HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM HOÀNG THỊ GIANG TẠO THỂ LAI MANG GEN KHÁNG BỆNH MỐC SƯƠNG BẰNG DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN GIỮA KHOAI TÂY DẠI VÀ KHOAI TÂY TRỒNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM HOÀNG THỊ GIANG TẠO THỂ LAI MANG GEN KHÁNG BỆNH MỐC SƢƠNG BẰNG DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN GIỮA KHOAI TÂY DẠI VÀ KHOAI TÂY TRỒNG Chuyên ngành: Di truyền chọn giống trồng Mã số: 62 62 01 11 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS.TS Nguyễn Quang Thạch TS Ramona Thieme HÀ NỘI – 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tôi, kết nghiên cứu đƣợc trình bày luận án trung thực, khách quan chƣa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận án đƣợc cám ơn, thông tin trích dẫn luận án đƣợc rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày… tháng… năm… Tác giả luận án Hoàng Thị Giang i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận án, nhận đƣợc hƣớng dẫn, bảo tận tình thầy cô giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép đƣợc bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Nguyễn Quang Thạch – Viện Sinh học Nông nghiệp – Học Viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình hƣớng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian, tâm huyết tạo điều kiện cho suốt trình học tập thực đề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Ramona Thieme, TS Thilo Hammann – Viện Nghiên cứu Chọn tạo Giống Cây trồng (Viện JKI)- CHLB Đức, ngƣời thầy tận tình tận tình hƣớng dẫn, dành nhiều thời gian công sức tạo điều kiện cho trình thực luận án Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Di truyền Chọn giống trồng, Khoa Nông học- Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ trình học tập, thực đề tài hoàn thành luận án Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán viên chức Viện Sinh học Nông nghiệp, đặc biệt cán Phòng Sinh học phân tử & Công nghệ vi sinh giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, ngƣời thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích hoàn thành luận án./ Hà Nội, ngày tháng năm 20 Nghiên cứu sinh Hoàng Thị Giang ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình ix Trích yếu luận án xi Thesis abstract xiii PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Những đóng góp đề tài 1.5 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình sản xuất khoai tây giới Việt Nam 2.2 Nguồn gen khoai tây dại tình hình khai khác nguồn gen khoai tây dại 2.2.1 Vai trò nguồn gen kháng bệnh khoai tây 2.2.2 Tình hình khai thác nguồn gen kháng bệnh chọn tạo giống khoai tây 2.3 Cơ sở khoa học phƣơng pháp dung hợp tế bào trần 10 2.3.1 Tách tế bào trần 10 2.3.2 Nuôi cấy tế bào trần 11 2.3.3 Tái sinh tế bào trần 12 2.3.4 Dung hợp tế bào trần 13 2.3.5 Chọn lọc lai soma 14 2.4 Bệnh mốc sƣơng khoai tây 15 2.4.1 Giới thiệu bệnh mốc sƣơng 15 2.4.2 Đặc điểm xâm nhiễm nấm P infestans 17 2.4.3 Cơ sở phân tử tính kháng bệnh mốc sƣơng nấm P infestans gây 18 iii 2.4.4 Các nghiên cứu gen kháng bệnh mốc sƣơng khoai tây 20 2.5 Các phƣơng pháp chọn tạo giống khoai tây 23 2.5.1 Chọn tạo giống khoai tây phƣơng pháp truyền thống 23 2.5.2 Chọn tạo giống khoai tây phƣơng pháp chuyển gen 23 2.5.3 Chọn tạo giống khoai tây phƣơng pháp dung hợp tế bào trần 24 PHẦN PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 3.