ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM VŨ THỊ ANH ĐÀO VŨ THỊ ANH ĐÀO NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX (L.) MERRILL) ĐỊA PHƯƠNG NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX (L.) MERRILL) ĐỊA PHƯƠNG Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS Chu Hoàng Mậu THÁI NGUYÊN - 2009 THÁI NGUYÊN - 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Lời cam đoan Lời cảm ơn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Chu Hoàng Mậu tận tình Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa có công bố công trình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện giúp đỡ hoàn thành công trình nghiên cứu Tôi xin cảm ơn CN Nguyễn Ích Chiến (Phòng thí nghiệm Di truyền học khác Công nghệ gen - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên) giúp đỡ trình hoàn thành luận văn Tác giả Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy Cô giáo, Cán Khoa Sinh - KTNN tạo điều kiện giúp đỡ trình học tập hoàn thành luận văn Vũ Thị Anh Đào Tôi xin cảm ơn động viên, khích lệ gia đình, bạn bè đồng nghiệp suốt thời gian làm luận văn Tác giả Vũ Thị Anh Đào i Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ii http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT ABA Trang Abscisic Acid Lời cam đoan i DNA Axit deoxyribonucleic AFLP Fragment Length Polymorphism ( Sự đa hình chiều dài phân đoạn ADN khuếch đại) Lời cảm ơn ii Những chữ viết tắt iii ASTT Áp suất thẩm thấu CS Cộng Mục lục .iv EDTA Ethylene Diamin Tetraaxetic Acid Danh mục bảng vii Kb Kilobase LEA Late Embryogeneis Abundant protein (Protein tổng hợp với số lượng lớn Danh mục hình .ix giai đoạn cuối trình phát triển phôi) MỞ ĐẦU PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU RAPD Random Amplified Polymorphism DNA (Phân tích ADN đa hình 1.1 Đặc điểm thực vật học hóa sinh học hạt đậu tương nhân ngẫu nhiên) 1.2 Nghiên cứu khả phản ứng đậu tương đốivới hạn Restriction Fragment Length Polymorphism (Sự đa hình chiều dài 1.2.1 Sự phản ứng đậu tương hạn giai đoạn hạt nảy mầm .4 phân đoạn ADN cắt hạn chế) 1.2.2 Sự phản ứng đậu tương hạn giai đoạn non .7 Sodium Dodecyl Sulphat 1.3 Sử dụng kỹ thuật RAPD nghiên cứu đa dạng di truyền mức phân tử RFLP SDS SDS-PAGE Phương pháp điện di gel polyacrylamid có chứa SDS 1.3.1 RAPD SSR Simple Sequence Repeats 1.3.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền RAPD 10 TBE Tris - Boric acid - EDTA Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 TAE Tris - Acetate - EDTA 2.1 Vật liệu nghiên cứu 12 TE Tris - EDTA 2.1.1.Vật liệu thực vật .12 Tris Trioxymetylaminometan 2.1.2 Các hoá chất thiết bị 12 NAA Naphthyl acetic acid (Axit naphthyl acetic) 2.2 Phương pháp nghiên cứu 13 2.2.1 Phương pháp xác định sinh trưởng rễ mầm thân mầm 13 2.2.2 Phương pháp hóa sinh .14 2.2.2.1 Phân tích hoá sinh giai đoạn hạt tiềm sinh 14 2.2.2.2 Đánh giá khả chịu hạn thông qua phân tích số tiêu hoá sinh giai đoạn hạt nảy mầm 15 iii Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên iv http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.3 Phương pháp sinh lý 17 3.2 Kết phân tích tính đa dạng di truyền mức phân tử ADN giống đậu 2.2.3.1 Đánh giá khả chịu hạn giai đoạn non phương pháp gây hạn tương nghiên cứu .48 nhân tạo .17 3.2.1 Kết tách chiết ADN tổng số .48 2.2.3.2 Xác định hàm lượng proline 18 3.2.2 Phân tích đa hình ADN kỹ thuật RAPD .49 2.2.4 Phương pháp sinh học phân tử 19 2.2.4.1 Phương pháp tách ADN tổng số từ mầm đậu tương 19 2.2.4.2 Phản ứng RAPD 19 2.2.4.3 Phân tích số liệu RAPD 19 3.2.3 Nhận xét kết phân tích đa hình ADN hệ gen 16 giống đậu tương địa phương 60 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .61 CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN .63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 2.2.5 Phương pháp xử lý kết tính toán số liệu 20 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 3.1 Kết phân tích tính đa dạng kiểu hình giống đậu tương nghiên cứu .21 3.1.1.Đặc điểm hình thái, kích thước khối lượng hóa sinh hạt 16 giống đậu tương 21 3.1.1.1 Hình thái, kích thước khối lượng hạt .21 3.1.1.2 Hàm lượng protein, lipit .23 3.1.2 Khả phản ứng 16 giống đậu tương giai đoạn hạt nảy mầm 26 3.1.2.1 Kích thước rễ mầm thân mầm 26 3.1.2.2 Hoạt độ enzym α - amilase hàm lượng đường hạt nảy mầm giống đậu tương tác động sorbitol % 28 3.1.2.3 Hoạt độ enzym protease hàm lượng protein hạt nảy mầm giống đậu tương tác động sorbitol % 33 3.1.2.4 Nhận xét .38 3.1.3 Khả phản ứng hạn 16 giống đậu tương giai đoạn non 39 3.1.3.1 Tỷ lệ thiệt hại 39 3.1.3.2 Chỉ số chịu hạn tương đối 41 3.1.3.3 Hàm lượng protein prolin 42 3.1.3.4 Nhận xét .46 3.1.4 Sự phân bố giống đậu tương nghiên cứu 46 v Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên vi http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 3.18 Tính đa hình phân đoạn ADN nhân 10 mồi ngẫu nhiên .51 Bảng 3.19 Thông tin tính đa hình (PIC) 16 giống đậu tương 52 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.20 Giá trị tương quan kiểu hình (r) .58 Bảng 3.21 Hệ số tương đồng giống đậu tương nghiên cứu 59 Bảng 2.1 Nguồn gốc giống đậu tương nghiên cứu .13 Bảng 2.2 Trình tự nucleotit 10 mồi RAPD sử dụng nghiên cứu .20 Bảng 3.1 Hình dạng, màu sắc, kích thước, khối lượng 1000 hạt 16 giống đậu tương địa phương 22 Bảng 3.2 Hàm lượng lipit protein 16 giống đậu tương (% KL khô) 24 Bảng 3.3 Chiều dài rễ mầm giống đậu tương nghiên cứu 26 Bảng 3.4 Chiều dài thân mầm giống đậu tương 27 Bảng 3.5 Hoạt độ enzyme α – amylase giai đoạn hạt nảy mầm xử lý sorbitol 7% 16 giống đậu tương 29 Bảng 3.6 Hàm lượng đường tan giai đoạn hạt nảy mầm xử lý sorbitol 7% 16 giống đậu tương 31 Bảng 3.7 Tương quan hoạt độ enzyme –amylase hàm lượng đường tan 33 Bảng 3.8 Hoạt độ protease giai đoạn hạt nảy mầm xử lý sorbitol 7% 34 Bảng 3.9 Hàm lượng protein giai đoạn hạt nảy mầm xử lý sorbitol 7% .36 Bảng 3.10 Tương quan hoạt độ enzyme protease hàm lượng protein .37 Bảng 3.11 Tỷ lệ thiệt hại 16 giống đậu tương giai đoạn non 40 Bảng 3.12 Chỉ số chịu hạn tương đối giống đậu tương 42 Bảng 3.13 Hàm lượng prolin giống đậu tương điều kiện hạn nhân tạo 44 Bảng 3.14 Hàm lượng protein giống đậu tương điều kiện hạn nhân tạo 45 Bảng 3.15 Hệ số khác giống đậu tương 46 Bảng 3.16 Hàm lượng độ tinh ADN 16 giống đậu tương nghiên cứu .48 Bảng 3.17 Tổng số phân đoạn ADN nhân 16 giống đậu tương phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên 50 vii Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên viii http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU DANH MỤC CÁC HÌNH Trang ĐẶT VẤN ĐỀ Đậu tương loại trồng chiến lược nhiều quốc gia giới Hạt Hình 3.1 Hạt giống đậu tương nghiên cứu 21 đậu tương có hàm lượng chất dinh dưỡng cao: 40% - 50% protein, 18% -25% Hình 3.2 Biểu đồ so sánh hàm lượng protein lipit 16 giống đậu tương .25 lipit, chứa nhiều loại axit amin cần thiết (lizin, triptophan, metionin, xystein, lozin ) Hình 3.3 Hình ảnh đậu tương trước xử lý hạn .39 nhiều loại vitamin (B1, B2, C, D, E, K ), nguồn lượng cần thiết cho Hình 3.4 Biểu đồ tỉ lệ thiệt hại giống đậu tương nghiên cứu 41 sống người Hình 3.5 Sơ đồ quan hệ giống đậu tương dựa phản ứng trước tác Cây đậu tương có thời gian sinh trưởng ngắn, hệ rễ có nốt sần mang vi khuẩn cố định động hạn 47 Hình 3.6 Kết điện di ADN tổng số giống đậu tương gel agarose 0,8% 48 Hình 3.7 Kết điện di sản phẩm RAPD gel agarose 1,8% với mồi M1 53 Hình 3.8 Kết điện di sản phẩm RAPD gel agarose 1,8% với mồi M8 53 đạm nên đậu tương thường trồng luân canh với lúa ngô để tăng vụ cải tạo đất bạc màu Với giá trị to lớn mà đậu tương trồng phổ biến nhiều nơi từ vùng ôn đới đến vùng nhiệt đới, từ 550 vĩ Bắc đến 550 vĩ Nam, từ vùng thấp mực nước biển vùng cao 2000m so với mực nước biển với diện tích khoảng 74,4 triệu [3], [8] Trong đó, chúng trồng nhiều Hình 3.9 Kết điện di sản phẩm RAPD gel agarose 1,8% với mồi M3 54 Mỹ, Braxin, Argentina, Trung