Kin Thc C bn Tỏch Chit DNA Ton b ADN ca t bo, bao gm tt c gen v nhng vựng liờn gen c gi l b gen B gen ngi cha khong 80.000 gen, nhng nhng vựng mó húa ca gen ny chim khong 3% ca ton b gen B gen ca nm cha khong 6.000 gen B gen ca mt vi thc vt cú nhiu trỡnh t lp li B gen ca prokaryote rt nh c cha nhim sc th cú dng vũng, prokaryote cng cú th cú nhng gen nm plasmid B gen ca prokaryote khụng cú intron v nhng trỡnh t lp li Hiu c nhng thụng tin cha trỡnh t b gen l nhng thỏch thc ln giai on u ca th k 21 Mun nghiờn cu v b gen, k thut tinh chit DNA l mt nhng k thut sinh hc phõn t u tiờn vụ cựng quan trng gúp phn cho s thnh cụng nhng bc tip theo Hin cú rt nhiu phng phỏp n gin hn, thi gian lm vic rỳt ngn hn tựy theo mc ớch s dng DNA lm gỡ, hoc chit xut DNA t loi mụ no, trờn i tng gỡ õy ta nghiờn cu vic ly trớch DNA trờn nhúm i tng chớnh l thc vt, ng vt v vi khun vi cỏc i in ca chỳng l lỏ bi, tụm,E.Coli NI DUNG 1.KIN THC C S 1.1/Chit xut v tinh sch DNA 1.2.1/Nguyờn tc chung chit xut DNA Chun b mu Phỏ v t bo Hũa tan DNA Loi b cht ( protein, polysaccharide) Ta DNA Ra DNA Lm khụ Kim tra cht lng DNA Chun b mu: i vi thc vt thng thu ly mu lỏ, ng vt thu ly mụ trờn c th, vi khun: nuụi vi khun mụi trng nuụi cy t 15-16 gi tng sinh., thng nuụi 16 gi cho kt qu tt nht Phỏ v t bo: Dựng phng phỏp ly tõm phỏ v mng t bo v phúng thớch ADN nhõn Riờng mu lỏ thc vt, cũn cú lp v cellulose bờn ngoi, nờn phi c nghin nit lng, giỳp lm cho vỏch cellulose tr nờn giũn hn, d v hn, ng thi bo v ADN phúng thớch t nhõn khụng b tiờu hy bi cỏc protease t bo Ngoi ra, mng t bo v mng nhõn cũn c phỏ v bng hn hp cht ty (SDS sodium dodecyl sulfate, sarcosyl) v proteinase Cỏc DNA s c gii phúng mụi trng Cỏc protein liờn kt vi DNA cng t b phõn hy Hũa tan ADN: Hũa tan DNA dung dch m buffer TE (pH 8) giỳp ADN khụng b bin tớnh Loi b cỏc thnh phn khụng phi l ADN: Proteinase K: loi b thnh phn protein CTAB: loi b polysaccharide v lipid Chloroform: phõn tỏch v kộo cỏc thnh phn khụng phi l DNA xung mt di dung dch Ta ADN: S dng ethanol 96% hoc isoproanol 20 0C ta DNA dung dch Mc ớch l thu nhn nucleic acid di dng cụ c v bo v chỳng s phõn hy ca cỏc enzyme Ra DNA: DNA c li bng ethanol 70% loi b cỏc mui v cỏc du vt isopropanol Lm khụ: DNA sau c lm khụ bng cỏch phi nhit phũng qua ờm hay sy khụ Mc ớch trỏnh mu DNA cũn cha ethanol s nh hng n DNA tng s Kim tra cht lng DNA: o quang ph Chy in di 1.2.2/Kim tra cht lng DNA Kim tra cht lng DNA l bc cn thit quy trỡnh chit xut DNA Thớ d:S lng v cht lng DNA cú th nh hng n kt qu ca PCR vỡ mt lng DNA d tha cú th c ch s khuch i nhng on DNA mong mun Bit c nng DNA s d dng tớnh toỏn c s lng cn dựng ca cỏc loi enzyme ct gii hn ct DNA Thụng thng unit enzyme ct c àg ca DNA tinh khit 1.2.2.1/o quang ph Nguyờn tc: Nguyờn tc ca phng phỏp ny l da vo s hp th mnh ỏnh sỏng ca mt cht mt bc súng xỏc nh Nucleic acid hp th mnh ỏnh sỏng t ngoi bc súng 260 nm s cú mt ca base purine v pyrimidine Giỏ tr mt quang bc súng 260nm (OD 260nm) ca cỏc mu cho phộp xỏc nh nng nucleic acid mu n v OD260nm tng ng nng 50ng/ml cho mt dung dch ADN si ụi Do ú nng ADN mu c tớnh theo cụng thc sau: CADN (ng/ml) = OD260nm * 50 * pha loóng kim tra sch ca dung dch, ngi ta o thờm giỏ tr OD 280 nm (OD 280nm) bc súng ny, cỏc protein cú mc hp th cao nht Ngoi ra, cỏc protein cng hp th ỏnh sỏng bc súng 260 nm nh cỏc nucleic acid v ú lm sai lch giỏ tr tht ca nng nucleic acid Mt dung dch nucleic acid c xem l sch (khụng nhim protein) t s: OD260nm/OD280nm nm khong 1.8 Cỏc bc o OD: Chun b mu DNA o OD: Ho 10ml dch ADN cn o vo 90ml nc kh ion vụ trựng o i chng: Ly 100ml nc kh ion