BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC NGUYỄN THANH TÂM NGHIÊN CỨU CẢI TẠO GIỐNG NHẰM TĂNG KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ Streptomyces 184.221 HÀ NỘI 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THANH TÂM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC Mã số: 60720402 Nơi thực đề tài: Bộ môn Vi sinh – Sinh học ĐH Dược HN HÀ NỘI 2016 LỜI CẢM ƠN – - - Do Học viên Nguyễn Thanh Tâm MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1.Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces 1.1.1.Đặc điểm chung 1.1.2 Phân loại xạ khuẩn 1.1.3.Đặc điểm chủng xạ khuẩn Streptomyces 184.221 1.3.Tuyển chọn, cải tạo bảo quản giống xạ khuẩn .5 1.3.1.Chọn chủng có HTKS cao sàng lọc 1.3.2.Đột biến cải tạo giống 1.3.3.Bảo quản giống xạ khuẩn 1.4.Sự sinh tổng hợp kháng sinh xạ khuẩn 1.4.1.Sự hình thành KS xạ khuẩn 1.4.2.Một số yếu tố ảnh hƣởng tới trình sinh tổng hợp KS .7 1.4.3.Lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 1.5.Chiết tách tinh chế kháng sinh từ dịch lên men .9 1.5.1.Vai trò chiết tách tinh chế kháng sinh 1.5.2.Các phƣơng pháp chiết tách .9 1.6.Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh 11 1.6.1.Phổ tử ngoại - khả kiến 11 1.6.2.Phổ hồng ngoại 11 1.6.3.Khối phổ 11 1.6.4.Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 12 1.7.Các nghiên cứu liên quan 13 1.7.1.Một số nghiên cứu liên quan đến actinomycin X2 13 1.7.2.Một số nghiên cứu Actinomycin D .14 CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1.Đối tƣợng nghiên cứu 17 2.2.Nguyên vật liệu thiết bị 17 2.3.Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.3.1.Nuôi cấy giữ giống xạ khuẩn 19 2.3.2.Đánh giá hoạt tính kháng sinh phƣơng pháp khuếch tán 19 2.3.3.Phƣơng pháp cải tạo giống .21 2.3.4.Lên men chìm tổng hợp kháng sinh 23 2.3.5.Chiết kháng sinh từ dịch lên men dung môi hữu 24 2.3.6.Sơ xác định thành phần kháng sinh sắc ký lớp mỏng 24 2.3.7.Thu kháng sinh thô phƣơng pháp cất quay 25 2.3.8.Tinh chế kháng sinh thô sắc ký cột 25 2.3.9.Kết tinh lại KS 26 2.3.11.Sơ xác định kháng sinh tinh khiết thu đƣợc 27 Chƣơng 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 28 3.1.Nâng cao khả sinh tổng hợp KS chủng giống Streptomyces 184.221 28 3.1.1.Kết sàng lọc chọn chủng có HTKS cao 28 3.1.2.Kết đột biến nâng cao khả sinh tổng hợp kháng sinh Streptomyces 184.221 29 3.1.2.1.Đột biến ánh sáng UV 29 3.1.2.2.Đột biến hóa chất 33 3.2.Kết chọn dung môi hữu pH chiết KS từ dịch lọc 35 3.3.Lên men dịch thể sinh tổng hợp kháng sinh .36 3.3.1.Chọn môi trƣờng lên men thích hợp .36 3.3.2.Chọn biến chủng lên men tốt nhất: 36 3.4.Chiết xuất bƣớc đầu tinh chế chất kháng sinh từ dịch lên men 37 3.4.1.Kết sắc ký lớp mỏng 37 3.4.2.Kết tinh chế kháng sinh sắc ký cột 38 3.4.3.Kết kết tinh .46 3.5 Kết phổ 47 3.5.1 Kết phổ chất .47 3.5.2 Kết phổ KS 51 3.5.3 Kết phổ chất 52 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 54 4.1 Cải tạo giống 54 4.2 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 55 Kết luận kiến nghị 57 Tài liệu tham khảo: 58 Phụ lục 63 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DM Dung môi ĐB Đột biến ĐBHH Đột biến hóa học Gr Gram HTKS Hoạt tính kháng sinh IR Hồng ngoại- Infrared KS Kháng sinh MTdt Môi trường dịch thể MS Khối phổ E.coli Eschirichia coli ATCC 25922 S.aureus Staphylococus aureus ATCC 1128 SKLM Sắc ký lớp mỏng VSV Vi sinh vật UV Tử ngoại ultra violet NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Danh mục bảng Tên bảng Trang Bảng 1.1: Kết thử MIC chất AR -1a số vi khuẩn 15 Bảng 1.2: Đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn 15 Bảng 