ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM - TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM - TRẦN THỊ KIM DUNG TRẦN THỊ KIM DUNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC YẾU TỐ ĐIỀU KHIỂN NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC YẾU TỐ ĐIỀU KHIỂN BIỂU HIỆN GEN UBIQUITIN TỪ HAI LOẠI BÈO TẤM LEMNA AEQUINOCTIALIS DB1 VÀ SPIRODELA POLYRHYZA DB2 BIỂU HIỆN GEN UBIQUITIN TỪ HAI LOẠI BÈO TẤM LEMNA AEQUINOCTIALIS DB1 VÀ SPIRODELA POLYRHYZA DB2 Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TRẦN THỊ PHƢƠNG LIÊN Thái Nguyên – 2009 Thái Nguyên – 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Trần Thị Phương Liên – phòng Công nghệ ADN Ứng dụng – Viện Công nghệ Sinh học đã tận tì nh hướng dẫn và dì u dắt quá trì nh hoàn thành luận văn Luận văn thực Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen với hỗ trợ kinh phí Đề tài nhánh: “Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố công trình khác H5N1 để chuyển vào bèo tấm” thuộc đề tài: Nghiên cứu tạo giống bèo mang gen kháng nguyên H5N1 phòng chống bệnh cúm gia cầm thuộc Chương trình Thái Nguyên, ngày Công nghệ Sinh học Nông nghiệp 2007-2010 tháng năm 2009 Tác giả luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học và các thầy cô giáo khoa Sinh – KTNN, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên , Đại học Thái Nguyên đã giảng dạy tạo điểu kiện cho học tập thực luận văn Tôi xin bày tỏ biết ơn tới toàn thể các cán bộ Phòng Công nghệ ADN Ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học , đặc biệt là PGS.TS Nông Văn Hải – Trưởng phòng Công nghệ ADN Ứng dụng , KS Hà Hồng Hạnh đã giúp đỡ và chỉ bảo Trần Thị Kim Dung rất tận tì nh suốt thời gian thực tập và thực hiện luận văn vừa qua Tôi xin chân thành cảm ơn Viện Di truyền Nông nghiệp đã cung cấp nguyên liệu bèo cho luận văn Cuối cùng , xin dành cho gia đì nh và bạn bè lòng biết ơn sâu sắc vì sự quan tâm, động viên và góp ý cho suốt quá trì nh học tập và hoàn thành khóa luận Học viên Trần Thị Kim Dung Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG NHƢ̃NG TƢ̀ VIẾT TẮT Amp Ampicilin DNA Deoxyribonucleic acid ATP Adenosine triphosphate bp Base pair (cặp bazơ) dNTP Deoxynucleoside triphosphate ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate E coli Escherichia coli EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid epp Eppendorf EtBr Ethidium bromide IPTG Isopropyl thio-β-D-galactoside kb Kilo base LB Luria – Bertani PCR Polymerase Chain Reaction RNase Ribonuclease RNA Ribonucleic acid SDS Sodium Dodecyl Sulphate SHPT Sinh học phân tử TAE Tris – acetate – EDTA X - gal v/p Bảng Tên bảng Tran 1.1 Kích thước gen nhân số loài bèo 1.2 Thành phần hàm lượng hợp chất hữu có cánh bèo Các vị trí nucleotide khác biệt Sp-Ubi-pin (Mỹ) với pJETSpUbipin6 43 3.1 pJETSpUbipin6R 3.2 Các vị trí nucleotide khác biệt La-Ubi-pin (Mỹ) với La-Ubi-10F 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactocide vòng/phút Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 50 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang Lời cam đoan 1.1 Hoa Lemna gibba Những từ viết tắt 1.2 Cây phân loại bèo theo Landolt cộng Danh mục bảng 1.3 Sinh sản vô tính hình thức nảy chồi S polyrrhiza Danh mục hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc gen điển hình 11 Mục lục 1.5 Sơ đồ cấu tạo promoter nhóm II sinh vật nhân chuẩn 12 1.6 Cấu trúc hệ thống điều khiển Ubiquitin thực vật 14 MỞ ĐẦU 2.1 Lemna aequinoctialis DB1; Spirodela polyrrhiza DB2 21 Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3.1 Điện di DNA tổng số gel agarose 0,8% 33 1.1 Giới thiệu chung bèo 3.2 Sơ đồ cấu trúc đoạn yếu tố điều khiển biểu gen ubiquitin loài 34 bèo Spirodela polyrrhiza DB2 (Mỹ) vị trí mồi Trang 1.1.1 Phân bố bèo 1.1.2 Đặc điểm hình thái bèo 3.3 Điện di sản phẩm PCR gel agarose 0,8% 36 1.1.3 Cây phân loại bèo 3.4 Điện di plasmid gel agarose 0,8% 38 1.1.4 Hình thức sinh sản bèo 3.5 Điện di sản phẩm xử lý DNA plasmid enzyme 39 1.1.5 Hệ gen bèo 3.6 Trình tự đoạn yếu tố điều khiển biểu gen ubiquitin loài bèo 40 1.1.6 Giá trị dinh dưỡng 1.1.7 Tiềm sử dụng bèo công nghệ sinh học Spirodela polyrrhiza DB2 với dự đoán vùng chức promoter 3.7 Sơ đồ cấu trúc đoạn yếu tố điều khiển biểu gen ubiquitin loài 44 bèo Lemna aequinoctialis DB1 vị trí mồi 3.8 Điện di sản phẩm PCR gel agarose 0,8% 45 3.9 Điện di plasmid gel agarose 0,8% 47 3.10 Điện di sản phẩm xử lý DNA plasmid enzyme 48 3.11 Trình tự đoạn promoter loài bèo Lemna aequinoctialis DB1 với dự 49 đoán vùng chức promoter Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 1.2 Promoter ứng dụng công nghệ gen thực vật 10 1.2.1 Cấu trúc gen sinh vật 10 1.2.2 Cấu trúc promoter 11 1.2.3 Vai trò biểu gen promoter 13 1.2.4 Phân loại promoter 13 1.2.5 Ứng dụng promoter công nghệ gen thực vật 15 1.3 Tình hình nghiên cứu chuyển gen bèo 17 1.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 17 1.3.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 19 Chƣơng NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U 21 2.1 Nguyên liệu 21 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 2.1.1 Nguyên liệu thực vật 21 MỞ ĐẦU 2.1.2 Hóa chất 21 2.1.3 Thiết bị Khi người có sống định cư, khoảng 8000 năm trước Công nguyên, 22 khu vực Tiểu Á lưu vực sông Nin người ta bắt đầu việc trồng trọt truyền 22 thống với mục đích trì cải thiện chất lượng giống trồng nhằm thỏa mãn 2.2.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ thực vật 22 yêu cầu người ngày tốt Con người biết tạo giống trồng 2.2.2 Phương pháp điện di DNA gel Agarose 24 mang đặc tính mong muốn phương pháp lai tạo giống (lai hữu tính 2.2.3 Nhân gen kỹ thuật PCR 24 hai dòng trồng) Phương pháp cần nhiều thời gian, công sức nhiều 2.2.4 Các phương pháp sử dụng để tách dòng gen 26 trường hợp lai thu kèm theo tính trạng không mong muốn 2.2.5 Xác định trình tự gen 30 Ngày nay, công nghệ gen sử dụng phương pháp đại khắc phục 2.2.6 Xử lý số liệu phần mềm chuyên dụng 30 hạn chế Công nghệ gen cho phép nhà di truyền chọn giống thực Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 vật xác định thiết kế gen đặc hiệu cho mục tiêu mong muốn (kể 3.1 Tách chiết DNA tổng số từ bèo 31 gen có nguồn gốc từ sinh vật khác loài) chuyển gen vào giống 3.2 Phân lập đoạn yếu tố điều khiển biểu gen loài S polyrhiza 33 sử dụng, tạo giống trồng biến đổi gen mang đặc tính 3.2.1 Thiết kế tổng hợp cặp mồi đặc hiệu cho đoạn promoter 33 đáp ứng yêu cầu người đem lại lợi ích quan trọng tăng tính 3.2.2 Nhân đoạn DNA kỹ thuật PCR tách dòng vector pJET1.2 33 chống chịu với điều kiện ngoại cảnh bất lợi, tăng suất chất lượng, cải 3.2.3 Xác định đoạn điều khiển biểu gen RE 38 thiện môi trường nhờ giảm lượng thuốc trừ sâu hoá học cần sử dụng Công nghệ 3.2.4 Xác định phân tích trình tự đoạn promoter 39 gen thực vật mở khả sử dụng thực vật nhà máy sản 43 xuất loại thuốc cần thiết cho người vitamin, enzyme, kháng thể, vacxin 3.3.1 Thiết kế tổng hợp cặp mồi đặc hiệu cho đoạn promoter 43 loại thuốc chữa bệnh khác [3] 3.3.2 Nhân đoạn DNA kỹ thuật PCR tách dòng vector pCR1.2 44 Trong nghiên cứu chuyển gen thực vật, bên cạnh gen có giá trị mã hoá 3.3.3 Xác định đoạn điều khiển biểu gen RE 46 cho tính trạng mong muốn, promoter cần thiết cho biểu gen 3.3.4 Xác định phân tích trình tự đoạn promoter 48 nhận quan tâm đặc biệt nhà nghiên cứu công nghệ gen thực KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53 vật Promoter thành phần quan trọng cấu trúc tất gen, khởi đầu TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 cho phiên mã, đóng vai trò then chốt việc biểu gen Việc phân lập 2.2 Phương pháp nghiên cứu 3.3 Phân lập đoạn yếu tố điều khiển biểu gen loài L aequinoctialis promoter biểu gen hữu hiệu trồng, đặc biệt promoter đặc hiệu cho loại cây, biểu loại mô tế bào khác ngày quan tâm đến Nhiều promoter từ gen thực vật phân lập số phải kể đến promoter ubiquitin gen ngô, promoter gen rbcS (ribulose – 1,5-bisphosphate carboxylase small subunit), promoter gen mã hóa sucrose synthase [4] Ubiquitin - protein sốc nhiệt (heat shock protein - HSP) với phân tử lượng nhỏ, có Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn mặt tế bào tất giai đoạn sinh trưởng, protein tham gia vào Chƣơng trình phân giải polypeptide tế bào chất, đóng vai trò quan trọng việc TỔNG QUAN TÀI LIỆU bảo vệ tế bào chuyển hóa chất tế bào Promoter Ubiquitin gen từ 1.1 Giới thiệu chung bèo ngô sử dụng rộng rãi công nghệ gen thực vật [22], [41], [53] 1.1.1 Phân bố bèo Bèo mầm nhỏ nhất, có hàm lượng protein Bèo với tên khoa học Lemnaceae loài sinh vật thủy sinh có khả polysaccharide cao Với đặc thù cấu trúc trình trao đổi chất, bèo sử tồn phát triển nhiều nơi giới, trừ vùng cực bắc cực nam dụng công nghệ gen thực vật nhà máy sản xuất protein tái tổ hợp Một số quanh năm giá lạnh Ở vùng sa mạc vùng ẩm ướt có mặt bèo promoter bèo phân lập promoter gen SSU5A, SSU5B, Trong chi thuộc loài bèo chi (Spirodela, Lemna, Wolffia) promoter gen NPR1 (negatively phytochrome regulated1) có phản ứng với phân bố khắp giới, Wolffia tìm thấy châu Mỹ châu Phi