Quốc, Ấn Độ Hình 3.10 Kết điện di sản phẩm RAPD gel agarose 1,8% với mồi M5 .54 Ở Việt Nam đậu tương gieo trồng vùng nông nghiệp nước Hình 3.11 Kết điện di sản phẩm RAPD gel agarose 1,8% với mồi M2 .55 Các giống đậu tương nước ta phong phú gồm giống đậu tương Hình 3.12 Kết điện di sản phẩm RAPD gel agarose 1,8% với mồi M4 .55 nhập nội, giống lai tạo, giống đậu tương đột biến tập đoàn giống đậu tương địa Hình 3.13 Kết điện di sản phẩm RAPD gel agarose 1,8% với mồi M6 .56 phương Các giống đa dạng phong phú kiểu hình kiểu gen, Hình 3.14 Kết điện di sản phẩm RAPD gel agarose 1,8% với mồi M9 .56 nguồn nguyên liệu để chọn tạo giống đậu tương cho suất chất lượng phù Hình 3.15 Kết điện di sản phẩm RAPD gel agarose 1,8% với mồi M7 mồi M10 .57 hợp với mục tiêu chọn giống [8] Hình 3.16 Biểu đồ hình giống đậu tương nghiên cứu theo kiểu phân nhóm Đậu tương tương đối mẫm cảm với điều kiện ngoại cảnh thuộc vào nhóm UPGMA .59 chịu hạn Vì đánh giá đa dạng di truyền giống đậu tương địa phương để tạo sở cho công tác lai tạo giống đề xuất biện pháp nâng cao tính chịu hạn vấn đề quan tâm nghiên cứu Hiện có nhiều phương pháp ứng dụng phân tích đa dạng di truyền giống trồng nói chung đậu tương nói riêng RFLP, AFLP, SSR, RAPD Các phương pháp phát huy hiệu mà khắc phục nhược điểm phương pháp chọn giống truyền thống hiệu sàng lọc cao, nhanh, tin cậy Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ix Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn http://www.lrc-tnu.edu.vn Trong số phương pháp kể RAPD phương pháp sử dụng rộng Chƣơng rãi phương pháp dễ thực tốn mà đánh giá đa TỔNG QUAN TÀI LIỆU dạng di truyền mối quan hệ di truyền mức độ phân tử Chỉ thị RAPD cho độ đa hình cao nên sử dụng để nghiên cứu đa dạng sinh học, liên kết tính trạng số lượng, đánh giá sai khác hệ gen dòng chọn lọc ứng dụng 1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC VÀ HOÁ SINH HẠT ĐẬU TƢƠNG Đậu tương có tên khoa học (Glycine Max (L.) Merrill) thuộc họ đậu chọn tạo giống trồng Chính việc nghiên cứu đa dạng di truyền mức ADN phản ứng hạn giai đoạn hạt nảy mầm, giai đoạn non sở khoa học để đề xuất việc chọn giống đậu tương có khả chịu hạn góp phần bảo tồn, phát triển nguồn gen đậu tương, tuyển chọn giống đậu tương thích hợp làm vật liệu chọn giống vấn đề quan tâm nghiên cứu Xuất phát từ lý chọn đề tài: “Nghiên cứu đa dạng di truyền số giống đậu tương (Glycine Max (L.) Merrill) địa phương” (Fabaceae), họ phụ cánh bướm (Papilionoidace) có NST 2n = 40, có nguồn gốc từ Trung Quốc loại trồng hàng năm không thấy xuất loài hoang dại Các giống đậu tương địa phương nước ta du nhập từ Trung Quốc từ lâu [3] Cây đậu tương trồng cạn thu hạt, gồm phận chính: rễ, thân, lá, hoa, hạt Rễ đậu tương rễ cọc, gồm rễ rễ phụ, rễ có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum, có khả cố định đạm không khí tạo thành đạm dễ tiêu [3] Các công trình nghiên cứu cho thấy giống có khả cộng sinh có đủ nốt sần thường làm cho hàm lượng protein cao, trồng đậu tương có tác dụng cải tạo đất Thân đậu tương thân thảo, phân cành dạng MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU bụi, đậu tương kép với chét, có 4-5 chét Đậu tương Xác định đa dạng di truyền giống đậu tương địa phương mức tự thụ phấn, hoa đậu tương nhỏ, không hương vị, có màu tím, tím nhạt trắng, hoa mọc từ nách ngọn, đậu tương thuộc loại ráp, thẳng kiểu hình mức phân tử ADN cong, có nhiều lông chín có màu vàng xám Hạt đậu tương nội NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Khảo sát đa dạng kiểu hình giống đậu tương thông qua đặc điểm hình thái, hóa sinh - Xác định hàm lượng protein, hàm lượng đường, hoạt độ enzym amylase, enzym protease giai đoạn hạt nảy mầm nhũ mà có lớp vỏ bao quanh phôi lớn Hạt có hình tròn bầu dục, tròn dài, tròn dẹt, ovan vỏ hạt thường nhẵn có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu, đen đa số hạt màu vàng Khối lượng hạt đa dạng dao động từ 20-400 mg/ hạt Màu sắc rốn hạt giống khác nhau, biểu đặc trưng giống Cây đậu tương có loại hình sinh trưởng: sinh trưởng hữu hạn sinh trưởng - Phân tích phản ứng hạn giống đậu tương điều kiện hạn nhân tạo vô hạn, thời gian sinh trưởng thường chia nhóm chín sớm, trung bình muộn Theo thời gian sinh trưởng Piper Mosse cho giống đậu tương chín - Sử dụng kỹ thuật RAPD với 10 mồi ngẫu nhiên để nhân đoạn ADN từ sớm (75-90 ngày), giống chín sớm (90-100 ngày), giống chín trung bình ADN hệ gen giống đậu tương địa phương (100-110 ngày), loại chín muộn trung bình (110-120 ngày), giống chín muộn - Thiết lập sơ đồ hình xác định khoảng cách di truyền giống đậu (130-140 ngày), giống chín muộn (140-150 ngày) thời gian sinh trưởng tương nghiên cứu yếu tố quan trọng để lựa chọn trồng luân canh xen vụ Đậu tương tương Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh Trong tập đoàn giống đậu tương có nước Trong trình nảy mầm nhu cầu nước đậu tương cao giống trồng vào vụ hè, có giống trồng vào vụ đông, có giống 50%, ngô 30%, lúa 26% [8] trồng vụ xuân hè có giống trồng thích hợp với vụ thu đông [8] Khi nghiên cứu đặc tính chịu hạn đậu tương phương diện sinh lí Đậu tương trồng lấy hạt, cung cấp dầu quan trọng di truyền cho thấy, đặc tính liên quan chặt chẽ đến đặc điểm hoá keo lấy dầu Hiện qua thống kê FAO cho thấy từ năm 1980 trở lại sản nguyên sinh chất, đặc điểm trình trao đổi chất Tính chịu hạn đậu lượng đậu tương giới tăng lên lần chủ yếu nhờ vào tăng suất diện tương mang tính đa gen Chúng thể nhiều khía cạnh khác nhau: phát tích Trong vòng 20 năm qua diện tích gieo trồng tăng nhanh, suất bình quân triển nhanh rễ, tính chín sớm tương đối chất di truyền tăng cao 23 tạ/ha Các nước sản xuất đậu tương đứng đầu giới: Mỹ, Brazin, giống có khả sử dụng nước tiết kiệm trình sinh trưởng phát triển Argentina Trung Quốc chiếm khoảng 90-95% tổng sản lượng đậu tương giới [8] Trong môi trường khô hạn, chống lại nước nhanh chóng bù lại Ở Việt Nam, đậu tương trồng vùng nông nghiệp, phần nước bị nhờ hoạt động rễ điều chỉnh ASTT tế bào vùng núi phía Bắc có diện tích gieo trồng lớn 46,6%, đồng Sông Ngoài ra, chống chịu hạn biến đổi hình thái có Hồng 19,3%, vùng Tây Nguyên 11%, miền Đông Nam Bộ 10,2%, đồng Sông nhiều lông, lớp cutin dày, cuộn lại thành ống để giảm thoát nước Cửu Long 8,9%, khu Bốn 2,3% vùng Duyên hải miền Trung 1,6% [8] Cây đậu Phân tích thành phần hóa sinh chịu hạn, nghiên cứu cho tương chiếm vị trí quan trọng nông nghiệp nước ta, đặc biệt gặp hạn có tượng tăng lên hàm lượng ABA, hàm lượng proline, vùng nông thôn nghèo, kinh tế chưa phát triển nồng độ ion K+, loại đường, hoạt độ enzym, axit hữu giảm phức hợp Tuy nhiên việc sản xuất đậu tương nước chưa đầu tư cao, suất CO2, protein axit nucleic [1], [12] Sự tổng hợp tích luỹ chất diễn thấp, nghiên cứu cải tiến đặc điểm nông học giống địa nhanh tế bào bị nước, với hai chức (1) điều chỉnh ASTT nhờ phương tạo giống có suất cao, thích nghi với điều kiện sinh thái khả giữ nước lấy nước vào tế bào (2) ngăn chặn xâm nhập ion Na + vùng khác phương pháp truyền thống kết hợp với đại đáp ứng chất Chúng thay vị trí nước nơi xảy phản ứng hóa sinh, yêu cầu thực tiễn đặt chiến lược quan trọng phát triển tương tác với lipit protein màng, ngăn chặn phá hủy màng phức đậu đỗ nước ta protein màng Quá trình liên quan đến biểu gen, hàng loạt 1.2 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHẢN ỨNG CỦA CÂY ĐẬU TƢƠNG ĐỐI gen nghỉ hoạt hóa tổng hợp chất cần thiết để chống lại khô hạn [1] VỚI HẠN Wan Li (2006), nghiên cứu Arabidopsis thaliana kết luận rằng, 1.2.1 Sự phản ứng đậu tƣơng hạn giai đoạn hạt nảy mầm gặp hạn tích lũy ABA tăng cường lạc tác giả chứng minh Cây họ đậu nói chung, đậu tương nói riêng có nhu cầu nước cao NAA có tác dụng tăng cường tổng hợp ABA dẫn đến biểu gen loại khác chịu hạn Đó hạt đậu AhNCED1 [31] tương có hàm lượng protein lipit cao, để tổng hợp 1kg chất khô cần 500-530 kg Nhiều nghiên cứu sử dụng tác động ngoại cảnh, thổi khô, hạn sinh lý để