vụ trựng vo cuvet, o bc súng 260nm, 280nm o mu: Ly 100ml mu DNA ó chun b trờn vo cuvet, o bc súng 260nm, 280nm c hp th trờn mỏy o quang ph bc súng 260 nm, 280 nm X lý s liu theo cụng thc: Nng DNA s l: OD 260 * 50 ng/àl * pha loóng 1.2.2.3/in di Gel Agarose Nguyờn tc in di gel agarose l phng phỏp thụng dng, thớch hp dựng tỏch ri cỏc on acide nucleic cú kớch thc t 200bp n 50kp Agarose l cht chit xut t loi rong bin, agarose cú cu trỳc polymer thng, hin ngi ta ó ch to c nhiu loi agarose c bit phõn tớch DNA, RNA nh agarose tan nhit thp nh: low meeting agarose, metaphore agarose Gel agarose c bng cỏch un agarose dung dch m thớch hp cho n cú mu trng v cho c li bng cỏch vo khuụn v ngui Khi c li agarose to nờn mng li m kớch thc ca nú ph thuc nng agarose v dung dch m Khi nm gel cú pH >7 DNA s tớch in õm, di tỏc dng ca in trng thỡ DNA s chy v phớa anode Vn tc di chuyn ca DNA ph thuc vo cỏc thụng s sau: Kớch thc DNA: kớch thc cng ln thỡ DNA di chuyn cng chm v ngc li Nng agarose: tựy kớch thc DNA mun phõn tớch m ta chn nng agarose thớch hp Kớch thc DNA cng nh thỡ nng agarose phi cng ln Kin trỳc DNA: vi cựng kớch thc, tựy kin trỳc: siờu xon, vũng hay thng m tc di chuyn ca DNA khỏc Tc d di chuyn cng ph thuc vo dung dich m v lng ethidium bromide õy chỳng ta khụng nghiờn cu k v ny Cng dũng in: phõn ly ca gel agarose gim cng dũng in tng cao Cng in trng khụng c ln hn 5V/cm (tớnh t khong cỏch in cc) Thnh phn base v nhit : trng hp nng agarose thp hn 0.5% thỡ phi in di 0C nu khụng thnh phn cỏc base s nh hng n s chuyn ng ca cỏc DNA Ethidium bromide: ethidium bromide nh hng n 15% tc di chuyn ca cỏc ca cỏc on DNA thng Dung dch m in di: dung dch m nh hng n DNA gel Trng hp nng dung dch m quỏ cao gel s b chy v DNA b bin tớnh Cỏc bc thc hin Bc 1: gel: Dựng bng keo dỏn cht hai u ca khay in di, t lc sn u khay t khay ni bng phng, dựng ming bt khớ kim tra Cõn 0.4g agarose cho vo bỡnh tam giỏc 250ml, thờm 50 ml nc ct Lc nh cho agarose hũa ln nc t bỡnh tam giỏc vo lũ vi song un khong 3-5 phỳt Dung dich bỡnh tam giỏc tr thnh mu trng Ly bỡnh tam giỏc ra, i 15 phỳt r thy va núng (60 oC) thỡ nh dung dch vo khay in di Khong 45 phỳt thỡ agarose c li, gel i thnh mu trng c Bc 2: Chy gel t khay vo b in di, ly nh lc ra, khụng lm ng n gel Thờm dung dich m in di ph mt gel khong 1mm Dựng pipette P100 hỳt 10ul loading buffer chia thnh git trờn paraffin Dựng pipette P100 hỳt 10ul mu, trn vi git loading buffer sau ú load vo ging Ging u tiờn cú th chy DNA chun Khi ng ngun in, chn voltage thớch hp Nhn nỳt Run DNA s chy t cc õm sang cc dng Do DNA mang in tớch õm (cỏc gc phosphate mang in tớch õm a ngoi) Sau DNA chy c hn 2/3 mu gel thỡ nhn nỳt stop Ly khay in di Nhum gel vi Ethidium Bromide Xem gel di ốn UV In kt qu 1.2.3/Chun b cỏc dung dch , mụi trng v dng c 1.2.3.1/Cỏc bc chun b dung dch,mụi trng Chun b dung dch stock Pha ch mụi trng Kh trựng Kh trựng nhit khụ Kh trựng nhit t Kh trựng mụi trng Kh trựng vt dng Chỳ ý kh trựng ỉ Khụng bao gi kh trựng micropipette Khụng bao gi kh trựng giy thm bng nhit khụ Nhng cht khỏng sinh khụng c kh trựng bng autoclave Nhng vt dng bng thy tinh, nha phi c sch Vt thy tinh, nha Vt dng thy tinh, nha rt thng c s dng phũng thỡ nghim sinh hc phõn t Cỏc vt dng ny trc s dng phi c cn thn Nhng vt dng khụng c sch, cũn dớnh vi khun cú th c ch cỏc phn ng hoc phõn gii ca DNA Vt dng thy tinh phi c sch bng x phũng, li bng nc ct v c kh trựng bng ni kh trựng nhit t hoc nhit khụ i vi nhng thớ nghim vi RNA, vt dng thy tinh v cỏc dung dch phi c x lý vi diethylpyrocarbonate c ch RNase enzymes a s cỏc vt dng bng nha nh ng hỳt (pipette), ng nuụi cy (falcon), a petri c cung cp di dng ó kh trựng ri Cỏc vt dng khỏc nh u cone, ng tube dựng cho mỏy ly tõm phi c kh trựng trc s dng 1.2.4/Cỏc húa cht quỏ trỡnh chit xut DNA 1.2.4.1/Ethidium Bromide (EtBr) Ethidium Bromide l cht cú kh nng gõy t bin, nu chm phi hoc ty khụng ỳng cỏch s cú nguy c b nhim Ethidium Bromide Ethidium Bromide & the process of interlacation, illustrating the lengthening and untwisting of the DNA helix (http://www.madsci.org) Ethidium Bromide (http://en.wikipedia.org/wiki/Ethidium_bromide) õy l cht dựng phũng thớ nghim Sinh hc Phõn t, ch yu dựng nhum, (ỏnh du) DNA/RNA chy in di Hin cú cỏc cỏch dựng nh sau: B sung trc tip Ethidium Bromide vo dung dch m chy in di (buffer chy gel) Vi cỏch ny, lng Ethidium Bromide cn phi thu hi loi thi buffer chy gel l rt ln õy l cỏch ớt c dựng nht Ethidium Bromide c b sung vo dung dch m load mu, vỡ ch cú mt lng rt nh dung dch load mu c s dng mi chy in di nờn lng Ethidium Bromide s dng cng s rt ớt Nhng s bt li õy l lng Ethidium Bromide cn ly mi ln load mu l quỏ it, khú cú th ly chớnh xỏc bng micropipette Ethidium Bromide c b sung vo gel, lỳc gel cũn cha c sau ú lc trn u, vi cỏch ny DNA (load mu) c nhum tt Trong quỏ trỡnh chy in di, khong 10% Ethidium Bromide gel s khuch tỏn ngoi buffer chy gel Trong trng hp ny, phn ln Ethidium Bromide s c loi b di dng rn (dớnh gel) Nng thớch hp thng l 5àg/ml gel solution Mt vi quy trỡnh chy in di thỡ thc hin nhum DNA sau chy in di Bng cỏch ny buffer chy gel khụng b nhim Ethidium Bromide v cú th loi b trc tip khụng qua x lý Gel sau chy in di xong s c dung dich pha sn cú cha Ethidium Bromide v cú th tỏi s dng dung dch ny, nhiờn sau mi ln s dng phi b sung thờm cho ỳng th tớch Phng phỏp ny cú th khụng c a thớch lm i vi mt s nh nghiờn cu Cỏc yờu cu i vi cht thi Ethidium Bromide: Gel chy in di cha Ethidium Bromide: Tt c nhng gel, cht rn cha Ethidium Bromide cn phi c thu nht v loi b mụi trng lm vic nh l cỏc cht thi c hi Phi úng gúi riờng bit Dung dch cha Ethidium Bromide: Nhng dung dch m cú nng cao hn 10àg/ml cn phi c lc, kh, thiờu hy Ethidium Bromide hoc lu tr li nh l cỏc cht thi húa hc nguy him Khi dung dch cú nng thp hn 10àg/ml cú th c loi thi qua cng rónh Dng c thao tỏc i vi cỏc i tng cú cha Ethidium Bromide: Nhng dng c thớ nghim liờn quan n Ethidium Bromide cn nhng ni riờng bit v lm du rừ rng Cỏc phng phỏp x lý EtBr hin trờn th gii ang s dng: ã Dựng kit lc cú bỏn sn loi b EtBr nc thi Tỏc nhõn lc ch yu l than hot tớnh, nc thi sau lc cú th cng rónh Nhng b kit lc bỏn sn c cung cp t BIO 101, ú ch yu l than hot tớnh ng di dng tỳi tr, mi tỳi cú th hp th 10mg EtBr, mt b kit 50 tỳi nờn cú th hp th 500mg EtBr dung dch Tỳi than sau x lý cn loi b nh l cht thi húa hc c hi ã Loi b dung dch cú nng thp (cha n 100mg/ml) Cỏch (Lunn v Sanrone 1987): + Thờm 2,9g Amberlite XAD 16 cho mi 100ml dung dch x lý + Tr dung dch 12h nhit phũng thnh thong lc u + Lc dung dch qua giy lc Whatman No.1 b dch lc xung cng + B giy lc v Amberlite vo tỳi nha, buc kớn, loi b Cỏch (Bensaude 1988) + Thờm 300mg bt than hot tớnh cho mi 100ml dung dch cn x lý + hn hp nhit phũng, thnh thong lc u + Lc hp hp qua giy lc Whatman No.1 b dch lc xung cng + B giy lc v Amberlite vo tỳi nha, buc kớn, loi b ta cn nng mui thp phc CTAB-ADN s tỏch Phc ny s tỏch gn nh hon ton bc bng cn 700 CTAB buffer: 0.2M Tris-Cl pH7.5 2M NaCl 0.05M EDTA 2% (w/v) CTAB 1.2.4.3/TE buffer L mt loi buffer thng s dng Sinh Hc Phõn T, TE buffer giỳp bt hot enzyme nuclease gúp phn bo v DNA mu Thnh phn bao gm: 10 mM Tris-Cl, pH mM EDTA Nhng nghiờn cu v enzyme nuclease t nhng nm 