BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ LINH ANH NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH TRONG NƯỚC THẢI NHÀ MÁY DƯỢC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ LINH ANH NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH TRONG NƯỚC THẢI NHÀ MÁY DƯỢC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 60720410 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh HÀ NỘI 2016 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tôi xin trân trọng cảm ơn NCS.Lê Xuân Kỳ tận tình hướng dẫn tạo điều kiện cho tơi suốt q trình nghiên cứu đề tài Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô giáo, anh chị kỹ thuật viên môn Hóa phân tích-Độc chất nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian làm thực nghiệm môn Tôi xin gửi lời cảm ơn thầy cô Ban Giám hiệu, phịng Đào tạo sau đại học tồn thể thầy cô môn trường Đại học Dược Hà Nội tận tình dạy dỗ giúp đỡ suốt thời gian học tập trường Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè động viên, quan tâm tạo điều kiện giúp đỡ hoàn thành luận văn Hà Nội, tháng năm 2016 Trần Thị Linh Anh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I TỔNG QUAN .3 1.1 Tổng quan đối tượng nghiên cứu .3 1.1.1 Tổng quan Clarithromycin Azithromycin 1.1.2 Tổng quan Sulfamethoxazol Trimethoprim .5 1.1.3 Một số nghiên cứu xác định dư lượng kháng sinh Clarithromycin, Azithromycin, Sulfamethoxazol Trimethoprim nước thải .7 1.2 Tổng quan phương pháp dùng nghiên cứu 11 1.2.1 Sắc ký lỏng hiệu cao 11 1.2.2 Phương pháp chiết pha rắn .15 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Đối tượng phương tiện nghiên cứu 18 2.1.1 Hoá chất - chất chuẩn .18 2.1.2 Máy móc - trang thiết bị 18 2.1.3 Đối tượng nghiên cứu .19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Thu thập xử lý mẫu sơ 19 2.2.2 Xử lý mẫu 19 2.2.3 Xây dựng phương pháp định lượng LC-MS/MS 20 2.2.4 Thẩm định quy trình phân tích xây dựng 20 2.2.5 Lấy mẫu, phân tích số kháng sinh thực tế .21 2.3 Phương pháp xử lý số liệu 21 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 22 3.1 Xây dựng phương pháp phân tích 22 3.1.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện khối phổ 22 3.1.2 Khảo sát lựa chọn điều kiện xử lý mẫu .33 3.2 Thẩm định quy trình phân tích 38 3.2.1 Độ phù hợp hệ thống 38 3.2.2 Độ đặc hiệu .39 3.2.3 Giới hạn phát giới hạn định lượng .40 3.2.4 Độ tuyến tính khoảng xác định 41 3.2.5 Độ độ lặp lại .43 3.3 Ứng dụng quy trình phân tích .45 CHƯƠNG BÀN LUẬN .49 4.1 Về xử lý mẫu 49 4.2 Về phương pháp phân tích 50 4.3 Về thẩm định phương pháp 51 4.4 Về ứng dụng phương pháp 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .55 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AOAC : Hiệp hội nhà hóa phân tích thống (Association of Official Analytical Chemists) AZI : Azithromycin AR : Thuốc thử phân tích (Analytical reagent) CLA : Clarithromycin HPLC : Sắc ký lỏng hiệu cao (High performance liquid chromatography) IS : Chuẩn nội (Internal Standard) LC – MS : Sắc ký lỏng khối phổ (Liquid chromatography – mass spectrometry) LOD : Giới hạn phát (Limit of Detection) LOQ : Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation) m/z : khối lượng/ điện tích MeOH : methanol MeCN : acetonitril PA : Tinh khiết phân tích (Pure analysis) RSD : Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation) SMX : Sulfamethoxazol SPE : Chiết pha rắn (Solid phase extraction) TB : Trung bình TCCS : Tiêu chuẩn sở TMP : Trimethoprim DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Cấu trúc vòng lacton phân nhóm Macrolid Bảng 1.2 Một số nghiên cứu xác định hàm lượng kháng sinh nghiên cứu nước thải giới Bảng 2.3 Các nguyên vật liệu dùng nghiên cứu 18 Bảng 3.4 Các thông số hoạt động nguồn ion hóa 24 Bảng 3.5 Các điều kiện khối phổ để phân tích kháng sinh nghiên cứu 