điều kiện chiếu sáng cảm ứng ABA nghiên cứu trình quang Spirodela có tâm phân bố Nam Mỹ Chi Lemna có tính đa dạng cao Bắc hợp [18], [61] Để tăng cường hiệu chuyển gen, sử dụng promoter Mỹ Đông Nam Á Wolffiella phân bố chủ yếu vùng ven nhiệt đới châu Mỹ truyền thống promoter 35S CAMV, promoter Ubiquitin từ loài bèo Lemna châu Phi Wolffia tồn chủ yếu châu Mỹ, Đông Nam Á châu Úc Lemna minor phân lập, nghiên cứu hoàn thiện Mỹ, đánh giá có hiệu aequinoctialis phân bố rộng rãi vùng có khí hậu ấm áp giới cao đăng ký thành patent [24] Ở Việt nam có loài bèo phát Cùng với nghề trồng lúa nước, chúng có mặt rộng rãi nhiều vùng khác như: thấy Lemna aequinoctialis, Spirodela polyrrhiza Wolffia globosa nhiều vùng Nam Âu, vùng trung tâm Bắc Mỹ, Bắc Trung Quốc, Bắc Nhật Bản…[36] Ở Việt khác Nhằm mục đích nghiên cứu phân lập promoter đặc hiệu từ loài bèo Nam, phát thấy có loài bèo thuộc chi khác (Spirodela, Lemna, Việt Nam phục vụ cho việc thiết theo vector mang gen đem lại lợi ích cho người để chuyển vào bèo tấm, chúng xin đăng ký thực đề tài: “Nghiên cứu phân lập yếu tố điều khiển biểu gen Ubiquitin từ hai loài bèo Lemna aequinoctialis DB1 Spirodela polyrrhiza DB2” với nội dung sau đây: Wolffia) loài L aequinoctialli, S polyrrhiza W globosa [36] Hiện nay, loài bèo phân bố phổ biến vùng mặt nước, ao hồ đồng ruộng tập trung nhiều khu vực đồng Bắc Bộ Nam [7], [36] 1.1.2 Đặc điểm hình thái bèo Lemnaceae thuộc nhóm mầm nhỏ phần lớn có lá, rễ, hoa, quả, trưởng thành thân Lá (cánh bèo) có kích thước khác Hoàn thiện phương pháp tách DNA tổng số từ hai loài bèo Lemna aequinoctialis DB1 Spirodela polyrrhiza DB2; phụ thuộc vào chi, loài 1.1.2.1 Đặc điểm cánh bèo Nghiên cứu thiết kế mồi đặc hiệu nhân đoạn yếu tố điều khiển Dạng thân giống loài Lemnaceae gọi “frond” (cánh bèo), biểu gen đặc hiệu từ hai loài bèo Lemna aequinoctialis DB1 Spirodela tập hợp mô có biệt hóa hạn chế Mức độ tổ chức mô cánh bèo polyrrhiza DB2 PCR; họ Lemnaceae giảm từ Spirodela tới Lemna, Wolffiella Wolffia [36] Cánh Tách dòng xác định trình tự đoạn yếu tố điều khiển biểu gen đặc hiệu từ hai loài bèo Lemna aequinoctialis DB1 Spirodela polyrrhiza DB2 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên bèo không dạng phẳng mà tồn u lồi đặc trưng có định vị gân lá, trưởng thành thường có từ 4-7 gân non có gân Đa số bèo có cánh mỏng giống Một số loài có cánh không dẹt có xoang khí http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn lớn Cánh bèo có hình ô van (hoặc tròn) dài tới 1,5 cm rộng tới cm (S polyrrhiza, L trisulca) Loài nhỏ có cánh đạt kích thước mm điều kiện tối ưu Ở điều kiện thường nhỏ mm (Wolffia) Kích thước hình dạng cánh bèo phụ thuộc nhiều vào điều kiện bên kiểu gen chúng Các yếu tố ngoại cảnh bao gồm: ánh sáng, hàm lượng đường, hàm lượng nitơ, phospho, kali, canxi magie, nhiệt độ…[36] Hình 1.1 Hoa Lemna gibba 1.1.2.2 Đặc điểm rễ bèo Kích thước số lượng rễ cánh bèo loài bèo không giống 1.1.3 Cây phân loại bèo phụ thuộc vào loài [36] Đa số loài thuộc họ Lemna có rễ, S polyrrhiza có từ 7-12 rễ nhiều dài đến 10 mm, Landoltia có 23 rễ lên đến rễ với chiều dài tối đa đạt mm Ngoại trừ điều kiện khắc nghiệt, điều kiện thiếu nitơ, phosphate hay chất khoáng, rễ dài Trong đó, môi trường dinh dưỡng thuận lợi, rễ ngắn chí có loại không hình thành rễ Cấu trúc rễ bèo đơn giản, rễ không phản ánh tăng trưởng tạo nhánh Vì lẽ đó, rễ bèo mảnh nhỏ Cũng giống loại rễ phổ biến khác, rễ bèo có cấu tạo gồm phần chính: Đỉnh rễ, vùng mô phân sinh, vùng kéo dài, vùng tế bào thục 1.1.2.3 Hoa bèo Hoa loài bèo nghiên cứu tương đối kĩ Chúng thường hình thành tồn thời gian ngắn quan sát thấy Hoa Hình 1.2 Cây phân loại bèo theo Landolt cộng loài bèo hình thành thời gian ngắn hay dài khác tuỳ thuộc vào loài Mỗi hoa thường có nhị hoa vòi nhụy hoa Các nhụy hoa Theo Landolt, bèo thuộc giới thực vật, ngành Magnoliophyta, lớp thường ngắn khó quan sát Quả bèo đa phần nhỏ, có lớp vỏ Liliopsida, Arales, họ Lemnaceae gồm chi Lemna, Spirodela, Wolffia, khô, số quan sát thấy mắt thường Quả bèo thường Woffiela với 40 loài khác [36] Ông phân loại bèo dựa số rễ có dạng túi có cưa, có dạng dọc phẳng, thường chứa từ kích thước cánh bèo: Lemna (1 rễ); Spirodela (7-12) rễ; cánh bèo từ 10 mm trở 1-6 hạt [36] Hình 1.1 thể số đặc điểm hoa bèo lên); Landoltia (2-3 rễ, cánh bèo 3-6 mm); Wolffia (không có rễ, cánh bèo 0,6-1,2 mm)… Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Năm 2002, Les cộng dựa đặc điểm hình thái nhiễm sắc thể nửa so với 20oC Trong giai đoạn ngủ, nghỉ nhiệt độ thấp, cánh bèo có vi phân tử (DNA nhân lục lạp) đề giả thiết phân loại bèo thể tồn vài tháng Điều kiện dinh dưỡng có ảnh hưởng đến vòng đời gồm chi tức có thêm chi Landoltia [38] cánh bèo Sự thiếu hụt chất dinh dưỡng làm cánh bèo già hoá nhanh Một số nghiên cứu gần Rothwell cộng sự, dựa so sánh trình tự đoạn intron tRNA Leu Phe UAA (trnL) tRNA UAA (trnF) gen lục chết sau đến tuần Có thể nói, vòng đời dài tốc độ nhân lên cánh bèo nhỏ Khi nồng độ dinh dưỡng giảm ngưỡng tối thiểu cánh bèo bị lạp xác định họ Lemnaceae Pisita thuộc họ ráy Araceae [48] Hình tổn thương chết nhanh bình thường [36] 1.2 biểu thị phân loại bèo [37] 1.1.4.2 Sinh sản hữu tính 1.1.4 Hình thức sinh sản bèo Sinh sản hữu tính thực thông qua hoa tạo hạt tương tự Bèo có hai phương thức sinh sản để trì nòi giống: Sinh sản hữu tính loài thực vật hạt kín khác Với kích thước cánh bèo, hoa hạt nhỏ bé, bèo sinh sản vô tính Sinh sản vô tính chiếm ưu so với sinh sản hữu tính Hình coi loài thực vật hạt kín nhỏ bé giới thực vật Sinh sản hữu tính thức sinh sản hữu tính bèo xảy chúng gặp điều kiện bất lợi để bảo bèo bao gồm giai đoạn: (i) Ra hoa (ii) Tạo hạt tồn nòi giống [36], [37] * Giai đoạn hoa: Cơ quan hoa bèo L aequinoctialis gồm 1.1.4.1 Sinh sản vô tính thành phần: bắc, nhị hoa, nhụy hoa Ở Spirodela Lemna, quan Bèo sinh sản vô tính hình thức nảy chồi từ vùng đỉnh phân sinh hoa phát sinh xoang phát sinh cánh Ở Wolffiella Wolffia, hoa phát sinh nằm xoang vùng gốc cánh Hình 1.3 thể trình sinh sản vô tính xoang bề mặt cánh bèo không cung xoang phát sinh cánh hình thức nảy chồi S polyrrhiza Hoa Wolffia nằm dọc theo đường trung tâm cánh Hoa Wolffiella nằm cạnh đường trung tâm cánh [36] * Giai đoạn tạo hạt: Sau khoảng thời gian từ đến tuần tính từ lúc thụ tinh chín Mỗi có bao khô thường có - hạt Ở hầu hết loài, gần đối xứng ngoại trừ L valdiviana L perpusilla Quả thường dài từ 0,35 mm đến 2,75 mm Hạt bèo có dạng hình trứng với vảy đen đỉnh Khi có nhiều hạt dạng hình trứng tam giác Kích thước hạt biến đổi loài loài từ 0,3 – mm chiều dài Hình 1.3 Sinh sản vô tính hình thức nảy chồi S polyrrhiza Ở điều kiện tối ưu, tốc độ sinh sản vô tính bèo gần đạt mức tăng theo 0,2 – 0,8 mm đường kính Hạt có vỏ hạt vỏ hạt trong, nội nhũ phôi Vỏ gồm – 11 lớp tế bào biểu bì ngoài, đỉnh có nhiều lớp tế bào hàm số mũ Lượng cánh bèo tăng gấp đôi sau 24 nuôi cấy loài cuối hạt [36] sinh trưởng nhanh L aequinoctialis, W microscopica Với hình thức sinh sản 1.1.5 Hệ gen bèo vô tính thời gian vòng đời cánh bèo vài tuần Theo nhiều tác giả cho o biết, vòng đời cánh bèo phụ thuộc vào nhiệt độ nuôi, 30 C vòng đời giảm Các nghiên cứu hệ gen bèo tiến hành từ đầu năm 80 kỷ trước ngày Các kết cho thấy, gen bèo giống với gen thực vật nói chung, bao gồm gen nhân gen nhân Bộ gen Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn bèo có kích thước nhỏ, (lượng DNA 01 nhiễm sắc thể: 1C=0,6 pg hàm lượng chất dinh dưỡng thành phần hữu khác bèo DNA) loài thực vật khác Triticum monococcum gen lớn liệt kê bảng 1.2 nhiều (1C=6,23 pg) [54] Kích thước gen nhân loài bèo khác Bảng 1.2 Thành phần hàm lƣợng hợp chất hữu có cánh bèo nhau, nhỏ Spirodela lớn Wolffia Số lượng nhiễm sắc thể loài Thành phần Hàm lượng (% trọng lượng chất khô) Proteins 6,8 – 45 Lipid 1,8 – 9,2 Sợi thô 5,7 – 16,2 Đường 14,1 – 43,6 Tro 12,0 – 27,6 1.1.7 Tiềm sử dụng bèo công nghệ sinh học khác khác từ 2n = 16 đến 2n = 126 Kích thước gen số loài bèo so với loài đối chứng liệt kê bảng 1.1 [36] Bảng 1.1 Kích thƣớc gen nhân số loài bèo Loài 2n pg DNA pg DNA / pg DNA / 1C chromsome Spirodela polyrrhiza 7110 80 1.19 / 8C 0.15 0.015 Một mục đích chủ yếu công nghệ sinh học, đặc biệt công Spirodela punctata 7461 46 1.48 / 4C 0.37 0.032 nghệ DNA tái tổ hợp tạo sản phẩm chuyển gen có giá trị thương mại cao Lemna minor 7115 126 5.82 / 12C 0.49 0.046 Wolffiella oblonga 79 (7166) Wolffia arrhiza 7347 42 42 3.02 / 4C 6.53 / 4C 0.76 1.63 0.072 0.155 Để tiến hành ứng dụng công nghệ sinh học quy mô sản xuất lớn, đòi hỏi cấp thiết cần phải có hệ thống tái sinh tốt với khả sinh trưởng Gen nhân bèo bao gồm gen lục lạp gen ty thể Gen lục lạp phát triển nhanh, ổn định [13] Cho đến nay, nhà công nghệ sinh học phân tử (cpDNA) bèo đối tượng quan tâm nghiên cứu nhiều Tháng sử dụng nhiều hệ thống sinh học bao gồm: vi khuẩn, nấm, dòng tế bào năm 2008, gen lục lạp Lemna minor giải trình tự hoàn chỉnh Bộ gen lục côn trùng, thực vật, động vật có vú, virus côn trùng, thực vật, sinh vật lạp có cấu trúc mạch vòng bao gồm 165 955 bp mã hóa cho 112 gen (78 gen mã hóa đa bào…Việc lựa