1980 ó ch rng enzyme ny ớt hot ng nht vựng pH 7,5 i vi RNA v pH i vi DNA EDTA lm bt hot enzyme nuclease bng cỏch ly i nhng ion kim loi cn thit cho enzyme ny 1.2.4.4/Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Cú tỏc dng giỳp phỏ v mng t bo, giỳp cho quỏ trỡnh ly trớch DNA c thun li hn 1.2.4.5/Extraction Buffer (EB) Thnh phn bao gm: 0.1M Tris-Cl 0.5M NaCl 0.05M EDTA 0.01M betamercaptho ethanol Cú tỏc dng lm bin tớnh protein (ct cỏc cu ni disulfite), ng thi bo v DNA mu khụng b bin tớnh 1.2.4.6/Proteinase K (endopeptidase K) Trong quỏ trỡnh ly trớch DNA s cú s hin din ca rt nhiu protein, lm cho mu DNA khụng sch, cỏc protein ú cn phi c loi b proteinase K c s dng loi b cỏc protein ny, gúp phn lm sch mu DNA Ngoi proteinase K cũn gúp phn phõn gii enzyme nuclease giỳp cho DNA ớt b bin tớnh hn Proteinase K thng c trỡ s hin din ca SDS, EDTA v urea T bo vi khun c hũa tan SDS v Proteinase K 1.2.4.7/Isopropanol Dựng ta DNA vi t l 1:1 vi dung dch cn ta 1.2.4.8/Hn hp Chloroform:Isoamylalcohol (24:1) Dựng loi b protein, nhng polycaccharide v phc hp Sau li tõm vi tc 13000rpm phỳt dung dch chia thnh lp: lp th nht l phn dch trờn cựng cú cha DNA, lp th hai l mt lp protein, lp k tip cú cha chloroform v tt c nhng thnh phn cn loi b khỏc (polysaccharides, protein,) 1.2.4.9/Ethanol 96% v 70% Ethanol 96% dựng ta DNA v bo v chỳng s phõn hy ca cỏc enzyme Chỳng kt hp vi mui trỏnh gõy hi cho DNA Ethanol 70% dựng ta, loi mui DNA 2.PHNG TIN V PHNG PHP 2.1/Trớch DNA t vi khun gram õm 2.1.1/Phng tin Micropipette ng tube 1.5 v 2.2 ml Mỏy lc TE pH8 Proteinase K Isopropanol Cloroform/Isoamylalchohol (24:1) SDS 10% CTAB/0.7M NaCl 2.1.2/Phng phỏp Chun b mu: Nuụi vi khun E.Coli 6ml mụi trng LB (Luria Broth) nuụi qua ờm, 370C Trớch DNA: Bc 1: Ly tõm thu sinh vi khun: Cho vo tỳp (2,2ml) mi tỳp 2ml dung dch vi khun E.coli ó c nuụi cy qua ờm Sau ú, li tõm 13000rpm 10 phỳt Li tõm xong loi b phn ly phn ta phớa di Bc 2: hũa tan DNA: Bm 250ml TE pH vo tỳp th nht hũa tan kt ta tỳp th nht, sau ú chuyn phn dung dch tỳp th nht sang tỳp th hai, tỳp th hai sang tỳp th ba, hũa tan DNA tỳp th ba Bc 3: chit xut DNA: Sau ú, cho thờm vo tỳp 50ml dung dch 10% SDS cng 5ml proteinase K lc u, 20 phỳt nhit 65oC, mi phỳt o ngc tỳp mt ln trn u dung dch, cú tỏc dng phỏ v mng t bo v mng nhõn, chit xut v tinh sch DNA Bc 4: to phc vi CTAB: Sau hũa tan ht ta ta cho thờm vo tỳp 400ml CTAB v 65 oC 20 phỳt, khong phỳt o ngc ng tỳp trn u Bc 5: loi b protein v cỏc phc hp: Tip tc thờm 600ml chloroform:isoamylalcohol (24/1), lc u v li tõm 13000 vũng 10 phỳt loi b protein, nhng polysaccharide v cỏc phc hp trờn Bc 6: ta DNA: Li tõm xong, chuyn 500ml phn phớa trờn vo tỳp mi v thờm 1ml isopropanol lc u, gi 20oC 30 phỳt nhm mc ớch ta DNA, khụng cho DNA bin tớnh, thu c DNA nhiu hn v bo v chỳng s phõn hy ca cỏc enzyme Tin hnh li tõm 13000 vũng 10 phỳt trung lng DNA kt ta xung ỏy tỳp Bc 7: loi b phn dch trong: Sau li tõm, ta loi b phn dch phớa trờn v thu phn kt ta phớa di Bc 8: ta: Ra ta vi 1ml ethanol 70% ly tõm 13000rpm phỳt, lm ln loi b mui bỏm DNA v loi b lng isopropanol cũn li DNA (mi ln b ethanol) Bc 9: phi khụ DNA: Ra DNA xong, ta tin hnh phi DNA qua ờm nhit phũng cho sch ht ethanol trỏnh nh hng n DNA tng s Sau ú, hũa tan DNA bng 30ml nc ct, lc u cho DNA tan v tin hnh o OD 2.2/Trớch DNA t tụm 2.2.1/Phng tin C tụm hay biu bỡ di da u tụm Dung dch trớch Lysis buffer TE buffer 0.1X Mỏy ly tõm Micropipette ng tube 1.5 v 2.2 ml Kộo, kp, a thy tinh 2.2.2/Phng phỏp Chun b mu: Tụm em bc b v phn lng tụm, dựng kộo ct khong 100mg tht tụm cho vo tỳp 2,2ml Sau ú, dựng a