24 Bảng 3.6 Điều kiện khảo sát pha động 27 Bảng 3.7 Hiệu suất chiết kháng sinh rửa giải với thể tích khác (n=2) .34 Bảng 3.8 Hiệu suất chiết kháng sinh thể tích mẫu chiết 100ml 200ml .35 Bảng 3.9 Quy trình phân tích kháng sinh nghiên cứu .36 Bảng 3.10 Kết đánh giá độ phù hợp hệ thống LC-MS/MS 38 Bảng 3.11 LOD LOQ kháng sinh (Tính mẫu ban đầu) 41 Bảng 3.12 Kết xây dựng đường chuẩn kháng sinh nghiên cứu 42 Bảng 3.13 Kết khảo sát độ độ lặp lại phương pháp 44 Bảng 3.14 Kết nồng độ kháng sinh mẫu thử (nồng độ ng/ml) 46 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ hệ thống LC-MS/MS 12 Hình 1.2 Sơ đồ tạo ion dương nguồn ESI .13 Hình 3.3 Phổ đồ kháng sinh IS 23 Hình 3.4 Sắc ký đồ phân tích kháng sinh khảo sát cột sắc ký 26 Hình 3.5 Sắc ký đồ phân tích kháng sinh khảo sát thành phần pha động 28 Hình 3.6 Sắc ký đồ phân tích kháng sinh khảo sát tốc độ dòng pha động 30 Hình 3.7 Sắc ký đồ phân tích kháng sinh khảo sát thể tích tiêm mẫu 32 Hình 3.8 Biểu đồ hiệu suất chiết kháng sinh khảo sát thể tích dung mơi rửa giải .34 Hình 3.9 Sắc ký đồ phân tích kháng sinh khảo sát độ đặc hiệu phương pháp 40 Hình 3.10 Sắc ký đồ kháng sinh phân tích nồng độ LOQ .41 Hình 3.11 Sắc ký đồ kháng sinh số mẫu nước thải 48 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, vấn đề thực trạng kháng kháng sinh mang tính tồn cầu đặc biệt trội nước phát triển với gánh nặng bệnh nhiễm khuẩn chi phí bắt buộc cho việc thay kháng sinh cũ kháng sinh mới, đắt tiền Các bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hố, đường hơ hấp, bệnh lây truyền qua đường tình dục nhiễm khuẩn bệnh viện nguyên nhân hàng đầu có tỉ lệ mắc tỉ lệ tử vong cao nước phát triển [10] Việc kiểm soát loại bệnh chịu tác động bất lợi phát triển lan truyền tình trạng kháng kháng sinh vi khuẩn Bên cạnh tình trạng sử dụng thuốc tràn lan bất hợp lý, việc tích lũy kháng sinh mơi trường tự nhiên, tích tụ dần thức ăn người từ xâm nhập vào thể người dẫn đến gia tăng tình trạng kháng kháng sinh Nhiều nghiên cứu cho thấy tồn kháng sinh đề kháng kháng sinh môi trường nước trở nên phổ biến [16,17] Hầu hết kháng sinh sử dụng người thải môi trường nhiều hình thức khác tiết, tồn dư kháng sinh dụng cụ, bông, băng y tế… điều góp phần vào tồn dư nước thải Trong nay, kháng sinh Clarithromycin, Azithromycin, Trimethoprim, Sulfamethoxazol sản xuất sử dụng rộng rãi Theo thống kê từ năm 2010 đến tháng 12 năm 2015 Cục Quản lý Dược, Clarithromycin có 95 số đăng ký, Azithromycin có 53 số đăng ký, Sulfamethoxazol Trimethoprim có 79 số đăng ký nước, chiếm tỷ lệ tương đối so với kháng sinh nhóm khác Các nhà máy sản xuất kháng sinh đạt tiêu chuẩn GMP có quy trình, hệ thống xử lý nước thải sau sản xuất Tuy nhiên, việc kiểm soát tồn dư kháng sinh nước thải sở chưa quan tâm mức chưa có yêu cầu quan nhà nước giới hạn nồng độ kháng sinh nước thải nhà máy sản xuất Bên cạnh đó, kháng sinh bền, khó phân hủy nên tồn dư, có mặt lâu dài mơi trường nước ảnh hưởng đện hệ vi sinh vật gây tình trạng kháng kháng sinh Tới thời điểm nay, Việt Nam chủ yếu nghiên cứu dư lượng kháng sinh Clarithromycin, Azithromycin, Sulfamethoxazol Trimethoprim trong nước sơng, nước thải chăn ni, cịn với nước thải y tế có số nghiên cứu bước đầu Xuất phát từ yêu cầu trên, tiến hành đề tài “Nghiên cứu xác định dư lượng số kháng sinh nước thải nhà máy dược phẩm phương pháp sắc ký lỏng khối phổ”, với mục tiêu là: Xây dựng phương pháp xác định đồng thời dư lượng kháng sinh Clarithromycin, Azithromycin, Sulfamethoxazol Trimethoprim nước thải nhà máy dược phẩm LC-MS/MS nồng độ ppb Thẩm định phương pháp phân tích dư lượng kháng sinh bước đầu ứng dụng phương pháp để đánh giá dư lượng kháng sinh nước thải nhà máy dược phẩm Qualitative Analysis Report Page of Printed at: 10:20 AM on: 31/03/2016 Qualitative Analysis Report Data Filename med R-S.d