chọn hệ thống sinh học phụ thuộc phần lớn vào sản lượng chất protein, 30 tRNA gen rRNA gen [42] lượng thương phẩm Hệ thống sinh học từ vi khuẩn có khả tạo protein với 1.1.6 Giá trị dinh dƣỡng hàm lượng cao hoạt tính protein thu có số hạn chế Bèo có chứa chất dinh dưỡng với đa dạng thành phần định Các tế bào động vật bậc cao có khả cải biến tốt protein sau dịch mã hàm lượng Sinh khối bèo có chứa vitamin A, B1, B2… amino acid lại tiềm ẩn tác nhân gây bệnh có nguồn gốc virus chúng ký chủ cho không thay trừ methionine Bèo nuôi điều kiện tối ưu số nhiều loại virus gây bệnh cho người gia súc Do nhiệm vụ nhà sinh loài thực vật cho hàm lượng protein tổng số đạt giá trị cao Hầu hết loài học phân tử tìm hệ thống sản xuất protein khác đảm bảo yêu cầu: bèo có hàm lượng protein đạt từ 6,8 – 45% phụ thuộc chủ yếu vào điều kiện rẻ tiền, dễ sử dụng không mang nguy lây nhiễm bệnh có nguồn gốc virus nuôi cấy [37] Trong thời gian gần đây, có nghiên cứu sử dụng bèo Hệ thống thực vật So với hệ thống truyền thống, thực vật có nhiều lợi hệ thống sinh tổng hợp chất thứ cấp, sản phẩm mang lợi ích cho người việc sản xuất protein tái tổ hợp Trước hết phải kể đến khả glycoside hóa dân, protein với hàm lượng lớn hoạt tính sinh học cao…[38] Các yếu tố ảnh protein, glycoprotein nhóm protein có vai trò quan trọng hưởng tới hàm lượng protein cánh bèo gồm có: ánh sáng, nhiệt độ, thành phần phản ứng miễn dịch Lợi thứ hai protein tạo thành từ thực vật tương đối an hàm lượng khoáng chất môi trường nuôi (đặc biệt nitơ) Thành phần toàn so với protein có nguồn gốc động vật bậc cao Thứ ba lợi giá thành, Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn http://www.Lrc-tnu.edu.vn thực vật trồng diện tích lớn với chi phí tối thiểu phân bón, công chăm vùng kết thúc Vùng điều khiển có số trình tự đặc hiệu điều khiển hoạt động sóc nguyên liệu đầu vào gen Vùng mang mã chứa thông tin di truyền, phiên mã sang RNA thông Trong loài thực vật nghiên cứu để làm hệ thống tái sinh, loài tin (mRNA), gen cấu trúc dịch mã tạo sản phẩm protein Vùng thuộc họ bèo đặc biệt quan tâm với vòng đời ngắn khả tăng kết thúc mang trình tự phân biệt gen, trình tự kết thúc trình sinh khối nhanh Bèo có tốc độ sinh sản nhanh, nhân đôi trọng lượng phiên mã Cấu trúc gen bao gồm số cấu trúc đặc thù nằm phía trước, phía vòng 24 – 72 Một số giống bèo có tốc độ tăng sinh khối cao hẳn so với sau gen trình tự điều hòa, vùng tăng cường (enhanor), vùng bất loài thực vật khác Đối với ngô, từ g chất khô ban đầu, sau tuần hoạt (silencer), vùng đệm (spacer)… [39] Hình 1.4 sơ đồ cấu trúc gen điển tạo lượng chất khô lớn 2,3 kg Trong số loài bèo hình lại tạo 64 g chất khô từ g chất khô ban đầu sau tuần [31], [50] Mặt khác hàm lượng chất dinh dưỡng bèo cao với đa dạng thành phần vitamin (A, B1, B2…), amino acid không thay Riêng protein bèo đạt từ 6,8 – 45 % trọng lượng khô tuỳ theo loài [36], tức tỷ lệ tương đương với đậu tương Theo tính toán, cần - % tổng số protein nói có hoạt tính sinh học quan tâm đủ để bèo coi hệ thống tái sinh hiệu Do ưu điểm đó, năm gần đây, có nhiều nghiên cứu chuyển gen để sản xuất hoạt chất sinh học từ bèo Các nhà khoa học Mỹ, Israel, Pháp sử dụng loài Lemna để chuyển gen có giá trị kinh tế, nhằm sản xuất hoạt chất sinh học khác có vacine Quy trình Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc gen điển hình 1.2.2 Cấu trúc promoter Gen cấu trúc biểu thành protein cần có mặt trình chuyển gen vào bèo tương tự quy trình biến nạp gen số loài tự điều khiển thích hợp nằm vị trí định Trình tự tham gia tích cực vào thực vật khác, tức phải tạo vật liệu vô trùng ống nghiệm, tạo callus, sau trình điều khiển biểu gen trình tự khởi động (promoter) Promoter bao tái sinh callus chuyển gen thành hoàn chỉnh Ngoài ra, loài thuộc họ bèo gồm trình tự nucleotide nằm ngược phía đầu 5’ so với vị trí khởi đầu phiên mã có khả chuyển gen sử dụng nguyên mà không cần nuôi cấy mô gen (transcription start site – TSS), đóng vai trò điều khiển trình phiên mã nhờ vật liệu vô trùng Tháng 10 năm 2004, phủ Pháp tài trợ để thành lập công khả đảm bảo vị trí nhận biết cho protein tham gia vào việc điều khiển ty Lemnagene nhằm mục đích nghiên cứu ứng dụng bèo công nghệ sinh biểu gen enzyme RNA polymerase, nhân tố phiên mã (transcription học [68] factor – TF) Tùy thuộc vào khoảng cách từ TSS, thuật ngữ “promoter gần” hay “promoter tối thiểu” (khoảng vài trăm nucleotide quanh vùng TSS) (proximal 1.2 Promoter ứng dụng công nghệ gen thực vật promoter hay minimal promoter ) “promoter xa” (hàng nghìn nucleotide phía 1.2.1 Cấu trúc gen sinh vật Gen đoạn phân tử DNA, RNA, mang thông tin di truyền xác định cấu TSS) (distal promoter) sử dụng Cả hai loại promoter gần xa trúc chuỗi polypeptide phân tử RNA định Một gen có cấu chứa nhiều yếu tố tham gia vào quy trình phức tạp nhân tố điều hòa trúc điển hình gồm ba vùng chính: Vùng điều khiển, vùng mang mã di truyền phiên mã đặc hiệu tế bào, mô, quan, giai đoạn phát triển môi trường [3], [53] Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 http://www.Lrc-tnu.edu.vn trúc DNA, đồng thời tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách pha nước với có khả phát quang ánh sáng tia tử ngoại (UV), nên ta phát pha hữu Isoamyl alcohol có tác dụng làm giảm bọt khí trình tách băng vạch chiếu gel ánh sáng UV Sau nhuộm gel chiết Sau lắc mạnh đem ly tâm, hỗn hợp phân làm pha: pha dung dịch EtBr 15 phút, băng DNA xuất rõ nét ánh sáng tử pha nước có chứa DNA, pha protein bị biến tính, pha hỗn ngoại Kết điện di trình bày hình 3.1 hợp phenol, chloroform isoamyl alcohol Pha nước hút nhẹ nhàng sang ống Dịch chiết sau xử lý tiếp hỗn hợp chloroform : isoamyl alcohol (24 : 1) nhằm loại bỏ hoàn toàn phenol có lẫn dịch chiết lần làm DNA, bước lặp lại - lần Tiếp theo bước kết tủa DNA cách bổ sung vào dung dịch chiết CH3COONa 3M có pH 5,2 cồn tuyệt đối Cồn có tác dụng hút lớp nước bao quanh phân tử DNA để lộ gốc phosphate tích điện âm Khi ion Na+ kết hợp với gốc phosphate khiến cho lực đẩy chuỗi nucleotide giảm, Hình 3.1 Điện di DNA tổng số gel agarose 1- DNA tổng số mẫu bèo L aequinoctialis DB1 2- DNA tổng số mẫu bèo S polyrrhiza DB2 DNA bị kết tủa Ở điều kiện -200C 15 DNA kết tủa gần hoàn toàn Trong dung dịch có lẫn nhiều RNA, chúng tiến hành loại RNA cách ủ dung dịch với Rnase 0,01mg/ml 370C - DNA Kết cho thấy, hai băng DNA tổng số hai mẫu bèo tổng số sau điện di gel agarose 0,8% để kiểm tra chất lượng nồng L aequinoctialis DB1 S polyrrhiza DB2 sáng tập trung tương đối rõ nét độ Điều cho thấy nồng độ DNA tổng số thu tương đối cao, bị phân hủy Vì agarose loại polyme tách từ rong biển, cấu tạo RNA Như vậy, sơ đánh giá DNA tổng số thu đạt yêu cầu monomer D-galactose 3,6-anhydro L-galactose, nên sau đun sôi với dung nồng độ để dùng cho thí nghiệm dịch đệm agarose đông lại tạo cấu trúc dạng mạng lưới với kích thước lỗ phụ 3.2 Phân lập đoạn yếu tố điều khiển biểu gen từ loài bèo S thuộc vào nồng độ agarose (kích thước lỗ 150 nm nồng độ 1% 500 nm polyrrhiza DB2 nồng độ 0,16%) Do có cấu trúc dạng mạng lưới, nên sau điện di đoạn DNA có kích thước trọng lượng khác di chuyển với tốc độ khác phụ thuộc vào cấu trúc trọng lượng phân tử chúng DNA tổng số có kích thước trọng lượng phân tử lớn nên tác dụng dòng điện chiều, DNA tổng số di chuyển chậm chiếm vị trí cao gel Những đoạn DNA có kích thước nhỏ (do bị phân hủy) phân tử RNA chạy nhanh tạo thành vệt sáng phía vạch DNA tổng số Trong cấu trúc phân tử DNA có liên kết hydro mạch đơn nên trình nhuộm, phân tử EtBr bám vào liên kết Phân tử EtBr Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 http://www.Lrc-tnu.edu.vn 3.2.1 Thiết kế tổng hợp cặp mồi đặc hiệu cho đoạn promoter Trình tự primer thiết kế dựa trình tự yếu tố điều khiển biểu gen Ubiquitin loài bèo S polyrrhiza DB2 công bố [24] Các gen Ubiquitin có cấu trúc bao gồm promoter, 5’UTR (untranslated region), intron sau trình tự mang mã di truyền ATG (mã Methionin) Như vậy, vùng 5’ trước vị trí khởi đầu phiên mã có đoạn promoter, 5’UTR đoạn intron, đoạn intron xem có chức tăng cường khả biểu gen Sơ đồ trình tự mồi thiết kế nhằm phân lập đoạn promoter Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 http://www.Lrc-tnu.edu.vn (SpUbip) đoạn bao gồm promoter intron (SpUbipin) trình bày sau dNTP làm giảm nhiệt độ nóng chảy Một thành phần quan trọng khác đây: PCR đoạn mồi Việc điều chỉnh nồng độ mồi có liên quan đến chất lượng sản Sp-UbipF Promoter ATG Intron 1033 phẩm thu Khi nồng độ mồi cao, mồi gắn không đặc hiệu khuôn DNA cho sản phẩm gồm nhiều đoạn có kích thước không mong muốn Ngược lại, XbaI-1509 PstI-474 HincII-934 Sp-UbipR 2013 Sp-UbipinR Hình 3.2 Sơ đồ cấu trúc đoạn yếu tố điều khiển biểu gen Ubiquitin loài bèo S polyrrhiza (Mỹ) vị trí mồi nồng độ mồi thấp làm giảm hiệu suất phản ứng Đối với kỹ thuật PCR, việc thiết lập chu trình phù hợp yếu tố quan trọng, yếu tố nhiệt đảm bảo cho giãn xoắn phân tử DNA việc gắn đoạn mồi kéo dài chuỗi Chúng tiến hành nhân đoạn promoter với 25 chu kỳ, chu kỳ gồm giai đoạn sau: Trình tự cặp mồi sau: Sp-UbipF: 5’ GGC GGA GAT GGA CAG ATA ATG AGA TG 3’ Sp-UbipR: 