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 30 3.1.1 Địa điểm nghiên cứu 30 3.1.2 Thời gian nghiên cứu 30 3.2 Vật liệu nghiên cứu 30 3.2.1 Vật liệu thực vật 30 3.2.2 Hóa chất 31 3.2.3 Thiết bị 32 3.3 Nội dung nghiên cứu 32 3.3.1 Nội dung 1: Tách dung hợp tế bào trần dòng khoai tây dại với giống khoai tây trồng 3.3.2 32 Nội dung 2: Xác định lai soma phƣơng pháp xác định độ bội (Flow cytometry) thị phân tử SSR 3.3.3 Nội dung 3: Đánh giá đặc tính kháng bệnh mốc sƣơng lai soma đặc tính nông sinh học 3.3.4 33 33 Nội dung 4: Lai lại lai soma với giống khoai tây trồng để tạo quần thể chọn lọc 34 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 34 3.4.1 Tách dung hợp tế bào trần dòng khoai tây dại với giống khoai tây trồng 3.4.2 34 Xác định lai soma đo độ bội (Flow cytometry) thị phân tử SSR 3.4.3 38 Đánh giá tính kháng bệnh mốc sƣơng lai soma lây nhiễm nhân tạo thị phân tử 3.4.4 3.5 39 Lai lại lai soma với giống khoai tây trồng để tạo quần thể chọn lọc 43 Phƣơng pháp xử lý số liệu 44 iv PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 4.1 Kết 4.1.1 Tách dung hợp tế bào trần dòng khoai tây dại với giống 45 khoai tây trồng 4.1.2 45 Dung hợp tế bào trần dòng khoai tây dại với dòng khoai tây trồng thu thập đƣợc 48 4.1.3 Nuôi cấy tái sinh tổ hợp lai sau dung hợp 51 4.1.4 Xác định lai soma phƣơng pháp đo độ bội (Flow cytometry) thị phân tử SSR 4.1.5 Đánh giá đặc tính kháng bệnh mốc sƣơng lai soma lây nhiễm nhân tạo thị phân tử 4.1.6 4.2 55 58 Nghiên cứu tạo lai trở lại lai soma với giống khoai tây trồng 73 Thảo luận 84 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 91 5.1 Kết luận 91 5.2 Kiến nghị 92 Danh mục công trình công bố 93 Tài liệu tham khảo 94 Phụ lục 104 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BA : 6-benzyl amino purine BC : Backcross CNSH : Công nghệ sinh học CT : Công thức CV : Coefficient of variation DAS – ELISA : Double Antibody Sandwich – Enzyme linked imunosorbent assay DNA : Deoxyribonucleic acid ELISA : Enzyme – linked imunosorbent assay FAO : Food and Agriculture Organization GA3 : Gibberellic Acid IAA : Indole-3-acetic acid JKI : Julius Kuehn Institute KLCTB : Khối lƣợng củ trung bình LSD : Least significant difference MS : Murashige and Skoog NAA : Naphthaleneacetic acid NSLT : Năng suất lý thuyết NSTT : Năng suất thực thu OD : Optical density PCR : Polymerase chain reaction PEG : Polyethylene glycol PVX : Potato virus X PVY : Potato virus Y RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA SAS : Statistical Analysis Systems SH : Somatic hybrid SSR : Simple sequence repeat Tm : Nhiệt độ gắn mồi UV : Ultra violet vi DANH MỤC BẢNG Tên bảng TT 2.1 Trang Năng suất lƣợng số lƣơng thực nƣớc phát triển 2.2 Tình hình sản xuất khoai tây giới năm 2013 2.3 Tốp 10 quốc gia có sản lƣợng khoai tây lớn giới 2.4 Diện tích, suất sản lƣợng khoai tây Việt Nam giai đoạn 2006 - 2013 2.5 Tổng kết kết đánh giá tính kháng loài khoai tây dại số loại sâu, bệnh hại khoai tây chống chịu với điều kiện bất thuận môi trƣờng 3.1 Các vật liệu thu thập, nguồn gốc, độ bội tính trạng mong muốn phục vụ cho lai soma 31 3.2 Các mồi sử dụng để chọn lọc lai 32 3.3 Các cặp mồi phát gen