BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI MAI THỊ HƢỜNG MÃ SINH VIÊN: 1101250 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SỐNG SÓT CỦA Lactobacillus sporogenes TRONG QUÁ TRÌNH TẠO NGUYÊN LIỆU ĐÔNG KHÔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI – 2016 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI MAI THỊ HƢỜNG MÃ SINH VIÊN: 1101250 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SỐNG SÓT CỦA Lactobacillus sporogenes TRONG QUÁ TRÌNH TẠO NGUYÊN LIỆU ĐÔNG KHÔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Kiều Thị Hồng DS Tô Ngọc Sắc Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dƣợc HÀ NỘI – 2016 LỜI CẢM ƠN Với tất kính trọng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới ThS Kiều Thị Hồng, người tận tình hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn TS Đàm Thanh Xuân DS Tô Ngọc Sắc đóng góp nhiều ý kiến quý báu, động viên tận tình giúp đỡ em thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô giáo, anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Công nghiệp Dược quan tâm, giúp đỡ em suốt trình nghiên cứu làm thực nghiệm môn Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn gia đình, thầy cô, bạn bè, người bên em động viên, giúp đỡ em vượt qua khó khăn học tập sống Em xin trân trọng cảm ơn! Hà nội, ngày 10 tháng năm 2016 Sinh viên Mai Thị Hƣờng MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 ĐẠI CƢƠNG VỀ PROBIOTIC…………………………….…2 1.2 Các vi sinh vật thƣờng dùng chế phẩm probiotic 1.3 Tình hình nghiên cứu sử dụng probiotic giới Việt Nam…………………………………………………….… 1.4 Lactobacillus sporogenes …………………………………… 1.4.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa điều kiện nuôi cấy…….….6 1.4.2 Vai trò Lactobacillus sporogenes……………………………9 1.4.3 Một số nghiên cứu nước L sporogenes…… 10 1.5 Phƣơng pháp đông khô……………………………………… 11 1.5.1 Khái niệm……………………………………………………….11 1.5.2 Các giai đoạn trình đông khô………………….……… 11 1.5.3 Ưu, nhược điểm phương pháp đông khô……………….… 12 1.5.4 Một số tá dược thường dùng đông khô VSV…………….12 CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………………………………………………………………………….14 2.1 Nguyên liệu thiết bị nghiên cứu……………………….….14 2.1.1 Nguyên vật liệu……………………………………………… 14 2.1.2 Môi trường sử dụng nghiên cứu…………………………15 2.1.3 Thiết bị…………………………………………………………16 2.2 Nội dung nghiên cứu……………………………………………16 2.2.1 Tạo nguyên liệu đông khô chứa Lactobacillus sporogenes… 16 2.2.2 Đánh giá số tiêu chất lượng nguyên liệu tạo thành trình bảo quản…………………………………… …………… 17 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu…………………………………… 17 2.3.1 Phương pháp giữ giống thạch nghiêng……………………17 2.3.2 Phương pháp nuôi cấy………………………………………….17 2.3.3 Phương pháp xử lý dịch nuôi cấy thu sinh khối…… ……… 18 2.3.4 Phương pháp tạo nguyên liệu đông khô………… ………… 18 2.3.5 Phương pháp nhuộm màu quan sát bào tử (pp Ogietska)….… 18 2.3.6 Phương pháp đo hàm ẩm……………………………………….19 2.3.7 Phương pháp nuôi cấy thu bào tử môi trường rắn…… ….19 2.3.8 Xác định số lượng vi sinh vật theo pp pha loãng liên tục…… 20 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN…………… 22 3.1 Tạo nguyên liệu đông khô chứa Lactobacillus sporogenes… 22 3.2 Đánh giá số tiêu chất lƣợng nguyên liệu tạo thành trình bảo quản………………… ……………… ………………………33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ……………………………………………… 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT B subtilis Bacillus subtilis CFU (Colony – Forming Unit) Số đơn vị khuẩn lạc CPA FAO Cryoprotectant (Food and