BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ KIỀU TRANG MÃ SINH VIÊN: 1101537 NGHIÊN CỨU NÂNG CAO TỈ LỆ SỐNG SÓT CỦA Lactobacillus acidophilus TRONG VI NANG ALGINAT PHỐI HỢP TINH BỘT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2016 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ KIỀU TRANG MÃ SINH VIÊN: 1101537 NGHIÊN CỨU NÂNG CAO TỈ LỆ SỐNG SÓT CỦA Lactobacillus acidophilus TRONG VI NANG ALGINAT PHỐI HỢP TINH BỘT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: Ths Kiều Thị Hồng Nơi thực hiện: BM Công nghiệp dược HÀ NỘI – 2016 LỜI CẢM ƠN Khóa luận thực hoàn thành tổ Vi sinh – môn Công nghiệp Dược Trong thời gian thực khóa luận, em nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ thầy cô, bạn bè gia đình Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô giáo thạc sĩ Kiều Thị Hồng tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện từ ngày đầu đến em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô giáo TS Đàm Thanh Xuân nhiệt tình giúp đỡ, dẫn đóng góp nhiều ý kiến quý báu giúp em thực đề tài Đồng thời, em xin cảm ơn quan tâm, giúp đỡ thầy cô giáo, anh chị kĩ thuật viên môn Công Nghiệp Dược suốt trình làm đề tài nghiên cứu thực môn Nhân dịp này, em xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu toàn thể thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội, người quan tâm, dạy dỗ thời gian em học tập trường Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân bạn bè động viên giúp đỡ em nhiều trình học tập sống Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 12 tháng năm 2016 Sinh viên Nguyễn Thị Kiều Trang MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN .2 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ PROBIOTIC 1.1.1 Khái niệm probiotic .2 1.1.2 Vai trò probiotic 1.1.3 Cơ chế tác dụng probiotic 1.1.4 Các chủng probiotic phổ biến 1.1.5 Các hệ probiotic 1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ Lactobacillus acidophilus 1.2.1 Đặc điểm hình thái .4 1.2.2 Tác dụng .5 1.3 PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG KHÔ .6 1.3.1 Khái niệm đông khô 1.3.2 Ưu nhược điểm đông khô 1.3.3 Một số tá dùng bảo vệ đông khô 1.4 PHƯƠNG PHÁP VI NANG HÓA 1.4.1 Khái niệm 1.4.2 Đặc điểm 1.4.3 Phương pháp vi nang hóa tách pha đông tụ .9 1.4.4 Tình hình nghiên cứu vi nang alginat – tinh bột 12 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 13 2.1.1 Chủng vi sinh vật 13 2.1.2 Hóa chất 13 2.1.3 Môi trường 13 2.1.4 Máy móc, dụng cụ 14 2.1.5 Các dung dịch sử dụng nghiên cứu 14 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 15 2.2.1 Nghiên cứu gia tăng số lượng sống sót vi sinh vật vi nang alginat phối hợp tinh bột chứa L acidophilus 15 2.2.2 Đánh giá độ ổn định vi nang alginat – tinh bột sau thời gian bảo quản tháng 15 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .15 2.3.1 Phương pháp tiệt khuẩn 15 2.3.2 Phương pháp nhân giống 15 2.3.3 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào 16 2.3.4 Phương pháp tạo hạt vi nang chứa Lactobacillus acidophilus .16 2.3.5 Phương pháp đông khô 17 2.3.6 Phương pháp xác định hàm ẩm 17 2.3.7 Phương pháp pha loãng liên tục để xác định số lượng VSV [1] 17 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19 3.1 Nghiên cứu gia tăng số lượng sống sót vi sinh vật vi nang alginat phối hợp tinh bột chứa L acidophilus 19 3.1.1 Khảo sát số lượng VSV nang alginat alginat – tinh bột sau ủ dung dịch MRS cao nấm men 2% 19 3.1.2 Khảo sát số lượng VSV vi nang alginat alginat – tinh bột sau đông khô .24 3.2 Đánh giá độ ổn định vi nang alginat phối hợp tinh bột sau thời gian bảo quản tháng……………………………………………………………… 28 3.2.1 So sánh số lượng vi sinh vật sống sót vi nang alginat – tinh bột mẫu 28 3.2.2 Theo dõi hàm ẩm mẫu vi nang alginat – tinh bột sau thời gian bảo quản tháng .30 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 I KẾT LUẬN .32 II KIẾN NGHỊ 32 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỨ VIẾT TẮT ATCC (American Type Culture Collection) : Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ Alg : Alginat B longum : Bifidobacterium longum B bifidum : Bifidobacterium bifidum Cps ( Cycles per second) : Vòng/giây H : Giờ LAB (Lactic acid bacterium) : Vi khuẩn lactic L acidophilus : Lactobacillus acidophilus L gasseri : Lactobacilus gaseri L rhamnosus : Lactobacillus rhamnosus MRS : Môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic MT : Môi trường TB : Tinh bột VSV : Vi sinh vật WHO (World health organization) : Tổ chức y tế giới DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 2.1 Các hóa chất dùng nghiên cứu 13 Bảng 2.2 Các máy móc dùng nghiên cứu 14 Bảng 3.1 Số lượng vi sinh vật vi nang alginat vi nang alginat – tinh bột trước sau ủ MRS (cfu/g) 21 Bảng 3.2 Số lượng vi sinh vật vi nang alginat vi nang alginat – tinh bột trước sau ủ cao nấm men 22 2% (cfu/g) Bảng 3.3 Số lượng vi sinh vật sống sót hạt Alg hạt Alg-TB điều kiện khác sau đông khô (cfu/g) 25 Bảng 3.4 Số lượng vi sinh vật sống sót vi nang alginat – tinh bột sau thời gian bảo quản (2 tháng) 4oC (cfu/g) 29 Bảng 3.5 Hàm ẩm vi nang alginat – tinh bột sau thời gian bảo quản tháng 30 DANH MỤC CÁCH HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Tên hình vẽ, đồ thị STT Hình 1.1 Hình ảnh vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Trang Hình 1.2 (a1-3) hình ảnh chụp CT cắt lớp tia X (b1-3) hình ảnh kính hiển vi điện tử quét hạt alginat đông khô 10 nồng độ tá dược độn khác Hình 3.1 (1)-(2) Hình ảnh khuẩn lạc đĩa petri Lactobacillus acidophilus vi nang alginat – tinh bột (3)-(4) Hình ảnh khuẩn lạc đĩa petri Lactobacillus 20 acidophilus vi nang alginat Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn số lượng vi sinh vật hạt Alg hạt Alg – TB sau ủ MRS cao nấm men 2% 22 (cfu/g 109) Hình 3.3 (1) hình ảnh hạt alginat – tinh bột (2) hình ảnh hạt alginat sau ủ môi trường MRS đem đông 25 khô Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn hàm ẩm mẫu trước sau thời gian bảo quản 30 23  Nhận xét bàn luận: Như kết luận số lượng vi sinh vật sau ủ môi trường MRS lớn so với trước ủ Đối với sau ủ cao nấm men 2%, số lượng vi sinh vật vi nang alginat vi nang alginat – tinh bột tăng 1,10 – 2,00 so với trước ủ Cụ thể, số lượng vi sinh vật vi nang alginat tăng 1,10 lần, số lượng vi sinh vật vi nang alginat – tinh bột tăng 2,00 lần Số lượng vi sinh vật sau ủ vi nang alginat – tinh bột 2,25.109 cfu/g số lượng vi sinh vật vi nang alginat 1,16.109 cfu/g Vẫn nhận thấy bảo vệ vi nang alginat – tinh bột tốt so với vi nang alginat Khi so sánh với môi trường MRS nhận thấy, số lượng vi sinh vật L acidophilus sau ủ môi trường cao nấm men gia tăng Ủ cao nấm men tăng 1,10 – 2,00 lần, ủ MRS tăng 3,15 – 3,45 lần Và số lượng vi sinh vật sau ủ cao nấm men 2% số lượng vi sinh vật sau ủ MRS 3,5 – 4,52 lần Đối với vi nang alginat – tinh bột số lượng vi sinh vật sau ủ cao nấm men 2,25.109, số lượng vi sinh vật sau ủ MRS 7,88.109 cfu/g Điều giải thích môi trường MRS cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng cần thiết cho sinh trưởng phát triển Lactobacillus acidophilus bao gồm nguồn Cacbohydrat, nito, kali khoáng chất cần thiết Các nhà khoa học nghiên cứu Lactobacillus acidophilus sử dụng MRS để nuôi cấy xác định số lượng VSV [42] Cao nấm men sản xuất cách tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae tự phân hủy để loại bỏ vỏ tế bào Thành phần cao nấm men bao gồm hỗn hợp nhiều acid amin, chuỗi peptid, base purin, pyrimydin, đặc biệt nhiều vitamin nhóm B, tan đương đối tốt nước [8] Cao nấm men 2% có chất dinh dưỡng để L acidophilus phát triển, nhiên chưa đủ dưỡng chất cần thiết cho sinh sản phát triển L acidophilus Vì tỉ lệ vi sinh vật sống sót ủ MRS gấp 3,5 - 4,52 lần so với ủ cao nấm men 2% 24 Số lượng vi sinh vật vi nang alginat vi nang alginat – tinh bột sau ủ môi trường dinh dưỡng đạt khoảng 109 cfu/g So với kết Bùi Thị Lệ Quyên (107 cfu/g) [6] giai đoạn ủ có gia tăng khoảng 100 lần Natri alginat polymer sử dụng rộng rãi tạo vi nang để bảo vệ probiotic khỏi điều kiện bất lợi nhiệt độ, pH, độ oxy hòa tan có tính linh hoạt, tương thích