Sample Name R Sample Type Sample Position P1-B2 Instrument Name Instrument User Name Acq Method MRM ACN H20.m Acquired Time 3/31/2016 10:17:17 AM IRM Calibration Status Not Applicable DA Method Default.m Comment Fragmentor Voltage 135 Integration Peak List Peak Start RT Collision Energy End 20 Height Ionization Mode Area ESI Area % 4.937 5.032 5.124 12 35 4.08 5.124 5.624 6.314 78 971 100 Fragmentor Voltage 135 Collision Energy 12 Ionization Mode ESI Fragmentor Voltage 154 Collision Energy 23 Ionization Mode ESI Integration Peak List Peak Start RT 4.229 Fragmentor Voltage End 4.691 135 Height 5.248 Collision Energy Area 166 32 Area % 1513 Ionization Mode Page of 100 ESI Printed at: 12:34 PM on: 31/03/2016 Qualitative Analysis Report Fragmentor Voltage 135 Collision Energy 18 Ionization Mode ESI - End Of Report - Page of Printed at: 12:34 PM on: 31/03/2016 Qualitative Analysis Report Data Filename med R-T.d Sample Name R Sample Type Sample Position P1-B3 Instrument Name Instrument User Name Acq Method MRM ACN H20.m Acquired Time 3/31/2016 10:31:15 AM IRM Calibration Status Not Applicable DA Method Default.m Comment Column3 Sample Group Column4 Column3 Info Acquisition SW Version 6400 Series Triple Quadrupole B.07.00 (B7022.0) User Chromatograms Fragmentor Voltage 135 Integration Peak List Peak Start RT Collision Energy End 20 Height Ionization Mode Area ESI Area % 4.937 5.026 5.124 40 131 3.81 5.124 5.623 6.306 1001 4744 100 Fragmentor Voltage 135 Collision Energy 12 Ionization Mode ESI Fragmentor Voltage 154 Collision Energy 23 Ionization Mode ESI Page of Printed at: 12:35 PM on: 31/03/2016 Qualitative Analysis Report Integration Peak List Peak Start RT 4.137 End 4.695 Height 5.063 Area 189 Area % 1734 100 Fragmentor Voltage 135 Collision Energy 32 Ionization Mode ESI Fragmentor Voltage 135 Collision Energy 18 Ionization Mode ESI - End Of Report - Page of Printed at: 12:35 PM on: 31/03/2016 Qualitative Analysis Report Data Filename med V.d Sample Name V Sample Type Sample Position P1-A2 Instrument Name Instrument User Name Acq Method MRM ACN H20.m Acquired Time 3/31/2016 9:07:26 AM IRM Calibration Status Not Applicable DA Method Default.m Comment Column3 Sample Group Column4 Column3 Info Acquisition SW Version 6400 Series Triple Quadrupole B.07.00 (B7022.0) User Chromatograms Fragmentor Voltage 135 Integration Peak List Peak Start RT Collision Energy End 20 Height Ionization Mode Area ESI Area % 4.921 5.004 5.211 93 503 3.92 5.456 5.993 6.467 1688 12843 100 Fragmentor Voltage 135 Collision Energy 12 Ionization Mode ESI Fragmentor Voltage 154 Collision Energy 23 Ionization Mode ESI Page of Printed at: 12:41 PM on: 31/03/2016 Qualitative Analysis Report Integration Peak List Peak Start RT 4.153 End 4.693 Height 5.127 Area 224 Area % 1975 100 Fragmentor Voltage 135 Collision Energy 32 Ionization Mode ESI Fragmentor Voltage 135 Collision Energy 18 Ionization Mode ESI - End Of Report - Page of Printed at: 12:41 PM on: 31/03/2016 Qualitative Analysis Report Data Filename med V-C.d Sample Name V.T Sample Type Sample Position P1-A5 Instrument Name Instrument User Name Acq Method MRM ACN H20.m Acquired Time 3/31/2016 9:49:21 AM IRM Calibration Status Not Applicable DA Method Default.m Comment Column3 Sample Group Column4 Column3 Info Acquisition SW Version 6400 Series Triple Quadrupole B.07.00 (B7022.0) User Chromatograms Fragmentor Voltage 135 Integration Peak List Peak Start RT Collision Energy End 20 Height Ionization Mode Area ESI Area % 4.937 5.025 5.437 84 578 5.3 5.493 6.08 6.596 1419 10910 100 Fragmentor Voltage 135 Integration Peak List Peak Start RT 4.753 Fragmentor Voltage Collision Energy End 4.836 154 12 Height 4.906 Collision Energy Ionization Mode Area 23 ESI Area % 17 Ionization Mode Page of 100 ESI Printed