5’ ACT TGG GAG AGA CGA CGC GCT TCC TC 3’ Sp-UbipinR: 5’ GCT GAT GGA ACA TAT GAC GAC TGA AAG G 3’ 3.2.2 Nhân đoạn DNA kỹ thuật PCR tách dòng vector pJET1.2 3.2.2.1 Nhân đoạn DNA kỹ thuật PCR - Giai đoạn biến tính: lựa chọn 950C phút Đây nhiệt độ thích hợp để tách hoàn toàn DNA sợi kép thành sợi đơn đồng thời đảm bảo hoạt tính Pfu DNA polymerase - Giai đoạn gắn mồi: nhiệt độ gắn mồi phải thấp nhiệt độ nóng chảy (Tm) primer để primer bắt cặp với DNA khuôn Đồng thời nhiệt độ gắn mồi không thấp khiến cho khuôn bị biến tính Giá trị phụ Chúng PCR nhân đoạn promoter từ DNA tổng số mẫu bèo S polyrrhiza DB2 sử dụng cặp mồi Sp-UbipF Sp-UbipinR cho đoạn khoảng thuộc vào loại mồi thấp Tm từ - 100C, Tm tính theo công thức: Tm = 20C x (A + T) + 40C x (G + C) + 3,30C Sau tính nhiệt kb (SpUbipin) Sản phẩm PCR sử dụng để tiến hành PCR nhân đoạn độ nóng chảy theo lý thuyết, chúng tiến hành PCR thử nghiệm với nhiệt promoter với cặp mồi Sp-UbipF Sp-UbipR với đoạn khoảng 1kb (SpUbip) độ khác chọn nhiệt độ gắn mồi tối ưu 50 0C thời gian Kỹ thuật PCR tiến hành môi trường đệm thích hợp với hoạt phút động xúc tác enzyme pH, lực ion,… Thành phần dung dịch đệm thay - Giai đoạn kéo dài chuỗi: đặt nhiệt độ 720C phút Đây nhiệt độ đổi tùy theo loại enzyme sử dụng kỹ thuật PCR Dung dịch đệm sử dụng cho làm việc tối ưu Pfu DNA polymerase thời gian đủ để kéo dài chuỗi DNA enzyme Pfu DNA polymerase gồm có: Tris-HCl 100 mM pH 8,3; KCl 500 mM; kích thước khoảng kb MgCl2 25 mM; gelatin 0,01% Ngoài ra, bắt đầu phản ứng chúng cho chạy trước bước khởi động Một yếu tố quan trọng thành phần đệm ion Mg2+, tạo thành nóng 950C phút để đảm bảo biến tính hoàn toàn DNA tổng số Sau kết phức với dNTP, Mg2+ có tác dụng gắn dNTP với enzyme, kích hoạt DNA thúc 25 chu kỳ, chúng đặt nhiệt độ 720C 10 phút để đảm bảo tổng polymerase, tăng kết hợp mồi đoạn khuôn, tác động vào hợp DNA kết thúc hoàn toàn Sau sản phẩm PCR bảo quản nhiệt 2+ nóng chảy DNA mạch kép Nồng độ ion Mg thay đổi tùy thuộc vào trình nhân đoạn DNA cụ thể Nồng độ dNTP phụ thuộc nhiều vào kích độ 40C Sản phẩm PCR sau kiểm tra gel agarose 0,8% Kết thước đoạn DNA cần nhân, nồng độ ion Mg2+ nồng độ đoạn mồi Việc bổ sung hình 3.3 cho thấy sản phẩm PCR mẫu bèo đặc hiệu Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 http://www.Lrc-tnu.edu.vn 35 http://www.Lrc-tnu.edu.vn tác lắp ghép, thu lại kiểm tra đoạn DNA chèn vào Cuối cùng, hai trình tự M mồi pJET1.2 xuôi pJET1.2 ngược nằm hai phía điểm gắn sản phẩm PCR tạo điều kiện thuận lợi cho việc xác định trình tự gen Trước thực phản ứng ghép nối, chúng tinh sản phẩm PCR Wizard kit Thành phần phản ứng ghép nối sau: 10 µl đệm phản ứng 2X, kb µl sản phẩm PCR, µl H2O, µl vector pJET1.2 µl enzyme T4 DNA ligase kb Sản phẩm phản ứng ghép nối biến nạp vào tế bào khả biến E coli DH5α Các tế bào sau nuôi cấy môi trường LB đặc có bổ sung Hình 3.3 Điện di sản phẩm PCR gel agarose 0,8% M: Thang DNA chuẩn kb 1: Sản phẩm PCR mẫu bèo S polyrrhiza DB2 với cặp mồi Sp-UbipF Sp-UbipinR 2: Sản phẩm PCR mẫu bèo S polyrrhiza DB2 với cặp mồi Sp-UbipF Sp-UbipR Căn vào thang DNA chuẩn, kích thước sản phẩm PCR kb cặp mồi Sp-UbipF Sp-UbipinR kb cặp mồi Sp-UbipF Sp-UbipR, đúng với dự đoán gen cần nhân Sản phẩm PCR hoàn toàn đạt yêu cầu làm Amp (50 g/ml) 370C qua đêm Kết chúng thu nhiều khuẩn lạc dòng tế bào vi khuẩn có mang plasmid Để xác định xem plasmid có thực mang đoạn DNA cần tách dòng (vùng promoter) hay không chúng tiến hành tách chiết DNA plasmid từ số khuẩn lạc để kiểm tra 3.2.2.3 Tách chiết plasmid DNA Để tách chiết DNA plasmid, chúng lấy 15 - 40 khuẩn lạc nuôi cấy môi trường LB lỏng có bổ sung Amp (50 g/ml) 370C từ 12 - 14 Trước tiên, tế bào dịch nuôi cấy thu nhận cách ly tâm nguyên liệu cho thí nghiệm tách dòng gen thu tủa Tiếp chúng xử lý dung dịch I (có tác dụng rửa tế bào); 3.2.2.2 Tách dòng vector pJET1.2 Nhằm mục đích tách dòng xác định trình tự đoạn promoter, chúng tiến hành gắn sản phẩm PCR nhân giống bèo S polyrrhiza DB2 vào vector pJET2.1 sử dụng hóa chất GeneJETTM PCR Cloning Kit Ưu điểm việc sử dụng Kit thao tác đơn giản, tiện lợi, nhanh hiệu Vector pJET1.2 có chứa điểm khởi đầu chép rep (pMB1) nên có khả chép độc lập với hệ gen tế bào chủ E coli Gen kháng Amp có vector cho phép chọn lọc tế bào có mang vector môi trường có Amp Ngoài ra, vector chứa gen eco471IR mã hóa cho nuclease phân hủy DNA nhân gây chết tế bào vật chủ Khi vector gắn thêm đoạn DNA ngoại lai gen eco471IR bị bất hoạt Nhờ đó, trình lựa chọn dòng khuẩn lạc có mang plasmid tái tổ hợp hiệu Trên vùng đa gắn MCS có chứa điểm nhận biết enzyme giới hạn KpnI, XhoI, XbaI,… giúp dễ dàng thao dung dịch II có chứa NaOH 0,2M SDS 1% Các cấu trúc tế bào liên kết hydro phân tử bị phá vỡ SDS với EDTA dung dịch II có vai trò ức chế nuclease EDTA liên kết ion Mg2+ (yếu tố cần thiết cho hoạt động nuclease), ngăn không cho nuclease phân giải DNA trình tách chiết Tế bào vi khuẩn E coli có chứa hai dạng DNA: DNA nhiễm sắc thể E coli DNA plasmid nên việc tách riêng, làm DNA plasmid quan trọng DNA plasmid tách riêng dựa khống chế thời gian xử lý dung dịch I, II, III DNA nhiễm sắc thể có kích thước phân tử lớn lại liên kết chặt chẽ với protein phức chất nucleoprotein nên khoảng thời gian ngắn không kịp thoát Trong đó, phân tử DNA plasmid mạch vòng giải phóng môi trường Khi môi trường xử lý tiếp với dung dịch III pH môi trường trở khoảng acid yếu gắn với điểm đẳng điện DNA Vì vậy, DNA plasmid dễ bị kết tủa cồn kiểm tra kích Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 http://www.Lrc-tnu.edu.vn thước phương pháp điện di gel agarose (hình 3.4) ĐC 10 11 12 13 14 15 kb 14 16 21 A kb B 6.0 4.0 3.0 2.0 6.0 4.0 3.0 2.0 1.0 1.0 kb 14 16 21 6.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.75 plasmid đối chứng (không chèn thêm đoạn DNA) Do vậy, độ cao thấp Hình 3.5 Điện di sản phẩm xử lý DNA plasmid enzyme A Plasmid số 1, 4, pJETSpUbip số pJETSpUbipin cắt HindIII NotI B Plasmid số 14, 16, 21 pJETSpUbipin cắt HincII C Plasmid số 14, 16, 21 pJETSpUbipin cắt PstI Các dòng pJETSpUbip, pJETSpUbipin có điểm cắt HincII tạo băng so với băng đối chứng sở để dự đoán dòng chèn thành băng tương ứng khoảng kb kb (hình 3.5 B) Hai điểm cắt PstI thêm đoạn DNA ngoại lai Kết hình 3.4 cho thấy giống bèo (pJET1.2 có điểm cắt vị trí 158) dòng pJETSpUbip cho hai băng 3,3 S polyrrhiza DB2 có dòng cao dòng đối chứng, kết 0,8 kb, pJETSpUbipin cho hai băng khoảng 4,2 kb 0,8 kb (hình 3.5 C) Như luận sơ dòng chèn thêm đoạn DNA ngoại lai vậy, kết kiểm tra vị trí enzym cắt hạn chế dự đoán đoạn gắn 3.2.3 Xác định đoạn điều khiển gen RE đoạn chúng cần tìm Hình 3.4 Điện di plasmid gel agarose ĐC: DNA plasmid đối chứng 1-15: DNA plasmid mang gen giống bèo S polyrrhiza DB2 Theo lý thuyết, plasmid mang đoạn gen ngoại lai có kích thước lớn Để kiểm tra kích thước thực tế đoạn DNA nối vào vector, chúng 3.2.4 Xác định phân tích trình tự đoạn promoter tiến hành phân tích mẫu DNA plasmid nói phương pháp xử lý với Chúng xác định trình tự DNA dòng này, dòng lần enzyme giới hạn Vector pJET1.2 có chứa điểm nhận biết enzyme XhoI phía bên máy xác định trình tự tự động dựa sở phương pháp Sanger Chúng trái điểm nhận biết enzyme XbaI phía bên phải vị trí ghép nối gen, sử dụng cặp mồi pJET1.2 để xác định trình tự đoạn promoter plasmid tái tổ nhiên nghiên cứu chúng không dùng enzyme XhoI XbaI hợp theo hai chiều Sau số liệu xử lý phần mềm ABI PRISM thường lệ mà dùng enzyme HindIII NotI để kiểm tra đoạn gắn trình tự 3100 Data Collection v2.0, DNA Sequencing Analysis v5.2, Seqscape v2.5, BioEdit đoạn promoter có điểm nhận biết hai enzym hạn chế Qua đó, chúng v7.0.5, nhận trình tự đoạn yếu tố điều khiển biểu gen Ubiquitin có chọn dòng pJETSpUbip số 1, với đoạn cắt kiểm tra khoảng chiều dài 2013 bp, đoạn promoter 5’UTR có chiều dài 1033 bp giống 1,3 kb dòng pJETSpUbipin số 14, 16 21 với đoạn cắt kiểm tra khoảng bèo S polyrrhiza DB2 Sau chúng tiến hành so sánh trình tự 2,3 kb (hình3.5 A) Các dòng lại tiếp tục kiểm tra enzym hạn với trình tự đoạn yếu tố điều khiển biểu gen Ubiquitin loài Mỹ chế HincII PstI bên đoạn công bố Ngân hàng gen quốc tế Kết so sánh trình tự đoạn điều khiển pJETSpUbipin16 trình bày hình 3.6 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 http://www.Lrc-tnu.edu.vn C Sp-Ubi-pin-core pJETSpUbipin16 10 20 30 40 50 60 | | | | | | | | | | | | GAGATGGACAGATAATGAGATGAATTAGAAAAAAAAAATTCGTGTTGTAAGATAGAATAC Sp-Ubi-pin-core pJETSpUbipin16 70 80 90 100 110 120 | | | | | | | | | | | | TTGCTATCTACTGATGAATGCAGTTCAGTTTTCCTCACGATCTTAAAGATCGCGCACTAT Sp-Ubi-pin-core pJETSpUbipin16 130 140 150 160 170 180 | | | | | | | | | | | | CCTCAGCTTCACTCTGGAAATTTTGATTCTCTTCTTCTGCTCAGCAGCCTCGACTCTGTC Sp-Ubi-pin-core pJETSpUbipin16 190 200 210 220 230 240 | | | | | | | | | | | | TAGGGTTTCGTACAATCGGACGCCATTCTACATGAATCGAGCACAGGGAATGAAGACAAT Sp-Ubi-pin-core pJETSpUbipin16 250 260 270 280 290 300 | | | | | | | | | | | | TAGGAGATCCTCGATGTCCTCCGACTTACTTGCATGACTTGACGGGGAAGATCTCGAGCA Sp-Ubi-pin-core pJETSpUbipin16 310 320 330 340 350 360 | | | | | | | | | | | | GGGAAGCGACGCCTCTCCGGAGGACTCGCCTCGCCGAGAGGACCTCCTCCGCGACACGGA