sinh học không độc hại Mặc dù vậy, gel alginat hình thành chưa thật ổn định Để vượt qua trở ngại cải thiện độ ổn định vi sinh vật vi nang, người ta sử dụng tinh bột tá dược phối hợp với alginat để bảo vệ VSV [25] Nhưng cấu trúc gel chứa lượng VSV định tạo vi nang nên để tăng tỉ lệ sống sót vi sinh vật vi nang cần cung cấp thêm chất dinh dưỡng cho VSV Việc ủ môi trường dinh dưỡng giúp cho VSV sinh sản thêm tăng số lượng vi sinh vật sống sót Từ nhận thấy số lượng VSV có gia tăng sau ủ môi trường dinh dưỡng 3.1.2 Khảo sát số lượng VSV vi nang alginat alginat – tinh bột sau đông khô Lactobacillus acidophilus có khả bảo vệ sức khỏe người việc cải thiện tiêu hóa lactose, ngăn ngừa tác động tiêu chảy, kích thích phản ứng miễn dịch có khả ngăn ngừa ung thư [40] Để đạt lợi ích đó, số lượng tế bào sống phải đủ lớn chúng tác động tế bào đích [33] Tuy nhiên, tế bào sống giảm đáng kể trình đông khô bảo quản lạnh, lượng oxy hòa tan hydrogen peroxide [42] Theo kết mục 3.1.1 số lượng vi sinh vật vi nang alginat vi nang alginat – tinh bột sau ủ môi trường dinh dưỡng đạt 109 cfu/g Tuy nhiên dạng nguyên liệu probiotic tồn thị trường chủ yếu bột đông khô phải tiến hành đông khô xác định số lượng vi sinh vật sống sót sau đông khô  Mục đích: Khảo sát số lượng VSV sống sót vi nang alginat alginat – tinh bột ủ môi trường dinh dưỡng sau đông khô 25  Tiến hành: Hạt alginat hạt alginat – tinh bột sau ủ môi trường dinh dưỡng đông khô 24 h (phương pháp nêu mục 2.3.5) Song song tiến hành với mẫu hạt Alg Alg-TB chưa ủ Sau 24 h đông khô, tiến hành xác định số lượng vi sinh vật mẫu phương pháp pha loãng liên tục (phương pháp nêu mục 2.3.7)  Kết quả: Bảng 3.3 Số lượng vi sinh vật sống sót hạt Alg hạt Alg-TB điều kiện khác sau đông khô (cfu/g) Vi Điều kiện Môi trường ủ nang Alginat Vi nang AlginatTinh bột Tỉ lệ tăng so với vi nang Alginat (lần) MRS (a1) 3,00.109 5,05.109 1,68 Cao nấm men 2% (a2) 1,01.109 3,09.109 3,06 2,97 1,63 _ 5,5.105 1,50.106 2,73 Tỉ lệ giảm so với ủ MRS (a1/a2) Không ủ (1) (2) Hình 3.3 (1) hình ảnh hạt alginat – tinh bột (2) hình ảnh hạt alginat sau ủ môi trường MRS đem đông khô 26  Nhận xét bàn luận Sau đông khô, số lượng vi sinh vật vi nang alginat vi nang alginattinh bột ủ môi trường giữ khoảng 109 cfu/g Số lượng vi sinh vật vi nang alginat vi nang alginat – tinh bột ủ MRS sau đông khô đạt 3,00.109 5,05.109 cfu/g Số lượng vi sinh vật vi nang alginat vi nang alginat – tinh bột ủ cao nấm men sau đông khô đạt 1,01.109 3,09.109 cfu/g Có thể thấy, số lượng vi sinh vật sống sót vi nang alginat – tinh bột vi nang alginat ủ MRS sau đông khô lớn so với ủ cao nấm men 1,63 – 2,97 lần (phù hợp với kết trước đông khô) Tuy nhiên với mẫu VSV sau tạo hạt không ủ môi trường mà đem đông khô số lượng vi sinh vật lại đáng kể so với mẫu vi nang có ủ môi trường Số lượng vi sinh vật hạt alginat đạt 5,5.105 cfu/g, số lượng vi sinh vật hạt alginat – tinh bột đạt 1,50.106 cfu/g Như số lượng vi sinh vật sau ủ môi trường dinh dưỡng lớn so với mẫu không ủ khoảng 2000 lần Đông khô phương pháp loại nước sử dụng rộng rãi để bảo quản tế bào Tuy nhiên, có số báo cáo liên quan đến việc tác dụng phụ đông khô cấu trúc chức tế bào, cuối dẫn đến giảm số lượng tế bào sống sót [17] Một số tác động trình đông khô biến tính protein tổn thương tế bào, màng tế bào Quá trình vi nang hóa tạo lớp màng bao bảo vệ tế bào VSV khỏi điều kiện bất lợi môi trường trình đông khô Tuy nhiên, Champagne cộng (1992) phát sử dụng mạng lưới hydrogel Ca-alginat không đủ để bảo vệ tế bào đóng gói [13] Kết thử nghiệm rằng, số lượng vi sinh vật sống sót hạt alginat – tinh bột lớn hạt alginat Và sau ủ môi trường dinh dưỡng nhận thấy số lượng vi sinh vật gia tăng Điều giải thích vi sinh vật tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng thích hợp, có sinh trưởng, 27 phát triển, khỏe nên tăng sức chống chịu với điều kiện bất lợi từ trình đông khô Xét riêng đến vi nang alginat vi nang alginat – tinh bột, sau đông khô, tỉ lệ sống sót vi sinh vật hạt alginat hạt alginat – tinh bột có thay đổi Số lượng vi sinh