Agriculture Organization) Tổ chức Nông lương HMG-CoA giới 3-hydroxy-3-methylglutaryl–coenzyme A L sporogenes Lactobacillus sporogenes MRS (de Man, Rogosa and Sharpe) Môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic MT Môi trường Vòng/phút (revolutions per minute) Vòng phút VSV Vi sinh vật WHO (World Health Organization) Tổ chức Y tế giới DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Tên bảng, biểu Bảng 1.1 So sánh đặc tính Lactobacillus Trang sporogenes với chi Bacillus Lactobacillus Bảng 2.1 Nguyên liệu pha môi trường 14 Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng đề tài 16 Bảng 3.1 Mật độ vi sinh vật có 1ml hỗn dịch bào tử 26 nuôi cấy môi trường MT4 Bảng 3.2 Mật độ L sporogenes mẫu đông khô với 28 thể tích nuôi cấy khác Bảng 3.3 Mật độ L sporogenes mẫu đông khô theo 30 thời gian nuôi cấy Bảng 3.4 Biến thiên mật độ VSV hàm ẩm mẫu đông khô L sporogenes trình bảo quản 35 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Tên hình vẽ, đồ thị Trang Hình 1.1 Hình ảnh nhuộm Gram tế bào vi khuẩn L.sporogenes Hình 1.2 Cấu tạo bào tử Lactobacillus sporogenes Hình 3.1 Hình ảnh nhuộm Ogietska Lactobacillus 23 sporogenes thời điểm 96 Hình 3.2 Hình ảnh nhuộm quan sát bào tử Lactobacillus 25 sporogenes sau nuôi cấy môi trường tạo bào tử MT4 Hình 3.3 Hình ảnh nhuộm quan sát bào tử Bacillus 25 subtilis sau nuôi cấy môi trường tạo bào tử MT4 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc mật độ L.sporogenes 28 mẫu đông khô vào thể tích nuôi cấy Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc mật độ L sporogenes 31 mẫu đông khô vào thời gian nuôi cấy Hình 3.6 Hình ảnh khuẩn lạc L sporogenes pha loãng 34 nồng độ 10-6 sau tuần bảo quản Hình 3.7 Hình ảnh khuẩn lạc L sporogenes pha loãng 34 nồng độ 10-7 sau tuần bảo quản Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn biến thiên mật độ VSV hàm ẩm mẫu đông khô L sporogenes trình bảo quản 35 ĐẶT VẤN ĐỀ Probiotics lợi khuẩn có nhiều giá trị thiết thực sức khỏe người như: ức chế vi sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa, cải thiện khả dung nạp lactose, tăng cường miễn dịch, giảm cholesterol… Trong thời gian gần đây, sản phẩm y tế chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc từ probiotic có tăng mạnh mẽ số lượng Lactobacillus sporogenes chủng vi khuẩn có nhiều đặc tính trội để sử dụng làm nguyên liệu cho chế phẩm probiotic: có khả sinh bào tử giúp chống chịu tốt với điều kiện bất lợi môi trường, làm tăng tỉ lệ sống sót tăng hiệu điều trị; có khả lên men đồng hình tạo acid L (+) lactic mà thể chuyển hóa hoàn toàn [8] Hiện đông khô phương pháp tốt để bào chế chế phẩm có dược chất bền với nhiệt độ, dễ bị phân hủy chất mang chất sinh học Các VSV sau đông khô có khả sống sót cao trình bảo quản, đặc biệt vi sinh vật probiotics như: Lactobacillus Bifidobacterium Xuất phát từ lí thực đề tài : “Khảo sát khả sống sót Lactobacillus sporogenes trình tạo nguyên liệu đông khô ” Nhằm mục tiêu sau: Tạo nguyên liệu đông khô chứa Lactobacillus sporogenes Đánh giá số tiêu chất lượng nguyên liệu tạo thành trình bảo quản 1.1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN Đại cƣơng probiotics Vào đầu kỷ 19, vai trò tích cực số vi khuẩn lần quan sát nhà khoa học người Nga Metchnikoff (1845-1916) Ông nhận thấy rằng: Những người nông dân Bungari thường xuyên sử dụng sữa lên men lactic acid thường sống mạnh khỏe có tuổi thọ cao Cùng thời giáo sư viện Pasteur – Pari nhận thấy: số vi khuẩn Clostria có sẵn đường ruột trình phân giải protein sinh số chất