Sp-Ubi-pin-core pJETSpUbipin16 370 380 390 400 410 420 | | | | | | | | | | | | CCATGGCCTCCACGGGGTAGAAGCTGGCCCTGTTCTTTATTCTCTTGAGGATCATCGGCC Sp-Ubi-pin-core pJETSpUbipin16 430 440 450 460 470 480 | | | | | | | | | | | | GAAGCCTCCGCAAATCCATCCCCGAGGAGTAGAATCTCGCCTGCAGGAAGCATCTGTCGA Sp-Ubi-pin-core pJETSpUbipin16 490 500 510 520 530 540 | | | | | | | | | | | | GATCCTCGCCGAGGCGGCGGAGATACCTCGCCGGCGCCGCCATGGCGCCGGGGACGGAGC ABRE Sp-Ubi-pin-core pJETSpUbipin16 730 740 750 760 770 780 | | | | | | | | | | | | ACGTCATCATGGTGTCATGACCGCCCAACAGCCGCAGATTTAAAATCGGTGGATGAGTGC G T Sp-Ubi-pin-core pJETSpUbipin16 790 800 810 820 830 840 | | | | | | | | | | | | GGCCACGCCACGAAAGCGATGGGCCTTCGTCGATGCCGTGAGAATCCATCTGACATAAAG Sp-Ubi-pin-core pJETSpUbipin16 850 860 870 880 890 900 | | | | | | | | | | | | TAAACGGCGCCGTCAGTATTGACGGCGTATGACACGTGGAAAGAAGCTATTGGTTCACGC C Sp-Ubi-pin-core pJETSpUbipin16 910 920 930 940 950 960 | | | | | | | | | | | | ATCGGTGGTTCCGCTAGCCTCCGTCGACCGCTAGTACTATAAATACGGTCCCGAGGCCTC Sp-Ubi-pin-core pJETSpUbipin16 970 980 990 1000 1010 1020 | | | | | | | | | | | | CTCACCACTCGCACATATCCTCTTTGTTTTCCTCTCCGTGAAAGAAGCGAGGAAGCGCGT Sp-Ubi-pin-core pJETSpUbipin16 1030 1040 1050 1060 1070 1080 | | | | | | | | | | | | CGTCTCTCCCAAGGTAAGGAGCAGATCTCTTTGATCGTTTTTGTTCTTCTTTTGTTTTGT MYC-like G-box TATA Sp-Ubi-pin-core pJETSpUbipin16 1090 1100 1110 1120 1130 1140 | | | | | | | | | | | | TTTTTTTTTCTGCGGATCTTCGGTTGCATCATGCCTTGGCTGTTTTTATTAGTTTAGGAT - 1150 1160 1170 1180 1190 1200 | | | | | | | | | | | | ATCCTCGTTTGGATCTGAGCCGATCATATATGTTAAAGGTTGTGTTCGATCTCTTTGTTC Sp-Ubi-pin-core pJETSpUbipin16 1210 1220 1230 1240 1250 1260 | | | | | | | | | | | | ATTTTCGCATGAAAAGGATGTATCCTTTTGATGTGAGGCGATCTTCTATGGTTAAGACTT Sp-Ubi-pin-core pJETSpUbipin16 550 560 570 580 590 600 | | | | | | | | | | | | ACCACCACGGAGAAGAAGAACCCTAACCCAAGGCATTAACGAAGTTGCGCAGATTATACA T Sp-Ubi-pin-core pJETSpUbipin16 1270 1280 1290 1300 1310 1320 | | | | | | | | | | | | TGTTCGGTCTATTGATCATTTCTGTTCTTCGTTTTTGAGTTTTTTTCTGCGGATATCGCA .- Sp-Ubi-pin-core pJETSpUbipin16 610 620 HSE 630 640 650 660 | | | | | | | | | | | | AAAGCCCTCAAATATCTTTCATTTTCTATTTCACTGATACATTTTCATTATTGTATATGA Sp-Ubi-pin-core pJETSpUbipin16 1330 1340 1350 1360 1370 1380 | | | | | | | | | | | | TCATCCCTAGGTTTTTGCTTTGGTTAGGATGCATCCTTTGGATTTGAGCCGATCTCCCTT Sp-Ubi-pin-core pJETSpUbipin16 DRE 710 670 680 HSE 690 700 720 | | | | | | | | | | | | GTGTTTATTTAAATTATTCCGTATTAGAAAAGCACCTCCAGAACCCGACAAAATAGGGTG Sp-Ubi-pin-core pJETSpUbipin16 1390 1400 1410 1420 1430 1440 | | | | | | | | | | | | GGTTAAGGCTGTGTCTGTTGCAGAGGAGAAAGTCTGTCGAGGTCCTTATGCAGGCTTTGT Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Sp-Ubi-pin-core pJETSpUbipin16 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Từ kết so sánh trên, chúng quan sát thấy đoạn yếu tố điều Sp-Ubi-pin-core pJETSpUbipin16 1450 1460 1470 1480 1490 1500 | | | | | | | | | | | | CCAGATGCGCGTGCTCTCTCATGCTATGAATTTATGTTTTGAGAACTCCTCCCGGTTTTT Sp-Ubi-pin-core pJETSpUbipin16 1510 1520 1530 1540 1550 1560 | | | | | | | | | | | | CTAGATCCGGATTTGAAGTATTCATTGCGGTTCCCCTTCGGTTTTATGTATTTCTCGAGT STT Vị trí Sp-Ubi-pin (Mỹ) Sp-Ubi-pin16 Sp-Ubi-pin-core pJETSpUbipin16 1570 1580 1590 1600 1610 1620 | | | | | | | | | | | | TGATTTGGTCCATGATCGTGTTCTGTCCAGATCTCTCTTGATATGGATGAGATATTCGTT 599 C T 729 A G 741 C T Sp-Ubi-pin-core pJETSpUbipin16 1630 1640 1650 1660 1670 1680 | | | | | | | | | | | | ACCTCTTTCAAACATCGGTGGATGTTCTTTTTAGTCTTGGCTCACCTTTATCTAGAAATT Sp-Ubi-pin-core pJETSpUbipin16 1690 1700 1710 1720 1730 1740 | | | | | | | | | | | | AATTTTCGGTTTGAAACCCCTGCTTGTTAAGGTGATGTATTCCTTCTTTATAGATTTCGG Sp-Ubi-pin-core pJETSpUbipin16 1750 1760 1770 1780 1790 1800 | | | | | | | | | | | | TGTGTTATTTCTTAACGGTGATCTGTCCGATCCATGTGTTGCACCTCTTGTTTTCTGTGT Sp-Ubi-pin-core pJETSpUbipin16 1810 1820 1830 1840 1850 1860 | | | | | | | | | | | | AATCCTCTGTGAATTATAATTATGTTTTGAAAACGTACTTAAGTAAGGGGCATGTTCCCC Sp-Ubi-pin-core pJETSpUbipin16 1870 1880 1890 1900 1910 1920 | | | | | | | | | | | | GTTTAAAACTTTTGTTCTATCAATTTGTGGTTAATAGATCCTGATTTGTGGTCGCCTTAT Sp-Ubi-pin-core pJETSpUbipin16 1930 1940 1950 1960 1970 1980 | | | | | | | | | | | | TCTGTCTTTAATCGTGGATTTTATTTATCTTGAGCGCGTCCTTTTCTTTTAAAATCATGT Sp-Ubi-pin-core pJETSpUbipin16 1990 2000 2010 | | | | | | GTTTAACCTTTCAGTCGTCATATGTTCCATCAG 42 kê bảng 3.1 sau: Bảng 3.1 Các vị trí nucleotide khác biệt Sp-Ubi-pin (Mỹ) với Sp-Ubi-pin 16 (Việt Nam) 859 T C Sử dụng phần mềm chuyên dụng dự đoán chức trình tự http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html, http://www.softberry.ru/cgi- bin/programs/promoter cho thấy đoạn có vùng chức promoter (hình 3) Hộp TATA vị trí 938 điểm khởi đầu phiên mã dự đoán vị trí 974 Ngoài có trình tự đặc trưng cho G-box (868) , ABRE (719), MYC - like (827), DRE (716), HSE (617 676)… Đây yếu tố điều hòa promoter gen cảm ứng với ánh sáng, abscisic acid, điều kiện nước…Vùng có trình tự nGAAn trình tự ngược chiều nTTCn dự đoán yếu tố sốc nhiệt (heat shock element - HSE) promoter gen mã hóa cho HSP 3.3 Phân lập đoạn yếu tố điều khiển biểu gen từ loài bèo L aequinoctialis DB1 3.3.1 Thiết kế tổng hợp cặp mồi đặc hiệu cho đoạn promoter Dựa trình tự yếu tố điều khiển biểu gen Ubiquitin loài bèo L aequinoctialis DB1 công bố [24] chúng thiết kế mồi theo sơ đồ Hình 3.6: Trình tự đoạn yếu tố điều khiển biểu gen ubiquitin loài bèo S polyrrhiza DB2 với dự đoán vùng chức promoter Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên khiển biểu gen Ubiquitin có vị trí thay đổi so với loài Mỹ thống http://www.Lrc-tnu.edu.vn vị trí mồi hình 3.7 Tương tự loài bèo S polyrrhiza DB2, mồi La-UbipF La-UbipR nhằm phân lập đoạn promoter, mồi La-UbipinR kết hợp với La-UbipF để nhân đoạn bao gồm promoter , 5’UTR intron Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 http://www.Lrc-tnu.edu.vn gian phút Thông thường nhiệt độ gắn mồi sử dụng Taq DNA polymerase cao La-UbipF Promoter ATG Intron 964 so vói sử dụng Pfu DNA polymerase - Giai đoạn kéo dài chuỗi: đặt nhiệt độ 720C phút Đây nhiệt độ 2068 Sall-858 La-UbipR La-UbipinR Hình 3.7: Sơ đồ cấu trúc đoạn yếu tố điều khiển biểu gen ubiquitin loài bèo Lemna aequinoctialis DB1 vị trí mồi Trình tự cặp mồi sau: làm việc tối ưu Taq DNA polymerase thời gian đủ để kéo dài chuỗi DNA kích thước khoảng kb Ngoài ra, bắt đầu phản ứng chúng cho chạy trước bước khởi động nóng 950C phút để đảm bảo biến tính hoàn toàn DNA tổng số Sau kết thúc 32 chu kỳ, chúng đặt nhiệt độ 720C 10 phút để đảm bảo tổng La-Ubip-F: 5’- GGG CAG TGT ACC AAT ATT TTA AAC CC - 3’ La-Ubip-R: 5’- ACT GAG AAA GAA GAA GGA TTC CGC CC - 3’ hợp DNA kết thúc hoàn toàn Sau sản phẩm PCR bảo quản nhiệt độ 40C Sản phẩm PCR sau kiểm tra gel agarose La-Ubipin-R: 5’- GGG CCT GCA AGG GAA AAT AAT AAA TTG - 3’ M 3.3.2 Nhân đoạn DNA kỹ thuật PCR tách dòng vector pCR2.1 3.3.2.1 Nhân đoạn DNA kỹ thuật PCR Chúng tiến hành PCR nhân đoạn điều khiển bao gồm promoter intron từ DNA tổng số mẫu bèo L aequinoctialis DB1 sử dụng cặp mồi kb La-UbipF La-UbipinR cho đoạn khoảng 2,1 kb (LaUbipin) Sản phẩm PCR kb sử dụng để tiến hành PCR nhân đoạn promoter với cặp mồi La-UbipF LaUbipR với đoạn khoảng kb (LaUbip) Kỹ thuật PCR tiến hành môi trường đệm thích hợp với hoạt động xúc tác enzyme pH, lực ion,… Thành phần dung dịch đệm thay đổi tùy theo loại enzyme sử dụng kỹ thuật PCR Dung dịch đệm sử dụng cho enzyme Dream Taq DNA polymerase gồm có: Tris-HCl 100 mM; pH 8,3; KCl 500 mM; MgCl2 25 mM; gelatin 0,01% Chúng tiến hành nhân đoạn promoter với 32 chu kỳ, chu kỳ gồm Hình 3.8 Điện di sản phẩm PCR gel agarose M: Thang DNA chuẩn kb 1: Sản phẩm PCR mẫu bèo L aequinoctialis DB1 với cặp mồi La-UbipF La-UbipinR 2: Sản phẩm PCR mẫu bèo L aequinoctialis DB1 với cặp mồi La-UbipF La-UbipR Kết hình 3.8 cho thấy sản phẩm PCR mẫu bèo đặc hiệu Căn vào thang DNA chuẩn, kích thước sản phẩm PCR 2,1 kb cho đoạn giai đoạn sau: - Giai đoạn biến tính: lựa chọn 95 C phút Đây nhiệt độ thích hợp promoter intron kb cho đoạn promoter đúng với dự đoán gen cần để tách hoàn toàn DNA sợi kép thành sợi đơn đồng thời đảm bảo hoạt tính nhân Sản phẩm PCR hoàn toàn đạt yêu cầu làm nguyên liệu cho thí nghiệm Taq DNA polymerase tách dòng gen - Giai đoạn gắn mồi: nhiệt độ gắn primer tối ưu loài bèo Lemna aequinoctialis DB1 cao so loài bèo S polyrrhiza DB2: 550C thời Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 http://www.Lrc-tnu.edu.vn chúng thu nhiều khuẩn lạc trắng dòng tế bào vi khuẩn có 3.3.2.2 Tách dòng vector pCR2.1 Nhằm mục đích tách dòng xác định trình tự đoạn promoter, chúng tiến mang plasmid Để xác định xem plasmid có thực mang đoạn DNA cần hành gắn sản phẩm PCR nhân giống bèo L.aequinoctialis DB2 vào tách dòng (vùng promoter) hay không chúng tiến hành tách chiết DNA vector pCR2.1 sử dụng hóa chất GeneJET TM PCR Cloning Kit nhờ đặc plasmid từ số khuẩn lạc để kiểm tra điểm ưu việt vector pCR2.1 3.3.2.3 Tách chiết plasmid DNA Vecctor pCR2.1 chứa đầy đủ thành phần cần thiết vector tách Kết hình 3.9 cho thấy giống bèo L aequinoctialis DB1 có dòng để tự chép tế bào chủ Vector có khả cho số lượng dòng từ 1, 3, 