khảo sát phản ứng hạn giống trồng giai đoạn hạt nảy mầm Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Enzyme chất xúc tác sinh học có hiệu cao Trong giai đoạn hạt nảy mầm đạt cực đại vào ngày thứ bắt đầu giảm giai đoạn ngày hạn Hàm lượng trình chuyển hoá chất diễn mạnh, hoạt động enzyme diễn protein protease có mối tương quan thuận Trong giai đoạn hạt nảy mầm 1, 3, 5, mạnh Ở giai đoạn hai enzym có vai trò quan trọng enzyme  - amylase và ngày tuổi không xử lý sorbitol hoạt độ protease hàm lượng protein enzym protease thấp so với hoạt độ protease hàm lượng protein hạt nảy mầm xử Enzyme α-amylase enzym quan trọng trình thủy phân lý sorbitol 7% Như vậy, áp suất thẩm thấu cao có ảnh hưởng rõ lên hoạt độ tinh bột thành dextrin mantose Sự tăng hoạt độ enzyme α-amylase làm tăng hàm protease [11] lượng đường tan Một số nghiên cứu đối tượng khác như: lúa, đậu xanh, lạc cho thấy Nguyễn Thị Thúy Hường (2005) thấy rằng, đậu tương hàm lượng đường tan điều kiện hạn sinh lý có gia tăng hoạt độ enzym protease có mối tương quan liên quan trực tiếp đến khả chống chịu trồng Đường tan thuận hàm lượng protein hoạt độ protease thể khả phản ứng chất tham gia điều chỉnh ASTT tế bào Sự gia tăng hoạt độ hạn khác giống enzyme α-amylase làm tăng hàm lượng đường tan làm tăng ASTT tăng 1.2.2 Sự phản ứng đậu tƣơng hạn giai đoạn non khả phản ứng hạn [5] Hạn tác động lên theo hai hướng là: làm tăng nhiệt độ gây Hà Tiến Sỹ (2007) nghiên cứu giống đậu tương địa phương tỉnh Cao nước Nước yếu tố giới hạn trồng, vừa nguyên liệu Bằng rút nhận xét, hoạt độ enzyme α-amylase hàm lượng đường tan có mối khởi đầu vừa sản phẩm trung gian cuối trình chuyển hoá sinh tương quan thuận chặt chẽ, liên quan đến khả nảy mầm hạt sinh học Nước môi trường để phản ứng trao đổi chất xảy ra, việc cung cấp trưởng mầm Giữa giống có thay đổi hoạt độ enzyme α-amylase nước cho trồng hướng nghiên cứu tăng cường tính chịu hạn trồng hàm lượng đường tan khác liên quan đến khả phản ứng hạn mục tiêu trình tạo giống chống chịu thường xuyên quan tâm Thiếu giống [13] nước trước tiên ảnh hưởng đến cân nước cây, từ ảnh hưởng Khi nghiên cứu lúa, lạc [12], [7] tác giả rút kết luận tương tự đến chức sinh lý khác quang hợp, hô hấp, dinh dưỡng khoáng cuối Trong điều kiện thiếu nước, enzym protease hoạt động cách tích cực phân giải protein để tạo polypeptit ngắn tan môi trường nội bào làm tăng ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển Mức độ thiếu hụt nước lớn ảnh hưởng xấu đến trình sinh trưởng phát triển cây, thiếu nước nhẹ làm giảm tốc độ sinh trưởng, thiếu nước trầm trọng làm biến đổi hệ keo nguyên ASTT tăng khả phản ứng hạn Trần Thị Phương Liên (1999) nghiên cứu số giống đậu tương có khả chịu nóng hạn nhận xét rằng, hoạt độ enzym protease trình nảy mầm hạt tất giống nghiên cứu đa dạng, có hoạt tính cao, có khả phân giải hoàn toàn protein dự trữ tạo nguyên liệu để tổng hợp protein cho thể [6] Đinh Thị Ngọc (2008) nghiên cứu số giống đậu tương Tây Nguyên rút nhận xét giai đoạn hạt nảy mầm, điều kiện bổ sung sorbitol nồng độ sinh chất làm tăng cường trình già hoá tế bào bị khô kiệt nước, nguyên sinh chất bị đứt vỡ học dẫn đến tế bào, mô bị tổn thương chết Đối với thực vật nói chung trồng nói riêng, hạn ảnh hưởng tới trình sinh trưởng, phát triển non giai đoạn hoa Theo thông báo Chen Murant (2002), sức chống chịu thực vật tăng lên chuyển gen mã hóa enzyme tham gia vào đường sinh tổng hợp 7%, hoạt độ protease hàm lượng protein tan biến đổi theo xu hướng tăng dần Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn proline tế bào [21] Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy tích lũy proline có vào Mg2+, nồng độ dNTP, pH, nhiệt độ biến tính ADN; Bốn loại deoxyribonucleotit thể tăng từ 10 đến 100 lần thực vật tác động ASTT triphotphat (dNTP): ATP, TTP, CTP, GTP; Ion Mg2+ Nguyễn Thị Thúy Hường (2005) gây hạn nhân tạo đậu tương địa phương Phản ứng RAPD tiến hành qua giai đoạn: (1) Giai đoạn biến tính ADN: tỉnh Sơn La nhận thấy, có tăng nhanh hàm lượng prolin giảm hàm lượng nhiệt độ 950C khoảng 30-60 giây làm cho hai mạch khuôn ADN tách (2) protein giống nghiên cứu, hàm lượng proline giống cao so với Giai đoạn tiếp hợp mồi: nhiệt độ hạ xuống 32-400C mồi tiếp hợp bám vào sợi đối chứng Khả chịu hạn đậu tương phụ thuộc tuyến tính vào hàm ADN khuôn (3) Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ nâng lên 720 C đoạn mồi lượng proline Điều đó, chứng tỏ đậu tương có phản ứng cách tích cực bắt cặp với mạch đơn kéo dài với tham gia Taq polymerase trước thay đổi điều kiện môi trường [5] Sau chu kỳ gồm ba giai đoạn trên, phân đoạn ADN khuôn nhân Hà Tiến Sỹ (2007) nghiên cứu khả chịu hạn giống đậu tương địa lên thành hai, đoạn ADN nhân chu kỳ lại coi ADN phương tỉnh Cao Bằng, Đinh Thị Ngọc (2008) nghiên cứu khả chịu hạn khuôn cho chu kỳ nhân Vậy sau k chu kỳ nhân tạo 2k các giống đậu tương trồng vùng Tây Nguyên rút nhận xét tương tự đoạn ADN giống đoạn ADN khuôn ban đầu RAPD thực từ 40 - 45 chu [11], [13] kỳ Như vậy, thành phần bước phản ứng RAPD dựa sở phản Kết nhận nghiên cứu đối tượng khác lúa, lạc [12], [7] ứng PCR khác chỗ nồng độ Mg2+ thành phần phản ứng cao hơn, mồi 1.3 SỬ DỤNG KỸ THUẬT RAPD TRONG NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI đơn ngắn (10bp) tiếp hợp nhiều vị trí ADN kết nhân TRUYỀN Ở MỨC PHÂN TỬ số đoạn ADN từ hai phân đoạn ADN trở lên Mỗi đoạn ADN nhân có kích thước 100-5000bp 1.3.1 RAPD Kỹ thuật RAPD kỹ thuật phân tích đa hình chiều dài phân đoạn ADN nhân nhờ mồi ngẫu nhiên có kích thước 10bp, hai nhóm nghiên cứu Williams CS (1990) [32] Welsh McClelland (1991) [33] đồng thời xây dựng Đây kỹ thuật phát thị di truyền dựa phản ứng chuỗi polymerase (PCR) Kỹ thuật RAPD phương pháp tương đối đơn giản đánh giá hệ gen thực vật, khắc phục nhược điểm phương pháp chọn giống truyền thống mà góp bảo tồn nguồn gen trồng nâng cao hiệu chọn lọc Các yếu tố cần thiết để tiến hành phản ứng RAPD bao gồm: ADN khuôn (DNA template); Đoạn mồi (primer): sử dụng mồi mồi oligonucleotit có trật tự nucleotit ngẫu nhiên có chiều dài khoảng 10 nucleotit, C + G chiếm 60%; ADN - polymerase (Taq polymerase): hoạt động Taq polymerase phụ thuộc Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Sử dụng kỹ thuật RAPD không cần biết trình tự đoạn ADN cần nghiên cứu, quy trình tiến hành nhanh, cần lượng nhỏ ADN khuôn cần mồi sử dụng với loài khác Kỹ thuật RAPD có ưu điểm chỗ sử dụng mồi ngẫu nhiên dài 10 nucleotit, trình nhân ADN ngẫu nhiên Đoạn mồi bám vào vị trí có trình tự nucleotit bổ sung phân tử ADN hệ gen Với đặc điểm ngắn nên xác suất đoạn mồi có điểm gắn phân tử ADN khuôn lớn Tùy vào nhóm, loài thực vật hay vi sinh vật mà đoạn mồi ngẫu nhiên thiết kế chuyên dụng Theo lý thuyết, số lượng ADN nhân phụ thuộc vào độ dài, vị trí đoạn mồi, kích thước cấu trúc ADN genome Thông thường đoạn mồi ngẫu nhiên tạo từ - 10 sản phẩm nhân [32] Kết sau điện di sản phẩm RAPD phát khác phổ phân đoạn ADN nhân Sự khác gọi tính đa hình Hiện tượng đa hình đoạn ADN nhân ngẫu nhiên xuất Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn trình nảy mầm hạt điều chỉnh ASTT tế bào điều kiện cực 3.1.3 Khả phản ứng hạn 16 giống đậu tƣơng giai đoạn non đoan Kết đánh giá khả phản ứng hạn giống đậu tương giai đoạn hạt nảy mầm thông qua phân tích hoạt độ enzym protease hàm lượng protein điều kiện xử lý dung dịch sorbitol % cho thấy hoạt độ enzym protease hàm lượng protein có liên quan đến khả chịu hạn giống đậu tương Giống SL có khả chịu hạn tốt thấp giống đối chứng VX93 3.1.2.4 Nhận xét (1) Khi hạt nảy mầm chiều dài rễ mầm thân mầm giống đậu tương tăng qua ngày tuổi có khác giống (2) Ở giai đoạn hạt nảy mầm, điều kiện bổ sung sorbitol nồng độ 7%, hoạt độ enzym  – amylase hàm lượng đường tan biến đổi theo xu hướng tăng dần đạt cực đại vào ngày thứ bắt đầu giảm giai đoạn ngày hạn, giống SL HD tăng cao thấp giống đối chứng VX93 ĐT84 Hàm lượng đường tan hoạt độ enzym  – amylase có mối tương quan thuận (3) Hoạt độ proteaza hàm lượng protein tan giai đoạn hạt nảy mầm, điều kiện bổ sung sorbitol nồng độ 7%, biến đổi theo xu hướng tăng dần từ đến ngày hạn, cao ngày hạn đến ngày hạn bắt đầu giảm dần, Hình 3.3 Hình ảnh đậu tương trước xử lý hạn giống SL tăng cao thấp giống đối chứng VX93 Hàm lượng protein 3.1.3.1 Tỷ lệ thiệt hại proteaza có mối tương quan thuận (4) Khả phản ứng với hạn 16 giống đậu tương giai đoạn hạt nảy mầm Phân tích ảnh hưởng hạn đến sinh trưởng phát triển đậu tương khác nhau, giống SL HD có khả chịu hạn tốt nhất, giống ĐT84 thông qua tính tỷ lệ héo tỷ lệ chết, xác định tỷ lệ thiệt VX93 hại hạn gây 16 giống đậu tương nghiên cứu (bảng 3.11 hình 3.4) Theo dõi thí nghiệm cho thấy, ngày sau xử lý hạn bắt đầu ảnh hưởng tới đậu tương mức độ thấp, số bắt đầu héo Sau ngày ngày xử lý hạn mức độ ảnh hưởng tăng lên rõ rệt Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 3.11 Tỷ lệ thiệt hại 16 giống đậu tương giai đoạn non (%) STT Giống ngày) đến 91,11% (hạn ngày) thấp giống SL (hạn ngày thiệt hại 1,11%; Tỷ lệ thiệt hại (%) Hạn ngày Hạn ngày chứng Giống có tỷ lệ thiệt hại cao ĐT84, dao động khoảng 7,78% (hạn Hạn ngày Hạn ngày HG 6,67 32,22 58,89 87,78 HD 5,56 28,89 51,11 78,89 CB1 3,33 16,67 47,78 76,67 QN 6,67 32,22 60,00 73,33 HT 2,22 32,22 56,67 84,44 QNG 4,44 21,11 45,56 82,22 CB2 4,44 28,89 48,89 74,44 CB3 3,33 26,67 51,11 75,56 DL 6,67 32,22 56,67 80,00 hạn ngày thiệt hại 66,67%) 100 90 Tỷ lệ thiệt hại (%) 80 70 60 50 40 30 20 10 10 11 12 13 14 15 16 Giống 10 KH 1,11 15,56 51,11 70,00 11 TN 5,56 26,67 48,89 84,44 12 BC 6,67 25,56 50,00 75,56 13 SL 1,11 16,67 45,56 66,67 14 LS 2,22 17,78 52,22 83,33 15 ĐT84 7,78 35,56 61,11 91,11 lệ thiệt hại, tỷ lệ sống sót, khả giữ nước, tỷ lệ rễ khô / rễ tươi, thân khô / 16 VX93 6,67 3111 56,67 85,56 thân tươi, tỷ lệ rễ / thân sau đậu tương sau xử lý hạn Hạn ngày Hạn ngày Hạn ngày Hạn ngày Hình 3.4 Biểu đồ tỉ lệ thiệt hại giống đậu tương nghiên cứu 3.1.3.2 Chỉ số chịu hạn tƣơng đối Tính chống chịu trồng nói chung khả chịu hạn nói riêng tính trạng đa gen Vì vậy, tiến hành phân tích tiêu khác như: tỷ ngưỡng thời gian 3, 5, 7, ngày Đặc biệt sau ngày hạn tất giống nghiên cứu bị héo lá, số lượng Khi bị hạn, lượng nước tế bào giảm gây tổn thương cho Các giống bị chết tăng cao Như tỉ lệ thiệt hại giống đậu tương tăng dần khác có đáp ứng khác để làm giảm tránh bị tổn thương theo thời gian bị hạn khác giống đậu tương Các giống đậu tương Qua thí nghiệm cho thấy, ngày sau xử lý hạn bắt đầu ảnh hưởng tới đậu địa phương nghiên cứu có tỉ lệ số chết héo thấp so với giống đối tương mức độ thấp, sau ngày xử lý hạn mức độ ảnh hưởng tăng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 http://www.lrc-tnu.edu.vn lên rõ rệt, đặc biệt sau ngày, tất giống đậu tương nghiên cứu bị héo số lượng bị chết tăng lên cao Giống SL có tỷ lệ sống khả giữ ● Hàm lƣợng proline nước cao thấp giống ĐT84 Điều chứng tỏ khả Sự tích luỹ axit amin hợp chất chứa nitơ xảy không điều chịu hạn giống đậu tương nghiên cứu mức độ non khác kiện thiếu nước mà điều kiện muối mặn NaCl thực vật bậc cao, động Kết xác định số chịu hạn tương đối giống đậu tương trình bày vật nguyên sinh, khuê tảo mà thấy tế bào động vật [12] Trong số chất có bảng 3.12 nitơ proline ý nhất, xem chất điều hòa ASTT có Bảng 3.12 Chỉ số chịu hạn tương đối giống đậu tương STT Giống Chỉ số chịu hạn tương đối HG 26,12 HD 32,10 CB1 41,03 QN vai trò quan trọng thực vật vi sinh vật, hàm lượng proline rễ sống điều kiện khô hạn hay nuôi cấy môi trường có ASTT cao tăng Giống Chỉ số chịu hạn tương đối DL 29,78 Hiện nay, gia tăng proline thực vật nói chung đậu tương nói riêng 10 KH 40,17 xem tiêu để đánh giá khả chịu hạn 11 TN 32,64 39,37 12 BC 29,00 HT 34,87 13 SL 42,59 QNG 28,16 14 LS 39,31 CB2 34,51 15 ĐT84 21,22 giống đậu tương nghiên cứu có gia tăng hàm lượng proline thời gian gây CB3 32,89 16 VX93 23,95 hạn kéo dài, gia tăng hàm lượng proline giống đậu tương STT lên gấp nhiều lần so với sống điều kiện bình thường Các nghiên cứu tác giả đến kết luận rằng, tính chống chịu với điều kiện bất lợi trồng có mối tương quan thuận với gia tăng hàm lượng proline Thí nghiệm xác định hàm lượng proline cho kết tất khác Chẳng hạn, giống HG hàm lượng proline tăng từ 1,56 đến 3,11 g/g; Từ kết bảng 3.12 thấy số chịu hạn tương đối giống BC hàm lượng proline tăng từ 2,15 g/g đến 5,21 g/g Sau ngày hạn, hàm giống đậu tương nghiên cứu giai đoạn khác nhau, giống có số lượng proline dao động từ 3,05 đến 5,69 g/g Giống SL có hàm lượng proline tăng chịu hạn tương đối lớn có khả phản ứng với hạn cao ngược cao tăng 2,43 lần Giống VX93 ĐT84 có hàm lượng proline tăng thấp lại Bảng 3.12 cho thấy, giống SL có số chịu hạn cao (42,59) thấp 1,94 1,98 lần (bảng 3.13) giống ĐT84 VX93 (21,22 23,95 ) Kết phù hợp với kết đánh giá khả chịu hạn giai đoạn hạt nảy mầm trình bày 3.1.3.3 Hàm lƣợng protein proline Để có thêm sở đánh giá phản ứng hạn giống đậu tương nghiên cứu giai đoạn non lá, tiến hành phân tích hàm lượng proline protein điều kiện hạn nhân tạo thời điểm trước gây hạn sau gây hạn 1, 3, 5, 7, ngày Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 3.13 Hàm lượng proline giống đậu tương điều kiện hạn nhân tạo Giống theo thời gian hạn khác giống Chẳng hạn, hàm lượng protein giống KH giảm từ 11,17% giai đoạn trước hạn đến 10,22% giai đoạn ngày hạn Hàm lượng proline (µM/g khối lượng tươi) Trước hạn Hạn ngày Hạn ngày Hạn ngày Hạn ngày Hạn ngày HG 1,56± 0,02 1,61±0,02 1,72± 0.05 1,87± 0,12 2,09± 0,07 3,11± 0,03 HD 1,49± 0,04 1,56± 0,04 1,65± 0,02 1,84± 0,06 2,15± 0,05 3,19± 0,09 CB1 1,96± 0,01 2,01± 0,03 2,11± 0,03 2,21± 0,03 3,19± 0,16 4,31± 0,05 QN 2,42± 0,03 2,54± 0,21 2,62± 0,04 2,80± 0,11 3,47± 0,03 4,78± 0,12 HT 1,50± 0,02 1,59± 0,07 1,67± 0,03 1,79± 0,05 2,09± 0,05 3,15± 0,20 QNG 2,16± 0,01 2,30± 0,05 2,38± 0,06 2,50± 0,02 2,98± 0,17 3,72± 0,12 CB2 1,36± 0,04 1,42± 0,02 1,56± 0,07 1,80± 0,09 2,48± 0,24 3,70± 0,05 CB3 2,18± 0,05 2,65± 0,03 2,91± 0,10 3,17± 0,24 3,84± 0,15 Hoặc giống QNG có hàm lượng protein trước hạn 10,06%, sau ngày hạn hàm lượng protein 9,33% Sự biến động hàm lượng protein biểu khác giống đậu tương phản ánh khác kiểu gen chịu hạn Trước hạn giống SL có hàm lượng protein cao (12,25%) giống ĐT84 có hàm lượng protein thấp (7,44%) Bảng 3.14 Hàm lượng protein giống đậu tương điều kiện hạn nhân tạo Giống Hàm lượng protein (% khối lượng tươi) HG Trước hạn 9,08± 0,15 Hạn ngày 9,01± 0,03 Hạn ngày 8,93± 0,09 Hạn ngày 8,81± 0,03 Hạn ngày 8,36± 0,10 Hạn ngày 8,19± 0,02 HD 10,18± 0,09 10,03± 0,05 9,80± 0,16 9,76± 0,02 9,55± 0,16 9,31± 0,03 5,02± 0,07 CB1 10,67±0,21 10,52± 0,05 10,46± 0,04 10,35± 0,05 10,04± 0,08 9,82± 0,14 QN 11,03± 0,04 10,90± 0,09 10,74± 0,02 10,62± 0,03 10,46± 0,04 10,25± 0,06 HT 12,24± 0,03 12,18± 0,02 12,06± 0,31 11,92± 0,09 11,83± 0,15 11,09± 0,03 QNG 10,06± 0,17 9,87± 0,14 9,80± 0,07 9,72± 0,05 9,67± 0,04 9,33± 0,05 CB2 9,94± 0,18 9,71± 0,07 9,69± 0,11 9,50± 0,04 9,31± 0,10 9,15± 0,06 DL 1,57± 0,01 1,63± 0,06 1,75± 0,07 1,92± 0,06 2,48± 0,04 3,49± 0,09 KH 1,84± 0,02 1,90± 0,01 1,94± 0,02 2,15± 0,03 3,06± 0,02 4,08± 0,03 TN 1,69± 0,03 1,80± 0,03 1,87± 0,06 1,96± 0,15 2,56± 0,11 3,45± 0,06 BC 2,15± 0,01 2,76± 0,01 2,94± 0,03 3,12± 0,09 3,75± 0,05 5,21± 0,09 CB3 8,61± 0.09 8,48± 0,03 8,36± 0,08 8,20± 0,17 8,12± 0,09 7,94± 0,07 SL 2,34± 0,02 2,85± 0,01 3,06± 0,02 3,18± 0,11 3,86± 0,09 5,69± 0,05 DL 10,26± 0,32 10,15± 0,25 10,08± 0,27 10,00± 0,12 9,73± 0,05 9,45± 0,12 LS 2,47± 0,03 2,63± 0,04 2,78± 0,05 3,04± 0,06 3,64± 0,03 4,96± 0,03 KH 11,17± 0,20 11,07± 0,09 10,93± 0,05 10,85±0,07 10,64± 0,03 10,22± 0,16 ĐT84 1,54± 0,04 1,66± 0,02 1,70± 0,03 1,92± 0,20 2,03± 0,16 3,05± 0,15 TN 10,49± 0,08 10,26± 0,03 10,15± 0,03 10,04± 0,05 9,92± 0,02 9,66± 0,06 VX93 1,62± 0,02 1,73±0,03 1,80± 0,12 1,85± 0,06 2,73± 0,06 3,14± 0,07 BC 9,53± 0,19 9,10± 0,08 9,01± 0,07 8,93± 0,04 8,82± 0,03 8,43± 