gây nhiễm độc ruột (như phenol, indols amoniac ), sử dụng sữa lên men với vi khuẩn lactic acid đường ruột không bị nhiễm độc Giáo sư cho rằng: trình lên men lactose tạo độ pH thấp mà ức chế phát triển vi khuẩn phân giải protein Từ khám phá ban đầu đó, giới khoa học bắt đầu quan tâm nghiên cứu nhóm vi khuẩn có lợi Thuật ngữ “Probiotic” giới thiệu lần vào năm 1953 Kollath Theo ông, Probiotic “các yếu tố có nguồn gốc từ vi khuẩn, kích thích phát triển vi khuẩn khác” [16] Năm 1989, Fuller đưa định nghĩa khác Probiotic: “Probiotic thực phẩm bổ sung VSV sống đem lại tác động có lợi cho vật chủ cách cải thiện cân hệ vi sinh đường ruột” Năm 1992, Havenaar mở rộng định nghĩa probiotic: “Probiotic vi khuẩn đơn lẻ hay hỗn hợp vi sinh vật sống dùng cho người động vật có ảnh hưởng có lợi cho sinh vật chủ cách cải thiện hệ vi khuẩn đường ruột” [40] Năm 2002, Tổ chức Y tế giới (WHO) tổ chức Nông lương giới (FAO) đưa định nghĩa ngắn gọn hoàn chỉnh Probiotics thời điểm sau: “Probiotics vi sinh vật sống mà đưa vào 30 3.1.2 Khảo sát ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến số lƣợng Lactobacillus sporogenes nguyên liệu đông khô Số lượng vi sinh vật nguyên liệu đông khô phụ thuộc vào thời gian nuôi cấy, đó, cần xác định thời điểm thích hợp để thu lượng vi sinh vật lớn Tiến hành: - Nuôi cấy L sporogenes môi trường MRS, đặt máy lắc nhiệt độ 37oC tốc độ lắc 110 vòng/phút theo phương pháp nêu mục 2.3.2 - Sau thời gian thích hợp tiến hành xử lý dịch nuôi cấy (lượng thể tích sử dụng 400 ml) thu sinh khối theo phương pháp nêu mục 2.3.3 - Sau thu sinh khối tiến hành đông khô theo phương pháp nêu mục 2.3.4 với lượng dung dịch sữa gầy 10% sử dụng 60 ml hấp tiệt khuẩn - Sau đông khô tiến hành xác định số lượng VSV theo phương pháp nêu mục 2.3.8 Kết quả: Bảng 3.3 Mật độ L sporogenes mẫu đông khô theo thời gian nuôi cấy Thời gian nuôi cấy (ngày) Mật độ vi sinh vật 10 3.36×108 mẫu đông 2.40×10 1.58×10 khô (A) (cfu/g) 5.62×108 31 12 Log (A) 10 4 Thời gian (ngày) Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc mật độ L Sporogenes mẫu đông vào thời gian nuôi cấy Nhận xét: Số lượng vi sinh vật sống thu mẫu đông khô tạo thành thay đổi thời gian nuôi cấy khác Với thời gian nuôi cấy tăng từ ngày lên ngày, lượng vi sinh vật sống mẫu đông khô thu tăng mạnh (từ 2.40×106 cfu/g lên 1.58×1010 cfu/g) Khi tăng thời gian nuôi cấy từ ngày lên ngày số lượng vi sinh vật sống lại giảm xuống 3.36×108 cfu/g Khi tăng thời gian nuôi cấy lên ngày số lượng vi sinh vật sống tăng lên so với ngày thấp so với ngày (2.46×109) Như vậy, với thời gian nuôi cấy vi sinh vật ngày có lượng vi sinh vật sống mẫu đông khô lớn 32 Bàn luận: Mật độ VSV mẫu đông khô tạo thành tăng theo thời gian nuôi cấy đạt cao ngày, sau giảm dần Điều giải thích khả tạo bào tử Lactobacillus sporogenes Khi phát triển đến pha cân Lactobacillus sporogenes chuyển dần sang dạng bào tử Thời gian tăng tạo nhiều dạng bào tử Với ưu điểm khả chống chịu tốt với điều kiện khắc nghiệt bào tử, tăng khả sống sót đông khô tạo nguyên liệu probiotic Khi thời gian nuôi cấy tăng, tỉ lệ VSV già hóa chuyển sang pha suy vong tăng, mật độ VSV mẫu đông khô giảm Tuy nhiên theo thực nghiệm tăng thời gian nuôi cấy lên ngày số lượng vi sinh vật sống tăng lên so với ngày, điều xác tế bào sinh dưỡng sau chuyển dạng bào tử lại phân hủy thành chất dinh dưỡng bổ sung vào môi trường nuôi cấy, làm cho VSV cung cấp chất dinh dưỡng môi trường không đủ chất dinh dưỡng chúng chuyển sang dạng bào tử, dẫn đến mật độ VSV có mẫu sau đông khô lớn so