4, 10, 11, 13, 14,15, 16 cao dòng đối chứng, lớn tế bào (200 sao/ tế bào), có khả tải đoạn gen tốt kết luận sơ dòng chèn thêm đoạn DNA ngoại lai ổn định tế bào chủ Đồng thời nhờ có kích thước nhỏ mà dễ dàng biến nạp vào tế bào pCR2.1 chứa vùng trình tự đa điểm cắt, mang hai dấu chuẩn ĐC 10 11 12 13 14 15 16 chọn lọc gen kháng sinh ampicilin kanamycin Vector pCR2.1 thiết kế để nhân gen ngoại lai vùng MCS Ở đầu 3’ sợi gắn thêm nucleotide T Nucleotide T dễ dàng bắt cặp bổ sung với nucleotide A đầu 3’ sản phẩm PCR sử dụng Taq DNA polymerase Khi đó, sản phẩm PCR vector pCR2.1 tự nối ghép với cách dễ dàng Một đặc điểm cấu trúc vector pCR2.1 vùng MCS có chứa operon LacZα mã hóa cho enzym β-galactosidaza dấu hiệu chọn lọc trắng- xanh để biến nạp mang plasmid tái tổ hợp: môi trường có chứa chất Xgal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D(-)-galactopyranoside) IPTG (isopropylthio--D-galactoside) khuẩn lạc tái tổ hợp có mầu trắng đoạn chèn làm bất hoạt enzyme Hình 3.9 Điện di plasmid gel agarose 0,8% ĐC: DNA plasmid đối chứng 1-16: DNA plasmid mang gen giống bèo L aequinoctialis DB1 3.3.3 Xác định đoạn điều khiển gen RE Để kiểm tra kích thước thực tế đoạn DNA nối vào vector, chúng tiến hành phân tích mẫu DNA plasmid pCRLaUbipin phương pháp xử lý với enzyme giới hạn EcoRI để kiểm tra kích thước đoạn gắn Các plasmid Để chuẩn bị ghép nối, sản phẩm PCR tinh Wizard kit Như biết, việc sử dụng Taq DNA polymerase PCR tạo khoảng 70 - 90% sản phẩm PCR có thêm nucleotide A đầu 3’, phản ứng ghép nối sản phẩm PCR thực sau: µl đệm phản ứng 10X; µl sản phẩm PCR, µl H2O, µl vector pCR2.1 µl enzyme T4 DNA ligase pCRLaUbipin số 10, 11, 31 thu băng 3,9 kb 2,1 kb tương ứng với kích thước vector pCR2.1 (3,9 kb) sản phẩm PCR – LaUbipin (hình 3.10 A) chọn để khảo sát Các dòng xử lý tiếp enzyme hạn chế Sall trình tự đoạn promoter có điểm nhận biết enzyme hạn chế Các dòng pCR2.1 LaUbipin thu băng 5,9 kb (hình 3.10B) Cũng Sản phẩm phản ứng ghép nối đem biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α Các tế bào sau nuôi cấy môi trường LB đặc có tương tự dòng pCRLaUbip, sau xử lý với enzyme EcoRI chọn dòng pCRLaUbip số có hai băng 3,9 kb kb tương ứng với kích bổ sung Amp (50g/ml), Xgal (50g/ml) IPTG (50g/ml) 370C qua đêm Kết Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 http://www.Lrc-tnu.edu.vn La-Ubi-pin Laubi-10 R 10 20 30 40 50 60 | | | | | | | | | | | | AGTGTACCAATATTTTAAACCCTACATTTATCATTCTTTATTCATTATTGCCATAAGTTA La-Ubi-pin Laubi-10 R 70 80 90 100 110 120 | | | | | | | | | | | | ATGAATATTGAAATTCAAATACGCGCAAGATGTCAATATCGATCGAATATGAATACCAGA La-Ubi-pin Laubi-10 R 130 140 150 160 170 180 | | | | | | | | | | | | TATAAAATCAAAAATCAAATATCAAATTAATAAAGATATAAAATATTGAATCCAAAAGCA La-Ubi-pin Laubi-10 R 190 200 210 220 230 240 | | | | | | | | | | | | ATAAAGAATATCACTATTAATATCAAAATATCGATTTGAAGTTCAAAAATTGGGTCCATT La-Ubi-pin Laubi-10 R 250 260 270 280 290 300 | | | | | | | | | | | | AGGAGCCAAGACCGATCATGATCCGATACTGATATCAATATCTGTAGCTCAGTGGCTAGG La-Ubi-pin Laubi-10 R 310 320 330 340 350 360 | | | | | | | | | | | | CCCCTCAATTTGCCTGGCCGAAGGCAGTGTACAAAACCTGGCTCTCGCAAGGGCAAAGAA La-Ubi-pin Laubi-10 R 370 380 390 400 410 420 | | | | | | | | | | | | AGAGTCTTTCCCAAAAAAAAAAAAATCGAACCCATTTGTAGTATCCAATATTTGGATTGA La-Ubi-pin Laubi-10 R 430 440 450 460 470 480 | | | | | | | | | | | | CATAAGATACCAAAA-CATAAAGTACTAACCACCCAATCTTATAATTAATCAAGATTTAT .A La-Ubi-pin Laubi-10 R 490 500 510 520 530 540 | | | | | | | | | | | | ATCACATCCAATATCAAGATCCGATATCAATACCTAGACCGGTAAACCCTAATTTACTCT La-Ubi-pin Laubi-10 R 550 560 570 580 590 600 | | | | | | | | | | | | TCCCCCCTCTAAAAATTTCCAATAAATATCTCCACATATTTAACTATTAAAAAATTGATA La-Ubi-pin Laubi-10 R 610 620 630 640 650 660 | | | | | | | | | | | | AGAGATAGGCCCTAGCCCTAAGTCCTAACATATAACCACTCTCTATGAAAAGTCCTATTA A La-Ubi-pin Laubi-10 R G-box670 680 690 700 710 720 | | | | | | | | | | | | AATGACGTCATTTATTTATTTATTGCCGGTTGGCTGCTCCACAGCCGCAATTTAATGGAT thước vector pCR2.1 sản phẩm PCR LaUbip Dòng pCRLaUbip kiểm tra SalI cho băng 4,9 kb (hình 3.10 C) Như vậy, kết kiểm tra vị trí enzyme cắt hạn chế dự đoán đoạn gắn đoạn chúng cần tìm 10 11 31 M Đ/C Đ/C M 10 11 31 M 5,9kb 3,9kb 4,9kb 3,9kb 2kb 1kb B A B C Hình 3.10 Điện di sản phẩm xử lý DNA plasmid enzyme M Thang DNA chuẩn 1kb Đ/C Plasmid đối chứng A Plasmid 10, 11, 31 pCRLaUbipin cắt EcoRI B Plasmid 10, 11, 31 pCRLaUbipin cắt SalI C Plasmid pCRLaUbip cắt EcoRI Sall 3.2.4 Xác định phân tích trình tự đoạn promoter Chúng xác định trình tự DNA mẫu plasmid số 10, 11 pCRLaUbipin mẫu plasmid số pCRLaUbip máy xác định trình tự tự động dựa sở phương pháp Sanger Sau số liệu xử lý phần mềm ABI PRISM 3100 Data Collection v2.0, DNA Sequencing Analysis v5.2, Seqscape v2.5, BioEdit v7.0.5, nhận đoạn promoter 5’UTR có chiều dài 964 bp giống bèo L aequinoctialis DB1 Sau chúng tiến hành so sánh trình tự với trình tự đoạn yếu tố điều khiển biểu gen Ubiquitin loài Mỹ công bố GenBank Kết so sánh đoạn LaUbipin mẫu số 10 với trình tự GenBank trình bày hình 3.10 Từ kết cho thấy đoạn có vị trí thay đổi so với loài Mỹ thống kê bảng 3.2 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 http://www.Lrc-tnu.edu.vn ABRE Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 http://www.Lrc-tnu.edu.vn HSE DRE ABRE 730 La-Ubi-pin Laubi-10 R 740 750 760 770 780 | | | | | | | | | | | | GGCTGACACGGCACGAAACCGACGGGCGGTGCCGTGGGAATAATTCTAGAGTAAACCTAA La-Ubi-pin Laubi-10 R 790 800 810 820 830 840 | | | | | | | | | | | | CGGCGCCGTTAACTTTGACGGTGGCGAAGACGCGTGGGGATAGGTGGTTGGTCCGCGTGA TATA La-Ubi-pin Laubi-10 R 850 860 870 880 890 900 | | | | | | | | | | | | CGGCGGCGGTTCAGCCCGTCGACCTTGAGCCGAGACTATAAATCGAGGCGAAGGGATGAG G La-Ubi-pin Laubi-10 R 910 920 930 940 950 960 | | | | | | | | | | | | CTTTGCCATTGCGTTCTTCTTCTGTTCATCTCTGAAATTCGGGCGGAATCCTTCTTCTTC - - La-Ubi-pin Laubi-10 R | TCAAG DRE (738), HSE (758),… Đây yếu tố điều hòa promoter gen cảm ứng với ánh sáng, abscisic acid, điều kiện nước… Trong đoạn trình tự yếu tố biểu gen đặc hiệu hai loài bèo chúng quan sát thấy trình tự DNA bảo thủ thường có mặt hầu hết đoạn promoter hộp TATA hộp CCAAT, trình tự bảo thủ có tác động trực tiếp đóng vai trò quan trọng trình biểu gen Kết thu cho thấy mẫu sử dụng nghiên cứu có trình tự đoạn nucleotide sai vài điểm so với trình tự gen dùng làm tham khảo công bố [24] Đối với trình tự nucleotit đoạn promoter 5’UTR SpUbipin16 mà chúng phân lập dài 1033 bp có vị trí nucleotide khác biệt với trình tự Mỹ công bố, vị trí C->T (599); A->G (729); C->T (741) T->C (859) Với trình tự nucleotide đoạn LaUbipin10 (964bp) có vị trí thay đổi so với loài Mỹ T->A (644) C->G (884) Trong Hình 3.11 Trình tự đoạn promoter loài bèo L aequinoctialis DB1 với đó, trình tự đoạn promoter 5’ UTR gen Ubiquitin ngô 982 bp (899 bp dự đoán vùng chức promoter trước TSS 83 bp 5’UTR) [22], lúa 1309 bp Còn đoạn intron gen Bảng 3.2 Các vị trí nucleotide khác biệt La-Ubi-pin với La-Ubi-10F ngô dài 1010 bp đoạn intron lúa dài 1141 bp [53] Như vậy, promoter STT Vị trí (tính từ vị trí khởi đầu yếu tố điều khiển gen) 644 884 La-Ubi-pin (Mỹ) La-Ubi-10F T A C G loài thực vật khác Kết giải trình tự cho chúng thấy đoạn intron mẫu LaUbipin đọc số điểm chưa quán Cần phải nhấn mạnh vùng intron thường có nhiều đoạn trình tự A/T dài nên việc nhân PCR xác định trình tự thường gặp khó khăn cần phải lặp lại nhiều lần Ngoài ra, qua kết nghiên cứu thực tế chúng nhận thấy việc sử dụng enzyme Pfu DNA polymerase phản ứng PCR mang lại hiệu tốt sử dụng enzyme Dream Taq DNA polymerase phản ứng PCR Ta biết cấu trúc enzyme Pfu DNA polymerase có 12 cuộn xoắn trình tổng hợp DNA với độ xác cao enzyme Taq DNA polymerase (Stratagene) có vai trò làm tăng hiệu trình nhân PCR không gây đột biến Trên thực tế, việc tối ưu hóa phản ứng PCR cho Pfu DNA polymerase Sử dụng phần mềm chuyên dụng dự đoán chức trình tự http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html, chúng phân lập có cấu trúc giống promoter gen Ubiquitin http://www.softberry.ru/cgi- bin/programs/promoter cho thấy đoạn có vùng chức thường khó khăn Chúng tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR loài S polyrrhiza DB2 tiếp tục tiến hành tối ưu điều kiện phản ứng PCR Pfu cho loài L aequinoctialis DB1 promoter (hình 3.11) Hộp TATA vị trí 876 điểm khởi đầu phiên mã dự đoán vị trí 916 Ngoài có trình tự đặc trưng cho G - box (662), ABRE (716), Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Ubiquitin HSP nhỏ Cấu trúc gen polyubiquitin KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ngô, lúa có vùng promoter, 5’UTR, intron exon Đoạn intron dự đoán có chức tăng cường khả biểu gen Vì vậy, để biểu gen thực vật, người ta sử dụng đoạn promoter mà đoạn promoter intron gen Ubiquitin Nghiên cứu sử dụng vùng riêng biệt đoạn trình tự yếu tố điều khiển biểu gen Ubiquitin lúa rubi3 biểu Kết luận Từ kết đạt được, chúng rút số kết luận sau: Đã hoàn thiện phương pháp tách chiết DNA từ loài bèo khác sử dụng kết hợp CTAB PVP, CTAB PEG SDS PVP gen GUS cho thấy: tác động promoter 5’UTR, gen GUS biểu Đã phân lập đoạn yếu tố điều khiển biểu gen mã hóa cho tất các dạng mô tế bào, đoạn intron tăng cường biểu gen số Ubiquitin loài bèo Spirodela polyrrhiza DB2 bao gồm promoter, 5’UTR mô tế bào định, đó, ngô, intron tăng cường biểu phần lớn intron promoter có độ dài 1033 bp, đoạn bao gồm promoter , 5’UTR tất mô [22], [41], [55] Như vậy, khả sử dụng đoạn yếu tố biểu intron có độ dài 2013 bp Đã phát thấy có vị trí nucleotide promoter khác gen Ubiquitin hai loài bèo vấn đề cần nghiên cứu với gen phân lập Mỹ tiếp Đã phân lập đoạn promoter 5’UTR gen mã hóa cho Ubiquitin loài bèo Lemna aequinoctialis DB1: promoter 5’UTR có độ dài 964 bp, có vị trí nucleotide khác với promoter phân lập từ loài Mỹ Đề nghị - Xác định đoạn intron đoạn yếu tố điều khiển biểu gen Ubiquitin mẫu bèo Lemna aequinoctialis DB1 - Sử dụng đoạn yếu tố điều khiển biểu gen Ubiquitin phân lập Spirodela polyrrhiza DB2 vào việc thiết kế vector mang gen cần thiết để chuyển vào bèo Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 http://www.Lrc-tnu.