kháng mốc sƣơng 32 4.1 Ảnh hƣởng nồng độ macerozym cellulase dung dịch enzym đến hiệu suất tách tế bào trần dòng/giống khoai tây thí nghiệm 4.2 Ảnh hƣởng thời gian ủ mô dung dịch enzym đến hiệu suất tế bào trần thu đƣợc 4.3 47 Ảnh hƣởng tần số dung hợp số lần xung đến chất lƣợng tế bào sau dung hợp (Nghiên cứu tổ hợp lai Solanum bulbocastanum Delikat) 4.4 45 48 Kết tái sinh độ bội lai tái sinh sau dung hợp mật độ tế bào dung hợp khác (Nghiên cứu tổ hợp lai Solanum bulbocastanum Delikat) 4.5 50 Kết dung hợp dòng khoai tây dại nhị bội với giống khoai tây trồng tứ bội phƣơng pháp xung điện 4.6 4.7 51 Sự phân chia tổ hợp lai sau dung hợp điều kiện môi trƣờng khác 52 Sự phân chia tổ hợp lai môi trƣờng nuôi cấy khác 53 vii 4.8 Ảnh hƣởng môi trƣờng tái sinh khác đến khả tạo chồi tổ hợp lai 54 4.9 Kết nuôi cấy tái sinh chồi tổ hợp lai sau dung hợp 55 4.10 Kết tái sinh phân tích độ bội thể tổ hợp lai sau dung hợp 56 4.11 Kết chọn lọc lai soma phân tích độ bội thị phân tử SSR 58 4.12 Đặc điểm hình thái nấm P infestans trình nuôi cấy 59 4.13 Phản ứng số giống khoai tây với mẫu mốc sƣơng thu thập từ Hà Nội Lạng Sơn 4.14 59 Kết đánh giá tính kháng bệnh mốc sƣơng lai soma dòng bố mẹ lây nhiễm nhân tạo đơn tách rời 4.15 Kết đánh giá tính kháng bệnh mốc sƣơng lai soma dòng bố mẹ lây nhiễm nhân tạo lát cắt củ (tuber slice test) 4.16 63 Kết đánh giá lai soma dòng bố mẹ khả kháng bệnh mốc sƣơng đồng ruộng đánh giá thành thục 4.17 61 64 Kết đánh giá tính trạng nông sinh học dòng/giống khoai tây bố mẹ lai soma 68 4.18 Đánh giá tính trạng củ lai soma dòng bố mẹ 70 4.19 Kết lai lai trở lại lai soma với giống khoai tây trồng làm bố 74 4.20 Đánh giá khả kháng bệnh mốc sƣơng lai BC1 giai đoạn 75 4.21-A Kết đánh giá tính trạng nông sinh học lai BC 78 4.21-B Kết đánh giá tính trạng nông sinh học lai BC 79 4.22 Kết đánh giá suất yếu tố cấu thành suất cá lai BC1 80 viii XỬ LÝ SỐ LIỆU theo chƣơng trình SAS 9.1 I- Xử lý số liệu phần đánh giá dòng lai kháng nh mốc sƣơng CHIEU CAO CAY 01:19 Friday, September 15, 2014 The ANOVA Procedure Dependent Variable: N Source DF Model 19 Error Sum of Squares 4730.392750 20 Corrected Total Mean Square F Value 49.375000 39 248.968039 Root MSE 0.989670 3.822236 1.571226 T 19 CHIEU CAO CAY F Anova SS 4730.392750 N Mean 41.10750 Mean Square 248.968039 F Value 100.85 Pr > F [...]... cứu Tạo đƣợc các con lai soma bằng dung hợp tế bào trần giữa các loài khoai tây dại nhị bội với các giống khoai tây trồng tứ bội nhằm chuyển tính kháng bệnh mốc sƣơng từ loài dại vào khoai tây trồng, sau đó lai trở lại (backcross) với khoai tây trồng nhằm tạo đƣợc nguồn vật liệu di truyền khoai tây kháng bệnh mốc sƣơng Phƣơng pháp nghiên cứu - Vật liệu nghiên cứu: Các dòng khoai tây dại kháng bệnh mốc. .. bằng dung hợp tế bào trần giữa các loài khoai tây dại nhị bội với các giống khoai tây trồng tứ bội nhằm chuyển tính kháng bệnh mốc sƣơng từ loài dại vào khoai tây trồng Tạo đƣợc các con lai lại (backcross) giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng tứ bội nhằm tạo đƣợc dòng vật liệu di truyền khoai tây mang gen kháng và có đặc điểm nông sinh học phù hợp phục vụ phát triển giống khoai tây kháng. .. trn3G và blb2G) mang gen kháng bệnh mốc sƣơng và dung hợp với tế bào trần từ các giống khoai tây trồng tứ bội