at: 12:46 PM on: 31/03/2016 Qualitative Analysis Report Integration Peak List Peak Start RT 4.273 End 4.688 Height 5.288 Area 175 Area % 1569 100 Fragmentor Voltage 135 Collision Energy 32 Ionization Mode ESI Fragmentor Voltage 135 Collision Energy 18 Ionization Mode ESI - End Of Report - Page of Printed at: 12:46 PM on: 31/03/2016 Qualitative Analysis Report Data Filename med V-S.d Sample Name V.S Sample Type Sample Position P1-A3 Instrument Name Instrument User Name Acq Method MRM ACN H20.m Acquired Time 3/31/2016 9:21:25 AM IRM Calibration Status Not Applicable DA Method Default.m Comment Column3 Sample Group Column4 Column3 Info Acquisition SW Version 6400 Series Triple Quadrupole B.07.00 (B7022.0) User Chromatograms Fragmentor Voltage 135 Integration Peak List Peak Start RT Collision Energy End 20 Height Ionization Mode Area ESI Area % 4.945 5.022 5.147 16 91 4.5 5.147 5.184 5.3 27 1.33 5.501 5.657 6.033 272 2031 100 Fragmentor Voltage 135 Integration Peak List Peak Start RT Collision Energy End 12 Height Ionization Mode Area ESI Area % 2.176 2.201 2.232 13 33.13 4.753 4.861 4.954 40 100 Fragmentor Voltage 154 Collision Energy 23 Ionization Mode Page of ESI Printed at: 12:47 PM on: 31/03/2016 Qualitative Analysis Report Integration Peak List Peak Start RT 4.137 End 4.698 Fragmentor Voltage 135 Integration Peak List Peak Start RT 0.554 Fragmentor Voltage 135 Area 193 Collision Energy End 0.578 Height 4.998 32 Height 0.602 Collision Energy Area % 1683 Ionization Mode Area 18 100 ESI Area % 18 Ionization Mode 100 ESI - End Of Report - Page of Printed at: 12:47 PM on: 31/03/2016 Qualitative Analysis Report Data Filename med V-T.d Sample Name V.T Sample Type Sample Position P1-A4 Instrument Name Instrument User Name Acq Method MRM ACN H20.m Acquired Time 3/31/2016 9:35:22 AM IRM Calibration Status Not Applicable DA Method Default.m Comment Column3 Sample Group Column4 Column3 Info Acquisition SW Version 6400 Series Triple Quadrupole B.07.00 (B7022.0) User Chromatograms Fragmentor Voltage 135 Integration Peak List Peak Start RT End 20 Height Ionization Mode Area ESI Area % 4.945 5.022 5.147 67 363 3.84 5.147 5.191 5.42 12 101 1.07 5.469 5.961 6.387 1193 9472 100 Fragmentor Voltage 135 Integration Peak List Peak Start RT Collision Energy 4.8 4.8 Fragmentor Voltage 154 Collision Energy 12 Ionization Mode End Height Area 4.9 15 Collision Energy 23 ESI Area % 100 Ionization Mode Page of ESI Printed at: 12:55 PM on: 31/03/2016 Qualitative Analysis Report Integration Peak List Peak Start RT 4.227 End 4.69 Height 4.98 Area 587 Area % 1698 100 Fragmentor Voltage 135 Collision Energy 32 Ionization Mode ESI Fragmentor Voltage 135 Collision Energy 18 Ionization Mode ESI - End Of Report - Page of Printed at: 12:55 PM on: 31/03/2016 Qualitative Analysis Report Data Filename arm.d Sample Name R Sample Type Sample Position P1-B5 Instrument Name Instrument User Name Acq Method MRM ACN H20.m Acquired Time 3/31/2016 10:59:13 AM IRM Calibration Status Not Applicable DA Method Default.m Comment Column3 Sample Group Column4 Column3 Info Acquisition SW Version 6400 Series Triple Quadrupole B.07.00 (B7022.0) User Chromatograms Fragmentor Voltage 135 Integration Peak List Peak Start RT 5.38 Collision Energy End 5.566 20 Height 5.702 Ionization Mode Area ESI Area % 40 100 Fragmentor Voltage 135 Collision Energy 12 Ionization Mode ESI Fragmentor Voltage 154 Collision Energy 23 Ionization Mode ESI Page of Printed at: 11:13 AM on: 31/03/2016 Qualitative Analysis Report Integration Peak List Peak Start RT 4.08 End 4.692 Height 5.127 Area 190 Area % 1659 100 Fragmentor Voltage 135 Collision Energy 32 Ionization Mode ESI Fragmentor Voltage 135 Collision Energy 18 Ionization Mode ESI - End Of Report - Page of Printed at: 11:13 AM on: 31/03/2016