưỡng protein số nấm mốc xem bảng 14 - Như nói, nấm mốc dùng sản xuất protein Hiện có số sở sản xuất United Parer rills Phần Lan, công suất 10.000tấn/năm, nguyên liệu nước sunfit, RHM Foods ( 10.000tấn/năm ) Tate anotty1 (4.000tấn/năm) Anh - Cho đến xạ khuẩn chưa dùng sản xuất protein Tuy vậy, người ta thường thu hệ sợi chúng nấm mốc, trình sản xuất chất kháng sinh, enzim, axit xitric … dạng sản phẩm phụ nhà máy, nhằm sử dụng protein, vitamin, enzim có vào mục đích khác Nhược điểm sinh khối xạ khuẩn nấm mốc thu theo phương pháp chóng bị hư hỏng, phải ý khâu sấy ngày sau tách sinh khối khỏi dây chuyền công nghệ Trong công nghiệp kháng sinh, người ta thu sinh khối hệ sợi gần 17% chất chứa nitơ, số chất chứa nitơ đồng hoá khoảng 14%, gần 10% protein tiêu hoá, 2% chất béo, 2,5% chất xơ … sinh khối sử dụng chăn nuôi Quá trình dinh dưỡng tế bào vi sinh vật Trong trình sống, tế bào vi sinh vật tiến hành trao đổi chất không ngừng với môi trường chung quanh Các chất dinh dưỡng qua màng tế bào chuyển hoá để tạo thành chất riêng biệt cần thiết để xây dựng tế bào Các chất dinh dưỡng qua màng tế bào tham gia vào hai loại phản ứng sinh hoá: 12 - Biến đổi dị hoá: làm xuất sản phẩm có cấu trúc đơn giản hơn, Một số thải đi, số khác làm vật liệu làm tiền chất cho phản ứng đồng hoá Những biến đổi cung cấp cho vi sinh vật lượng chuyển hoá dạng ATP hợp chất giàu lượng khác - Biến đổi đồng hoá: đảm bảo tổng hợp thành phần có cấu trúc phức tạp phân tử lượng cao Quá trình gọi đồng hoá phản ứng sinh tổng hợp Khi môi trường có hợp chất - vật liệu vi sinh vật trực tiếp sử dụng Nhưng môi trường có sẵn hợp chất vật liệu cần cho trình sinh tổng hợp Muốn có tế bào vi sinh vật bắt buộc phải tự sản xuất cách tự biển đổi dị hoá thành phần có môi trường nuôi cấy Các chất dinh dưỡng vi sinh vật chủ yếu lấy môi trường chung quanh môi trường dinh dưỡng nhân tạo cần cung cấp đầy đủ lượng, vật liệu xây dựng tế bào đảm bảo hiệu suất sinh tổng hợp cao Thành phần môi trường gồm nguồn thức ăn cacbon, nitơ, chất khoáng, nguyên tố vi lượng chất kích thích sinh trưởng Việc lựa chọn nguồn dinh dưỡng nồng độ chúng môi trường phụ thuộc vào đặc tính sinh lý chủng, loài vi sinh vật điều kiện nuôi cấy chúng 2.1 Dinh dưỡng cacbon: Nguồn số nguồn cacbon: Cacbon có tế bào chất, thành tế bào, tất phân tử enzim, axit nucleic sản phẩm trao đổi chất Số nguồn cacbon sinh vật vô lớn Hầu hợp chất cacbon (trừ kim cương, than chì) mà nhóm vi sinh vật định sử dụng Giá trị dinh dưỡng khả hấp thụ nguồn cacbon phụ thuộc vào: - Thành phần cấu tạo hoá học, đặc biệt mức độ oxi hoá nguyên tử cacbon - Đặc điểm sinh lý vi sinh vật: + với hợp chất có phân tử thấp số đường vi sinh vật đồng hoá trực tiếp + Với hợp chất hữu cao phân tử (tinh bột, protein …) phân huỷ nhờ enzim tạo thành hợp chất phân tử thấp mà vi sinh vật đồng hoá + Với hợp chất không tan nước (lipit, xenluloza, parafin ) vi sinh vật hấp thụ quanh bề mặt chúng phân giải chúng Nguồn thức ăn cacbon chủ yếu vi sinh vật: hydrat cacbon trước hết phải kể đến glucoza Trao đổi hydrat cacbon đáp ứng nhu cầu tế bào: + Sản sinh lượng + Tạo thành tiền chất + Tạo trình oxi hoá-khử để biến đổi tiền chất thành sản phẩm trung gian hay sản phẩm cuối để xây dựng tế bào, đồng thời tích tụ môi trường vài sản phẩm sinh tổng hợp 13 Trong công nghiệp lên men nói chung, trừ trường hợp thu sinh khối vi sinh vật đơn thuần, người ta cố gắng tạo điều kiện cho vi sinh vật sử dụng nguồn dinh dưỡng cacbon để tổng hợp sản phẩm cần thiết nhiều để tăng sinh khối tạo thành CO2 Như vậy, chất dinh dưỡng làm nguồn cacbon trình trao đổi chất sản xuất lên men loại đường sacaroza, maltoza, lactoza, glucoza, đường hexoza khác loại bột ngũ cốc bột gạo, bột ngô, bột đại mạch … chứa chủ yếu tinh bột Để đồng hoá tinh bột, vi sinh vật phải tiết vào môi trường enzim amilaza α-amilaza, β-amilaza, α-glucosidaza Hệ enzim sinh tế bào tiết môi trường để phân huỷ chất cảm ứng tinh bột Quá trình đồng hoá tinh bột vi sinh vật giới thiệu sơ đồ sau (theo V.Lilli G.Banettu, 1953): Các trình ngoại bào Maltoza Tinh bột α , β- amilaza Glucoza Tế bào vi sinh vật α - glucosidaza Các trình nội bào Glucoza Các enzim Các enzim CO2, rượu axit hữu sản phẩm trao đổi hiếu khí khác CO2, rượu sản phẩm trao đổi hiếu kỵ khác 2.2 Dinh dưỡng nitơ: Vi sinh vật tất thể sống khác cần nitơ trình sống để xây dựng tế bào Tất loại protein cấu tạo từ axit amin Các axit amin dạng tự nguyên liệu để tổng hợp phân tử protein Các axit amin tạo thành trình trao đổi cacbon nitơ Việc tổng hợp axit amin trải qua hàng loạt phản ứng phức tạp với xúc tác nhiều loại enzim khác nhau, qui hai phản ứng có tế bào vi sinh vật phản ứng amin hoá phản ứng chuyền amin Nguồn nitơ + Nitơ không khí phong phú, song bền vững mặt hoá học, khó bị oxi hoá khử Chỉ có số vi sinh vật cố định nitơ có khả đồng hoá nitơ không khí + Trong tất môi trường nuôi cấy cần thiết phải có loại hợp chất nitơ mà vi sinh vật đồng hoá để đảm bảo hiệu suất lên men cao Các nguồn nitơ dùng công nghiệp lên men hợp chất nitơ hữu vô 14 * Các axit amin có mặt môi trường thường không vi sinh vật sử dụng trực tiếp mà phải tiến hành loại phản ứng trao đổi chất: phản ứng khử amin phản ứng khử cacboxy1 * Các axit amin dạng hợp chất thường protein đậu tương, khô lạc pepton Muốn đồng hoá hợp chất này, Vi sinh vật phải tiết vào môi trường hệ enzim proteaza để thủy phân axit amin thành axit amin Rất nhiều loài nấm mốc, vi khuẩn, xạ khuẩn có hoạt tính proteaza cao: Asperillus, Penicillium, Fusarium, Rhizopus, Actinomyces, Clostridium, Bacillus v v Những axit amin, purin pirimidin thức ăn thích hợp hay Vi sinh vật sử dụng Sự dị hoá purin pirimidin hai hợp chất tạo thành trình thuỷ phân axit nucleic, nucleotit nucleozit thành cacbonic, amoniac, axit