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO of Brassica napus Sequences in its 5’ flanking region are conserved in other pollenspecific promoter”, Plant Mol Biol 16: 501-513 Tài liệu tiếng Việt : 10 Angeles J.G.C., Laurena A.C., Tecson-Mendoza E.M (2005) Extraction of Lê Thị Thu Hiền, Lê Trần Bình, Đinh Duy Kháng, Nông Văn Hải (2000), “Phân genomic DNA from the lipid-polysaccharide, and polyphenol-rich coconut (Cocos tích trình tự đoạn điều khiển gen tổng hợp đường (Rsuc1-Promoter) từ giống lúa nucifera L.) Plant Mol Biol Rep 23: 297a-297i C71 ”, Tạp chí sinh học 23 : 45-50 11 Ainley W.M., Key J.L (1990), “Development of heat shock inducible expression Lê Thị Thu Hiền, Phạm Bích Ngọc, Nông Văn Hải, Lê Trần Bình (2003), “Cây cassette for plants characterization of parameters for its use in transient espression trồng biến đổi gen di truyền : Thực trạng triển vọng ”, Tạp chí Công nghệ sinh assay”, Plant Mol Biol 14: 949-967 học : 265-285 12 Back E., Dunne W., Schneiderbauer A., De Framond A., Rasogi R., Tein S.J Lê Thị Thu Hiền, Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải (2007), Promoter ứng (1991), ”Isolation of the spinach nitrite redutase gene promoter which confer nitrate dụng công nghệ gen thực vật Tạp chí Công nghệ Sinh học 5(1): 1-18 inducibility on GUS gene espression in transgenic tobacco”, Plant Mol Biol 17: 9-18 Trần Bích Lan, Nguyễn Lan Hoa, Nguyễn Đức Doanh, Trần Duy Quý (1998), 13 Bernard R.G., Jack J.P., 2006 “Molecular biotechnology: Principles and “Kết bước đầu sử dụng Agrobacterium tumefaciens nghiên cứu chuyển gen applications of recombinant DNA”, Department of Biology, University of Waterloo, vào lúa”, Hội nghị Toàn quốc lần thứ Công nghệ sinh học Cây lúa, Huế : 98- Waterloo, Ontario, Canada 101 14 Becker C., Shutov A.D., Nong Van Hai, Senyuk V.I., Jung R, Horstmann C., Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải (1997), “Chuyển tổ hợp gen GUS-BNG vào Fischer J., Nielsen N.C., Muntz K (1995) Purification, cDNA cloning and thuốc lá”, Tạp chí Khoa học Công nghệ : 23-27 characterization of proteinase B an asparagine-specific endopeptidase Đặng Trọng Lương, R Offringa, Vũ Đức Quang, Nguyễn Hữu Đồng, Trần Duy Biochemystry 228: 456-462 Quý, W Dolff, Pau J J Hooykaas (1999), “Thiết kế lại cấu trúc gen Bt (Bacillus 15 Binet M N., Lepetit M., Weij J H., Tessier L H (1990), “Analysis of a thurigensis) để chuyển gen vào hai mầm”, Báo cáo Khoa học Hội nghị sinh sunflower polyubiquitin promoter by transient expression”, Plant Sci 79: 87-94 học toàn quốc, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội : 1371-1376 16 Buchanan C.D., Klein P.E., Mullet J.E (2004), “Phylogenetic analysis of Vũ Văn Tiến, (2007), “Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh chuyển gen bèo noncoding regions from ABA – responsive rab 16/17 gene family of sorghum, maize, Lemna aequinoctialis”, Luận văn thạc sỹ khoa học and rice provides insight in to the composition, organization and function of Tài liệu tiếng Anh: 17 Bustos M M., Begum D., Kalkan F A., Battraw M J., Hall T C (1991), Amin J., Anathan J., Voellmy R (1988), “Key features of heat shock regulatory regulation of gene expression by a seed storage protein promoter”, EMBO 10: 1469- Eur J 5’ – cis – regulatory modules”, Genetics 168: 1639 – 1654 elements”, Mol Cell Biol 8: 3761-3769 ”Positive and negative cis-acting DNA domain are required for spatial and temporal 1479 Albani D., Altossar I., Arnison P G., Fabijanski S F (1991), ”A gene showing sequence similarity to pectin esterase is spesificially expressed in developing pollen Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 http://www.Lrc-tnu.edu.vn 18 Buzby J S., Yamada T., Tobin E M (1990), “A light-regulated DNA-binding 29 Gasdaska J R., Spencer D., Dickey L (2003), ”Advantages of therpeutic protein activity interacts with a conserved region of a Lemna gibba rbcS promoter”, Plant production in the aquatic plant Lemna”, Biology Review 67: 16-37 Cell 2: 805-814 30 Golovchenko VV, Ovodova RG, Shashkov AS, Ovodov YS (2002) Structural 19 Callis J., RaaschJ A., Vierstra R D (1990), “Ubiquitin extension proteins of studies of the pectic polysaccharide from duckweed Lemna minor L Phytochemistry Arabidopsis thaliana – structure, localization, and expression of their promoters in 60(1):89-97 transgenic tobacco”, J Biol Chem 265: 12486-12493 31 Hadi M.Z., McMullen M.D., Finer J.J, (1996), “Transformation of 12 different 20 Chang W C., Chiu L (1978), “Regeneration of Lemnaceae gibba G3 through plasmids into soybean via particle bombardment”, Plant Cell Rep 15: 500 – 505 callus culture”, Z Pflanzenphisiol 89: 91-94 32 Hernandez-Garcia CM, Martinelli AP, Bouchard RA, Finer JJ (2009), “A 21 Chiera J M., Bouchard R A., Dorsey S L., Park E H., Buenrostro – Nava M T., soybean (Glycine max) polyubiquitin promoter gives strong constitutive expression Ling P P., Finer J J (2007), “Isolation of two highly active soybean promoters and in transgenic soybean”, Plant Cell Rep 28: 837-849 their characterization using a new automated image collection and analysis system”, 33 Kehoe DM., Dgenhardt.J, Winicov I, Tobin EM., (1994), “Two 10-bp regions are Plant Cell Rep 26: 1501-1509 critical for Phytochorome regulation of a Lemna gibba Lhcb gene promoter”, The 22 Christensen A.H., Sharrock RA, Quail P.H., (1992), “Maize polyubiquitin genes: Plant Cell 6: 1123-1134 structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter 34 Keim P, Olson TC, Shoemaker RC (1988) A rapid protocol for isolating soybean activity following transfer to protoplasts by electroporation” Plant Mol Biol 18: 675- DNA Soybean Genet Newsl 15: 150-152 689 35 Kohli A., Grifiths S., Palacios N., Twyman R.M.,Vai P., Laurie D.A., Christou P 23 Cornejo M J., Luth D., Blankenship K M., Anderson O D., Blechl A E (1993), “Activity of a maize uniquitin promoter in transgenic rice”, Plant Mol Biol 23(3): (1999), “Molecular characterization of transforming plasmid rearrangements in transgenic rice reveals a recombination hotspot in the CaMV 35S promoter and 567-581 confirms the predominance of microhomology mediated recombination”, The Plant 24 Dickey LF, Cox KM, Peele CG (2007) Expression control elements from the Journal 17: 591 – 601 lemnaceae family US Patent Application 20070180583 36 Landolt E (1986), The family of Lemnaceae - a monographic study Vol.1, 25 D’Halluin K., Bonne E., Bossut M., De Beukeleer M., Leemans J (1992), Veroff Geobot Inst ETH, Stiftung Rubel, Zurich, Heft 71 “Transgenic maize plants by tisue electroporation”, The Plant Cell 4: 1495-1505 37 Landolt, E.and Kandeler, R (1987) The family of Lemnaceae - a monographic 26 Departer B S., Schilperoort R A (1992), “Structer and expression of a root- study Vol.2, Veroff Geobot Inst ETH, Stiftung Rubel, Zurich, Heft 95 specific rice gene”, Plant Mol Biol 18: 161-164 38 Les D.H., Crawford D.J., Landolt E., Gabel J.D., Kimball R.T (2002), 27 Eldeman M., Perl A., Flaishman M., Blumethal A (1999), ”Transgenic “Phylogeny and systematics of Lemnaceae, the Duckweed Family”, Systematic Lemnaceae”, Patent No WO 99/19498 Botany 27(2): 221-240 28 Garbarino J E., Oosumi T., Belknap W R (1995), “Isolation of a polyubiquitin 39 Lewin B, (2004), Genes VIII, Oxford University Pres, Oxford – New York – promoter and its expression in transgenic potato plamts”, Plant Physiol 109: 1371- Tokyo 1378 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 http://www.Lrc-tnu.edu.vn 40 Li J., Jain M., VunshR., Vishnevetsky J., Hanania U., Flaishman M., Perl A., 49 Rollfinke I K., Silber M V., Pfizner U M (1998), “Charaterization and Edelman M (2004), “Callus induction and generation in Spirodela and Lemna”, expression of a heptaubiquitin gene from tomato”, Gene 211: 267-276 Plant Cell Report 22: 457-464 50 Rusoff L.L., Blamkeney E W., Gulley D.D, (1980), “Duckweeds (Lemnaceae): 41 Lu J, Sivamani E, Li X, Qu R (2008) Activity of the 5’ regulatory regions of the A potential Source of Protein and Amino Acid”, J Agricult Food Chem 28: 848- rice polyubiquitin