vật sống sót hạt alginat – tinh bột lớn so với hạt alginat khoảng 1,68 lần ủ MRS 3,06 lần ủ cao nấm men 2% Kết tương đối phù hợp với nghiên cứu trước Nguyễn Mai Hương (2014) [4], tỉ lệ vi sinh vật sống sót vi nang alginat 2%-tinh bột 10% gấp 2,8 lần số vi sinh vật sống sót vi nang alginat 2% Đã có nhiều nghiên cứu việc sử dụng alginat phối hợp tinh bột tạo vi nang bảo vệ VSV sau đông khô Do probiotic nhạy cảm với trình đông khô, Kets, Teunissen & De Bont năm 1996 tìm cách cải thiện khả chịu lạnh tế bào VSV sử dụng chất bảo vệ [22] Sultana (2000) sử dụng tinh bột chất bảo vệ nồng độ khác nhau, vi hạt có chứa 2% natri alginat 2% tinh bột, từ nhận thấy khả sống sót lớn L casei sau đông khô [25] Tương tự vậy, Albertini et al.(2010) sử dụng 10% tinh bột thấy tỉ lệ sống sót cao L acidophilus vi hạt [25] Vì việc sử dụng thêm tinh bột làm tá dược bảo vệ tế bào đông khô cần thiết, qua thử nghiệm thấy rõ tăng tỉ lệ sống sót L acidophilus vi nang alginat – tinh bột Khi phối hợp tinh bột tá dược độn rắn, thể chất nguyên liệu dạng hạt cải thiện do: hạt vi nang Ca-alginat có cấu trúc bên dạng đường viền mạng lưới hydrogel tạo thành lớp đồng tâm dày đặc bề mặt với khoảng trống mạng lưới [35] Khi xảy trình gel hóa, cấu trúc đường viền kết hợp với liên kết ngang có hướng tỏa tròn từ bề mặt lõi bên hạt tạo thành hạt vi nang có dạng hình cầu Sự thăng hoa nước thể đá từ mạng lưới hydrogel alginat trình đông khô để lại khoảng trống cấu trúc hạt bề mặt hạt vi nang [43] Kết tạo số đặc tính không mong muốn, chẳng hạn hình dạng méo mó, bề mặt hạt thô, kích thước không đều, độ 28 bền học độ xốp cao Khi thêm tinh bột, cấu trúc bên hạt xốp hạt tinh bột chiếm khoảng không gian kẽ lớp đồng tâm Chúng giúp hỗ trợ cấu trúc mạng gel tàm tăng độ bền học hạt, làm tăng khả bảo vệ hạt với L acidophilus  Kết luận sơ : Sau ủ MRS số lượng vi sinh vật vi nang alginat tăng 4,52 lần, số lượng vi sinh vật vi nang alginat – tinh bột tăng 3,50 so với sau ủ cao nấm men 2% Sau đông khô số lượng vi sinh vật ủ MRS lớn số lượng vi sinh vật ủ cao nấm men 2% từ 2,97 vi nang alginat 1,63 lần vi nang alginat – tinh bột Tuy số lượng vi sinh vật sống sót sau đông khô mẫu vi nang ủ môi trường dinh dưỡng đạt 109 cfu/g, lớn khoảng 2000 lần so với mẫu không ủ Đối với vi nang alginat vi nang alginat – tinh bột, nhận thấy khả bảo vệ tinh bột với L acidophilus Do thí nghiệm chọn vi nang alginat – tinh bột để khảo sát đánh giá 3.2 Đánh giá độ ổn định vi nang alginat phối hợp tinh bột sau thời gian bảo quản tháng Sau thời gian bảo quản, tác động môi trường VSV mẫu vi nang alginat – tinh bột giảm độ ổn định Vì thí nghiệm tiến hành với mục đích khảo sát độ ổn định chế phẩm sau thời gian bảo quản 3.2.1 So sánh số lượng vi sinh vật sống sót vi nang alginat – tinh bột mẫu  Mục tiêu: Đánh giá khả bảo vệ Lactobacillus acidophilus vi nang alginat – tinh bột điều kiện ủ khác sau thời gian bảo quản tháng  Tiến hành: Vi nang alginat – tinh bột sau đông khô bảo quản lọ thủy tinh có nắp đậy kín, hút ẩm, đặt tủ lạnh điều kiện nhiệt độ 4oC – 6oC 29 Sau thời gian tháng, mẫu vi nang alginat – tinh bột ủ MRS, cao nấm men không ủ tiến hành xác định số lượng vi sinh vật theo phương pháp pha loãng liên tục (phương pháp nêu mục 2.3.7)  Kết Bảng 3.4 Số lượng vi sinh vật sống sót vi nang alginat – tinh bột sau thời gian bảo quản (2 tháng) 4oC (cfu/g) Cao nấm men Thời điểm MRS Ban đầu 5,05.109 3,09.109 1,50.106 Sau tháng 5,52.108 8,63.107 2,2.105 9,14 35,8 6,81 Tỉ lệ giảm so với ban đầu (lần) 2% Không ủ  Nhận xét bàn luận Sau thời gian bảo quản tháng lọ thủy tinh có nắp đậy kín, hút ẩm, số lượng vi sinh vật hạt vi nang alginat – tinh bột giảm so với ban đầu Cụ thể sau tháng, số lượng vi sinh vật hạt alginat – tinh bột ủ MRS giảm 9,14 lần không ủ môi trường giảm 6,81 lần số lượng vi sinh vật ủ cao nấm men 2% giảm 35,8 lần Probiotic nhạy cảm với trình đông khô suy thoái trạng thái sinh lí tế bào Martin (2013) nghiên cứu độ ổn định vi hạt đông khô điều kiện (điều kiện nhiệt độ phòng, lạnh) cho thấy, độ ẩm ảnh hưởng đến tồn vi