thy tinh nghin mu thnh bt mn Trớch DNA: Bc 1: phỏ v mng t bo: Mu sau nghin mn cho thờm vo tỳp 400ml dung dch trớch buffer D giỳp phỏ v mng t bo, lc u v qua ờm nhit 50oC Bc 2: tỏch protein v cỏc thnh phn hu c DNA: Sau xong, ta cho thờm vo tỳp 400ml dung dch chloroform:isoamylalcohol (24:1) tỏch protein v cỏc thnh phn hu c khỏc (polysaccharides, polyphenols, lipids,), lc nh ri em ly tõm vi tc 13000 vũng/phỳt thi gian 10 phỳt Bc 3: ta DNA: Ta tin hnh hỳt 300ml phn dch phớa trờn cho qua mt tỳp 2,2ml mi, sau ú thờm vo tỳp ny 150ml 7,5M ammonium acetate v 600ml ethanol 96% cú tỏc dng giỳp DNA kt ta Lc nh v tin hnh li tõm vi tc 13000 vũng/phỳt phỳt Bc 4: DNA: Sau li tõm xong, ta loi b phn dch trờn ly phn cn phớa di Ra phn cn vi 600ml ethanol 70% ln loi b mui DNA Ly tõm 13000 vũng/phỳt phỳt sau mi ln b ethanol sau mi ln Bc 5: sy khụ DNA: Sy khụ bng mỏy ly tõm chõn khụng nhit 45 oC 15 phỳt, trỏnh trng hp mu DNA cũn cha ethanol s nh hng n DNA tng s Bc 6: hũa tan DNA: Sau sy mu xong, hỳt 30ml nc ct cho vo tỳp cha DNA hũa tan DNA Sau ú hỳt 10ml dung dch ny cho vo tỳp 1,5ml mi ó hỳt sn 90ml nc ct, lc u Sau ú em mu o OD 2.3/Trớch DNA t thc vt 2.3.1/Phng tin Lỏ bi Din B in di minisub gel Kộo ct mu, chy v ci nghin mu Micropipette ng tube 1.5 v 2.2 ml Extraction buffer (EB) CTAB buffer Agarose Isopropanol Cloroform/Isoamylalchohol (24:1) SDS Nit lng 2.3.2/Phng phỏp Chun b mu: Mu lỏ bi c kh trựng bng cn 70o (dựng bụng gũn thm cn v lau u trờn c hai b mt lỏ), dựng kộo ct ly phn tht lỏ hai bờn v b phn gõn lỏ gia Phn tht lỏ c gúi giy nhụm v ngõm nit lng thi gian 15 phỳt Sau ú, nghin k mu bng ci v chy ó c kh trựng bng cỏch ngõm nit lng Trong quỏ trỡnh nghin ta thờm nit lng vo nhm mc ớch c ch cỏc enzym gõy bin tớnh DNA ca lỏ, mu c nghin cho n thnh bt mn Trớch DNA: Bc 1: phỏ v mng t bo v mng nhõn: Chuyn phn bt mn vo tỳp 2,2ml Tip tc cho 50ml dung dch SDS 10% vo tỳp cú tỏc dng giỳp DNA d hũa tan hn, sau ú lc nh tỳp (trỏnh DNA b góy) Bc 2: mu: Mu sau thờm cỏc dung dch em nhit 65 oC 30 phỳt, quỏ trỡnh khong phỳt o nh tỳp trn mu Bc 3: li tõm: Sau thi gian , mu c em li tõm vi tc 13000rpm 10 phỳt, tỏch cỏc thnh phn khỏc ca t bo Bc 4: ta DNA: Li tõm xong ta hỳt 800ml phn dung dch phớa trờn cho vo tỳp mi, sau ú cho 800ml dung dch isopropanol vo tỳp v tin hnh thi gian khong 30 phỳt -20 oC kt ta DNA, khụng cho DNA bin tớnh, giỳp tng kh nng thu DNA iu kin ny nhiu protein v cỏc cht khỏc cng b kt ta cựng ADN nờn mu s b ln Sau ú, tin hnh li tõm vi tc 13000rpm 10 phỳt Bc 5: hũa tan ta: Li tõm xong, phn dch c b vo mt cỏi hp m cú cha nc v thu phn kt ta Hũa tan ta DNA 400ml TE, TE gi DNA n nh, khụng b bin tớnh Bc 6: to phc vi CTAB: Sau ta hũa tan ht ta cho thờm vo tỳp 400ml CTAB v 65 oC 15 phỳt, khong phỳt o ngc ng tỳp trn u Bc 7: loi b protein v cỏc phc hp: Sau ú cho thờm vo tỳp 800ml Chloroform/Isoamylalcohol lc u v li tõm vi tc 13000rpm phỳt loi b protein, nhng polycaccharide v phc hp trờn Bc 8: ta DNA: Sau ly tõm ta tin hnh hỳt 650ml phn dch phớa trờn cho qua mt tỳp 2,2ml mi, thờm vo tỳp ny 1.4ml Ethanol 96% nhit phũng vũng 15 phỳt ta DNA v bo v chỳng s phõn hy ca cỏc enzyme Sau ú, li tõm 13000rpm 10 phỳt Bc 9: DNA: Li tõm xong b phn dch phớa trờn vo hp m cú cha nc, thu ly phn kt ta phớa di Sau ú, tin hnh kt ta vi ethanol 70% loi b mui DNA Phn kt ta c ln vi ethanol 70% (khụng gõy hi cho DNA nng thp) Mi ln cho 400ml ethanol 70% vo tỳp, lc nh v em li tõm phỳt vi tc 13000rpm, sau ú loi b ethanol Bc 10: sy khụ DNA: Sy khụ bng mỏy ly tõm chõn khụng nhit 45 oC 15 phỳt, trỏnh trng hp mu DNA cũn cha ethanol s nh hng n DNA tng s Bc 11: hũa tan DNA: DNA sau sy khụ c hũa tan vi 100ml TE 0.1 Dung dch DNA c dựng chy in di 3.KIM TRA CHT LNG MU 3.1/o OD i vi mu vi khun v tụm Ly 100ml nc kh ion vụ trựng vo cuvet 100ml, o i chng Ho 10ml dch ADN cn o vo 90ml nc kh ion vụ trựng, bm vo cuvet, o bc súng 260nm, 280nm c hp th trờn mỏy o quang ph bc súng 260 nm, 280 nm X lý s liu 3.2in di i vi mu lỏ Khay in di c t lc sn mt u khay S dng lc cú s rng l 17 Khay c t ni bng phng Gel s dng chy in di lỏ: 40ml vi nng 1% agrarose Trc tiờn cõn 0,4g agrarose cho vo chai thy tinh, sau ú cho vo chai 50ml Bufer TE, tr hao quỏ trỡnh nu bc hi ht 10ml Lc chai cho agrarose hũa tan vo Buffer TE, sau ú em nu microwave phỳt 450W (nu cho agrarose hũa tan hon ton v nh nuc), agrarose sau nu xong ngui khong 60oC ri nh dung dch vo mt u khay dung dch s t tri u khay Khong 45 phỳt sau gel c li, ta dựng tay ly lc nhng phi cn thn trỏnh b b gel t khay vo b in di, thờm dung dch in di ph mt gel khong 2mm Sau gel chun b xong, ta tin hnh load mu vo cỏc ging ca gel + Load mu: u tiờn hỳt dung dch loading buffer (mt dung dch ti DNA cha 30% glycerol, 0,25% bromophenol blue (BPB) v 0,25% xylencyanol (XC), thnh phn cú cha glycerol cú t trng cao s kộo DNA nm ging khụng b trụi ngoi load mu) v nh thnh tng git nh khong 2ml giy paraflim, sau ú hỳt 10ml dung dch mu trn iu vi dung dch loading buffer v tin hnh load mu vo ging ca gel Bt u load t ging th 2, ging th nht dựng load thang chun Sau load xong ta y np b in di li v tin hnh chy in di Thi gian in di thay i ph thuc vo ln ca DNA, nng agarose ca gel v cng dũng in Sau chy in di xong bn gel c ly nh khuụn gel v ngõm vo dung dch EtBr thi gian 30 phỳt cú tỏc dng ỏnh du phõn t DNA, húa cht ny cú kh nng gn xen vo gia cỏc base ca nucleic acid v s phỏt hunh quang di tỏc dng ca tia t ngoi Sau ú sch bn gel bng nc ct Quan sỏt v chp hỡnh: Bn gel c quan sỏt di ỏnh sỏng t ngoi c gel bio-rad Quan sỏt thy ADN hin lờn di dng cỏc vch sỏng = 260-360 nm trờn b 4.KT QU V THO LUN 4.1/Kt qu Kt qu o OD cỏc mu DNA OD Mu Tụm E.Coli OD260 OD260/OD280 Nng DNA (ng/àl) 2.5825 1.4437 1.9888 2.0032 1291.25 721.85 Kt qu chp gel in di mu lỏ Vch s l vch c cp bỏo cỏo ny 4.2/Tho lun 4.2.1/Mu tụm Kt qu OD260/OD280 l 1.9888 cho thy DNA ca mu tụm l khỏ tinh sch,khụng b nhim Protein cng nh Chlorofrom,ng thi nng DNA thu c cng khỏ cao (1291.25 ng/àl) 4.2.2/Mu vi khun Kt qu o OD260/OD280 (2.0032) cho ta bit tinh sch ca mu l khỏ tt, nhiờn mu cú th b nhim mt ớt Chloroform sai sút quỏ trỡnh thc hin, cú th l sai sút quỏ trỡnh rỳt mu sau ly tõm vi cloroform/isoamylalchohol ng thi nng DNA thu c cng khỏ cao (721.85 ng/àl) 4.2.3/Mu lỏ bi Mu ging s 5, cho ta thy DNA ớt b nhim mui(ớt sỏng v trớ ging) v khụng cú trng hp b góy(ch cú vch sỏng ln, khụng cú cỏc vch sỏng di vch sỏng ln) , nhiờn vch sỏng hi m chng t nng DNA thu c l khụng cao TR LI CU HI Cõu 1: Cụng dng ca cỏc cht: Sodium Dodecyl Sulfate (SDS): Cú tỏc dng phỏ v mng t bo, DNA thoỏt mụi trng ngoi Cetyl Trimethylammonium Bromide (CTAB): CTAB cú kh nng liờn kt thun nghch vi ADN v polysaccharide, c th nng mui cao (trờn 1.4 M NaCl cú m chit) thỡ CTAB kt hp vi ADN v polysaccharide nhng phc hp CTAB-ADN tn ti trng thỏi hũa tan, ú phc CTABpolysaccharide li kt ta, phc ny s c loi i bc ly tõm u tiờn nng mui di 0.7M thỡ phc CTAB-ADN li kt ta, cho phộp thu hi li ADN bc ta cn nng mui thp phc CTAB-ADN s tỏch Phc ny s tỏch gn nh hon ton bc bng cn 700 Proteinase K (endopeptidase K): Trong quỏ trỡnh ly trớch DNA s cú s hin din ca rt nhiu protein, lm cho mu DNA khụng sch, cỏc protein ú cn phi c loi b proteinase K c s dng loi b cỏc protein ny, gúp phn