focmioc, axetic lactic chúng tham gia vào chuỗi chuyển hoá khác * Urê dùng tronuwg công tổng hợp có hai tác dụng: Làm nguồn N chất điều chỉnh pH Dưới tác dụng ereaza, uree phân huỷ thành CO2 NH3 (NH2)2CO + H2O ereaza 2NH3 + CO2 * Nitrat: Vi sinh vật thường không trực tiếp đồng hoá nitrat mà phải qua trình biến đổi: 4AH2 + HNO3 NH3 + 3H2O AH2 - chất khử có môi trường HNO3 HNO2 (HNO)2 NH2OH Axit nitric Axit nitơ Hyponitrit Hydrolamin NH3 Quá trình thực nhờ hệ enzim nitratreductaza Muối amon: Tất loại vi sinh vật đồng hoá muối amon Việc sử dụng nguồn N hữu cơ, ure muối amon gắn liền với việc tách NH3 hấp thụ vào tế bào Như vậy, NH3 trung tâm đường dinh dưỡng nitơ Vi sinh vật Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh tổng hợp vi sinh vật phụ thuộc vào nguồn N mà phụ thuộc vào tỉ số C:N môi trường Tỷ số có nhiều ý nghĩa Nó tạo cho vi sinh vật có khả trao đổi chất thích hợp, khả tích tụ cao sản phẩm sinh tổng hợp tạo thành hệ enzim để tiến hành phản ứng hoá sinh theo chiều hướng có lợi 2.3 Dinh dưỡng khoáng 2.3.1 Các hợp chất photpho Sự có mặt hợp chất photpho nồng độ chúng môi trường có ảnh hưởng lớn đến trình trao đổi chất tế bào vi sinh vật Ngoài ra, photpho môi trường có tác dụng điều chỉnh hoạt tính hệ enzim đồng hoá loại thức ăn cacbon Nguồn photpho có mặt môi trường nuôi cấy vi sinh vật thường loại hợp chất photpho hữu có bột đậu, cao ngô, bã rượu, khô dầu … hợp chất photpho vô cơ, muối photpho mono dibazic K Na, amon super photpho 15 Yêu cầu photpho vi sinh vật phụ thuộc vào chủng loài, vào tỉ lệ thành phần môi trường trước hết tỉ lệ C:N điều kiện nuôi cấy Nồng độ nguồn photpho cao làm cho vi sinh vật phát triển giảm hiệu suất sinh tổng hợp Nếu môi trường có cacbonat canxi, trùng, chất photpho vô kết hợp với ion Ca2+ tạo thành kết tủa Vi sinh vật thường sử dụng nhanh photpho vô hoà tan, hợp chất photpho vô không tan môi trường thường sử dụng chậm 2.3.2 Các chất khoáng khác Trong tế bào vi sinh vật có hàng loạt chất khoáng khác như: magiê, natri, sắt, nhôm, kali, liti, rubidi, mangan, chì v v Vi sinh vật lấy chất khoáng từ môi trường dinh dưỡng, có trường hợp phải bổ sung vào môi trường số muối khoáng có chúng có sẵn nguyên liệu pha môi trường (đường, bột, cao ngô, rỉ đường, cacbonnat canxi…) nước Những hợp chất khoáng môi trường có nhiều ý nghĩa sinh lý khác nhau: - Làm thay đổi trạng thái hoá keo tế bào chất - Làm thay đổi tốc độ phản ứng enzim tế bào chất Ví dụ muối ăn (NaCL) môi trường lên men chất kháng sinh, tác dụng cung cấp nguồn ion Cl-, có tác dụng làm thay đổi sức thẩm thấu tế bào, tạo điều kiện tiết chất kháng sinh từ sợi mốc, xạ khuẩn vào môi trường dễ dàng Một số kim loại (kẽm, sắt, mangan, magiê ) chất hoạt hoá enzim Một số kim loại Zn, Cu, Mn, Mo, B, K, Mg, Ca… có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính sinh tổng hợp vi sinh vật Năm chất đầu cần với lượng nên