sinh vật vi hạt Vi sinh vật sống sót tốt điều kiện nhiệt độ 4oC -20oC [26] Do hút ẩm chế phẩm số lượng vi sinh vật sau thời gian bảo quản chưa giữ mức ban đầu Tuy vậy, mẫu vi sinh vật vi nang alginat – tinh bột 30 sau ủ MRS sau thời gian bảo quản tháng đạt khoảng 10 cfu/g Cần theo dõi thời gian dài 3.2.2 Theo dõi hàm ẩm mẫu vi nang alginat – tinh bột sau thời gian bảo quản tháng  Mục tiêu: Đánh giá hút ẩm chế phẩm sau thời gian bảo quản  Tiến hành: Đo hàm ẩm mẫu thiết bị đo hàm ẩm Ohaus (phương pháp nêu mục 2.3.6) Mẫu sau đông khô mẫu sau bảo quản tháng  Kết quả: Bảng 3.5 Hàm ẩm vi nang alginat – tinh bột sau thời gian bảo quản tháng Hàm ẩm theo thời gian Hàm ẩm sau đông khô Hàm ẩm sau tháng Hầm ẩm tăng sau thời Hàm ẩm vi nang Alg-TB gian bảo quản MRS Cao nấm men 2% Không ủ 1.92% 2,05% 1,87% 2,68% 2,89% 2,74% 0,76% 0,84% 0,87% 3.5 2.5 2.89 2.68 2.05 1.92 2.74 1.87 1.5 0.5 MRS Cao nấm men 2% Không ủ Điều kiện môi trường Hàm ẩm ban đầu hàm ẩm sau tháng Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn hàm ẩm mẫu trước sau thời gian bảo quản 31  Nhận xét bàn luận: Từ kết thu ta thấy, hàm ẩm mẫu sau thời gian bảo quản tháng tăng so với trước bảo quản khoảng 0,76% – 0,84% Cụ thể mẫu vi nang alginattinh bột ủ MRS có hàm ẩm tăng so với ban đầu 0,76% Mẫu vi nang alginattinh bột ủ cao nấm men có hàm ẩm tăng so với ban đầu 0,84% mẫu không ủ có hàm ẩm tăng 0,87% Kết hoàn toàn phù hợp với kết Nguyễn Mai Hương (2014) [4], hàm ẩm mẫu vi nang alginat – tinh bột sau thời gian bảo quản tháng tăng 0,83% so với ban đầu Giữa mẫu vi nang ủ MRS, cao nấm men 2% không ủ hàm ẩm khác biệt lớn Cho thấy hút ẩm không bị ảnh hưởng điều kiện ủ môi trường dinh dưỡng trước đông khô  Kết luận sơ bộ: Số lượng VSV mẫu vi nang alginat – tinh bột ủ MRS, đông khô sau thời gian bảo quản tháng giữ số lượng 108 cfu/g Cao so với sau ủ cao nấm men 2% 14 lần so với không ủ môi trường 2509 lần Hàm ẩm mẫu không khác nhiều điều kiện ủ môi trường dinh dưỡng trước đông khô 32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I KẾT LUẬN Đề tài hoàn thành mục tiêu đề thu số kết sau: Trước đông khô, với mẫu ủ môi trường MRS cao nấm men 2% số lượng vi sinh vật vi nang alginat vi nang alginat – tinh bột đạt 109 cfu/g Tuy nhiên mẫu ủ MRS có số lượng vi sinh vật lớn mẫu ủ cao nấm men 2% từ 3,50 – 4,52 lần Sau đông khô, mẫu không ủ môi trường số lượng vi sinh vật giảm nhiều xuống khoảng 106 cfu/g Sau ủ môi trường MRS cao nấm men 2% số lượng vi sinh vật sống sót đạt khoảng 109 cfu/g Tuy nhiên nhận thấy số lượng vi sinh vật sống sót nhiều ủ MRS Đối với vi nang alginat vi nang alginat – tinh bột, kết phù hợp với nghiên cứu trước [4] [6] bảo vệ tinh bột L acidophilus Sau thời gian bảo quản tháng số lượng vi sinh vật sống sót đạt 108 cfu/g mẫu vi nang alginat – tinh bột ủ MRS So với ủ cao nấm men 2% ủ MRS tỉ lệ sống sót VSV cao hơn.Hàm ẩm mẫu giảm sau thời gian bảo quản, nhiên khác biệt điều kiện ủ môi trường dinh dưỡng trước đông khô II KIẾN NGHỊ Tiếp tục theo dõi độ ổn định vi nang alginat – tinh bột sau thời gian bảo quản tiêu độ ẩm số lượng VSV Đánh giá khả bảo vệ L acidophilus vi nang alginat – tinh bột sau ủ cao nấm men nồng độ khác TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ Y Tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất Y học Phạm Xuân Chung (2004), Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm đông khô Artesunat, Khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ, Trường Đại Học Dược Hà Nội, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng (2000), Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo dục, Việt Nam, tr 221-228 Nguyễn Mai Hương (2014), Nghiên cứu sử dụng tinh bột làm chất bảo vệ trình tạo nguyên liệu probiotic chứa Lactobacillus acidophilus, Khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ, Trường Đại Học Dược Hà Nội, Hà Nội Lê Quan Nhiệm, Huỳnh Văn Hóa (2007), Bào chế sinh dược học, NXB Giáo dục, Hà Nội Bùi Thị Lệ Quyên (2015), Nghiên cứu sử dụng alginat phối hợp tinh bột làm chất bảo vệ trình tạo vi nang chứa Lactobacillus