Delikat, Atlantic, Agave và Rasant, mẫn cảm với bệnh mốc sƣơng 1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Xác định đƣợc các thông số để tách, dung hợp, nuôi cấy tái sinh tế bào trần giữa các loài khoai tây dại nhị bội kháng bệnh mốc sƣơng và các giống khoai tây trồng mẫn cảm với bệnh mốc sƣơng Tạo đƣợc các con lai. .. con lai soma của tổ hợp lai giữa dòng khoai tây dại S bulbocastanum với giống khoai tây trồng Delikat (2295/2, 2292/4, 2181/10 và 2283/5) mang gen kháng bệnh mốc sƣơng Rpi-blb1 và Rpi-blb3 là nguồn vật liệu kháng bệnh khoai tây có giá trị cho chƣơng trình chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh của Việt Nam - Đã lai trở lại thành công giữa các con lai soma với khoai tây trồng tạo đƣợc 11 tổ hợp lai và chọn... C- con lai soma pnt2G (+) Atlantic; D- BC1 của tổ hợp lai khoai tây của một số tổ hợp lai pnt2G (+) Atlantic với giống khoai tây trồng Atlantic 83 x TRÍCH YẾU LUẬN ÁN Tên tác giả: Hoàng Thị Giang Tên Luận án: Tạo thể lai mang gen kháng bệnh mốc sƣơng bằng dung hợp tế bào trần giữa khoai tây dại và khoai tây trồng Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng Mã số: 62 62 01 11 Tên cơ sở đào tạo: Học... các con lai soma với các giống khoai tây trồng để tạo quần thể chọn lọc Kết quả chính - Đã xác định đƣợc các thông số để dung hợp tế bào trần giữa khoai tây dại mang gen kháng bệnh mốc sƣơng và khoai tây trồng bao gồm: nồng độ dung dịch enzym thích hợp cho từng dòng/giống; thời gian ủ thích hợp của các mẫu lá trong dung dịch enzyme đối với các dòng/giống khoai tây dao động từ 14-16 giờ; dung hợp ở thông... có thể sử dụng kỹ thuật nhiễm sắc thể, lai bắc cầu, thụ phấn mento, xử lý auxin và cứu phôi Dung hợp tế bào trần để tạo con lai, gọi là con lai soma, là một giải pháp để khắc phục rào cản lai xa (Oberwalder et al., 2000; Wielgat and Wasilewska, 2001) và chuyển nhiều gen kháng vào khoai tây trồng Dung hợp tế bào trần hay lai soma có thể chuyển các tính trạng đơn gen và đa gen từ các loài hoang dại vào... thể lai soma có khả năng kháng bệnh mốc sƣơng và mang các đặc tính nông sinh học phù hợp 1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI Đã xác định đƣợc các thông số để dung hợp tế bào trần giữa khoai tây dại mang gen kháng bệnh mốc sƣơng và khoai tây trồng bao gồm: nồng độ dung dịch enzym thích hợp cho từng dòng/giống; thời gian ủ thích hợp của các mẫu lá trong dung dịch enzyme đối với các dòng/giống khoai tây. .. độ tế bào thích hợp nhất để xung điện là từ 4x 105 tế bào/ ml đến 5x 105 tế bào/ ml; môi trƣờng nuôi cấy các sản phẩm sau dung hợp là môi trƣờng VKMII lỏng; môi trƣờng Cul-medium để tạo callus và môi trƣờng RJM để tái sinh chồi - Đã lai thành công soma bằng dung hợp tế bào giữa khoai tây dại nhị bội (2x) mang gen kháng bệnh mốc sƣơng (S bulbocastanum, S pinnatisectum, S tarnii) với giống khoai tây trồng. .. chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh của Việt Nam Đã lai trở lại thành công giữa các con lai soma với khoai tây trồng tạo đƣợc 11 tổ hợp lai và chọn đƣợc 4 con lai từ tổ hợp lai blb2G (+) Delikat/2283/5 x Delikat (13.1303.2, 13.1303.4, 13.1303.6 và 13.1303.11) mang gen kháng bệnh mốc sƣơng đồng thời có các đặc điểm nông sinh học phù hợp, đây là nguồn vật liệu có giá trị cho chọn giống khoai tây kháng bệnh