gọi nguyên tố vi lượng thường có sẵn nguyên liệu pha môi trưòng Có cần phải pha thêm vào môi trường dạng muối Cơ chế sinh tổng hợp protein 3.1 Vai trò điều khiển tổng hợp protein ADN Protein có phân tử lớn, hoá học người ta gọi đại phân tử Đại phân tử protein cấu tạo từ phân tử đơn giản axit amin đính kết Số lượng axit amin phân tử protein có đến hàng trăm hàng nghìn đơn vị, tất thuộc số 20 axit amin khác Một loại protein đầy đủ 20 loại axit amin (thường khoảng 10), thành phần protein vi sinh vật khác khác Giá trị dinh dưỡng loại protein hoàn toàn phụ thuộc vào thành phần số lượng axit amin việc hình thành chủng loại protein khác Do từ 20 axit amin, thể sống hình thành vô số loại protein khác Trong tế bào sống thường xuyên có loại axit nucleic: Ribonucleic (ARN) dexoxyribonucleic (ADN) Chúng khác thành phần, cấu tạo hóa học vị trí chúng tế bào ADN có chủ yếu nhân ARN thường thấy tế bào chất nhiều nhân 16 Theo thuyết sinh tổng hợp protein, axit nucleic định cấu trúc hoá học xác định vị trí axit amin chuỗi protein tổng hợp vai trò ADN quan trọng Nó định thành phần cấu tạo kiểu ARN đặc biệt gọi ARN thông tin (ARNt), định thành phần cấu tạo phân tử protein Những ARN vào riboxôm thực chức làm khuôn mẫu Các axit amin xếp đặt vào phân tử protein theo trật tự phù hợp với cấu trúc ARNt Quá trình điều khiển sinh tổng hợp protein axit nucleic trình bày sơ đồ hình 1.1 sau: Hình 1.1 Sơ đồ tổng hợp protein vai trò định hướng axit dexoxyribonucleic (ADN) Theo sơ đồ tổng hợp protein xảy riboxôm Ở có dòng hoà lại với nhau: dòng ARNt từ nhân tới dòng axit amin hoạt hoá nhờ ARN vận tải (ARNv), chuyển đến 3.2 Cơ chế sinh tổng hợp protein Sự tổng hợp protein trình bày theo sơ đồ sau: Theo sơ đồ này, từ nhân tế bào, ARNt chui qua màng nhân mà vào tế bào chất đính vào riboxôm Các axit amin tồn tự tế bào chất gắn vào loại ARN đặc biệt gọi ARN vận tải (ARNv), ARNv chuyển axit amin vào riboxôm Tại đây, ARNt đóng vai trò khuôn mẫu Trên khuôn mẫu này, axit amin đính vào cách có lựa chọn riboxôm trình tổng hợp protein hoàn thành Như vậy, chế sinh tổng hợp protein tóm tắt sau: - Nơi tổng hợp protein tế bào vi sinh vật (và tế bào động thực vật) riboxôm 17 - Sự tổng hợp protein cần có tham gia enzim hoạt hoá ARN vận tải - Ở riboxôm xảy trình tổng hợp protein ADN điều khiển, phải tồn mắc xích trung gian nhân tế bào chất Đó ARNt - Trong tế bào vi khuẩn, ARN thông tin nhanh chóng bị phá huỷ, hoàn thành chức thời gian ngắn, nghĩa xác định protein tổng hợp nên, sau phân tử ARNt khác lại vào ribôxôm Hình 1.2 Sơ đò tổng hợp protein tế bào ( theo Lobasov) Các yếu tố tổng hợp protein 4.1 Riboxôm Trong tế bào chất vi sinh vật, có loại hạt bé nhỏ thành phần cấu tạo nên tế bào chất, loại hạt gọi ribôxôm, quan trung tâm tổng hợp nên loại protein Ribôxôm vi khuẩn chứa khoảng 40-60% ARN 60-40% protein Ngoài ra, ribôxôm chứa lipit, số enzim