0,08 SL 12,25± 0,12 11,96± 0,17 11,76± 0,16 11,62± 0,04 11,54± 0,05 10,06± 0,21 ● Hàm lƣợng protein tan trƣớc sau xử lý hạn LS 8,86± 0,07 8,60± 0,05 8,52± 0,03 8,41± 0,02 8,35± 0,02 8,11± 0,09 Đặc điểm chất nguyên sinh có vị trí quan trọng khả chịu hạn ĐT84 7,93± 0,04 7,87± 0,02 7,74± 0,16 7,68± 0,05 7,56± 0,04 7,44± 0,05 Khi nước tổng hợp protein tăng cường, hạn kéo dài VX93 8,26± 0,25 8,16± 0,20 8,07± 0,12 7,90± 0,03 7,81± 0,02 7,62± 0,03 xảy tượng thuỷ phân protein Kết phân tích hàm lượng protein thân, rễ 16 giống đậu tương giai đoạn trước gây hạn, 1, 3, 5, ngày hạn trình bảng 14 Bảng 3.14 cho thấy, hàm lượng protein giảm dần Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 http://www.lrc-tnu.edu.vn Sự gia tăng hàm lượng proline giảm hàm lượng protein giống đậu tương sau gây hạn chứng tỏ đậu tương có phản ứng cách tích cực trước thay đổi điều kiện môi trường Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.1.3.4 Nhận xét (1) Kiểu gen giống đậu tương nghiên cứu có phản ứng khác hạn, biểu tỷ lệ sống sót khả giữ nước, số chịu hạn tương đối Giống SL có số chịu hạn cao nhất, giống ĐT84 VX93 có số chịu hạn thấp (2) Khả chịu hạn đậu tương liên quan đến hàm lượng protein proline Khi gặp hạn đậu tương giảm tổng hợp protein tăng tổng hợp proline (3) Có phù hợp kết đánh giá phản ứng hạn giống đậu tương giai đoạn hạt nảy mầm giai đoạn non 3.1.4 Sự phân bố giống đậu tƣơng nghiên cứu Trên sở phân tích 65 tiêu liên quan đến khả chịu hạn từ giai đoạn tiềm sinh đến giai đoạn non như: khối lượng 1000 hạt, hàm lượng protein lipit hạt, phản ứng giống đậu tương điều kiện nhân tạo, tỷ lệ rễ / thân, chương trình NTSYS pc 2.02i xác định hệ số khác khả phản ứng cặp giống đậu tương thiết lập sơ đồ hình giống đậu tương nghiên cứu (hình 3.5) Hình 3.5 Sơ đồ quan hệ giống đậu tương dựa phản ứng trước tác Bảng 3.15 Hệ số khác giống đậu tương HG HD CB1 QN HT QNG CB2 CB3 DL KH TN BC SL động hạn LS DT84 HG 0,00 HD 6,83 0,00 CB1 1,75 7,31 0,00 QN 2,05 1,80 1,51 0,00 HT 9,58 5,13 1,27 2,71 0,00 QNG 4,88 5,41 7,45 1,49 9,57 0,00 CB2 1,21 1,14 1,24 5,80 1,80 7,04 0,00 CB3 6,55 5,34 4,81 3,06 6,51 5,63 3,44 0,00 DL 2,61 3,34 4,27 1,85 4,68 2,74 1,36 5,05 0,00 KH 5,09 5,31 4,73 2,05 7,32 4,19 2,54 3,69 1,90 0,00 TN 4,14 4,28 5,17 2,06 6,16 3,78 1,85 5,79 5,80 1,43 0,00 BC 9,16 1,13 1,31 7,06 1,93 5,27 5,32 3,99 1,82 2,27 2,48 0,00 SL 3,56 2,93 1,95 1,02 3,57 2,22 1,40 3,04 3,68 1,99 3,08 1,26 0,00 LS 1,64 1,27 6,52 5,94 2,01 7,90 6,24 4,35 2,58 2,54 2,74 6,23 8,87 0,00 DT84 4,98 6,92 8,14 3,93 8,73 5,60 3,84 8,29 1,05 2,27 1,02 3,81 5,93 4,95 0,00 VX93 3,82 5,35 6,10 2,59 6,95 4,03 2,48 6,47 6,72 1,37 5,84 2,43 4,02 3,36 2,19 VX93 Bảng 3.15 cho thấy hệ số khác giống đậu tương dao động từ 1,02% đến 9,57% Trong giống QNG HT có hệ số khác lớn (9,57%) hai giống SLvà QN có hệ số khác nhỏ (1,02%) Sơ đồ hình (Hình 3.5) thiết lập theo hệ số di truyền khác chia 16 giống đậu tương địa phương thành nhóm : nhóm I nhóm II, khoảng cách nhóm 11% Trong nhóm I chia thành nhóm phụ, khoảng cách nhóm phụ 10,10%: - Nhóm phụ I có giống KH - Nhóm phụ II gồm giống DL, TN, ĐT84 VX93 Nhóm II chia thành nhóm phụ, khoảng cách nhóm 8,975%: 0,00 - Nhóm phụ I gồm có giống SLvà CB3 - Nhóm phụ II gồm giống QN, CB2, LS, BC, CB1, QNG, HT, HD HG Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.2 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở MỨC PHÂN TỬ Kết bảng 3.16 hình 3.6 cho thấy, ADN tổng số tách từ ADN CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU TƢƠNG NGHIÊN CỨU giống đậu tương có hàm lượng cao dao động từ 843,5- 1220,5 μg/ml, băng vạch 3.2.1 Kết tách chiết ADN tổng số ADN gọn, không đứt gãy tương đối sạch, tỷ lệ OD260/OD280 đạt từ 1,78-1,98 Như Tách ADN tổng số từ non đậu tương sau kiểm tra độ tinh xác chất lượng ADN đảm bảo tiêu chuẩn để tiến hành phản ứng RAPD định hàm lượng thông qua điện di gel agarose 0,8%, đo phổ hấp thụ bước sóng 260nm, 280nm máy quang phổ Kết thể bảng 3.16 hình 3.6 3.2.2 Phân tích đa hình ADN kỹ thuật RAPD Sau tách chiết ADN tổng số, pha loãng ADN nồng độ 10 11 12 13 14 15 16 10ng/μl tiến hành phản ứng RAPD với 10 mồi ngẫu nhiên Đánh giá tính đa hình thông qua giá trị PIC (giá trị PIC lớn tính đa hình mồi cao), khoảng cách di truyền xác định thông qua hệ số tương đồng biểu đồ hình ● Số phân đoạn tần số xuất phân đoạn Sản phẩm RAPD với mồi khác điện di gel agarose 1,8% để Hình 3.6 Kết điện di ADN tổng số giống đậu tương gel agarose 0,8% Ghi chú: 1.HG, 2.HD, 3.CB1, 4.QN, 5.HT, 6.QNG, 7CB2, 8.CB3, 9.DL, 10.KH, 11.TN, 12.BC, 13.SL, 14.LS, 15.ĐT-84, 16.VX93 Bảng 3.16 Hàm lượng độ tinh ADN 16 giống đậu tương nghiên cứu phân tích tính đa hình ADN 16 giống đậu tương nghiên cứu Số lượng phân đoạn ADN nhân với cặp mồi xê dịch từ 41-144 phân đoạn Kích thước phân đoạn ADN nhân khoảng từ 250-3000bp Tổng số phân đoạn ADN nhân 10 đoạn mồi RAPD phân tích 16 giống đậu tương 776 Kết thể bảng 3.17 Giống Hàm lƣợng ADN(μg/ml) Tỉ số OD 260/280 Giống Hàm lƣợng ADN (μg/ml) Tỉ số OD 260/280 Bảng 3.17 cho thấy, số 10 mồi phân tích, số phân đoạn ADN nhân HG 989,7 1,82 DL 956,8 1,90 16 giống đậu tương mồi M5 nhiều (144 phân đoạn ADN) HD 1220,5 1,87 KH 1159,6 1,87 mồi M1 (41 phân đoạn) Tuy nhiên, tổng số phân đoạn nhân CB1 1025,7 1,90 TN 1076,8 1,76 giống đậu tương nghiên cứu sử dụng 10 mồi phân tích có biến động nhỏ, dao QN 997,3 1,89 BC 902,5 1,83 động từ 44- 50 phân đoạn Trong đó, có tới giống nhân 50 phân đoạn HT 932,5 1,83 SL 843,5 1,85 (HG; HD; CB1; HT CB3), giống thu 48 phân đoạn ADN giống thu QNG 900,5 1,96 LS 975,6 1,78 46 phân đoạn CB2 896,8 1,79 ĐT84 996,5 1,84 CB3 867,3 1,85 VX93 871,2 1,98 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 3.17 Tổng số phân đoạn ADN nhân 16 giống đậu tương Bảng 3.18 Tính đa hình phân đoạn ADN nhân 10 mồi ngẫu nhiên phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên Số phân đoạn Số phân đoạn ADN đa hình đơn hình đa hình (%) M1 83,3 M2 4 100,0 M3 55,6 M4 28,6 M5 9 0,00 M6 25,0 Mồi Mồi HG HD CB1 QN HT QNG CB2 CB3 DL M1 3 4 2 M2 4 4 M3 7 7 M4 6 5 5 M5 9 9 M6 4 4 M7 4 4 M8 4 M9 3 M10 6 Tổn g 50 50 LS ĐT 84 VX 93 Tổng số phân đoạn Số phân đoạn Tỷ lệ phân đoạn KH TN BC SL 2 2 2 41 4 3 4 56 7 7 108 6 6 6 6 7 94 9 9 9 9 9 144 4 4 3 3 3 58 4 4 4 4 4 4 64 4 4 4 4 58 3 3 3 3 3 3 47 6 6 6 6 6 6 6 96 M7 4 0,00 50 46 50 46 48 50 48 48 45 46 44 46 48 51 766 M8 75,0 M9 33,3 M10 6 0,00 Tổng số 56 21 35 37,5 Tính đa hình thể xuất hay không xuất phân đoạn so sánh giống đậu tương với mồi Điều tổng kết thể qua tỷ lệ phân đoạn đa hình mồi nghiên cứu Kết tổng hợp bảng 3.18 Tổng số phân đoạn ADN 16 giống đậu tương phân tích 10 mồi ngẫu nhiên 56 phân đoạn, có 21 phân đoạn cho tính đa hình (chiếm Giá trị PIC sử dụng phân tích thông tin đa hình Giá trị PIC không 37,5%) không đa hình 35 phân đoạn (62,5%) Kích thước phân đoạn ADN liên quan tới tỷ lệ phân đoạn ADN đa hình mà liên quan trực tiếp với số nhân khoảng từ 250-3000bp Số lượng phân đoạn tương ứng với lượng cá thể xuất phân đoạn đa hình lớn hay nhỏ Số liệu bảng 3.19 phù mồi nằm khoảng 3-9, mồi M9 nhân (3 phân hợp với tỷ lệ đa hình phân đoạn ADN nhân bảng 3.18 Giá trị đoạn) mồi M3 M5 nhân nhiều (9 phân đoạn) Trong số 10 mồi PIC mồi M5, M7 M10 (không đa hình) Tuy nhiên, giá trị PIC nghiên cứu, có mồi không biểu tính đa hình mồi M5, M7 M10 mồi M1 0,82 (đa hình cao nhất) cao so với M2 Như vậy, phân tích với Mức độ đa hình mồi lại 25,0 – 100%, mồi M2 cho tỷ lệ phân mồi M1, số cá thể xuất phân đoạn đa hình cao so với M2 Hầu hết mồi đoạn đa hình cao thấp mồi M6 cho tính đa hình thấp (PIC < 0,5) Trong mồi cho tính đa hình phân đoạn ADN nhân có hai mồi M1 M2 cho giá trị PIC > 0,5 điều cho thấy mức độ đa dạng phân đoạn ADN không cao giống đậu tương mà Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 http://www.lrc-tnu.edu.vn nghiên cứu Như vậy, với 10 mồi ngẫu nhiên đa dạng di 10 11 12 13 14 15 16 M truyền 16 giống đậu tương có nguồn gốc khác