acidophilus, Khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ, Trường Đại Học Dược Hà Nội, Hà Nội Trần Văn Thái (2015), Nghiên cứu sử dụng tinh bột Alginat làm chất bảo vệ trình tạo nguyên liệu Lactobacillus acidophilus đông khô, Luận văn tốt nghiệp thạc sỹ dược học, Trường Đại Học Dược Hà Nội, Hà Nội Nguyễn Thị Thúy (2011), Nghiên cứu triển khai mô hình gây tăng acid uric thực nghiệm acid oxonic cao nấm men, Khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ, Trường Đại Học Dược Hà Nội, Hà Nội Lê Ngọc Tú, La Văn Chừ, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thăng, Nguyễn Thị Thịnh,Bùi Đức Hợi, Lưu Duẩn, Lê Doãn Biên (2000), Hoá sinh công nghiệp, NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội Tiếng Anh 10 Abadias M., Benabarre A., Teixido N., Usall J., Vinas I (2001), “Effect of freeze drying and protectants on viability of the biocontrol yeast Candida sake”, International Journal of Food Microbiology, 65, pp 173-182 11 Barry J.Fuller (2004), “Cryoprotectants: The essential antifreezes to protect life in the frozen state”, CryoLetters, 25(6), pp 375-388 12 B.De Giulio., P.Orlando., G.Barba., R.Coppola., M.De Rosa., A.Sada, P.P.De Prisco., F.Nazzaro (2005), “Use of alginate and cryo-protective sugars to improve the viability of lactic acid bacteria after freezing and freeze-drying”, World Journal of Microbiology & Biotechnology, 21, pp.739-746 13 Champagne C.P., Morin N., Couture R., Gagnon C., Jelen P., Lacroix C (1992), “The potential of immobilized cell technology to produce freeze-dried, phageprotected cultures of Lactococcus lactics”, Food Research International, 25(6), pp.419-427 14 Diamante Maresca., Annachiara De Prisco., Antonietta La Storia., Teresa Cirillo., Francesco Esposito., Gianluigi Mauriello (2016), “Microencapsulation of nisin in alginate beads by vibrating technology: Prelimin ary investigation”, LWT - Food Science and Technology, pp.436-443 15 Eng-Seng Chan., Sze-Ling Wong., Peh-Phong Lee., Jau-Shya Lee., Tey Beng Ti., Zhibing Zhang., Denis Poncelet., Pogaku Ravindra., Soon-Hock Phan., ZhiHui Yim (2011), “Effects of starch filler on the physical properties of lyophilized calcium–alginate beads and the viability of encapsulated cells”, Carbohydrate Polymers , 83, pp 225-232 16 Fatih Ozogul., Imen Hamed (2011), “Lactic Acid Bacteria | Lactobacillus spp.: Lactobacillus acidophilus”, Encyclopedia of Dairy Sciences (Second Edition), pp 91-95 17 Guergoletto Karla Bigetti (2012), “Dried Probiotics for Use in Functional Food Applications”, Food Industrial Processes – Methods and Equipment, pp.227-247 18 Jack Preiss (2009), “Chapter 4- Biochemistry and Molecular Biology of Starch Biosynthesis”, Starch (Third Edition) - Chemistry and Technology, A volume in Food Science and Technology 2009, pp.83-148 19 James Swarbrick (1972), Freeze drying lyophilization of pharmaceutical and biological products, Marcel Dekker Inc., The United States of America 20 Kaila Kailasapathy and James Chin (2000), “Survival and therapeutic potential of probiotic organisms with reference to Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium spp.”, Immunology and Cell Biology, 78(1), pp 70-88 21 Karla Bigetti Guergoletto (2000), “Dried Probiotics for Use in Functional Food Applications”, Food Industrial Processes – Methods and Equipment 22 Kets, E P W., Teunissen, P J M., & De Bont, J A M (1996), “Effect of compatible solutes on survival of lactic acid bacteria subjected to drying”, Applied and Environmental Microbiology, 62, p.259-291 23 Lim Chi Ming., Raha Abd Rahim., Ho Yin Wan., Arbakariya B Ariff (2009), “ Formulation of Protective Agents for Improvement of Lactobacillus salivarius I 24 Survial Rate Subjected to Freeze Drying for Production of Live Cells in Powderized Form”, Food Bioprocess Technol, 2, pp.431-436 24 Louis Rey., Joan C.May (2007), “FreezeDrying/Lyophilization of Pharmaceutical and Biological Products”, Drugs and the pharmaceutical sciences, America 25 Mariana de Araújo Etcheparea., Greice