rubi3 gene in transgenic rice plants as analyzed by both GUS and 850 GFP reporter genes Plant Cell Rep 27: 1587-1600 51 Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T (2001), "Molecular Cloning: A laboratary 42 Mardanov A V (2008), “Complete Sequence of the Duckweed ( Lemna minor ) manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Chloroplast Genome: Structural Organization and Phylogenetic Relationships to 52 Shahmuradov I.A., Gammerman A.J., Hancock J.M., Bramley P.M., Solovyev Other Angiosperms”, J Molec Evol 66(6):555-564 V.V (2003) “ PlantPron: a database of plant promoter sequences”, Nucleic Acids 43 McElrroy D., Chamberlain D.A., Moon E., Wilson K.J (1995), “Development of Research 31(1): 114-117 gusA reporter gene constructs for cereal transformation: Availability of plant 53.Sivamani E., Qu R (2006), “Expression enhancement of a rice polyubiquitin gene transformation vectors from the CAMBIA molecular genetics resource serevice”, Mol Breed 1: 27-37 44 Noad R.J., Turner D.S., Covey S.N (1997), “Expression of function elements inserted into the 35S promoter region of infectious cauliflower mosaic virus replicons”, Nucleic Acids Res 15: 1123 – 46 Okubaca PA, Tobin EM, (1991), “Isolation and characterization of three genes negatively regulated by Phytochrome action in Lemna gibba”, Plant Physiol 96: promoter”, Plant Mol Biol 60: 225-239 54 Soltis DE, Soltis PS, Bennett MD, Leitch IJ (2003), “Evolution of genome size in the angiosperms1”, American Journal of Botany 90:1596-1603 55.Stefaniak B., Wozng A., Budna T (2002), “Callus induction and plant regeneration in Lemna minorL”, Biologia Plantarium 45(3): 469-472 56 Stewart C.N.Jr., Via L.E.(1993) A rapid CTAB DNA isolation technique useful for RAPD fingerprinting and other PCR applications BioTechniques 14: 748-751 1237-1245 46 Pineda Rodo A, Brugiere N, Vankova R, Malbeck J, Olson JM, Haines SC, 57 Stomp A M., Rajbhardari N (2000), “Generatically engineered duckweed”, US Martin RC, Habben JE, Mok DWS, Mok MC (2008), “Over-expression of a zeatin patent No 6040498 O-glucosylation gene in maize leads to growth retardation and tasselseed formation” 58 Van De Meer I M., Spelt C E., Mol J N., Stuitje A R (1990), ”Promoter J Exper Bot 59(10): 2673-2686 analysis of chalcone synthase (chsA) gene of Petunia hybrida: A 67 bp promoter 47 Plesse B., Criqui M C., Durr A., Parmentier Y., Fleck J., Genschik P (2001), region directs flower –specific expression’, Plant Mol Biol 15: 95-109 “Effects of the polyubiquitin gene Ubi.u4 leader intron and first ubiquitin monomer 59 Walden R., Koncz C., SchellJ (1990), “The use of gene vectors on plant on reporter gene expression in Nicotiana tabacum”, Plant Mol Biol 45: 655-667 moleculer biology”, Methods in Molecular and Cellular Biology: 175-194 48 Rothwell G.W., Van M.R., Ballard H.E., Stockey R.A (2004), ”Molecular 60 Wang J., Oard J H., (2003), “Rice ubiquitin promoters: deletion analysis and phylogenetic Relationships among Lemnaceae and Araceae using Chrotoplast trnL- potential usefulness in plant transformation systems”, Plant Cell Rep 22: 129-134.; trnF intergenic spacer”, Molecular phylogenetics and Evulotion 30: 378-385 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 59 http://www.Lrc-tnu.edu.vn 61 Weathermax S C., William S A., Tingay S., Tobin E M (1998), “The phytochrome response of the Lemna gibba NPR1 gene is mediated primarily through changes in absscisic acid levels”, Plant Physiol 116: 1299-1305 62 Weeks K.E., Chuzhanova N.A., Donnison I.S., Scott I.M (2007), “Evolutionary hierarchies of conserved blocks in 5’ noncoding sequenced of dicot rbcS genes”, BMC Evol Biol 7: 51 63 Wei H R., Wang M L., More P H., Albert H H (2003), “Comparative expression analysis of two sugarcane polyubiquitin promoters and flanking sequences in transgenic plants”, Plant Physiol 160: 1241-1251 64 Yamaguchi Shinozaki K., Mino M., Mundy J., Chua N H (1990), “Analysis of an ABA – Responsive rice gene promoter in transgenic tobacco”, Plant Mol Biol 15: 905-912 65 Yamamoto Y.T.; Rajbhandari N.; Lin X.; Bergmann B.A.; Nishimura Y.; Stomp A.M (2001) "Genetic transformation of duckweed Lemna gibba and Lemna minor." In Vitro Cellular and Development Biology - Plant 37(3):349-353 66 Yin Y., Chen L., Beachy R (1997), “Promoter elements required for phloemspecific gene espression from the RTBV promoter in rice”, The Plant Journal 12: 1179-1188 67 Zuccarello GC, Critchley AT, Smith J, Sieber V, Lhonneur GB, West JA (2006) Systematics and genetic variation in commercial Kappaphycus and Eucheuma (Solieriaceae, Rhodophyta) J Appl Phycol, 2006, DOI:101007 10811-006-9066-2 68 http://www.lemnagene.com 69 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60 http://www.Lrc-tnu.edu.vn [...]... điều khiển biểu hiện gen từ loài bèo tấm L aequinoctialis DB1 3.3.1 Thiết kế và tổng hợp cặp mồi đặc hiệu cho đoạn promoter Dựa trên trình tự các yếu tố điều khiển biểu hiện gen Ubiquitin loài bèo tấm L aequinoctialis DB1 đã được công bố [24] chúng tôi đã thiết kế mồi theo sơ đồ và Hình 3.6: Trình tự đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen ubiquitin của loài bèo tấm S polyrrhiza DB2 với dự đoán các. .. trí nucleotide khác với promoter được phân lập từ loài này ở Mỹ Đề nghị - Xác định đoạn intron trong đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen Ubiquitin mẫu bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 - Sử dụng đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen Ubiquitin đã phân lập được của Spirodela polyrrhiza DB2 vào việc thiết kế các vector mang gen cần thiết để chuyển vào bèo tấm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại... gần đây, các nghiên cứu phân lập promoter từ bèo 1.3.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam tấm cũng được thực hiện như các promoter của gen SSU5A, SSU5B, NPR1…[18], Tại Việt Nam, các nghiên cứu về bèo tấm còn hết sức hạn chế Các nghiên [62] Cùng với các nghiên cứu phân lập gen, các nghiên cứu xây dựng quy trình cứu ban đầu chủ yếu nhằm mục đích sử dụng cho chăn nuôi và mới chỉ dừng lại ở chuyển gen cũng... tự các yếu tố điều khiển biểu hiện gen Ubiquitin ở lúa rubi3 trong biểu Kết luận Từ các kết quả đã đạt được, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau: 1 Đã hoàn thiện được phương pháp tách chiết DNA từ các loài bèo tấm khác nhau sử dụng kết hợp CTAB và PVP, CTAB và PEG hoặc SDS và PVP hiện gen GUS cho thấy: dưới tác động của promoter và 5’UTR, gen GUS biểu hiện 2 Đã phân lập được đoạn các yếu tố điều. .. học phân tử, đã có các nghiên dụng bèo tấm để sản xuất các loại protein tái tổ hợp có nguồn gốc từ vi khuẩn, thực cứu phân lập và xác định đặc tính của hệ gen bèo tấm Đã có nhiều những nghiên vật, động vật và người ngày càng được xúc tiến mạnh Các hệ thống vector chuyển cứu phân lập và tách dòng gen trên đối tượng này Năm 1991, Okubara và cộng sự gen sử dụng các promoter được phân lập từ bèo tấm được... Như vậy, khả năng sử dụng đoạn các yếu tố biểu hiện intron có độ dài 2013 bp Đã phát hiện thấy có 4 vị trí nucleotide trên promoter khác gen Ubiquitin của hai loài bèo tấm này như thế nào là vấn đề cần được nghiên cứu với gen này được phân lập ở Mỹ tiếp 3 Đã phân lập được đoạn promoter và 5’UTR của gen mã hóa cho Ubiquitin loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1: promoter và 5’UTR có độ dài 964 bp, trong... dụng như CaMV35S và NOS promoter [1], [2], [4], [5], [6] Tại Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, các 2.1 Nguyên liệu 2.1.1 Nguyên liệu thực vật nghiên cứu đầu tiên chuyển gen vào bèo tấm đã được thực hiện Bắt đầu từ năm Giống bèo tấm Lemna aequinoctialis DB 1và Spirodela polyrrhiza DB2 do 2006, các loài bèo tấm phổ biến ở Việt Nam đã được thu thập và nghiên cứu Các Viện Di truyền... mạnh để điều khiển quá trình biểu hiện Hiện nay đã có nhiều loại promoter được phân lập và sử dụng, trong đó promoter ubiquitin là một đối tượng được quan tâm nghiên cứu do nó có khả năng làm tăng mạnh mẽ quá trình biểu hiện gen từ mức độ phiên mã cho tới dịch mã [41] Bèo tấm là loài sinh vật có tốc độ sinh trưởng nhanh và hơn hết là rất phổ biến ở Việt Nam, do đó việc phân lập promoter từ bèo tấm là... đến Ngoài đã phân lập được 3 gen được điều khiển với hệ thống phytochrome ở L gibba [45] promoter SSU5B, NPR1, đoạn điều khiển của gen ubiquitin đã được phân lập từ Sau đó, Kehoe và cộng sự đã xác định được 2 đoạn trình tự có kích thước khoảng một số loài bèo tấm, bước đầu được sử dụng trong nghiên cứu chuyển gen và chứng 10 bp quyết định đến sự điều khiển phytochrome của promoter gen Lhcb từ minh là... Phân lập đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen từ loài bèo tấm S thuộc vào nồng độ của agarose (kích thước lỗ là 150 nm ở nồng độ 1% và 500 nm ở polyrrhiza DB2 nồng độ 0,16%) Do có cấu trúc dạng mạng lưới, nên sau khi điện di các đoạn DNA có kích thước và trọng lượng khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau phụ thuộc vào cấu trúc và trọng lượng phân tử của chúng DNA tổng số có kích thước và