với ngày thấp nhiều so với ngày Như vậy, thời gian nuôi cấy thích hợp để thu xử lý sinh khối ngày Kết có tương đồng với số nghiên cứu trước với chủng B clausii, môi trường lỏng lượng bào tử nhiều đạt sau thời gian nuôi cấy ngày [2] Công bố Donnellan J E cộng có kết tương tự, sau ngày nuôi cấy B subtilis có 60% 80% tế bào dạng sinh dưỡng chuyển thành bào tử 18 Tóm lại: L sporogenes môi trường MRS khó tạo bào tử môi trường tạo bào tử MT4 Trong môi trường tạo bào tử, lượng bào tử tạo đạt 82.4% so với B subtilis Tuy nhiên với mục đích tạo nguyên liệu đông khô có 33 lượng VSV sống sót cao nuôi cấy môi trường MRS với thể tích nuôi cấy 400 ml thời gian ngày tạo nguyên liệu đông khô có số lượng vi sinh vật sống sót lên tới 109 cfu/g đạt tiêu số lượng VSV sử dụng làm nguyên liệu probiotics 3.2 Đánh giá số tiêu chất lƣợng nguyên liệu tạo thành trình bảo quản Mục tiêu: Trong thời gian bảo quản, theo dõi hàm ẩm số lượng VSV bột đông khô chứa L sporogenes tạo thành để đánh giá chất lượng nguyên liệu Tiến hành: Mẫu đông khô probiotics sau tạo bảo quản đĩa petri gói giấy bạc kín đặt tủ lạnh nhiệt độ 4-6oC Mẫu theo dõi số lượng vi sinh vật hàm ẩm thời gian bảo quản Từ đánh giá sơ độ ổn định mẫu đông khô probiotics thời gian điều kiện bảo quản Xác định hàm ẩm theo phương pháp nêu mục 2.3.6 mật độ VSV nguyên liệu tạo thành theo phương pháp nêu mục 2.3.8 thời điểm ban đầu thời gian bảo quản Lựa chọn thời điểm tuần, tuần, tuần, tuần kết thu thể bảng 3.4 34 Hình 3.6: Hình ảnh khuẩn lạc L sporogenes pha loãng nồng độ 10-6 sau tuần bảo quản Hình 3.7: Hình ảnh khuẩn lạc L sporogenes nồng độ pha loãng 10-7 sau tuần bảo quản 35 Bảng 3.4 Biến thiên mật độ VSV hàm ẩm mẫu đông khô L sporogenes trình bảo quản Thời gian Mật độ VSV (cfu/g) tuần tuần tuần 4.10×109 2.31×109 1.62×109 1.49×109 1.41×109 Hàm ẩm (%) 2.86 2.95 3.01 4.5 3.15 3.23 4.5 4 3.5 3.5 3 2.5 2.5 2 1.5 Mật độ VSV (.10^9 cfu/g) Hàm ẩm Mật độ VSV (.10^9 cfu/g) tuần Hàm ẩm 1.5 1 0.5 0.5 0 tuần tuần tuần tuần Thời gian Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn biến thiên mật độ vi sinh vật hàm ẩm mẫu đông khô L sporogenes trình bảo quản Nhận xét: Số lượng VSV mẫu đông khô thời gian bảo quản giảm nhiều tuần (từ 4.10×109 xuống 2.31×109 cfu/g) Các tuần số lượng VSV mẫu có giảm suy giảm so với tuần đầu 36 (sau tuần số lượng VSV mẫu 1.62×109 cfu/g, sau tuần 1.49×109 cfu/g, sau tuần 1.41×109 cfu/g) Hàm ẩm mẫu đông khô ban đầu đạt mức 2.86% (dưới 3%) Sau thời gian bảo quản tuần hàm ẩm mẫu đông khô tăng dần tăng lên 3.23% Khi làm tiêu soi kính hiển vi mẫu đông khô, L sporogenes nguyên liệu đông khô chủ yếu dạng bào tử bắt màu đỏ, nhiên lẫn tế bào bắt màu nhạt Bàn luận: Trong thời gian bảo quản: Hàm ẩm mẫu đông khô ban đầu đạt mức 2.86% (dưới 3%) Sau thời gian bảo quản tuần hàm ẩm mẫu đông khô tăng dần tăng lên 3.23% (dưới 5%) Có thể giải thích nguyên liệu đông khô tạo thành có độ xốp cao, diện tích bề mặt lớn, đó, bị hút ẩm trình bảo quản trình lấy mẫu kiểm nghiệm Số lượng VSV mẫu đông khô thời gian bảo quản giảm nhiều tuần (giảm từ 4.10×109 xuống 2.31×109 cfu/g) Ở tuần số lượng VSV mẫu có giảm mức suy giảm so với tuần đầu (sau tuần số lượng VSV mẫu 1.62×109 cfu/g, sau tuần 1.49×109 cfu/g, sau tuần 1.41×109 cfu/g) Có thể giải thích mẫu đông khô tạo thành hàm ẩm, thấp (2.86%), chưa kể điều kiện bảo quản mẫu đông khô có khả hút ẩm tăng hàm ẩm Hàm ẩm cao khả sống sót vi sinh vật theo thời gian giảm Bởi điều kiện có ẩm, làm vi sinh vật trở lại trạng thái hoạt động tiếp tục sinh trưởng, phát triển, già