M1 Bảng 3.19 Thông tin tính đa hình (PIC) 16 giống đậu tương STT Tên mồi PIC STT Tên mồi PIC M1 0,82 M6 0,23 M2 0,63 M7 0,00 M3 0,43 M8 0,38 M4 0,31 M9 0,34 M5 0,00 10 M10 0,00 2000 bp 1500 bp 500 bp 250 bp Hình 3.7 Kết điện di sản phẩm RAPD gel agarose 1,8% với mồi M1 Mồi M8: Tổng số phân đoạn ADN quan sát điện di 58, phân bố băng vạch, phạm vi kích thước từ 250-1000 bp (hình 3.8) Trong có băng vạch cho đa hình phân đoạn ADN nhân Kết điện di mồi M8 Kết điện di kiểm tra phản ứng RAPD gel agarose 1,8% mồi điển hình M1, M8, M3 mồi M5 lựa chọn phân tích chi tiết thông cho thấy khác biệt mẫu 4, 6, 11, 13 so với mẫu lại Cụ thể, 14 mẫu nhân phân đoạn ADN kích thước khoảng 780 bp, riêng hai mẫu 4, (QN, QNG) không thu phân đoạn ADN Ở hai băng vạch tương ứng kích thước qua ảnh trình bày đây: Mồi M1: Kết điện di sản phẩm RAPD mồi M1 cho thấy, phạm vi vùng phân tích từ 250 bp- 3000 bp có băng vạch ADN nhân bản, có tới băng vạch cho tính đa hình Cụ thể kích thước khoảng 2200 bp, có giống VX93 khoảng 280 480 bp, hai mẫu 11, 13 (TN, SL) không xuất phân đoạn ADN nhân bản, nhiên 14 mẫu lại xuất hai phân đoạn Như vậy, có tới phân đoạn cho tính đa hình số cá thể khác biệt nên giá trị PIC nhỏ (0,38) (mẫu 16) nhân phân đoạn ADN Ở kích thước khoảng 1700 bp, giống QN HT (mẫu 4, 5) không nhân phân đoạn ADN này, 14 giống lại xuất phân đoạn ADN nhân Ở phạm vi kích thước khoảng 1500 bp, ba 10 11 12 13 14 15 16 M M8 mẫu 3, 4, (CB1, QN HT) có phân đoạn ADN nhân bản, giống lại 1000 bp 750 bp không xuất băng vạch Phân đoạn thứ tư cho tính đa hình kích thước 500 bp khoảng 800 bp với xuất băng vạch ADN mẫu số 1, 2, 3, (HG, HD, 250 bp CB1, QN HT), mẫu lại không thu phân đoạn Với kích thước 500 bp, toàn 16 mẫu nghiên cứu nhân phân đoạn ADN (hình 3.7) Hình 3.8 Kết điện di sản phẩm RAPD gel agarose 1,8% với mồi M8 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 http://www.lrc-tnu.edu.vn Mồi M5: Đây mồi điển hình số mồi không cho tính đa hình phân đoạn 10 11 12 13 14 15 16 M ADN nhân Tổng số 16 mẫu thu 144 phân đoạn ADN tương ứng với M3 băng vạch kiểm tra gel agarose 1,8% 1500 bp 1000 bp Mặc dù số lượng phân đoạn ADN nhân lên lớn số mồi sử dụng 500 bp băng vạch cho tính đa hình phân đoạn ADN nhân 250 bp Toàn băng vạch giống hoàn toàn 16 mẫu đậu tương nghiên cứu Điều khẳng định thông qua giá trị PIC =0 Kích thước phân đoạn nhân đa dạng dao động từ 200 bp tới 3000 bp Hình 3.9 Kết điện di sản phẩm RAPD gel agarose 1,8% với mồi M3 Mồi M3: Kết điện di cho thấy, tính đa dạng thể cách rõ nét Ngoài ảnh điện di mồi lại tổng hợp thể hình mẫu đậu tương nghiên cứu Từ giới hạn kích thước 250-1500 bp có băng vạch ADN xuất hiện, tương ứng với tổng số 108 phân đoạn ADN nhân tổng 16 mẫu đậu tương nghiên cứu Có băng vạch cho tính đa hình phân đoạn ADN M 21 32 43 54 65 76 87 98 10 11 10 12111312141315141615M 16 M2 2000 bp 1500 bp 1000 bp nhân băng vạch không cho tính đa hình Cụ thể kích thước khoảng 1400 bp 500 bp giống KH (mẫu số 10) không xuất phân đoạn ADN nhân bản, mẫu lại 250 bp xuất Hai mẫu 4, (QN HT) không thu phân đoạn ADN kích thước khoảng 1300 bp Ở kích thước khoảng 600 bp có tới mẫu không thu Hình 3.11 Kết điện di sản phẩm RAPD gel agarose 1,8% với mồi M2 phân đoạn ADN nhân Trong phạm vi kích thước khoảng 300 bp có Mồi M2: có tổng số băng vạch ADN nhân băng cho mẫu có phân đoạn ADN nhân 5, 8, 9, 14, 16 (HT, CB3, DL, LS VX93) tính đa hình phân đoạn ADN Ở kích thước khoảng 2500 bp, ba mẫu số 12; 13; 14 Riêng mẫu số (HG) nhân phân đoạn ADN có kích thước khoảng 400 bp (BC, SL, LS) không nhân phân đoạn mẫu lại xuất mẫu lại không xuất phân đoạn Ở phạm vi kích thước khoảng 500pb, mẫu 11 (DL, TN) không xuất phân đoạn ADN nhân 10 11 12 13 14 15 16 M 2000 bp M5 1000 bp 10 11 12 13 14 15 16 M M4 250 bp 2000 bp 1500 bp 1000 bp 750 bp 500 bp 250 bp Hình 3.10 Kết điện di sản phẩm RAPD gel agarose 1,8% với mồi M5 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 3.12 Kết điện di sản phẩm RAPD gel agarose 1,8% với mồi M4 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 http://www.lrc-tnu.edu.vn Mồi M4: Kết điện di cho thấy có băng vạch ADN xuất hai băng vạch Mồi M9: Tổng số có phân đoạn ADN nhân tương ứng với băng vạch cho tính đa hình phân đoạn ADN nhân Cụ thể kích thước tương ứng ảnh điện di Tuy nhiên mẫu số 12 không nhân phân đoạn ADN có khoảng sấp sỉ 2000 bp, bốn mẫu 1; 2; 15; 16 (HG, HD, DT84, VX93) xuất phân kích thước khoảng 66 bp Các mẫu lại nhân phân đoạn có kích thước đoạn ADN nhân bản, mẫu lại không nhân phân đoạn Ở kích hoàn toàn giống thước khoảng 700 bp, sáu mẫu đầu không nhân phân đoạn ADN tương ứng 10 mẫu lại xuất băng vạch M 10 11 12 13 14 15 16 3000 bp 1500 bp 1000 bp 500 10 11 12 13 14 15 16 M M6 3000 bp 1500 bp 1000 bp 10 11 12 13 14 15 16 M M10 M7 2000 bp bp 250 bp 500 bp 250 bp 500 bp 250 bp Hình 3.15 Kết điện di sản phẩm RAPD gel agarose 1,8% với mồi M7 M10 Hình 3.13 Kết điện di sản phẩm RAPD gel agarose 1,8% với mồi M6 Mồi M7 M10: Hai mồi không cho tính đa hình phân đoạn ADN nhân Trong mồi M7 thu phân đoạn có kích thước giống 16 mẫu Mồi M6: Trong ba băng vạch ADN xuất hiện, băng vạch tương ứng với kích thước nghiên cứu, mồi M10 thu băng vạch với kích thước giống hoàn toàn khoảng 1250bp cho tính đa hình phân đoạn ADN nhân mẫu so sánh 16 giống đậu tương phân tích từ 11-16 không nhân phân đoạn này, mẫu lại xuất phân đoạn Từ kết phân tích hình ảnh điện di sản phẩm RAPD, thống kê băng điện di (xuất hiện=1, không xuất hiện= 0) xử lý số liệu phân tích RAPD M 10 11 12 13 14 15 16 phần mềm NTSYSpc version 2.0i nhằm xác định khoảng cách di truyền mẫu đậu tương nghiên cứu thông qua hệ số tương đồng di truyền biểu đồ hình M9 2000 1500 bp bp 1000 bp750 bp 500 bp quan kiểu hình theo ba phương pháp tính hệ số di truyền giống (phương pháp 250 bp Jaccard, Nei & Li, Sokal) với bốn kiểu phân nhóm (WPGMA, UPGMA, Để xác định quan hệ di truyền, tiến hành xác định giá trị tương liên kết hoàn toàn liên kết đơn lẻ) (bảng 3.20) Biểu đồ hình thiết lập dựa giá trị tương quan cao với giá trị r  0,9: tương quan chặt, r = 0,8 - 0,9: Hình 3.14 Kết điện di sản phẩm RAPD gel agarose 1,8% với mồi M9 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 http://www.lrc-tnu.edu.vn tương quan chặt, r = 0,7 - 0,8: tương quan tương đối chặt, r  0,7: tương quan không chặt Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 3.20 Giá trị tương quan kiểu hình (r) UPGMA SM Dice Jaccard 0,79571 0,78117 0,78581 WPGMA 0,64512 Bảng 3.21 Hệ số tương đồng giống đậu tương nghiên cứu Liên kết hoàn toàn Liên kết đơn lẻ TO toàn 0,75486 0,62954 0,48727 0,61745 0,64080 0,51293 0,62909 0,52799 Kết bảng 3.20 cho thấy, giá trị tương quan kiểu hình (r) 16 mẫu đậu tương nghiên cứu thấp, phạm vi từ không chặt tới tương đối chặt Cụ thể giá trị r dao động từ 0,48727- 0,79571 Điều lý giải hầu hết giống đậu tương địa phương Giá trị tương quan kiểu hình (r) lớn 0,79571 tính theo hệ số di truyền SM kiểu phân nhóm UPGMA Kết xác định hệ số đồng dạng di truyền thể bảng 3.21 Kết phân tích cho thấy có sai khác di truyền giống đậu tương nghiên cứu Hệ số tương đồng 16 giống đậu tương nghiên cứu dao dộng từ 0,745-0,963 Trong hai giống có hệ số đồng dạng di truyền lớn HG HD (0,963), hai giống có hệ số đồng dạng nhỏ QN TN (0,745) HG HG HD 0,963 CB1 0,960 QN 0,843 HT QNG 0,918 CB2 0,920 CB3 DL 0,882 0,920 TN 0,860 BC Vì sơ đồ hình thiết lập theo hệ số di truyền giống SM LS kiểu phân nhóm UPGMA (hình 3.12) Biểu đồ hình tạo phân tích 16 DT8 Nhóm I: bao gồm hai giống QN HT có hệ số tương đồng 0,918 sai 0,922 KH SL giống đậu tương với 10 mồi ngẫu nghiên chia làm nhóm chính: 0,885 VX9 0,880 0,840 0,843 0,920 0,904 HD CB1 QN HT QNG CB2 CB3 DL KH TN BC SL LS ĐT8 VX9 0,92 0,84 0,88 0,84 0,92 0,91 0,88 0,91 0,87 0,84 0,92 0,92 0,84 0,84 0,91 0 0,88 0,92 0,80 0,88 0,91 0,95 8 0,88 0,88 0,80 0,84 0,87 0,95 0,95 2 8 0,88 0,92 0,80 0,84 0,91 0,95 0,95 0,91 0,82 0,86 0,74 0,78 0,85 0,89 0,89 