ribonucleaza, lexinaminopeptidaza, B-galactozidaza… chất khoáng (điểm đặc biệt ribôxôm giàu magiê canxi thành phần khác tế bào) Ribôxôm trung tâm tổng hợp protein tế bào, ribôxôm có khả tham gia vào trình Số ribôxôm tham gia tổng hợp protein thường không 5-10% tổng số protein có tế bào Những ribôxôm hoạt 18 động dạng tập hợp gồm số ribôxôm gọi poliribôxôm polixôm Cấu trúc không vững ribôxôm liên kết với nahu sợi ARNt 4.2 ARN thông tin Đầu tiên nhân tế bào xảy tượng “sao chép” đoạn phân tử ADN nhờ chép mà loại ARN đặc biệt hình thành Sự chép thực theo nguyên tắc bổ sung nhau, có vài ngoại lệ: Chuỗi kép gồm sợi ADN tách rời nhau, sợi dùng làm khuôn để tổng hợp nên sợi ARN Theo nguyên tắc bổ sung nhau, tương ứng với xitozin (viết tắt X) ADN guanin (G) ARN Tương ứng với timin (T) ADN adenin (A) ARN, tương ứng với adenin ADN timin mà uraxin (U) ARN Điểm ngoại lệ không quan trọng mặt hoá học uraxin timin tương tự Khác với ADN có cấu tạo chuỗi kép (gồm hai sợi) phân tử AND có cấu tạo chuỗi đơn (chỉ có sợi) Vì ADN chép lại theo trật tự nucleotit (các gốc kiềm) khuôn ADN, nên người ta nói ADN truyền thông tin cho ARN, ARN giữ lấy thông tin di truyền ADN để thay mặt ADN điều khiển tổng hợp protein Vì loại ARN đặc biệt gọi ARN môi giới hay ARN thông tin 4.3 ARN vận chuyển ARNv loại axit ribonucleic đặc biệt, có phân tử lượng thấp (khoảng 25.000 đến 30.000) Trong lúc đó, ARNt có phân tử lượng cao 10 lần (250.000 đến 500.000) Mỗi loại axit amin số 20 axit amin thông thường có kiểu ARNv đặc thù cho mình, có có vài kiểu ARNv Mỗi ARNv, có cấu trúc phân tử đặc biệt riêng, cho phép đính kết với axit amin thích hợp mang đến ARNt đặt vào chỗ ARNt dành sẵn cho axit amin (chứ không cho axit amin khác) Sau giao axit amin cho ARNt, ARN v tiếp tục làm nhiệm vụ vận chuyển lần khác vận chuyển axit amin lần liên tiếp Trên khuôn mẫu (tức ARNt) lắp đầy axit amin cần thiết chuỗi axit amin hình thành Đó chuỗi polipeptit Một protein gồm chuỗi polipeptit, thường protein gồm số chuỗi polipeptit khác (Sở dĩ ARNv có khả chuyển phân tử loại axit amin định đến nơi định ARNt ARNt có đơn vị mã riêng biệt tức có ba gốc kiềm (nucleotit) Phân tử ARNt chuỗi dài ba Mỗi ARNv có đơn vị ba gốc kiềm đặc biệt Các đơn vị ba gốc kiềm phân tử ARNt tương ứng theo nguyên tắc bổ sung (tức A ARN tương ứng với U ARN ngược lại; G ARN tương ứng với X ARN ngược lại) với đơn vị ba gốc kiềm ARNv, nhờ mà ARNv với axit amin đính kết vào tìm chỗ thích hợp ARNt 4.4 Sự hoạt hoá axit amin 19 Trước tham gia vào tổng hợp protein, axit amin phải hoạt hoá, nghĩa liên kết với ARNv tương ứng Chỉ sau axit amin vận chuyển đến ribôxôm Quá trình hoạt hoá axit amin diễn qua bước nhờ vào xúc tác loại enzim axit amin –ARNv – sintetaza đặc trưng axit amin: - Trước hết axit amin phản ứng với ATP thành phức hợp cao axit amin AMT - Tiếp đến axit amin phức hợp chuyển đến ARNv tương ứng 20