hóa chết [17], [34] So sánh với nghiên cứu Lactobacillus acidophilus với mẫu đông khô pellet, bảo quản pellet probiotic lọ thủy tinh nút cao su kín nhiệt độ 37 4– 6oC kết có tương đồng mà số lượng VSV sống giảm nhiều tuần bảo quản, giảm chậm dần tuần [7] Cả nghiên cứu tác dụng bảo vệ VSV sữa gầy trình đông khô trình bảo quản Bởi thành phần lactose có sữa gầy số disaccharide khác thấm qua thành tế bào, sau chúng hình thành liên kết hydro đường - protein Các liên kết giúp trì cấu trúc protein màng nước bị loại Protein giúp hình thành trạng thái glass xung quanh bên tế bào tạo môi trường đủ nhớt bên tế bào giúp ngăn cản biến đổi tế bào mức thấp Theo nghiên cứu khác protein sữa gầy tạo thành lớp áo bảo vệ thành tế bào, đồng thời sữa gầy cung cấp chất đệm tan nước (muối phosphate, muối citrat) giúp ổn định pH trình đông khô [31], [32] Hình ảnh VSV mẫu đông khô tồn chủ yếu dạng bào tử, nhiên lẫn tế bào bắt màu nhạt Có thể bào tử L sporogenes nằm đầu tế bào, số tách khỏi tế bào [9] Như vậy, mẫu đông khô L.sporogenes tồn chủ yếu dạng bào tử, bảo quản nguyên liệu đĩa petri gói giấy bạc kín đặt tủ lạnh nhiệt độ 4-6oC số lượng VSV sống mẫu đông khô giảm nhiều tuần ổn định dần tuần (sau tuần 1.41×109 cfu/g), hàm ẩm sau đông khô đạt 2,86% (dưới 3%) sau tuần đạt 3.23% (dưới 5%) Do đạt tiêu số lượng VSV hàm ẩm sau tháng bảo quản 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sau nuôi cấy Lactobacillus sporogenes với thời gian ngày môi trường MRS 37oC, tốc độ lắc 110 vòng/phút lượng dịch sử dụng 400ml, đề tài thu kết sau: Đã tạo nguyên liệu đông khô chứa Lactobacillus sporogenes với mật độ vi sinh vật đạt 4.10×109 cfu/g Trong nguyên liệu L sporogenes tồn chủ yếu dạng bào tử Tuy nhiên bào tử không tách khỏi tế bào, nằm đầu tế bào Hầu hết chế phẩm thị trường dùng để uống, bào chế dạng viên nén Estromineral hãng Rotta | Madaus (Italia), hay dạng viên nang Biolac CT TNHH MTV Vacxin sinh phẩm Nha Trang Vì vậy, với nguyên liệu đông khô tạo sử dụng thành phẩm Đánh giá số tiêu chất lượng nguyên liệu tạo thành - Ngay sau đông khô: hàm ẩm đạt 2.86% (dưới 3%) - Sau tuần: Số lượng VSV 1.41×109 cfu/g hàm ẩm đạt 3.23% ( 5%) Kiến nghị : Do thời gian nghiên cứu có hạn nên khóa luận chưa giải hết vấn đề liên quan Vì vậy, đề xuất số hướng nghiên cứu tiếp sau: - Nghiên cứu thu bào tử tinh Lactobacillus sporogenes - Nghiên cứu ảnh hưởng số chất bảo vệ đến khả sống sót vi sinh vật trình đông khô TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Vũ Thị Minh Đức (2001), Thực tập vi sinh vật học, Nhà xuất đại học Quốc Gia Hà Nội Nguyễn Thị Hiền (2012), Khảo sát khả hình thành bào tử vi khuẩn Bacillus clausii, Khóa luận tốt nghiệp dược sỹ, Trường Đại học Dược Hà Nội Nguyễn Trọng Hiệp, Bùi Tùng Hiệp, Nguyễn Văn Vinh (2009), Bàn khả sống sót vi sinh vật sản phẩm probiotics, Tạp chí dược học, trang 4-7 Nguyễn Duy Khánh (2006), Khảo sát điều kiện nuôi cấy sinh bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis Luận văn kĩ sư chuyên ngành công nghệ sinh học, Trường đại học Nông lâm thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Bích Ngọc (2012), Khảo sát điều kiện nuôi cấy vi khuẩn Baccillus clausii, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội Lê Xuân Phương (2008), Thí nghiệm vi sinh vật học, Đại học Đà Nẵng Tô Ngọc Sắc (2014), Đánh giá khả sống sót Lactobacillus acidophilus trình tạo pellet probiotics, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Trường Đại Học Dược Hà Nội Nguyễn Thanh Quỳnh Trang (2015), Bước đầu khảo sát điều kiện