Carine Raddatza., Alexandre José Cichoskia., Érico Marlon Moraes Floresb., Juliano Smanioto Barina., Leila Queiroz Zepkaa., Eduardo Jacob-Lopesa., Carlos Raimundo Ferreira Grossoc., Cristiano Ragagnin de Menezesa (2016), “Effect of resistant starch (Hi-maize) on the survival of Lactobacillus acidophilus microencapsulated with sodium alginate”, Journal of Functional Foods, pp 321–329 26 Martin M J., Lara-Villoslada F., Ruiz M A., Morales M E (2013), “Effect of unmodified starch on viability of alginate-encapsulated Lactobacillus fermentum CECT5716”, Food Science and Technology, 53, pp 480-486 27 Mcfarlane G., Cummings J.H (1999), “Probiotics and prebiotics: can regulating the activities of intestinal bacteria benefit health?”, British Medical Journal, 318, pp.999-1003 28 Morgan C., Vesey G (2009), “Freeze-Drying of Microorganisims”, Journal Microbiol Methods, 66(2), pp 183-93 29 Murtaza G (2011), “Alginat microparticles for biodelivery: a review”, African Journal of Pharmacy and Pharmacology, 5(25), pp 2726-2737 30 Oelschlaeger T (2010), “Mechanisms of probiotic actions – A review”, International journal of Medical Microbiology, 300 (1), pp.57-62 31 Oriented Pharma Co., Ltd (2008), “Application Documents for DUOLACTM”, Oriented Pharma Co 32 Ouwehand C., Kirjavainen P., Shortt C., Salminen S (1999), “Probiotic: Mechanisms and established effect”, International Dairy Journal, 9, pp.43-52 33 Pescuma, M., Heesbert, E.M., Mozzi,F., &de Valdez., G.F (2010), “Functional fermented whey-based beverage using lactic acid bacteria”, International Journal of Food Microbiology, 141, p.73-81 34 Pramod Kumar Singh., Parneet Kaur Deol., Indu Pal Kaur (2011), “Entrapment of Lactobacillus acidophilus into alginate beads for the effective treatment of cold restraint stress induced gastric ulcer”, Food Funct, 3, pp.83-90 35 Rassis D.K., Saguy I.S., Nussinovitch A (2002), “Collapse, shrinkage and structural changes in dried alginate gels containing fillers”, Food Hydrocolloids, 16, pp.139-151 36 Rathore Sweta., Desai Parind Mahendrakumar., Liew Celine Valeria., Chan Lai Wah., Heng Paul Wan Sia (2013), “Microencapsulation of microbial cells”, Journal of Food Engineering, 116(2), pp 369-381 37 Rosemary J Young., MS., RN., Shari Huffman., MN., RN., CPNP., J Pediatr Health Care (2003), “Proposed Mechanisms of Action”, Probiotic Use in Childrent, 17(6) 38 R.R.Mokartam., S.A.Mortazavi., M.B.Habibi Najafi., F.Shahidi (2009), “The influence of multi stage alginate coating on survivability of potential probiotic bacteria in simulated gastric and intestinal juice”, Food Research International, 42, pp.1040-1045 39 Sanders M E (2000), "Considerations for use of probiotic bacteria to modulate human health", The Journal of Nutrition, 130(2), pp 384–390 40 Sanders M.E., & Klaenhammer, T.R (2001), Invited review: “the scientific basic of Lactobacillus acidophilus NCFM functionality as a probiotic”, Journal of Dairy Science, 84, pp.319-331 41 Schlundt., Jorgen (2012), “Report of a Joint FAO/WHO: Expert Consultation on Evaluation of Heath and Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria”, Journal of Nutrition, 132(4), pp.25113 42 Sha Li., Chengjie Ma., Guangyu Gong., Zhenmin Liu , Chao Chang , Zhiping Xu, “The impact of oni on juice on milk fermentation by Lactobacillus acidophilus”, LWT - Food Science and Technology, pp.543-548 43 Tal Y., Van Rijn J., Nussinovitch A (1997), “Improvement of structural and mechanical properties of denitrifying alginate beads by freeze-drying”, Biotechnology Progress, 13, pp.788-793 44 Vidhyalakshmi R., Bhakyaraj R., Subhasree R S (2009), “Encapsulation “The Future of Probiotics””, Advances in Biological Research, 3(3-4), pp 96-103 45 Vrese M., Stegelmann A., Richter B., Fenseau S., Love C., Schrezenneir J (2000), “Probiotics compensation for lactose insufficiency”, Journal of Clinical Nutrition, 73(2), pp 9-421 [...]