0,89 0,89 8 6 0,84 0,88 0,76 0,80 0,87 0,91 0,91 0,87 0,91 0,89 8 0,84 0,84 0,76 0,76 0,83 0,91 0,87 0,87 0,87 0,93 0,91 0 5 3 0,84 0,84 0,76 0,80 0,83 0,91 0,91 0,91 0,87 0,85 0,91 0,91 3 7 8 0,92 0,88 0,80 0,81 0,87 0,95 0,92 0,91 0,91 0,89 0,91 0,91 0,91 8 8 7 0,86 0,86 0,75 0,83 0,86 0,90 0,94 0,90 0,90 0,88 0,90 0,86 0,90 0,94 8 3 2 0 0 1 1 1 1 1 1 khác với giống thuộc nhóm II 16,6% (1-0,834) Nhóm II: bao gồm 14 giống lại tiếp tục phân thánh hai nhóm phụ (PI PI PII), sai khác gữa hai nhóm phụ 10,6% (1- 0,894) Nhóm Phụ PI có chứa giống HG, HD, QNG CB1 với mức độ sai khác di truyền từ 3,70- 8,75% (1-0,963 1- 0,9125) Nhóm phụ PII gồm 10 giống (CB2, Nhóm II CB3, DL, KH, ĐT84, VX93, BC, LS, TN, SL) P II Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 http://www.lrc-tnu.edu.vn I – Đại học Thái Nguyên Số hóa Trung tâmNhóm Học liệu 59 http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 3.17 Biểu đồ hình giống đậu tương nghiên cứu theo kiểu phân nhóm UPGMA 3.2.3 Nhận xét kết phân tích đa hình ADN hệ gen 16 giống đậu KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ tƣơng địa phƣơng (1) Đã tách chiết ADN với hàm lượng chất lượng tốt đảm bảo cho nghiên cứu KẾT LUẬN 1.1 Các giống đậu tương địa phương nghiên cứu có đa dạng phong phú hình (2) Kết phân tích đa dạng di truyền 16 giống đậu tương thị RAPD với 10 mồi ngẫu nhiên, có 7/10 mồi cho tính đa hình phân đoạn ADN nhân Tuy nhiên, tính đa hình mồi không cao, có tới mồi cho giá trị PIC < 0,5 Hai mồi M1 M2 cho tính đa hình cao với giá trị PIC tương ứng 0,82 0,63 (3) Trong phạm vi vùng phân tích có 56 băng vạch phân đoạn ADN nhân có 21 băng vạch cho tính đa hình (tương ứng 37,5%) Tổng số phân đoạn ADN thu 16 mẫu đậu tương phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên 766 Số lượng phân đoạn ADN nhân mồi dao động từ 41-144, cao mồi M5 thấp mồi M1 thái, kích thước, khối lượng hạt hóa sinh hạt Giống có khối lượng 1000 hạt cao giống KH (172,9g) có kích thước hạt lớn (dài/ rộng = 0,81/0,65), thấp giống HT có khối lượng (81,5g) kích thước hạt nhỏ (dài/rộng = 0,62/0,42) Hàm lượng protein giống đậu tương dao động khoảng (25,28- 34,83%) hàm lượng lipit dao động khoảng (11,29 - 18,52%) 1.2 Ở giai đoạn hạt nảy mầm, điều kiện bổ sung sorbitol 7%, hoạt độ enzym  – amylase hàm lượng đường, hoạt độ proteaza hàm lượng protein tan biến đổi theo xu hướng tăng dần từ đến ngày hạn, cao ngày hạn đến ngày hạn bắt đầu giảm dần, giống SL HD tăng cao thấp (4) Kết phân tích cho thấy, 16 giống đậu tương nghiên cứu có đa dạng di truyền với mức độ sai khác từ 25,5% (1-0,745) tới 3,7% (1-0,963) Hai nhóm giống có độ tương đồng di truyền cao bao gồm nhóm (HG, HD, CB1- hệ số tương đồng từ 0,9125-0,9630) nhóm (CB2, CB3, DL KH – hệ số tương đồng từ 0,91800,9590) Qua biểu đồ hình bảng hệ số tương đồng cho thấy 16 giống đậu tương nghiên cứu có tính đa hình mức độ phân tử giống đối chứng VX93 ĐT84 1.3 Ở giai đoạn non giống đậu tương địa phương phản ứng khác hạn, biểu tỷ lệ thiệt hại, chết, héo Chỉ số chịu hạn tương đối dao động từ 21,22 đến 42,59 Giống SL có khả chịu hạn cao giống lại Trong điều kiện hạn, đậu tương giảm tổng hợp protein tăng hàm lượng proline 1.4 Kết phân tích đa dạng di truyền 16 giống đậu tương thị RAPD với 10 mồi ngẫu nhiên, có mồi cho tính đa hình Hai mồi M1 M2 cho tính đa Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60 http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 61 http://www.lrc-tnu.edu.vn hình cao với giá trị PIC tương ứng 0,82 0,63 Đã nhân 766 số phân đoạn ADN, số lượng phân đoạn ADN nhân mồi dao động từ 41144, cao mồi M5 thấp M1 1.5 Các giống đậu tương nghiên cứu có đa dạng di truyền với mức độ sai khác từ 25,5% (1-0,745) tới 3,7% (1-0,963) Chúng xếp thành nhóm chính: - Nhóm I: bao gồm hai giống QN HT có hệ số tương đồng 0,918 sai khác với giống thuộc nhóm II 16,6% (1-0,834) - Nhóm II: bao gồm 14 giống lại tiếp tục phân thành hai nhóm phụ (PI PII), sai khác gữa hai nhóm phụ 10,6% (1- 0,894) CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN ĐỀ NGHỊ - Cần tiếp tục khảo sát phản ứng giống đậu tương giai đoạn sinh trưởng khác giai đoạn hoa kết Vũ Anh Đào, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Mậu (2009), Đánh giá đa - Tiếp tục phân tích RAPD với số lượng mồi nhiều kết hợp với kỹ thuật sinh học phân tử khác SSR, AFLP dạng di truyền mức phân tử số giống đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) địa phương, Tạp chí Khoa học Công nghệ, Đại học Thái Nguyên, 57(9): 85-90 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 62 http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 63 http://www.lrc-tnu.edu.vn Chu Hoàng Mậu (2001), Sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm để tạo dòng đậu tương đậu xanh thích hợp cho miền núi Đông Bắc Việt Nam, Luận án tiến sĩ sinh học, Viện Công nghệ sinh học Hà Nội 10 Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành hóa sinh học, NXB Đại học Quốc Gia, Hà Nội 11 Đinh Thị Ngọc (2008), Nghiên cứu đặc điểm hóa sinh phân lập gen chaperonin liên quan đến tính chịu hạn số giống đậu tương địa phương trồng vùng Tây Nguyên, Luận văn thạc sĩ sinh học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên TÀI LIỆU THAM KHẢO 12 Đinh Thị Phòng (2001), Nghiên cứu khả chịu hạn chọn dòng chịu hạn lúa công nghệ tế bào thực vật, Luận án tiến sĩ sinh học, Viện công nghệ sinh TIẾNG VIỆT Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen chọn dòng chống chịu ngoại học Hà Nội 13 Hà Tiến Sỹ (2007), “Khả chịu hạn số giống đậu tương (Glycine cảnh bất lợi lúa, Nxb Đại học Quốc gia, Hà Nội Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Tường (1998), Thực hành hóa max (L.) Merrill) điạ phương tỉnh Cao Bằng”, Tạp chí Khoa học Công nghệ , Đại học Thái Nguyên, số (43), 13-19 sinh, NXB Giáo dục Ngô Thế Dân cộng (1999), Cây đậu tương, NXB Nông Nghiệp Lê Xuân Đắc, Đinh Thị Phòng, Lê Thị Muội, Lê Trần Bình (1999), “Sử dụng kỹ thuật RAPD để đánh giá tính đa hình ADN số dòng chọn lọc từ mô sẹo giống lúa C71” Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, NXB Khoa học kỹ thuật 14 Nguyễn Thị Tâm (2004), Nghiên cứu khả chịu nóng chọn dòng chịu nóng lúa công nghệ tế bào thực vật, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ sinh học Hà Nội 15 Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2003), Nghiên cứu thành phần hóa sinh hạt tính đa dạng di truyền số giống đậu xanh có khả chịu hạn khác nhau, Luận Hà Nội, tr 1341-1347 Nguyễn Thị Thúy Hường (2006), Sưu tập, đánh giá nghiên cứu khả chịu hạn số giống đậu tương địa phương tỉnh Sơn La, Luận văn thạc sĩ sinh Trần Thị Phương Liên (1999), Nghiên cứu đặc tính hóa sinh sinh học phân tử số giống đậu tương có khả chịu nóng, chịu hạn Việt Nam, Luận án giống chống chịu bệnh gỉ sắt kỹ thuật RAPD” Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc, tr 805-809 17 Nguyễn Hải Tuất, Ngô Kim Khôi (1996), Xử lý thống kê kết nghiên cứu thực tiến sĩ sinh học, Viện công nghệ sinh học Hà Nội Ngô Thị Liêm, Chu Hoàng Mậu (2006),“Đặc điểm phản ứng giống lạc điều kiện hạn sinh lý” Tạp chí nông nghiệp PTNT, (84), tr 82- 87 Trần Đình Long (2000), Cây đậu tương, NXB Nông nghiệp Hà Nội 64 16 Bùi Văn Thắng, Đinh Thị Phòng, Lê Thị Muội, Lê Trần Bình, Nguyễn Văn Thắng, Trần Văn Dương (2003),“Đánh giá tính đa dạng số giống lạc tập đoàn học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên văn thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn nghiệm nông lâm ngư nghiệp máy vi tính, NXB Nông nghiệp Hà Nội 18 Vũ Thanh Trà, Trần Thị Phương Liên (2006), “Nghiên cứu đa dạng di truyền số giống đậu tương địa phương có phản ứng khác với bệnh gỉ sắt thị SSR” Tạp chí Nông nghiệp Phát triển nông thôn, 21, 30-32 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 65 http://www.lrc-tnu.edu.vn TIẾNG ANH diversity of wild soybean (Glycine soja Siebold et Zucc.) in the far eastern region of 19 Brown-Guedira, J.A Thompsonb, R.L