nuôi cấy Lactobacillus sporogenes, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội Trần Hạnh Triết (2005), Nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng phát triển vi khuẩn Lactobacillus sporogenes, Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh Tiếng Anh 10 Abdelwahed, W., Degobert, G., Stainmesse, S., & Fessi, H (2006) "Freeze-drying of nanoparticles: formulation, process and storage considerations" Advanced drug delivery reviews, 58(15), PP.1688-1713 11 Apajalahti J H A L K Sarkilabti B R E Maki, J P Heikkinen, P H Nurminen and W E Holben (1998), "Effective recovery of bacteria DNA and percent-guanine-plus-cytosin-based analysis community structure in the gastrointestinal tract of broiler chickens", Appl Environ Microbiol, 64, pp.4084 - 4088 12 B De Giulio, P Orlando, G Barba, R Coppola, M De Rosa, A Sada, P P De Prisco, F Nazzaro (2005), "Use of alginate and cryo-protective sugars to improve the viability of lactic acid bacteria after freezing and freeze-drying", World Journal of Microbiology & Biotechnology, 21, pp 739 - 746 13 Barry J Fuller (2004), "Cryoprotectants: The essential antifreezes to protect life in the frozen state", CryoLetters, 25(6), pp.375-388 14 Buchanan, RoE, Gibbons NE (1974), "Bergey’s manual of determinative bacteriology., The Williams and Wilkins Co", Baltimore, Md, pp.489-491 15 C A Morgan, N Herman, P A White, G Vesey (2006), "Preservation of micro-organisms by drying", Journal Microbiol Methods, 66(2), pp.183193 16 Carlos Ricardo Soccol, Luciana Porto de Souza, Vandenberghe Michele Rigon Spier, Adriane Bianchi Pedroni Mederios, Caroline Tiemi Yamaguishi, Juliano De Dea Lindner, Ashok Pandey, Vanete ThomazSoccol (2010), The potential of Probiotics, Brazil and Indian 17 Dimitris Charalampopoulos Robert A Rastall (2009), "Prebiotics and Probiotics Science and Technology", pp.2658 18 Donnellan J E et al (1964), "Chemically defined, synthetic media for sporulation and for germination and growth of Bacillus subtulis", Journal of bacteriology, 87(2), pp.332-336 19 FAO/WHO (2002), "Guidelines for the evaluation of probiotics in food Joint FAO/WHO working group report on drafting guidelines for the evaluation of probiotics in food, London, Ontario, Canada" 20 Filomena Nazzaro Florinda Fratianni Raffaele Coppola, Alfonso Sada, Pierangelo Orlando (2009), "Fermentative ability of alginat-prebiotic encapsulated Lactobacillus acidophilus and survival under simulated gastrointestinal conditions", Journal of Functional Food 1, pp 319-323 21 Gong J Forster R J Yu H, Chamber J R, Sabour P M, Wheatcroft R and Chen S (2002), "Diversity and phylogenetic analysis of bacteria in the muscosa of chicken ceca and comparison with bacteria in the cecal lumen", FEMS Microbiol Lett, 208, pp.1-7 22 Hammer B W (1915), "Bacteriological studies on the coagulation of evaporated milk", Agricultural experiment station Iowa state college of agriculture and mechanic arts, Research Bulletin No 19, pp.119 – 132 23 Julie S Jurenka MT (2012), "Bacillus coagulans", Alternative Medicine Review, Vol 17, No.1, pp.76 – 81 24 L Drago E De Vecchi (2009), "Should Lactobacillus sporogenes and Bacillus coagulans Have a Future", Journal of Chemotherapy, Vol 21, No.4, pp.371 – 377 25 L Drago E De Vecchi (2006), "Lactobacillus sporogenes or Bacillus coagulans: Misidentification or mislabeling?", International Journal of Probiotic and Prebiotics Vol 1, No 1, pp.3-10 26 Lim Chi Ming, Raha Abd Rahim, Ho Yin Wan, Arbakariya B Ariff (2009), "Formulation of Protective Agents for Improvement of Lactobacillus salivarius I 24 Survival Rate Subjected to Freeze Drying for Production of Live Cells in Powderized Form", Food Bioprocess Technol, 2, pp.431-436 27 Louis Rey, Joan C May (2007), "Freeze-Drying/Lyophilization of Pharmaceutical and Biological Products", Drugs and the pharmaceutical sciences, America 28 M Patterson J A and Burkholder K (2003), "Application of prebiotics and probiotics in poultry production", J Animal Science, 82, pp.627-631 29 M.J.Pikal (2002), "Freeze-Drying", Encyclopedia of Pharmceutical Technology, pp.1299-1326 30 Majeed M Prakash L (1998), "Lactospore: The Effective Probiotic", Piscataway, NJ: NutriScience Publishers, Inc 31 Ming Lim Chi, Rahim Raha Abd, Wan Ho Yin, Ariff Arbakariya B (2009), "Formulation of protective agents for improvement of Lactobacillus salivarius I 24 survival rate subjected to freeze drying for production of live cells in powderized form", Food and bioprocess technology, 2(4), pp 431-436 32 Morgan C., Vesey G (2009), "Freeze-Drying of Microorganisms", Elsevier, Australia 33 Nations World Gastroenterology Organisation Food and Agriculture Orgarnization Of The United (2006), "Probiotics in food: Health and nutritional properties and guidelines for eveluation" 34 Nei T Souru H., Araki (1996), "Effect of residual moisture content on the survival of freeze-dried bacteria during storage under various conditions", Cryobiology, 2(5), pp.276-279 35 Netherwood T Gilbert H J Parker D S and O'Donnell A G (1999), "probiotics shown to change bacterial community structure in the avian gastrointetinal tract", Appl Environ Microbiol, 65, pp.5134 - 5138 36 R Gibson G R and Fuller (2000), "Aspect of in vitro and in vivo research approaches directed toward identifying probiotics and prebiotics for human use", J Nut, 130, pp.391-395 37 Saad N Delattre C Urdaci M., Schmitter J M., Bressollier P (2013), "An overview of the last advances in probiotic and prebiotic field", LWT - Food Science and Technology, 50(1), pp.1-16 38 Thorne Research Inc All Right Reserved (2002), "Lactobacillus sporogenes Monograph", Alternative Medicine Review, Vol 7, No 4, pp 340 – 342 39 Vivek K B (2013), "Use of encapsulated Probiotics in dairy based foods", International Journal of Food, Agriculture and Veterinary Sciences ISSN: 2277-209X, (1), pp.188-199 40 World Gastroenterology Organisation Food and Orgarnization Of The United Nations (2006), "Probiotic Agriculture in food: Health and nutritional properties and guidelines for eveluation" 41 Yoon Ho-Geun, Lee Kyung-Han, Kim Hee-Yun, Kim Hye-Kyung, Shin Dong-Hoon, Hong Bum-Shik, Cho Hong-Yon (2002), "Gene cloning and biochemical analysis of thermostable chitosanase (TCH-2) from Bacillus coagulans CK108", Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 66(5), pp.986-995 [...]... khô chứa Lactobacillus sporogenes - Khảo sát ảnh hưởng của lượng dịch nuôi cấy ban đầu đến số lượng L sporogenes trong nguyên liệu đông khô - Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến số lượng L sporogenes trong nguyên liệu đông khô 17 2.2.2 Đánh giá một số chỉ tiêu chất lƣợng nguyên liệu tạo thành trong quá trình bảo quản - Đánh giá số lượng vi sinh vật và hàm ẩm của các mẫu nguyên liệu trong thời... lƣợng L sporogenes trong nguyên liệu đông khô  Khảo sát khả năng tạo bào tử của L sporogenes Bào tử có sức đề kháng cao đối với các yếu tố vật lý và hóa học như: nhiệt độ, tia cực tím, áp suất và chất sát trùng Do vậy, nguyên