lm sch mu DNA Ngoi proteinase K cũn gúp phn phõn gii enzyme nuclease giỳp cho DNA ớt b bin tớnh hn Proteinase K thng c trỡ s hin din ca SDS, EDTA v urea Isopropanol: Dựng ta DNA (th tớch isopropanaol t l 1:1 vi dung dch cn ta) Hn hp Chloroform:Isoamylalcohol (24:1): Dựng loi b protein, polycaccharide v cỏc phc hp khụng phi DNA Sau li tõm vi tc 13000rpm phỳt dung dch chia thnh lp: lp th nht l phn dch trờn cựng cú cha DNA, lp th hai l mt lp protein, lp k tip cú cha chloroform v tt c nhng thnh phn cn loi b khỏc Ethanol 96% v 70%: Ethanol 96% dựng ta DNA v bo v chỳng s phõn hy ca cỏc enzyme Chỳng kt hp vi mui trỏnh gõy hi cho DNA Ethanol 70% dựng ta, loi b isopropanol, mui CTAB DNA Cõu 2: S khỏc dựng TE 0.1X v nc hũa tan DNA TE 0.1 Buffer bao gm 10mM Tris pH8 ,0.1 mM EDTA (pH 8) cú tỏc dng bo qun DNA (chng oxy húa DNA, bo v DNA s phõn hy ca cỏc enzyme) thi gian lõu hn so vi ta hũa tan DNA vi nc Cõu 3: DNA cn phi c lm khụ trc hũa tan DNA sau c lm khụ bng cỏch phi nhit phũng qua ờm hay sy khụ Mc ớch trỏnh mu DNA cũn cha ethanol s nh hng n DNA tng s V quỏ trỡnh phõn tớch mu v sau Khi cn cú th hũa tan li vi nc theo nng mong mun Cõu 4: Nng v s lng DNA mu tụm: Ta cú: OD260nm = ị DNA = 50ng/ml Qua kt qu o OD ca Tụm ta cú: OD260nm = 2.5825 Trc tin hnh o OD, mu ó c pha loóng 10 ln Vy nng DNA mu Tụm thu c: CDNA= OD260nm * 50ng/ml*10 = 2.5825*50ng/ml*10 = 1291.25 ng/ml Dung dch DNA trc pha loóng l 30 ml nờn s lng DNA thu c l: 30*1291.25 = 38,737.5ng Kt qu OD260/OD280 l 1.9888 cho thy DNA ca mu tụm l khỏ tinh sch,khụng b nhim Protein cng nh Chlorofrom,ng thi nng DNA thu c cng khỏ cao (1291.25 ng/àl) Tng t: Nng v s lng DNA mu vi khun: CDNA= OD260nm * 50ng/ml*10 = 1.4437*50ng/ml*10 = 721.85ng/ml Dung dch DNA trc pha loóng l 30 ml nờn s lng DNA thu c l: 30*721.85= 21,655.5 ng Kt qu o OD260/OD280 (2.0032) cho ta bit tinh sch ca mu l khỏ tt, nhiờn mu cú th b nhim mt ớt Chloroform sai sút quỏ trỡnh thc hin, cú th l sai sút quỏ trỡnh rỳt mu sau ly tõm vi cloroform/isoamylalchohol ng thi nng DNA thu c cng khỏ cao (721.85 ng/àl) Cõu 5:Cht lng v s lng DNA lỏ da trờn kt qu in di Mu ging s 5, cho ta thy DNA ớt b nhim mui v khụng cú trng hp b góy, nhiờn vch th hin hi m chng t nng DNA thu c l khụng cao Bi a.Lng húa cht hũa tan cỏc dung dch Stock cú nng sau: ng nht th tớch dung dch pha V= 1lit * Tris 1M (M= 121.13g/mol) CM Tris = n/V=m/(M*V) => m= CM Tris * (M*V) = 1x (121.13 *1) =121.13g *EDTA 0.5M (M=372.24 g/mol) CM EDTA = n/V=m/(M*V) => m= CM EDTA* (M*V) = 0.5 x (372.24 *1) =186.12g *NaCl 5M( M=58.4 g/mol) CM NaCl = n/V=m/(M*V) => m= CM NaCl * (M*V) = x (58.4*1) = 292 g b.Pha V2 ml Buffer A (0.1M Tris; 0.5M NaCl, 0.005M EDTA pH 8) t cỏc dung dch gc Tris 1M, NaCl 5M, EDTA 0.5M Phi mt bao nhiờu dung dch gc pha Buffer A Da vo cụng thc C1V1=C2V2 ta tớnh c cỏc th tớch cỏc dung dch gc cn pha nh sau: V1 = C2V2 / C1 * VTris.HCl = 0.1* V2/1 = V2/10 ml * VNaCl = 0.5* V2/5 = V2 /10 ml * VEDTA = 0.005* V2/0.5 = V2 /100 ml Tng th tớch ca dung dch gc = V2/10 + V2/10 +V2/100 =21V2/100 ml ị Th tớch nc ct thờm vo = V2 79 V2/100= 79V2/100 ml [...]... mui CTAB ra khi DNA Cõu 2: S khỏc nhau khi dựng TE 0.1X v nc hũa tan DNA TE 0.1 Buffer bao gm 10mM Tris pH8 ,0.1 mM EDTA (pH 8) cú tỏc dng bo qun DNA (chng oxy húa DNA, bo v DNA khi s phõn hy ca cỏc enzyme) trong thi gian lõu hn so vi khi ta hũa tan DNA vi nc Cõu 3: DNA cn phi c lm khụ trc khi hũa tan DNA sau khi ra c lm khụ bng cỏch phi nhit phũng qua ờm hay sy khụ Mc ớch trỏnh mu DNA cũn cha ethanol... 13000rpm trong 5 phỳt, lm 2 ln loi b mui bỏm trong DNA v loi b lng isopropanol cũn li trong DNA (mi ln b ethanol) Bc 9: phi khụ DNA: Ra DNA xong, ta tin hnh phi DNA qua ờm nhit phũng cho sch ht ethanol trỏnh nh hng n DNA tng s Sau ú, hũa tan DNA bng 30ml nc ct, lc u cho DNA tan ra v tin hnh o OD 2.2/Trớch DNA t tụm 2.2.1/Phng tin C tụm hay biu bỡ di da u tụm Dung dch trớch Lysis buffer TE buffer... mi ln ra b ethanol sau mi ln ra Bc 5: sy khụ DNA: Sy khụ bng mỏy ly tõm chõn khụng nhit 45 oC trong 15 phỳt, trỏnh trng hp mu DNA cũn cha ethanol s nh hng n DNA tng s Bc 6: hũa tan DNA: Sau khi sy mu xong, hỳt 30ml nc ct cho vo tỳp cha DNA hũa tan DNA Sau ú hỳt 10ml dung dch ny cho vo tỳp 1,5ml mi ó hỳt sn 90ml nc ct, lc u Sau ú em mu o OD 2.3/Trớch DNA t thc vt 2.3.1/Phng tin Lỏ bi Din B in di... hng n DNA tng s V quỏ trỡnh phõn tớch mu v sau Khi cn cú th hũa tan li vi nc theo nng mong mun Cõu 4: Nng v s lng DNA mu tụm: Ta cú: OD260nm = 1 ị DNA = 50ng/ml Qua kt qu o OD ca Tụm ta cú: OD260nm = 2.5825 Trc khi tin hnh o OD, mu ó c pha loóng 10 ln Vy nng DNA trong mu Tụm thu c: CDNA= OD260nm * 50ng/ml*10 = 2.5825*50ng/ml*10 = 1291.25 ng/ml Dung dch DNA trc khi pha loóng l 30 ml nờn s lng DNA. .. ethanol 70% vo tỳp, lc nh v em li tõm trong 5 phỳt vi vn tc 13000rpm, sau ú loi b ethanol Bc 10: sy khụ DNA: Sy khụ bng mỏy ly tõm chõn khụng nhit 45 oC trong 15 phỳt, trỏnh trng hp mu DNA cũn cha ethanol s nh hng n DNA tng s Bc 11: hũa tan DNA: DNA sau khi sy khụ c hũa tan vi 100ml TE 0.1 Dung dch DNA c dựng chy in di 3.KIM TRA CHT LNG MU 3.1/o OD i vi mu vi khun v tụm Ly 100ml nc kh ion vụ trựng... thu c l: 30*1291.25 = 38,737.5ng Kt qu OD260/OD280 l 1.9888 cho thy DNA ca mu tụm l khỏ tinh sch,khụng b nhim Protein cng nh Chlorofrom,ng thi nng DNA thu c cng khỏ cao (1291.25 ng/àl) Tng t: Nng v s lng DNA mu vi khun: CDNA= OD260nm * 50ng/ml*10 = 1.4437*50ng/ml*10 = 721.85ng/ml Dung dch DNA trc khi pha loóng l 30 ml nờn s lng DNA thu c l: 30*721.85= 21,655.5 ng Kt qu o OD260/OD280 (2.0032) cho... phỳt nhm mc ớch ta DNA, khụng cho DNA bin tớnh, thu c DNA nhiu hn v bo v chỳng khi s phõn hy ca cỏc enzyme Tin hnh li tõm 13000 vũng trong 10 phỳt tp trung lng DNA kt ta xung ỏy tỳp Bc 7: loi b phn dch trong: Sau khi li tõm, ta loi b phn dch trong phớa trờn v thu phn kt ta phớa di Bc 8: ra ta: Ra ta vi 1ml ethanol 70% ly tõm 13000rpm trong 5 phỳt, lm 2 ln loi b mui bỏm trong DNA v loi b lng isopropanol... protein (ct cỏc cu ni disulfite), ng thi bo v DNA trong mu khụng b bin tớnh 1.2.4.6/Proteinase K (endopeptidase K) Trong quỏ trỡnh ly trớch DNA s cú s hin din ca rt nhiu protein, lm cho mu DNA khụng sch, cỏc protein ú cn phi c loi b proteinase K c s dng loi b cỏc protein ny, gúp phn lm sch mu DNA Ngoi ra proteinase K cũn gúp phn phõn gii enzyme nuclease giỳp cho DNA ớt b bin tớnh hn Proteinase K thng c... (endopeptidase K): Trong quỏ trỡnh ly trớch DNA s cú s hin din ca rt nhiu protein, lm cho mu DNA khụng sch, cỏc protein ú cn phi c loi b proteinase K c s dng loi b cỏc protein ny, gúp phn lm sch mu DNA Ngoi ra proteinase K cũn gúp phn phõn gii enzyme nuclease giỳp cho DNA ớt b bin tớnh hn Proteinase K thng c duy trỡ trong s hin din ca SDS, EDTA v urea Isopropanol: Dựng ta DNA (th tớch isopropanaol t l 1:1... 1.4ml Ethanol 96% nhit phũng trong vũng 15 phỳt ta DNA v bo v chỳng khi s phõn hy ca cỏc enzyme Sau ú, li tõm 13000rpm trong 10 phỳt Bc 9: ra DNA: Li tõm xong b phn dch trong phớa trờn vo hp m cú cha nc, thu ly phn kt ta phớa di Sau ú, tin hnh ra kt ta vi ethanol 70% loi b mui ra khi DNA Phn kt ta c ra 2 ln vi ethanol 70% (khụng gõy hi cho DNA do nng thp) Mi ln ra cho 400ml ethanol 70% vo tỳp,