... vi nang Tinh bột phối hợp Alginat giúp bảo vệ vi sinh vật sau đông khô và tăng tỉ lệ sống sót của vi sinh vật cũng là một hướng nghiên cứu đáng chú ý Chính vì vậy, đề tài Nghiên cứu nâng cao tỉ lệ sống sót của Lactobacillus acidophilus trong vi nang alginat phối hợp tinh bột được thực hiện với các mục tiêu cụ thể sau: 1 Nghiên cứu gia tăng số lượng sống sót của vi sinh vật trong vi nang alginat phối. .. NGHIÊN CỨU 2.2.1 Nghiên cứu gia tăng số lượng sống sót của vi sinh vật trong vi nang alginat phối hợp tinh bột chứa L acidophilus - Khảo sát số lượng VSV trong vi nang alginat và alginat – tinh bột sau khi ủ trong dung dịch MRS và cao nấm men trước khi đông khô - Khảo sát số lượng VSV trong vi nang alginat và alginat – tinh bột sau khi đông khô 2.2.2 Đánh giá độ ổn định của vi nang alginat – tinh bột. .. phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Mai Hương (2014) [4] về khả năng bảo vệ của tinh bột đối với L acidophilus Tiếp tục theo dõi số lượng vi sinh vật trong vi nang alginat và vi nang alginat – tinh bột sau khi ủ trong cao nấm men 2% 22 Bảng 3.2 Số lượng vi sinh vật trong vi nang alginat và vi nang alginat – tinh bột trước và sau khi ủ trong cao nấm men 2% (cfu/g) Alginat – tinh bột Alginat Môi trường Cao. .. hiện trong bảng 3.1 và 3.2  Kết quả Hình 3.1 (1)-(2) Hình ảnh khuẩn lạc trên đĩa petri của Lactobacillus acidophilus trong vi nang alginat – tinh bột (3)-(4) Hình ảnh khuẩn lạc trên đĩa petri của Lactobacillus acidophilus trong vi nang alginat 21 Bảng 3.1 Số lượng vi sinh vật trong vi nang alginat và vi nang alginat – tinh bột trước và sau khi ủ trong MRS (cfu/g) Vi nang Alginat - Tinh bột Vi nang Alginat. .. sau khi ủ trong cao nấm men 2%, số lượng vi sinh vật trong vi nang alginat và vi nang alginat – tinh bột tăng 1,10 – 2,00 so với trước khi ủ Cụ thể, số lượng vi sinh vật trong vi nang alginat tăng 1,10 lần, số lượng vi sinh vật trong vi nang alginat – tinh bột tăng 2,00 lần Số lượng vi sinh vật sau khi ủ trong vi nang alginat – tinh bột là 2,25.109 cfu/g còn số lượng vi sinh vật trong vi nang alginat. .. luận Sau khi đông khô, số lượng vi sinh vật trong vi nang alginat và vi nang alginattinh bột đã ủ trong môi trường vẫn giữ ở khoảng 109 cfu/g Số lượng vi sinh vật trong vi nang alginat và vi nang alginat – tinh bột đã ủ trong MRS sau đông khô đạt lần lượt là 3,00.109 và 5,05.109 cfu/g Số lượng vi sinh vật trong vi nang alginat và vi nang alginat – tinh bột đã ủ trong cao nấm men sau đông khô đạt lần... ủ Số lượng vi sinh vật trong vi nang alginat – tinh bột tăng 3,15 lần so với trước khi ủ Tuy số lượng vi sinh vật trong vi nang alginat – tinh bột tăng ít hơn so với vi nang alginat nhưng vi nang alginat – tinh bột vẫn giữ được nhiều vi sinh vật hơn Số lượng vi sinh vật trong vi nang alginat – tinh bột sau khi ủ là 7,88.109 cfu/g còn số lượng vi sinh vật trong vi nang alginat sau khi ủ là 5,25.109 cfu/g... Nghiên cứu gia tăng số lượng sống sót của vi sinh vật trong vi nang alginat phối hợp tinh bột chứa L acidophilus Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh khả năng bảo vệ vi sinh vật của tinh bột khi phối hợp với alginat tạo vi nang [4] [6] [7] Natri alginat là một polymer được sử dụng rộng rãi làm nguyên liệu bao gói tạo vi nang vì nó có tính linh hoạt, tương thích sinh học và không độc hại, giúp bảo vệ vi. .. tạo vi nang nên để tăng tỉ lệ sống sót của vi sinh vật trong vi nang cần cung cấp thêm chất dinh dưỡng cho VSV Vi c ủ trong môi trường dinh dưỡng giúp cho các VSV sinh sản thêm do đó tăng số lượng vi sinh vật sống sót Từ đó nhận thấy số lượng VSV có gia tăng sau khi ủ trong môi trường dinh dưỡng 3.1.2 Khảo sát số lượng VSV trong vi nang alginat và alginat – tinh bột sau khi đông khô Lactobacillus acidophilus. .. lượng vi sinh vật trong các vi nang alginat và vi nang alginat – tinh bột sau khi ủ trong môi trường dinh dưỡng đều đạt 109 cfu/g Tuy nhiên dạng nguyên liệu probiotic tồn tại trên thị trường chủ yếu là bột đông khô vì thế phải tiến hành đông khô và xác định số lượng vi sinh vật sống sót sau đông khô  Mục đích: Khảo sát số lượng VSV sống sót trong các vi nang alginat và alginat – tinh bột đã ủ trong