liệu probiotic dạng bào tử có nhiều ưu thế hơn dạng tế bào sinh dưỡng trong quá trình bảo quản và tạo dạng bào chế.Với những ưu điểm trên tiến hành khảo sát sơ bộ khả năng tạo bào... được sử dụng trong quá trình khảo sát của đề tài Mặt khác Lactobacillus sporogenes có các đặc tính chung của cả hai chi Lactobacillus và Bacillus, theo nghiên cứu đã khảo sát về khả năng hình thành bào tử của B clausii cho kết quả ở 4 ngày (96h) lượng bào tử tạo thành nhiều nhất [2] Vậy để tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thể tích nuôi cấy ban đầu đến số lượng vi sinh vật của nguyên liệu đông khô với điều... vi khuẩn giảm khả năng tồn tại, độ nhạy cao hơn với không khí và mất khả năng sinh sản [26] Để ngăn chặn hoặc giảm thiểu các tác dụng bất lợi này, nhiều chất đã được sử dụng như tá dược bảo vệ trong quá trình đông khô [12] Các chất bảo vệ hay tá dược đông khô (Cryoprotectant – CPA) là các chất được thêm vào trong thành phần nguyên liệu đem đông khô nhằm bảo vệ tế bào trong quá trình đông khô và đảm bảo... xung quanh và bên trong tế bào tạo ra một môi trường đủ nhớt bên trong và ngoài tế bào giúp ngăn cản sự biến đổi của tế bào ở mức thấp nhất [15] Theo một nghiên cứu khác thì protein trong sữa giúp ổn định pH trong quá trình đông khô [26] 14 CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1: Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu 2.1.1 Nguyên vật liệu:  Chủng Lactobacillus sporogenes do Bộ... trường MRS lỏng L sporogenes cũng thể hiện đã hình thành bào tử hơn nữa phương pháp nuôi cấy trong môi trường lỏng và có nhiều ưu điểm hơn về thời gian thu lượng sinh khối, giữ vô trùng… 27  Khảo sát ảnh hƣởng của thể tích nuôi cấy ban đầu đến số lƣợng Lactobacillus sporogenes trong nguyên liệu đông khô Theo các nghiên cứu đã khảo sát [8] ở nhiệt độ 37oC và tốc độ lắc 110 vòng/phút L sporogenes cho lượng... triển của vi khuẩn Lactobacillus sporogenes [9] 11 1.5 Phƣơng pháp đông khô 1.5.1 Khái niệm: Đông khô (sấy thăng hoa) là phương pháp tách ẩm ra khỏi vật liệu bằng cách thăng hoa, nghĩa là ẩm được chuyển thẳng từ pha rắn sang pha hơi mà không qua trạng thái lỏng Muốn vậy trước khi đông khô phải biến ẩm trong vật liệu thành thể rắn, nghĩa là phải tiến hành làm lạnh đông vật liệu Như vậy, đông khô được... tác phải có trình độ kĩ thuật cao Tiêu hao điện năng lớn làm giá thành sản phẩm tăng cao Do những ưu nhược điểm trên nên đông khô chỉ được áp dụng khi yêu cầu sản phẩm phải có chất lượng cao [27] 1.5.4 Một số tá dƣợc thƣờng dùng trong đông khô vi sinh vật Đông khô là một trong những phương pháp phổ biến nhất để giữ được độ sống sót của vi sinh vật với nồng độ cao [12] Tuy nhiên, trong quá trình này,... chịu tác dụng của dịch vị, cũng như của acid mật vì thế vi sinh vật bị chết rất nhiều và không đến ruột được hoặc đến ruột với số lượng rất ít không đủ gây tác dụng Việc đảm bảo khả năng sống sót của vi sinh vật probiotics trong sản xuất, bảo quản, lưu hành, và tỉ lệ sống sót cao khi đến ruột không đơn giản; do vậy đã có nhiều hướng nghiên cứu khác nhau như cải tiến phương pháp đông khô tạo 5 bột, áp... quả Số lượng VSV có trong mẫu cần định lượng được tính theo công thức: A = 5 × nTB × d Trong đó: A: số lượng vi sinh vật trong 1 đơn vị khối lượng (cfu/1g), nTB: số lượng khuẩn lạc trung bình trong 3 đĩa petri (cfu), d: độ pha loãng của hỗn dịch thử 22 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Tạo nguyên liệu đông khô chứa Lactobacillus sporogenes 3.1.1 Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy