Đang tải... (xem toàn văn)
1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Trong những năm gần đây enzyme đang là hướng đi mới được ứng dụng vào nhiều ngành khác nhau và đem lại nhiều hiệu quả với ưu điểm chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm nhanh hơn hàng nghìn lần so với chất xúc tác hóa học khác; phản ứng xảy ra trong điều kiện êm dịu không cần tác nhân nhiệt độ cao, pH lớn; phản ứng có tính đặc hiệu, đặc biệt an toàn đối với con người và thiên nhiên. Mặt khác, hiện nay, ở Việt Nam có một số công trình nghiên cứu sản xuất enzyme tái tổ hợp với các mục đích sử dụng trong công nghiệp, thực phẩm, nông nghiệp. Cụ thể: Đề tài nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm đa enzyme có chất lượng cao từ các vi sinh vật tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn chăn nuôi; Đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất enzyme tái tổ hợp Streptokinase và yếu tố hoạt hóa plasminogen”. Gelatinase là một trong những enzyme được nghiên cứu hiện nay với tác dụng có thể thủy phân được gelatin. Gelatin là một polymer tự nhiên có nguồn gốc từ collagen của da, xương của bò, lợn, cá; là loại protein không mùi, không vị, trong suốt hoặc có màu hơi hơi vàng, gelatin được sử dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm. Gelatinase được tách chiết từ nhiều loài vi khuẩn khác nhau Pseudomonas, Aerromonas, Enterobacter,…Hoạt động chính của enzyme này là thủy phân các liên kết peptit của gelatin để tạo ra các đoạn peptit ngắn và các axit amin, tuy nhiên nguồn gelatinase này thường là tác nhân gây nên độc tố của vi khuẩn, đồng thời một số loại vi khuẩn có thể gây hại đối với con người, động vật cây trồng như Pseudomonasaeruginosa gây bệnh mủ xanh ở người không an toàn và hiệu quả không cao, vì vậy sản xuất enzyme tái tổ hợp đang là hướng đi mới với mong muốn tạo được nguồn enzyme tái tổ hợp an toàn. Mặt khác, để có một lượng gelatinase lớn ứng dụng trong thực tế với ngành công nghiệp chế biến bằng phương pháp thông thường sẽ khó chủ động, số lượng enzyme cần thiết sẽ không đáp ứng đủ. Do đó, việc sản xuất vi sinh vật tái tổ hợp, để từ đó sản xuất enzyme gelatinase tái tổ hợp thành công, đạt chất lượng tốt sẽ góp phần quan trong trong việc ứng dụng enzyme này với quy mô rộng, lớn. Với những lý do trên chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu chế tạo gelatinase tái tổ hợp và đánh giá đặc tính của enzyme ”.
PHẦN I MỞ ĐẦU LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Trong năm gần enzyme hướng ứng dụng vào nhiều ngành khác đem lại nhiều hiệu với ưu điểm chuyển hóa chất thành sản phẩm nhanh hàng nghìn lần so với chất xúc tác hóa học khác; phản ứng xảy điều kiện êm dịu không cần tác nhân nhiệt độ cao, pH lớn; phản ứng có tính đặc hiệu, đặc biệt an toàn người thiên nhiên Mặt khác, nay, Việt Nam có số công trình nghiên cứu sản xuất enzyme tái tổ hợp với mục đích sử dụng công nghiệp, thực phẩm, nông nghiệp Cụ thể: Đề tài nghiên cứu sản xuất ứng dụng chế phẩm đa enzyme có chất lượng cao từ vi sinh vật tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu sử dụng thức ăn chăn nuôi; Đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất enzyme tái tổ hợp Streptokinase yếu tố hoạt hóa plasminogen” Gelatinase enzyme nghiên cứu với tác dụng thủy phân gelatin Gelatin polymer tự nhiên có nguồn gốc từ collagen da, xương bò, lợn, cá; loại protein không mùi, không vị, suốt có màu hơi vàng, gelatin sử dụng rộng rãi ngành thực phẩm, dược phẩm mỹ phẩm Gelatinase tách chiết từ nhiều loài vi khuẩn khác Pseudomonas, Aerromonas, Enterobacter,…Hoạt động enzyme thủy phân liên kết peptit gelatin để tạo đoạn peptit ngắn axit amin, nhiên nguồn gelatinase thường tác nhân gây nên độc tố vi khuẩn, đồng thời số loại vi khuẩn gây hại người, động vật trồng Pseudomonasaeruginosa gây bệnh mủ xanh người không an toàn hiệu không cao, sản xuất enzyme tái tổ hợp hướng với mong muốn tạo nguồn enzyme tái tổ hợp an toàn Mặt khác, để có lượng gelatinase lớn ứng dụng thực tế với ngành công nghiệp chế biến phương pháp thông thường khó chủ động, số lượng enzyme cần thiết không đáp ứng đủ Do đó, việc sản xuất vi sinh vật tái tổ hợp, để từ sản xuất enzyme gelatinase tái tổ hợp thành công, đạt chất lượng tốt góp phần quan trong việc ứng dụng enzyme với quy mô rộng, lớn Với lý tiến hành đề tài “Nghiên cứu chế tạo gelatinase tái tổ hợp đánh giá đặc tính enzyme ” MỤC TIÊU 2.1 Mục tiêu chung Chế tạo gelatinase tái tổ hợp đánh giá đặc tính gelatinase tái tổ hợp 2.2 Mục tiêu cụ thể Chế tạo enzyme tái tổ hợp gelatinase Xác định điều kiện thích hợp để biểu gen mã hóa gelatinase Xác định đặc tính gelatinase tái tổ hợp, bao gồm: đặc tính vật lý, hóa học enzyme NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Nghiên cứu tạo chủng biểu gen mã hóa gelatinase Nghiên cứu xác định điều kiện biểu gen mã hóa gelatinase Nghiên cứu đặc tính gelatinase tái tổ hợp ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 4.1 Đối tượng nghiên cứu: Gelatinase tái tổ hợp 4.2 Nguyên liệu nghiên cứu: Gen mã hóa gelatinase nhóm A (kích thước 501bp) tách dòng từ chủng vi khuẩn Pseudomonas C4.4.1; A.hydrophila C4.1.1 4.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu - Thời gian nghiên cứu: Đề tài tiến hành từ tháng 10/2013 đến tháng 9/2014 - Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm khoa Công nghệ Sinh học Viện Đại Học Mở Hà Nội NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI - Hệ thống hóa kỹ thuật công nghệ tạo enzyme tái tổ hợp nói chung công nghệ tạo gelatinase tái tổ hợp nói riêng - Đưa điều kiện để chế tạo gelatinase tái tổ hợp ứng dụng xử lý phụ phẩm chế biến cá da trơn PHẦN II NỘI DUNG CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan gelatin gelatinase 1.1 Gelatin Gelatin polymer tự nhiên có nguồn gốc từ collagen da, xương bò, lợn, cá Gelatin hòa tan đun nóng (khoảng 40 oC) cô đặc làm lạnh, với nước điều kiện bình thường có dạng sệt Theo Hofmeister: Gelatin sản phẩm thủy phân Collagen nhiệt: C102H149N31O38 (collagen) + H2O C102H151N31O39 (gelatin) Về cấu tạo, gelatin chứa 18 – 20 acid amin, có acid amin thiết yếu (Hình 1) Hình Cấu trúc chuỗi acid amin gelatin Sản phẩm sau thủy phân gelatin bao gồm số acid amin theo bảng sau: Bảng Thành phần acid amin gelatin STT Loại acid amin Tỉ lệ (% ) Alanine 8.6 - 10.7 Arginine 8.3 - 9.1 Aspartic acid 6.2 - Cysteine 0.1 Glutamic acid 11.3 - 11.7 Glycine 26.4 - 30.5 Hydroxylysine 1.04 Hydroxyproline 13.5 Isoleucine 1.36 10 Leucin 3.1 - 3.34 11 Lysine 4.1 - 5.2 12 Methionin 0.8 - 0.92 13 Histidine 0.85 - 1.0 14 Phenylalanine 2.1 - 2.56 15 Proline 16.2 - 18.0 16 Serine 2.9 - 4.13 17 Threonine 2.2 18 Tyrosine 0.44 - 0.91 19 Valine 2.5 - 2.8 2,519 1.2 Gelatinase Gelatinase enzyme thủy phân protein có số loài vi khuẩn động vật bậc cao Gelatinase enzyme thuộc nhóm protease - nhóm hydrolase, xúc tác cho trình thủy phân liên kết peptid (-CO – NH-) phân tử protein peptid thành acid amin tự do, peptid ngắn, peptone Enzyme có khả thủy phân cấu trúc ngoại bào elastin, collagen gelatin Ở thể người, gelatinase chia thành hai loại, là: gelatinase A gelatinase B (hình 1a, 1b) Gelatinase A hay gelatinase 72 kDa gọi collagenase 72 kDa typ IV thuộc nhóm MMP-2, mã hóa gen GelE có kích thước 501bp Gelatinase B hay gelatinase 92 kDa gọi collagenase 92 kDa typ IV thuộc nhóm MMP-9, mã hóa gen GelE có kích thước 615bp Hình 2a Cấu trúc gelatinase A Hình 2b Cấu trúc gelatinase B Ở vi khuẩn, gelatinase thuộc loại protease có trọng lượng phân tử 72 kDa, với trung tâm hoạt động có chứa ion Zn2+ (bảng 1) Bảng Một số loài vi khuẩn có khả sinh gelatinase Tên loài Staphylococcus aureus Bacillus subtilis Clostridium perfringens Corynebacterium sp Proteus spp Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas fluorescens Serratia plymuthica Serratia liquefaciens Serratia rubidaea Peudomonas anguilliseptica Hoạt tính Gelatinase + + + + + + + + + + + Một số loài vi khuẩn sử dụng để tách chiết gelatinase 2.1 Vi khuẩn Aeromonas hyrophila A.hydrophila loài vi khuẩn gram âm, có dạng hình que ngắn Kích thước chiều rộng thường từ 0,3 đến 1µm, chiều dài từ đến µm Chúng khả hình thành bào tử sinh trưởng nhiệt độ thấp (4oC) Hình Hình thái A hydrophila A hydrophila thường biết đến nguyên nhân gây nên bệnh đốm đỏ cá Hình Cá nhiễm khuẩn A.hydrophila 2.2 Vi khuẩn Pseudomonas Loài điển hình : Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas Stutzeri, Pseudomonas Putida , Pseudomonas oleovorans , Pseudomonas denitrificans Đặc điểm hình thái học chung cho Pseudomonas (viết tắt Ps) trực khuẩn Gram âm, tế bào hình que, di động nhờ roi đầu (tiên mao chùm tiên mao) bào tử Hình Đặc điểm hình thái Pseudomonas aeruginosa Một enzyme quan trọng Pseudomonas sinh Protease Bên cạnh chúng có khả tiết enzyme gelatinase phân giải gelatin có ý nghĩa lớn công nghiệp, dược phẩm, mỹ phẩm Các loài cá hay bị nhiễm khuẩn Pseudomonas cá tra, cá basa, cá trê, cá bống tượng, cá tai tượng gây nên dấu hiệu bệnh lý xuất huyết đốm nhỏ da, xung quanh miệng nắp mang, phía mặt bụng Bề mặt thể chảy máu, tuột nhớt không xuất huyết vây hậu môn Hình Cá nhiễm khuẩn Pseudomonas Tình hình thực tế Các thành phần thủy phân từ da cá Bảng Các thành phần acid amin chủ yếu da số loại cá nước lạnh, nước ấm bì lợn (thành phần 1000g) Da cá tuyếta Loại acid amin Alanine Glycine Hydroxyproline Proline 96 344 50 106 Da cá Alaska pollockb 108 358 55 95 Hakea 119 331 59 114 Biến nạp Vector biểu 6.1 Vector biểu 6.2 Vector biểu gen vi khuẩn E.coli Sơ đồ tiến trình thí nghiệm Megrima 123 350 60 115 Cá rô phic 123 347 79 119 Bì lợnd 112 330 91 132 CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu, hóa chất, thiết bị 1.1 Vật liệu 1.1.1 Các chủng vi sinh vật - Vi khuẩn E.coli 1.1.2 Vector sử dụng đề tài - Vector biểu pET32a+ Hình Sơ đồ pET32a+ dùng biểu gen 1.1.3 Mồi Tên mồi Gelatinase-A Trình tự mồi 5’ AATGGATCCGACTTCCAAGAATT 3’ 5’ TTAGAGCTC TTGCTTCAAATGTTT 3’ 1.1.4 Môi trường Môi trường LB lỏng Môi trường LB thạch Môi trường LB - Kháng sinh 1.2 Hóa chất Hóa chất tách plasmid từ tế bào vi khuẩn Hóa chất chạy điện di gel agarose Hóa chất tinh ADN từ gel agarose Hóa chất chạy điện di SDS-PAGE 1.3 Thiết bị Kích thước gel 501 bp Phương pháp nghiên cứu 2.1 Phương pháp điện di gel agarose 2.2 Kiểm tra mang gen vector tái tổ hợp phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) 2.3 Phương pháp tinh ADN từ gel agarose 2.4 Tách chiết thu nhận plasmid pET-32a(+) phương pháp SDS-kiềm 2.5 Phương pháp cắt enzyme giới hạn 2.6 Phương pháp nối gen 2.7 Phương pháp biến nạp vector mang ADN đích vào tế bào vật chủ 2.8 Phương pháp tách chiết ADN plasmid từ vi khuẩn E.coli 2.9 Phương pháp biểu gen mã hóa genatinase vi khuẩn E coli BL21(DE3) 2.10 Tinh protein tái tổ hợp cột lực Ni2+ 2.11 Phương pháp điện di gel SDS-PAGE 2.12 Phương pháp thu enzyme gelatinase 2.13 Phương pháp đánh giá khả phân giải gelatinase với gelatin thô 2.14 Phương pháp xác định hoạt tính gelatinase 2.15 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn 2.16 Phương pháp xác định ảnh hưởng ion kim loại đến khả phát triển sinh khối hoạt tính enzyme gelatinase 2.17 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt tính gelatinase 2.18 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng chất tẩy rửa đến hoạt tính gelatinase 2.19 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng dung môi hữu đến hoạt tính gelatinase 2.20 Phương pháp thu thập xử lý số liệu CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Nghiên cứu biểu gen gelatinase vi khuẩn E.coli BL21 1.1 Thiết kế vector tái tổ hợp pET32a+ - GelE/A Gen mã hóa gelatinase nhóm nghiên cứu khoa Công nghệ Sinh học, viện Đại học Mở Hà Nội xác định trình tự Trình tự thu có độ tương đồng 99% với trình tự gen GelE GeneBank có mã số: DQ845100.1 (hình 1.1) Hình 1.1 So sánh mức độ tương đồng GelE phân lập GeneBank Enterococcus faecalis GelE (gelE) gene, partial cds Sequence ID: gb|DQ845100.1|Length: 580Number of Matches: Score Expect Identities Gaps Strand Frame 1044 bits(565) 0.0 580/586(99%) 6/586(1%) Plus/Plus Features: Query Sbjct Query 61 Sbjct 61 Query 121 Sbjct 121 Query 181 Sbjct 181 Query 241 Sbjct 241 Query 301 Sbjct 301 Query 361 Sbjct 355 Query 421 Sbjct 415 Query 481 Sbjct 475 Query 541 Sbjct 535 GACTTCCAAGAATTCATGATTATGCCTGTAGGTGCGCCTACATTCAAAGAAGCTTTACGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GACTTCCAAGAATTCATGATTATGCCTGTAGGTGCGCCTACATTCAAAGAAGCTTTACGT 60 ATGGGTGCAGAAGTATACCACGCATTAGCTTCAATCTTAAAAGGTCGCGGTTTAGCTACT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATGGGTGCAGAAGTATACCACGCATTAGCTTCAATCTTAAAAGGTCGCGGTTTAGCTACT 120 TCAGTAGGTGACGAAGGTGGTTTCGCTCCTAACCTAGGTTCAAACGAAGAAGGTTTCGAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCAGTAGGTGACGAAGGTGGTTTCGCTCCTAACCTAGGTTCAAACGAAGAAGGTTTCGAA 180 GTAATCATCGAAGCTATCGAAAAAGCTGGCTATGTTCCTGGTAAAGACGTTGTTCTTGCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTAATCATCGAAGCTATCGAAAAAGCTGGCTATGTTCCTGGTAAAGACGTTGTTCTTGCT 240 ATGGATGCTGCCTCTTCAGAATTCTACGACAAAGAAAAAGGCGGTTACGTTTTAGCTGAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATGGATGCTGCCTCTTCAGAATTCTACGACAAAGAAAAAGGCGGTTACGTTTTAGCTGAC 300 TCAGGCGAAGGTGGCGAAAATACAACTGTAGATATGATCGCGTTCTACGTAGTAAAATTA ||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||| TCAGGCGAA -GGCGAAAATACAACTGTAGATATGATCGCGTTCTACGTAGT -ATTA 360 GTTTCTATATACCCAATCATTTCTATCGAAGACGGCTTAGACGAAAACGACTGGGACGGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTTTCTATATACCCAATCATTTCTATCGAAGACGGCTTAGACGAAAACGACTGGGACGGA 420 TTCAAAATATTAACTGAAGTATTAGGCGACAAAGTTCAATTAGTTGGTGACGATTTATTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTCAAAATATTAACTGAAGTATTAGGCGACAAAGTTCAATTAGTTGGTGACGATTTATTC 480 GTAACAAACACAACTAAATTAGCTGAAGGTATCGAAAAAGGTATCGCTAACTCAATCCTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTAACAAACACAACTAAATTAGCTGAAGGTATCGAAAAAGGTATCGCTAACTCAATCCTA 540 ATCAAAGTTAACCAAATCGGTACTTTAACTGAAACATTTGAAGCAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATCAAAGTTAACCAAATCGGTACTTTAACTGAAACATTTGAAGCAA + 60 120 180 240 300 354 414 474 534 586 580 Gen GelE/A vector pET 32a cắt với enzyme BamHI điện di tinh Sản phẩm tinh tiếp tục cắt với XhoI Sản phẩm xử lý enzyme cuối tinh điện di kiểm tra gel agarose 1% (Hình 1.2) trước thực phản ứng ghép nối với (Hình 1.3) Hình 1.2 Hình ảnh điện di gen GelE vector pET 32a+ cắt enzyme giới hạn Bam HI Xho I M: thang chuẩn 10kb, 1: sản phẩm cắt gen GelE, 2: sản phẩm cắt vector pET 32a+ Kết điện di cho thấy sản phẩm cắt enzyme gen GelE vector pET 32a + xuất băng nhất, có kích thước khoảng 0,5 kb 5,9 kb, tương tự kích thước lý thuyết gen vector Kết chứng tỏ, sản phẩm PCR sau cắt hai enzyme cắt giới hạn Bam HI Xho I có chất lượng tốt, không thay đổi đáng kể so với kích thước ban đầu gen Hình 1.3 Sơ đồ tóm tắt trình thiết kế vector biểu gen mã hóa gelatinase Hình 1.4 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp enzyme BamHI XhoI M: thang chuẩn 10kb; 1: Sản phẩm PCR gen GelE; 2: sản phẩm cắt pET 32a+/ GelE với enzyme BamHI XhoI 10 Kết điện di cho thấy: enzyme giới hạn cắt plasmid thành hai băng có kích thước tương ứng với kích thước gen GelE/A vector pET 32a + Như kết luận, thiết kết thành công vector tái tổ hợp pET 32a+-GelE/A 1.2 Biểu gen mã hóa gelatinase tế bào vật chủ Kết nuôi cấy vi khuẩn thể hình 1.5 Hình 1.5 Kết biến nạp vector pET 32a+/GelE vào tế bào E.coli BL21(DE3) nuôi môi trường LBAmp Sự biểu protein GelE E coli BL21(DE3) bước đầu phân tích phương pháp SDS-PAGE Hình 1.6 Kết điện di protein tái tổ hợp gelatinase gel SDS-PAGE (M: thang chuẩn; giếng 1: E.coli BL21- pET32a+/GelE không cảm ứng với IPTG; giếng 23: E.coli BL21- pET32+/GelE cảm ứng với IPTG; giếng 4: E.coli BL21- pET32+) So sánh hình ảnh điện di đồ mẫu có chất cảm ứng IPTG, đồng thời so sánh kích thước với thang protein chuẩn ta thấy: mẫu có cảm ứng với IPTG (đường chạy số 2-3) xuất băng protein có kích thước nằm khoảng 72 kDa (tương ứng với kích thước lý thuyết protein gelatinase có gắn đuôi His-tag) mẫu không cảm ứng với IPTG (đường chạy số 1) không thấy xuất băng Hơn nữa, mẫu nuôi E.coli BL21- pET 32a+ không bổ sung IPTG (đường chạy số 4) không thấy xuất băng protein Như vậy, băng protein xuất khả lớn protein tái tổ hợp đích mà cần biểu 11 1.3 Tinh đánh giá hoạt tính gelatinase tái tổ hợp Các phân đoạn protein thu sau tách khỏi cột kiểm tra SDSPAGE, kết thể hình 1.7 Hình 1.7 Điện di protein gelatinase tinh SDS-PAGE M: Thang protein chuẩn, 1-4: gelatinase thu pha 1, 2, 3, Kết điện di hình 1.7 cho thấy, tất phân đoạn dịch tinh xuất băng protein kích thước 72 kDa, tương ứng với kích thước lý thuyết gelatinase A Kết chứng tỏ tinh thành công protein gelatinase Theo báo cáo Vu công 1998, kích thước gelatinase A có kích thước 72 kDa, tương tự với kích thước protein tái tổ hợp tạo nghiên cứu Nhằm chứng minh hoạt tính gelatinase sau tinh sạch, sử dụng phân đoạn tinh từ dịch nuôi cấy, cảm ứng chủng E.coli BL21/pET 32a+-GelE đánh giá mức độ phân giải gelatin enzyme Kết thể hình 1.8 Hình 1.8 Hình ảnh phân giải gelatinase enzyme thu từ chủng E.coli BL21/pET 32-GelE 1: phân đoạn 1; 2: phân đoạn 3; 3: phân đoạn 4; 4-6: phân đoạn Kết hình 1.8 cho thấy, enzyme sau trình tinh cột sắc ký ProbondTM Nickel-Chelating Resin (Invitrogen) đảm bảo hoạt tính 12 Xác định điều kiện thích hợp để biểu gen mã hóa gelatinase 2.1 Ảnh hưởng chất cảm ứng IPTG đến kết biểu gen mã hóa gelatinase Kết biến nạp thể hình 2.1 Hình 2.1 Kết biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E coli BL21 Chủng E.coli BL21- pET32a+/GelE nuôi cấy điều kiện pH = 7, thời gian tăng sinh giờ, nhiệt độ tăng sinh 370C, nồng độ kháng sinh ampicillin 100 µg/ml, nồng độ IPTG cảm ứng 1mM, 2mM, 3mM, 4mM, 5mM, 6mM Kết thí nghiệm kiểm tra điện di SDS – PAGE, thể hình 2.2 Hình 2.2 Mức độ biểu protein GelE nồng độ IPTG cảm ứng M: thang protein chuẩn, 1-6: protein thu từ dịch tăng sinh chủng E.coli BL21pET32a+/GelE cảm ứng với nồng độ IPTG 6, 5, 4, 3, 2, 1mM, 7: không cảm ứng IPTG Kết điện di cho thấy, nồng độ IPTG từ 1-6mM cảm ứng sinh gelatinase Trên hình ảnh điện di đồ, mẫu xuất vạch tương ứng với kích thước 72kDa, tương ứng với trọng lượng lý thuyết enzyme gelatinase Dịch tăng sinh chủng vi khuẩn biểu cảm ứng với IPTG không cảm ứng với IPTG tách để định xác định hoạt tính gelatinase Kết thí nghiệm thể hình 2.3 13 Hình 2.3 Mức độ biểu gelatinase nồng độ IPTG cảm ứng Hình 2.3 cho thấy: Các mẫu cảm ứng với IPTG nồng độ 2mM có hoạt lực gelatinase mạnh mẫu cảm ứng với IPTG nồng độ 3-6mM Kết chứng tỏ, hàm lượng IPTG 1mM phù hợp để biểu gen mã hóa gelatinase 2.2 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp gelatinase chủng vi khuẩn tái tổ hợp Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy (nguồn dinh dưỡng nitơ bon) đến sinh trưởng chủng vi khuẩn biểu gen mã hóa gelatinase E.coli BL21- pET32a+/GelE hoạt tính enzyme gelatinase trình bày bảng Bảng Ảnh hưởng nguồn bon nitơ đến khả sinh trưởng hoạt tính enzyme tái tổ hợp Các Các bon Nitơ thông Yeast số sinh Glucose Sucrose Lactose extract Peptone NH4Cl NH4(SO2)4 Urea trưởng Mật độ 0.41 sinh 2.57 ± 2.23 ± 0.79 ± 3.17 ± 3.18 ± 1.23 ± 1.25 ± 0.14 ± khối 0.03 0.09 0.02 0.03 0.01 0.00 0.01 (OD600) D-d (mm) 8.12 7.33 1.34 8.22 8.48 3.52 3.92 1.59 Kết bảng cho thấy, glucose chất cacbon phù hợp cho phát triển chủng vi khuẩn biểu Bên cạnh đó, theo dõi động thái học sinh trưởng sinh khối chủng biểu 16 giờ, với kiểm tra nồng độ sinh khối lần cho kết hình 2.4 14 Hình 2.4 Ảnh hưởng nguồn bon đến khả sinh trưởng chủng E.coli BL21- pET32a+/GelE (◊: glucose, sucrose, ∆: lactose) Kết hình 2.4 cho thấy có khác biệt lớn tốc độ tăng trưởng sinh khối vi khuẩn nuôi môi trường LB có bổ sung glucose sucrose so với sinh khối vi khuẩn nuôi môi trường bổ sung lactose Đánh giá hoạt tính gelatinase chủng biểu hiện, kết thể hình 2.5 Hình 2.5 Ảnh hưởng nguồn bon đến hoạt tính gelatinase chủng E.coli BL21- pET32a+/GelE (◊: glucose, sucrose, ∆: lactose) Kết hình 2.5 cho thấy: Glucose nguồn bon phù hợp cho phát triển hoạt tính gelatinase chủng E.coli BL21- pET 32a+/GelE Về ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh trưởng hoạt tính gelatinase chủng E.coli BL21- pET 32a+/GelE đánh giá với hai nguồn nitơ hữu vô Kết theo dõi ảnh hưởng loại chất nitơ thể hình 2.6 Hình 2.6 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh trưởng sinh khối chủng E.coli BL21- pET32a+/GelE (♦: yeast extract, ■: peptone, ∆: NH4Cl, Ο: (NH4)2SO4, : urea) Kết hình 2.6 cho thấy: Nguồn nitơ hữu phù hợp cho phát triển chủng tái tổ hợp E.coli BL21- pET 32a+/GelE Theo dõi hoạt tính gelatinase mẫu E.coli BL21- pET32a+/GelE tăng sinh môi trường có chất nitơ khác cho kết thể hình 2.7 15 Hình 2.7 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến hoạt tính gelatinase chủng E.coli BL21pET32a+/GelE (♦: yeast extract, ■: peptone,∆: NH4Cl,Ο: (NH4)2SO4, : urea) Kết hình 2.7 thể hoạt tính phân giải gelatin mẫu vi khuẩn tăng sinh môi trường có chứa yeast extract peptone cao 2-5 lần so với hoạt tính mẫu tăng sinh môi trường chứa nitơ vô 2.3 Ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ Phân tích mức độ biểu phương pháp điện di SDS-PAGE, đánh giá hoạt tính enzyme phương pháp đục lỗ thạch Kết thể hình 2.8 Hình 2.8 Mức độ biểu gelatinase nhiệt độ nuôi cấy Hình ảnh điện di đồ: 1-3: protein tổng số mẫu tăng sinh nhiệt độ 37oC, 30oC 28oC; hình ảnh đĩa thạch: 1,2,3: vùng phân giải gelatin enzyme tái tổ hợp thu từ mẫu tăng sinh nhiệt độ 37oC, 30oC 28oC Kết hình 2.8 cho thấy: Ở nhiệt độ 28oC 30oC có xuất băng protein mờ kích thước 72 kDa, chứng tỏ gelatinase tổng hợp mức độ yếu so với 37 0C Bên cạnh đó, kích thước vùng phân giải gelatin mẫu tăng sinh 37 0C lớn rõ so với mẫu lại Theo dõi ảnh hưởng nhiệt độ đến nồng độ sinh khối hoạt tính gelatinase cho thấy chủng E.coli BL21-pET32a+/GelE phát triển tốt hoạt tính gelatinase mạnh 370C (hình 2.9, 2.10) Hình 2.9 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng sinh khối chủng E.coli BL21- pET32a+/GelE (♦: 370C, : 300C, ∆: 280C) 16 Hình 2.10 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính gelatinase sinh khối chủng E.coli BL21- pET32a+/GelE (♦: 370C, : 300C, ∆: 280C) 2.4 Ảnh hưởng yếu tố pH Kết thể hình 2.11, 2.12 Hình 2.11 Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng sinh khối chủng E.coli BL21- pET32a+/GelE (♦: pH=7, : pH= 6, ∆: pH= 8) Kết hình 2.11 cho thấy: Mật độ quần thể mẫu tăng sinh môi trường có pH=7 cao so với mẫu tăng sinh môi trường có pH= Hình 2.12 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính gelatinase sinh khối chủng E.coli BL21- pET32a+/GelE (♦: pH=7, : pH= 6, ∆: pH= 8) Hình 2.12 cho thấy khả phân giải gelatin dịch sinh khối vi khuẩn mẫu tăng sinh môi trường có pH=7 cao so với mẫu tăng sinh môi trường có pH= Kiểm tra hàm lượng hoạt lực enzyme phương pháp điện di đục lỗ thạch, kết thể hình 2.13 17 Hình 2.13 Mức độ biểu gelatinase giá trị pH khác Hình ảnh điện di đồ: 1: thang protein chuẩn; 2-4: protein tổng số mẫu tăng sinh có pH môi trường 7, 8, 6; hình ảnh đĩa thạch: 1,2,3: vùng phân giải gelatin enzyme tái tổ hợp thu từ mẫu có pH môi trường 7, Qua hình 2.13 cho thấy: Mẫu nuôi cấy với pH môi trường (đường chạy số 4) có băng protein mờ hay lượng protein thu thấp Ngược lại với mẫu có pH môi trường (đường chạy 2, 3), băng protein đích xuất tương đối giống đậm so với băng protein môi trường có pH Kiểm tra hoạt tính phân giải gelatin cho kết tương tự, kích thước vùng phân giải gelatinase giảm dần theo thứ tự từ mẫu có pH môi trường 7, Chúng cho pH = pH phù hợp để biểu gen mã hóa gelatinase 2.5 Ảnh hưởng yếu tố thời gian nuôi cấy Kết thu thể hình 2.14 2.15 Hình 2.14 Ảnh hưởng thời gian tăng sinh đến khả sinh trưởng sinh khối chủng E.coli BL21- pET32a+/GelE Kết hình 2.14 cho thấy mức độ tăng trưởng quần thể phụ thuộc lớn vào thời gian nuôi cấy, quần thể vi khuẩn đạt tới pha cân sau theo dõi giảm nhẹ sau 24 18 Hình 2.15 Ảnh hưởng thời gian tăng sinh đến hoạt tính gelatinase sinh khối chủng E.coli BL21- pET32a+/GelE Kết hình 2.15 cho thấy: mức độ phân giải chất mạnh khoảng thời gian từ 14-18 giờ, sau giảm dần Đánh giá hàm lượng hoạt lực enzyme phương pháp điện di SDS-PAGE đục lỗ thạch, kết thể hình 2.16 Hình 2.16 Mức độ biểu gelatinase giá trị OD khác Hình ảnh điện di đồ: 1-3: protein tổng số mẫu mẫu tăng sinh sau 12, 16 24 giờ; hình ảnh đĩa thạch: 1,2,3: vùng phân giải gelatin enzyme tái tổ hợp thu từ mẫu tăng sinh sau 12, 16 24 Kết hình ảnh điện di cho thấy: Cả đường chạy 1, xuất băng tương ứng với kích thước lý thuyết gelatinase 72 kDa, độ đậm băng khác biệt lớn Kiểm tra hoạt tính enzyme mẫu tăng sinh cho thấy, sau 12h, 16h 24h tăng sinh kích thước vùng phân giải mẫu tăng sinh sau 16 lớn so với kích thước vùng phân giải mẫu tăng sinh sau 12 24 Từ kết xác định thời gian tăng sinh chủng biểu 16h 2.6 Ảnh hưởng ion kim loại Kết thí nghiệm trình bày bảng Bảng Ảnh hưởng ion bổ sung đến khả phát triển sinh khối hoạt tính gelatinase chủng E.coli BL21- pET32a+/GelE 19 Kết thí nghiệm cho thấy, ion Ca2+ có khả tăng cường hoạt tính gelatinase tái tổ hợp mật độ sinh khối chủng biểu E.coli BL21- pET32/GelE Các ion Mg Mn2+ bổ sung ion vào môi trường nuôi cấy vai trò đáng kể việc tăng hoạt tính kết hợp với ion Ca 2+ lại có tác dụng làm tăng đáng kể hoạt tính enzyme mật độ sinh khối Các ion Ca 2+ + Mg2+ + Mn2+ có tác dụng kích thích tăng trưởng quần thể chủng biểu dẫn tới lượng enzyme tổng hợp nhiều để làm nên hoạt tính enzyme mạnh Ngược lại, ion Fe2+, Co2+, Zn2+ lại ức chế hoàn toàn khả sinh trưởng chủng E.coli BL21- pET32/GelE đồng nghĩa với việc không tổng hợp enzyme Xác định đặc tính gelatinase tái tổ hợp 3.1 Đánh giá hoạt tính gelatinase gelatin bột Kết thể biểu đồ 3.1 hình 3.1 Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ tới khả phân giải gelatin ( 1: enzyme Sigma, 2: enzyme tái tổ hợp) Hình 3.1 Kết phản ứng biure thủy phân gelatin 370C ( 1: enzyme Sigma, 2: enzyme tái tổ hợp, ĐC: không bổ sung enzyme) Kết cho thấy, gelatinase có khả hoạt động mạnh mức nhiệt độ 37⁰C 20 Tiếp tục xác định thời gian thủy phân gelatin enzyme tái tổ hợp Kết đồ thị 3.2 hình 3.2 Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng thời gian tới khả phân giải gelatin ( 1: enzyme Sigma, 2: enzyme tái tổ hợp) Hình 3.2 Kết phản ứng biure thủy phân gelatin sau 48h xử lí ( 1: enzyme Sigma, 2: enzyme tái tổ hợp, ĐC: không bổ sung enzyme) Như vậy, hiệu xuất thủy phân gelatinase cao sau 36-48h xử lý 3.2 Xác định đặc tính vật lý gelatinase tái tổ hợp 3.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính gelatinase Theo dõi thí nghiệm 12 với mẫu enzyme xử lý 300C, 370C, 450C, 500C, 600C, 700C, 800C thu kết hình 3.3 Hình 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính gelatinase 21 Kết hình 3.3 cho thấy: Khi có ion Ca2+ hoạt tính enzyme cao 45°C Khi Ca2+ hoạt tính gelatinase thấp hoạt tính enzyme đạt cao 45°C Kết thí nghiệm cho thấy, nhiệt độ từ 370C đến 50°C không làm thay đổi vùng liên kết với Ca2+ enzyme Độ bền nhiệt gelatinase theo dõi 60 điều kiện xử lý nhiệt 50°C, giờ, enzyme lại đánh giá hoạt tính lần, thu kết hình 3.4 Hình 3.4 Ảnh hưởng thời gian xử lý nhiệt đến hoạt tính gelatinase Kết hình 3.4 cho thấy: Hoạt tính enzyme ổn định 12 đầu, sau đó, thời gian ủ lâu hoạt tính giảm, đến 60 khả thủy phân gelatin cho đạt 8-12% so với hoạt tính ban đầu Từ kết trên, chứng tỏ,enzyme gelatinase hoạt động tốt 50 0C 12 xử lý 3.2.2 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính gelatinase Dưới biểu đồ ảnh hưởng pH đến hoạt tính tương đối gelatinase (Hình 3.5) Hình 3.5 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính gelatinase Kết hình 3.5 cho thấy: Sự bổ sung ion Ca2+ có vai trò việc ổn định hoạt tính enzyme pH từ 7-7,5 So sánh ảnh hưởng ion Ca2+ độ pH đến hoạt tính enzyme chứng tỏ pH = thích hợp hoạt tính gelatinase 3.3 Xác định đặc tính hóa học gelatinase tái tổ hợp 3.3.1 Ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt tính gelatinase 22 Dưới bảng tổng kết ảnh hưởng ion kim loại hóa chất đến hoạt tính enzyme gelatinase Bảng Ảnh hưởng ion kim loại hóa chất đến hoạt tính gelatinase Nồng độ ion (mM) STT Ion bổ sung Không bổ sung 10 Hoạt tính tương đối (%) 2+ Ca 100 111 103 115 2+ Cu 100 105 96 95 Co2+ 100 110 102 92 2+ Mn 100 101 99 97 2+ Fe 100 105 110 104 2+ Mg 100 101 103 100 EDTA 100 0 β-mercaptoetanol 100 0 2+ 2+ 2+ Kết bảng cho thấy ion Mg , Ca , Fe không làm ảnh hưởng làm tăng nhẹ hoạt tính enzyme gelatinase Trong ion như: Cu 2+, Co2+, Mn2+ gây ức chế hoạt tính enzyme nồng độ -10 mM, nồng độ thấp mM hoạt tính gelatinase không bị ảnh hưởng nhiều Còn trường hợp EDTA βmercaptoetanol gây kìm hãm mạnh hoạt tính enzyme gelatinase 3.3.2 Ảnh hưởng chất tẩy rửa đến hoạt tính gelatinase Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng chất tẩy rửa đến hoạt tính enzyme gelatinase Qua biểu đồ 3.3 ta thấy: Tween 20 nồng độ 0,3 – % không ảnh hưởng đến hoạt tính gelatinase Triton X-100 nồng độ 1% có ảnh hưởng nhẹ đến hoạt tính gelatinase Ở nồng độ thấp enzyme gelatinase không bị ảnh hưởng hoạt tính trì mức 97 – 98% Tuy nhiên SDS hoạt tính gelatinase bị ảnh hưởng rõ rệt Với nồng độ SDS cao hoạt tính gelatinase thấp, dù nồng độ thấp 0,3 % hoạt tính gelatinase bị giảm mạnh 53% 3.3.3 Ảnh hưởng dung môi hữu đến hoạt tính gelatinase Dưới biểu đồ biểu thị ảnh hưởng dung môi hữu đến hoạt tính enzyme gelatinase xử lý nồng độ 10%, 20% 30% thời gian nhiệt độ 50ºC 23 Biểu đồ 3.4 Ảnh hưởng dung môi hữu đến hoạt tính enzyme gelatinase Qua biểu đồ 3.4 ta thấy: n-butanol (nBtOH) có ảnh hưởng ức chế rõ rệt hoạt tính enzyme gelatinase Các dung môi hữu khác methanol, ethanol, isopropanol aceton không ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính enzyme, hoạt tính enzyme tăng nhẹ lên 103% giảm nhẹ xuống 90% nồng độ thí nghiệm 10 – 30% KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã tạo thành công chủng E.coli BL21- pET32/GelE biểu gen mã hóa enzyme gelatinase, kích thước protein tái tổ hợp khoảng 72 kDa tương ứng với kích thước lý thuyết enzyme gelatinase A Đã xác định điều kiện phù hợp để biểu gen mã hóa gelatinase: 2.1 Nồng độ chất cảm ứng IPTG phù hợp 1mM 2.2 Điều kiện nuôi cấy: - Môi trường nuôi cấy (nguồn dinh dưỡng nitơ bon): + Glucose nguồn bon phù hợp cho phát triển hoạt tính gelatinase chủng E.coli BL21- pET 32a+/GelE + Nguồn nitơ hữu (yeast extract peptone) phù hợp cho phát triển chủng tái tổ hợp E.coli BL21- pET 32a+/GelE - Chủng E.coli BL21-pET32a+/GelE phát triển tốt hoạt tính gelatinase mạnh 370C - pH = pH phù hợp để biểu gen mã hóa gelatinase - Thời gian tăng sinh chủng biểu 16h - Sự phối hợp ion phù hợp cho tăng sinh chủng vi khuẩn tái tổ hợp E.coli BL21(DE3) - pET 32a(+)/GelE 1mM Ca2+ + 1mM Mg2+ + 1mM Mn2+ Đã xác định đặc tính gelatinase tái tổ hợp 3.1 Khả phân giải gelatin bột enzyme tái tổ hợp enzyme thương mại Sigma tương đương, hiệu suất phân giải đạt 90% 3.2 Enzyme gelatinase tái tổ hợp hoạt động tốt 500C 12 xử lý độ pH phù hợp cho hoạt động enzyme 3.3 Ảnh hưởng ion kim loại, chất tẩy rửa, dung môi hữu đến hoạt tính gelatinase là: 24 - - - Các ion Mg2+, Ca2+, Fe2+ không làm ảnh hưởng làm tăng nhẹ hoạt tính enzyme gelatinase, Các ion như: Cu2+, Co2+, Mn2+ gây ức chế hoạt tính enzyme nồng độ cao, nồng độ thấp hoạt tính gelatinase không bị ảnh hưởng nhiều Với EDTA β-mercaptoetanol gây kìm hãm mạnh hoạt tính enzyme gelatinase Tween 20 không ảnh hưởng đến hoạt tính gelatinase Triton X-100 có ảnh hưởng nhẹ đến hoạt tính gelatinase SDS nồng độ cao hoạt tính gelatinase thấp, dù SDS nồng độ thấp hoạt tính gelatinase bị giảm mạnh n-butanol (nBtOH) có ảnh hưởng ức chế rõ rệt hoạt tính enzyme gelatinase làm hoạt tính enzyme gelatinase giảm mạnh Các dung môi hữu khác methanol, ethanol, isopropanol aceton không ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính enzyme KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu điều kiện thu hồi enzyme để thu gelatinase có hoạt tính cao Nghiên cứu ứng dụng gelatinase vào thủy phân phụ phẩm chế biến cá da trơn để sản xuất sản phẩm chất lượng cao dùng cho thực phẩm, mỹ phẩm 25 [...]... tổng hợp được enzyme 3 Xác định đặc tính của gelatinase tái tổ hợp 3.1 Đánh giá hoạt tính gelatinase trên gelatin bột Kết quả được thể hiện trên biểu đồ 3.1 và hình 3.1 Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng phân giải gelatin ( 1: enzyme của Sigma, 2: enzyme tái tổ hợp) Hình 3.1 Kết quả phản ứng biure thủy phân gelatin ở 370C ( 1: enzyme của Sigma, 2: enzyme tái tổ hợp, ĐC: không bổ sung enzyme) ... hiện là 16h - Sự phối hợp các ion phù hợp cho sự tăng sinh chủng vi khuẩn tái tổ hợp E.coli BL21(DE3) - pET 32a(+)/GelE là 1mM Ca2+ + 1mM Mg2+ + 1mM Mn2+ 3 Đã xác định được các đặc tính của gelatinase tái tổ hợp 3.1 Khả năng phân giải gelatin bột của enzyme tái tổ hợp và enzyme thương mại của Sigma là tương đương, hiệu suất phân giải đạt trên 90% 3.2 Enzyme gelatinase tái tổ hợp hoạt động tốt nhất... hưởng của pH đến hoạt tính tương đối của gelatinase (Hình 3.5) Hình 3.5 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của gelatinase Kết quả hình 3.5 cho thấy: Sự bổ sung ion Ca2+ có vai trò trong việc ổn định hoạt tính của enzyme ở pH từ 7-7,5 So sánh về ảnh hưởng của ion Ca2+ và độ pH đến hoạt tính enzyme cũng chứng tỏ rằng pH = 7 thích hợp nhất đối với hoạt tính của gelatinase 3.3 Xác định đặc tính hóa học của gelatinase. .. làm tăng nhẹ hoạt tính của enzyme gelatinase Trong khi đó các ion như: Cu 2+, Co2+, Mn2+ gây ức chế hoạt tính của enzyme ở nồng độ 5 -10 mM, còn ở nồng độ thấp 2 mM thì hoạt tính của gelatinase không bị ảnh hưởng nhiều Còn đối với trường hợp của EDTA và βmercaptoetanol thì gây kìm hãm rất mạnh đối với hoạt tính của enzyme gelatinase 3.3.2 Ảnh hưởng của chất tẩy rửa đến hoạt tính của gelatinase Biểu đồ... đến hoạt tính của enzyme gelatinase Qua biểu đồ 3.4 ta thấy: n-butanol (nBtOH) có ảnh hưởng ức chế rõ rệt hoạt tính của enzyme gelatinase Các dung môi hữu cơ khác như methanol, ethanol, isopropanol và aceton hầu như không ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính của enzyme, hoạt tính của enzyme tăng nhẹ lên 103% và giảm nhẹ xuống 90% ở nồng độ thí nghiệm là 10 – 30% KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1 KẾT LUẬN 1 Đã tạo thành... EDTA và β-mercaptoetanol thì gây kìm hãm rất mạnh đối với hoạt tính của enzyme gelatinase Tween 20 hầu như không ảnh hưởng đến hoạt tính của gelatinase Triton X-100 có ảnh hưởng nhẹ đến hoạt tính của gelatinase SDS nồng độ càng cao thì hoạt tính gelatinase càng thấp, và dù SDS ở nồng độ rất thấp thì hoạt tính của gelatinase cũng bị giảm mạnh n-butanol (nBtOH) có ảnh hưởng ức chế rõ rệt hoạt tính của enzyme. .. cho thấy, gelatinase có khả năng hoạt động mạnh nhất ở mức nhiệt độ 37⁰C 20 Tiếp tục xác định thời gian thủy phân gelatin của enzyme tái tổ hợp Kết quả trong đồ thị 3.2 và hình 3.2 Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng của thời gian tới khả năng phân giải gelatin ( 1: enzyme của Sigma, 2: enzyme tái tổ hợp) Hình 3.2 Kết quả phản ứng biure thủy phân gelatin sau 48h xử lí ( 1: enzyme của Sigma, 2: enzyme tái tổ hợp, ĐC:... Xác định đặc tính hóa học của gelatinase tái tổ hợp 3.3.1 Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt tính của gelatinase 22 Dưới đây là bảng tổng kết ảnh hưởng của ion kim loại và hóa chất đến hoạt tính của enzyme gelatinase Bảng 6 Ảnh hưởng của các ion kim loại và hóa chất đến hoạt tính của gelatinase Nồng độ ion (mM) STT Ion bổ sung Không bổ sung 2 5 10 Hoạt tính tương đối (%) 2+ 1 Ca 100 111 103 115... trong 12 giờ xử lý và độ pH phù hợp cho hoạt động của enzyme là 7 3.3 Ảnh hưởng của các ion kim loại, chất tẩy rửa, dung môi hữu cơ đến hoạt tính của gelatinase là: 24 - - - Các ion Mg2+, Ca2+, Fe2+ không làm ảnh hưởng hoặc làm tăng nhẹ hoạt tính của enzyme gelatinase, Các ion như: Cu2+, Co2+, Mn2+ gây ức chế hoạt tính của enzyme ở nồng độ cao, còn ở nồng độ thấp thì hoạt tính của gelatinase không bị... bổ sung enzyme) Như vậy, hiệu xuất thủy phân của gelatinase cao nhất sau 36-48h xử lý 3.2 Xác định đặc tính vật lý của gelatinase tái tổ hợp 3.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của gelatinase Theo dõi thí nghiệm trong 12 giờ với các mẫu enzyme được xử lý ở 300C, 370C, 450C, 500C, 600C, 700C, 800C chúng tôi thu được kết quả như hình 3.3 Hình 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của gelatinase