2.1: Các VSV kiểm định 17 Bảng 2.2: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn 17 Bảng 2.3: Các môi trường nuôi cấy VSV 18 Bảng 2.4: Các dung môi sử dụng 18 Bảng 3.1: Kết thử HTKS sàng lọc chọn chủng có HTKS cao 28 Bảng 3.2: Kết thử HTKS biến chủng sau ĐB 30 Bảng 3.3: Kết thử HTKS biến chủng sau ĐB2 31 Bảng 3.4: Kết thử HTKS biến chủng sau ĐBHH 33 Bảng 3.5: Kết chọn dung môi hữu pH từ dịch lọc 35 Bảng 3.6: Kết chọn MT lên men Bảng 3.7: Kết chọn biến chủng lên men tốt 36 37 Bảng 3.8: Kết sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi 38 Bảng 3.9: Kết thử HTKS phân đoạn sau sắc kí cột lần 39 Bảng 3.10: Kết SKLM phân đoạn sau sắc kí cột lần 40 Bảng 3.11: Kết thử HTKS phân đoạn sau SK cột lần 41 Bảng 3.12: Kết sắc kí lớp mỏng phân đoạn sau sắc kí cột lần 42 Bảng 3.13: Kết chạy sắc ký phân đoạn chạy cột lần 44 Bảng 3.14: Kết thử hoạt tính kháng sinh phân đoạn chạy cột lần 44 Bảng 3.15: Kết SKLM phân đoạn sắc ký cột lần 45 Bảng 3.16: Kết thử hoạt tính kháng sinh phân đoạn chạy cột lần 45 Bảng 3.17: Bảng so sánh đặc trưng phổ NMR KS1 với nhóm 48 phenoxazon Bảng 3.18: Bảng so sánh đặc điểm phổ NMR chất KS1 Actinomycin X2 49 Danh mục hình Tên hình Hình 1.1: Các khuẩn ty xạ khuẩn Hình 3.1:Công thức cấu tạo Actinomycin X2 Hình 3.2: Công thức cấu tạo Actinomycin D Hình 3.3: Công thức cấu tạo Actinomycin F4 Trang 53 54 55 ĐẶT VẤN ĐỀ Sự phát tác dụng kháng sinh lần bác sĩ người Anh Alexander Flaming vào tháng 10 năm 1928 thành tựu lớn y học Kháng sinh trở thành công cụ hữu hiệu giúp người chống lại công loài vi khuẩn nguy hiểm làm giảm tỉ lệ tử vong cho người bệnh Song, sinh tồn, vi khuẩn tìm cách biến đổi đồng thời với tình trạng sử dụng kháng sinh không cách khiến tỉ lệ vi khuẩn kháng thuốc tăng cách vô nhanh chóng Chính việc tìm ra, phát triển loại kháng sinh có hoạt tính kháng khuẩn hiệu điều trị cao vấn đề thiết ngành công nghiệp kháng sinh Như biết số kháng sinh biết đến tỉ lệ lớn có nguồn gốc từ xạ khuẩn Bên cạnh theo kết điều tra 65% kháng sinh nguồn gốc xạ khuẩn chi Streptomyces sản xuất ra.[37] Đó sở để nhà khoa học nước ta tập trung nghiên cứu vào chi xạ khuẩn Tại môn Vi sinh – Sinh học trường đại học Dược Hà Nội chọn đề tài : ―Nghiên cứu cải tạo giống nhằm tăng khả sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 184.221” Nội dung luận văn mong muốn đạt mục tiêu sau đây: Nghiên cứu đột biến để tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh Streptomyces 184.221 Xây dựng điều kiện lên men, chiết xuất, tách tinh chế kháng sinh thích hợp Phụ lục 11: Phổ HMBC chất KS Phụ lục 12: Phổ HMBC chất KS1 Phụ lục 13: Phổ HSQC chất KS Phụ lục 14: Phổ HSQC chất KS Phụ lục 15: Phổ HSQC chất KS1 Phụ lục 16: Phổ HSQC chất KS Phụ lục 17: Hình ảnh phổ DEFT KS Phụ lục 18: Hình ảnh phổ COSY KS Phụ lục 19: Phổ MS chất KS1 Ten may: Impact 410 Nicolet Người gửi mẫu: Nguyễn Thanh Tâm Date: 3/13/2016 Tên mẫu: TAM-1 101.6 90 793 1369 637 732 80 1192 1294 1098 1270 70 1475 60 2958 1582 2928 50 %T 1737 40 3434 1648 30 20 10 0.0 4000.0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 cm-1 1600 1400 Phụ lục 20: Hình ảnh phổ IR KS 1200 1000 800 600.0 Phụ lục 21: Kết đo phổ UV – VIS kháng sinh Phụ lục 22: Hình ảnh phổ UV-VIS KS2 Ten may: Impact 410 Nicolet Nguoi gui mau: Nguyen Thanh Tam Date: 3/25/2016 MAU: KS2 103.1 100 90 820 949 677 640 80 3057 70 60 1097 1410 1270 1363 1318 1300 1194 2964 2928 1745 %T50 1478 3442 1583 40 30 1646 20 10 0.0 4000.0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 cm-1 1600 1400 1200 Phụ lục 23: Hình ảnh phổ IR KS2 1000 800 600.0 Phụ lục 24: Phổ MS chất KS Phụ lục 25: Phổ MS KS