Nelsonc and M.L Warburton (2000), Russia”, Genetika, 40(2):224-231 “Evaluation of Genetic Diversity of Soybean Introductions and North American 29 Subramanion V, Gurtu S, Nageswara Rao RC, Nigam SN (2000), “Identification Ancestors Using RAPD and SSR Markers”, Crop Science 40:815-823 of DNA polymoraphism in cultivated groundnut using random amplified 20 Bates L S (1973), “Rapid determinatin of tree protein for water-stress studies”, polymoraphic DNA (RAPD) assay”, Genome, 43 (4): 656-60 Plant and Soil, 39, pp 205-207 30 Vierling R., Nguyen H J (1992), “Use of RAPD marker to determine the genetic 21 Chen T.H., Murant N (2002), “Enhancement of tolerance of a family of plant relationships of diploid wheat genotype”, Theor Appl Genet, 84: 835-838 dehydrin proteins”, Physiol Plant, pp 795-803 31 Wan XR, Li L (2006), “Regulation of ABA level and water-stres tolerance of 22 Gawel, Jarret “Genomic (1991) DNA isolation” Arabidopsis by ectopic expression of a peanut 9-cis-epoxycarotenoid”, Biochem www.weihenstephan.de/pbpz/bambara/htm/dna.htm Biophys Res Commun, 347(4), pp 1030-1038 23 Gyu-Taek Cho, Jeongran Lee, Jung-Kyung Moon, Mun-Sup Yoon, Hyung-Jin 32 (71) William J G K., Kubelik A E., Levak K J., Rafalski J A., Tingey S V, Baek, Jung-Hoon Kang, Tae-San Kim, Nam-Chon Paek (2008), “Genetic Diversity (1990), “DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic and Population Structure of Korean Soybean Landrace [Glycine max (L.) Merr.]”, J merers”, Nucleic Acids Res, 18, pp 6531-6535 Crop Sci Biotech 2008 (June) 11 (2) : 83 – 90 33 Welsh J., McClelland M (1990), “Fingeprinting genomes using PCR with 24 Julie Waldron, Cameron P Peace, Iain R Searle, Agnelo Furtado, Nick Wade, Ian arbitrary primer”, Nucleic Acids Res, 18, pp 7213-7218 Findlay, Michael W Graham, and Bernard J Carroll (2002), “Randomly Amplified DNA 34 Xingliang Zhou, Thomas E Carter Jr, Zhanglin Cui, Shoji Miyazaki, Joseph W Fingerprinting: A Culmination of DNA Marker Technologies Based on Arbitrarily- Burto (2002), “Genetic diversity patterns in Japanese soybean cultivars based on Primed PCR Amplification”, J Biomed Biotechnol 2(3): 141–150 coefficient of Parentage” Crop Science; 42, 4; ProQuest Central 25 Moretzsohn MC, Hopkins MS, Mitchell SE, Kresovich S, Valls JF, Ferreira ME 35 Yiwu Chen, Randall L Nelson (2005), “Relationship between Origin and Genetic (2004), “Genetic diversity of peanut (Arachis hypogaea L ) and its wild relatives Diversity in Chinese Soybean Germplasm”, Crop Science; 45, 4; ProQuest Central based on the analysis of hypervariable regions of the genome”, Plant Mol Biol, 4(1) :11 36 Yiwu Chen, Dechun Wang, Prakash Arelli, Mohsen Ebrahimi, Randall L Nelson 26 Lanham PG, Fennell S, Moss JP, Powell W (1992), “Detection of polymorphic (2006), “Molecular marker diversity of SCN-resistant sources in soybean”, Genome; loci in Arachis germplasm using radom amplified polymorphic DNAs”, Genome, 35 49, 8; ProQuest Central (5) :885-9 37 Yong-Bi Fu, Gregory W Peterson, Malcolm J Morrison (2007), “Genetic 27 Li Z., Nelson R.L., (2002), “RAPD Marker Diversity among Cultivated and Wild Diversity of Canadian Soybean Cultivars and Exotic Germplasm Revealed by Simple Soybean Accessions from Four Chinese Provinces”, Crop Science, 42:1737-1744 Sequence Repeat Marker”, Crop Science; 47, 5; ProQuest Central 28 Seitova A.M., Ignatov A.N., Suprunova T.P., Tsvetkov I.L., Deĭneko E.V., Dorokhov D.B., Shumnyĭ V.K., Skriabin K.G., (2004), “Assessment of genetic Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 66 http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 67 http://www.lrc-tnu.edu.vn [...]... giá sự đa giống khác nhau phản ứng khác nhau trước các điều kiện nảy mầm của hạt dạng di truyền về kiểu hình của các giống đậu tương nghiên cứu Chiều dài thân mầm của các giống đậu tương nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.4 Bảng 3.4 Chiều dài thân mầm của các giống đậu tương Chiều dài rễ mầm của các giống đậu tương được thể hiện ở bảng 3.3 Bảng 3.3 Chiều dài rễ mầm của các giống đậu tương nghiên cứu. .. giống đậu tương địa phương Giá trị tương quan kiểu hình (r) lớn nhất 0,79571 khi tính theo hệ số di truyền SM và kiểu phân nhóm UPGMA Kết quả xác định hệ số đồng dạng di truyền được thể hiện ở bảng 3.21 Kết quả phân tích cho thấy có sự sai khác di truyền giữa các giống đậu tương nghiên cứu Hệ số tương đồng giữa 16 giống đậu tương nghiên cứu dao dộng từ 0,745-0,963 Trong đó hai giống có hệ số đồng dạng. .. giống đậu tương trồng và đậu tương dại ở bốn tỉnh của Trung Quốc đã bổ sung dữ liệu về sự đa dạng chỉ thị phân tử Để đánh giá sự thay đổi di truyền của các dòng lúa tái sinh từ mô sẹo chịu RAPD của các giống đậu tương này [27] Sự đa dạng di truyền của các cây đậu tương mất nước, Lê Xuân Đắc, Đinh Thị Phòng đã sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên để chỉ ra dại (Glycine soja Siebold et Zucc.) ở vùng Viễn Đông của. .. trong hạt, sự phản ứng của các giống đậu tương trong điều kiện nhân tạo, tỷ lệ rễ / thân, lá và bằng chương trình NTSYS pc 2.02i chúng tôi đã xác định được hệ số khác nhau về khả năng phản ứng của các cặp giống đậu tương và thiết lập được sơ đồ hình cây của các giống đậu tương nghiên cứu (hình 3.5) Hình 3.5 Sơ đồ quan hệ giữa các giống đậu tương dựa trên sự phản ứng trước tác Bảng 3.15 Hệ số khác nhau... chọn lọc, nghiên cứu sự đa dạng di truyền của lạc và mối quan hệ với dạng dại của chúng trên đánh giá hệ gen của giống và sự đa dạng di truyền của tập đoàn giống [25], [26], [32] cơ sở phân tích các vùng siêu biến của hệ gen [25] Từ khi ra đời kỹ thuật RAPD đã được ứng dụng rộng rãi cho nhiều đối tượng Kỹ thuật RAPD được sử dụng rộng rãi trong những năm gần đây để phân tích khác nhau như: đậu xanh,... trong đó giống SL và HD tăng cao nhất và thấp (4) Kết quả phân tích cho thấy, 16 giống đậu tương nghiên cứu có sự đa dạng di truyền với mức độ sai khác từ 25,5% (1-0,745) tới 3,7% (1-0,963) Hai nhóm giống có độ tương đồng di truyền cao bao gồm nhóm (HG, HD, CB1- hệ số tương đồng từ 0,9125-0,9630) và nhóm (CB2, CB3, DL và KH – hệ số tương đồng từ 0,91800,9590) Qua biểu đồ hình cây và bảng hệ số tương đồng... TÍCH TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở MỨC PHÂN TỬ Kết quả ở bảng 3.16 và hình 3.6 cho thấy, ADN tổng số được tách từ các lá của các ADN CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU TƢƠNG NGHIÊN CỨU giống đậu tương có hàm lượng cao dao động từ 843,5- 1220,5 μg/ml, băng vạch 3.2.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số ADN gọn, không đứt gãy và tương đối sạch, tỷ lệ OD260/OD280 đạt từ 1,78-1,98 Như Tách ADN tổng số từ lá non của đậu tương sau... tinh sạch ADN của 16 giống đậu tương nghiên cứu phân tích tính đa hình ADN của 16 giống đậu tương nghiên cứu Số lượng các phân đoạn ADN được nhân bản với mỗi cặp mồi xê dịch từ 41-144 phân đoạn Kích thước các phân đoạn ADN được nhân bản trong khoảng từ 250-3000bp Tổng số phân đoạn ADN nhân bản được của 10 đoạn mồi RAPD khi phân tích 16 giống đậu tương là 776 Kết quả thể hiện trên bảng 3.17 Giống Hàm lƣợng... trường Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.1.3.4 Nhận xét (1) Kiểu gen của các giống đậu tương nghiên cứu có sự phản ứng khác nhau đối với hạn, biểu hiện ở tỷ lệ sống sót và khả năng giữ nước, chỉ số chịu hạn tương đối của cây Giống SL có chỉ số chịu hạn cao nhất, giống ĐT84 và VX93 có chỉ số chịu hạn thấp nhất (2) Khả năng chịu hạn của cây đậu tương liên... Các giống đậu tương địa phương nghiên cứu có sự đa dạng và phong phú về hình (2) Kết quả phân tích đa dạng di truyền của 16 giống đậu tương bằng chỉ thị RAPD với 10 mồi ngẫu nhiên, có 7/10 mồi cho tính đa hình các phân đoạn ADN được nhân bản Tuy nhiên, tính đa hình của các mồi không cao, có tới 5 mồi cho giá trị PIC < 0,5 Hai mồi M1 và M2 cho tính đa hình cao với giá trị PIC tương ứng là 0,82 và 0,63