TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC BỘ MÔN HÓA HỌC HỮU CƠ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LOÀI NẤM CORDYCEPS NEOVOLKIANA GVHD: ThS Lê Thị Thu Hương ThS Dương Thúc Huy SVTH: Lê Tấn Lộc MSSV: K38.106.069 Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2016 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC BỘ MÔN HÓA HỌC HỮU CƠ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LOÀI NẤM CORDYCEPS NEOVOLKIANA GVHD: ThS Lê Thị Thu Hương ThS Dương Thúc Huy SVTH: Lê Tấn Lộc MSSV: K38.106.069 Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2016 NHẬN XÉT CỦA HỘI ĐỒNG LỜI CẢM ƠN Bằng tất trân trọng lòng biết ơn, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến với: Cô Lê Thị Thu Hương thầy Dương Thúc Huy – thầy cô đầy tâm huyết nhiệt tình Thầy, cô dạy cho em kiến thức chuyên môn với kinh nghiệm nghiên cứu quý báu mà giúp đánh thức niềm say mê nghiên cứu khoa học em suốt thời gian cô hướng dẫn Tất quý Thầy cô khoa Hóa, trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh tận tình truyền đạt kiến thức quý báu suốt thời gian em theo học hoàn thành khóa luận Các anh chị học viên cao học bạn sinh viên môn Hóa Hữu cơ, khoa Hóa học, trường Đại học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh động viên, giúp đỡ suốt trình thực đề tài Và cuối xin cảm ơn gia đình – chỗ dựa vững tinh thần suốt thời gian theo học thực đề tài trường Đại học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU iv DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC PHỔ v LỜI MỞ ĐẦU vi CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHI CORDYCEPS 1.1.1 Định nghĩa phân loại chi Cordyceps 1.1.2 Hoạt tính hợp chất có chi Cordyceps .1 1.2 NHỮNG NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CỦA CÁC LOÀI NẤM THUỘC CHI CORDYCEPS .1 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 2.1.1 Hóa chất 2.1.2 Thiết bị 2.2 NGUYÊN LIỆU 2.3 QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM 2.3.1 Rửa tủa phân đoạn cao A1 .8 2.3.2 Sắc ký cột phân đoạn cao A3 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .10 3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT T3 10 3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT TT1 12 CHƯƠNG : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 15 4.1 KẾT LUẬN 15 4.2 KIẾN NGHỊ 15 TÀI LIỆU THAM KHẢO 16 PHỤ LỤC ii MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 13 C-NMR : Carbon Nuclear Magnetic Resonance H-NMR : Proton Nuclear Magnetic Resonance Ac : Acetone AcOH : Acetic acid C : Chloroform COSY : Homonuclear shift correlation spectroscopy d : Mũi đôi (Doublet) dd Mũi đôi đôi (Doublet of duoblet) DMSO : Dimethyl sulfoxide EA : Ethyl acetate H : Hexane HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Coherence HSQC : Heteronuclear Single Quantum Correlation J : Hằng số tương tác spin-spin m : Mũi đa (Multiplet) Me : Methanol NMR : Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) ppm : Part per million s : Mũi đơn (Singlet) t : Mũi ba (Triplet) UV : Tia cực tím (ultra violet) iii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU Hình 1.1: Polysaccharide xác định Yu cộng sự, 2009 Hình 1.2: Các hợp chất cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps Hình 3.1: Khung Ergostane 10 Hình 3.2: Tương quan HMBC phần aglycon hợp chất T3 11 Hình 3.3: Cấu trúc hợp chất T3 .12 Hình 3.4: Cấu trúc hợp chất TT1 13 Hình 4.1: Cấu trúc hợp chất T3 hợp chất TT1 15 Sơ đồ 2.1: Quy trình cô lập hợp chất T3 TT1 Bảng 2.1 : Phân đoạn cao methanol thô Bảng 3.3: Dữ liệu phổ NMR hợp chất T3, ergosterol 3-O-β-D-glucopyranoside, TT1 ergosterol 14 iv DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC PHỔ Phụ lục Phổ 1H-NMR hợp chất T3 dung môi DMSO-d Phụ lục Phổ 13C hợp chất T3 dung môi DMSO-d Phụ lục Phổ HSQC hợp chất T3 dung môi DMSO-d Phụ lục Phổ HMBC hợp chất T3 dung môi DMSO-d Phụ lục Phổ COSY hợp chất T3 dung môi DMSO-d Phụ lục Phổ 1H-NMR hợp chất TT1 dung môi CDCl v LỜI MỞ ĐẦU Cùng với phát triển Y học nói chung Y học dân tộc nói riêng xu hướng quay sản phẩm thuốc có nguồn gốc từ tự nhiên, vừa mang lại hiệu cao vừa tác dụng phụ Nghiên cứu hợp chất thiên nhiên đóng góp thành tựu quý báu cho ngành Hóa học ngành Sinh học Y dược học Sự kết hợp chứng khoa học từ lĩnh vực nghiên cứu hợp chất thiên nhiên hoạt tính sinh học góp phần củng cố phát triển Y học cổ truyền Từ thời xa xưa loài nấm thuộc chi Cordyceps xem nguồn nguyên liệu quý, thuốc quý y học để giúp người chữa bệnh Phổ biến loại nấm Cordyceps sinensis (còn gọi Đông Trùng Hạ Thảo) Những nghiên cứu gần cho biết polysaccharide diện C sinensis thể đa dạng hoạt tính sinh học kháng oxi hóa, ức chế miễn dịch chống xơ vữa động mạch, nucleoside mang đa tác dụng macrophage cordycepin có hoạt tính ức chế phát triển khối u ức chế miễn dịch Vì thế, loài nấm thu hút nhiều nhà nghiên cứu năm gần dựa giá trị dinh dưỡng dược học Tuy nhiên, nguồn cung cấp tự nhiên loài nấm giảm dần môi trường sống khắc nghiệt khai thác mức nguồn nguyên liệu Gần đây, vài loài nấm thuộc chi Cordyceps chiết tách nuôi cấy phòng thí nghiệm[25] Tuy nhiên số nguyên cứu gần chứng tỏ có khác thành phần hàm lượng hợp chất hóa học nấm tự nhiên nấm nuôi cấy Xuất phát từ ứng dụng Y học quý giá kế thừa kết nghiên cứu nước chi Cordyceps, tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học loài nấm Cordyceps neovolkiana vi Khóa Luận Tốt Nghiệp Lê Tấn Lộc CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHI CORDYCEPS 1.1.1 Định nghĩa phân loại chi Cordyceps Các loài nấm thuộc chi Cordyceps gồm có C sinensis, C militaris, C pruinosa C ophioglossoides nguồn nguyên liệu quý dược học Thành phần dược liệu loài nấm khô thuộc chi Cordyceps phát triển ấu trùng Trong đó, phổ biến loài nấm Cordyceps sinensis, gọi với tên Đông Trùng Hạ Thảo (Tiếng Trung Quốc, Dong-Chong-Xia-Cao hay Tochukaso, tiếng Nhật) Tên gọi bắt nguồn từ thay đổi theo mùa Vào mùa đông, ấu trùng nhiễm nấm chuyển thành sâu sống đất gọi Đông Trùng Khi sang hè, stroma phát triển đầu ấu trùng có hình dáng giống cỏ nên gọi Hạ Thảo Ở Trung Quốc, vị thuốc có nguồn gốc hàng ngàn năm [22] 1.1.2 Hoạt tính hợp chất có chi Cordyceps Thành phần hóa học chi Cordyceps tìm thấy gồm có cordycepin (30deoxyadenosin) dẫn xuất, ergosterol, polysaccharide, glycoprotein peptides có chứa thành phần aminoisobutyric acid Các hợp chất có hoạt tính sinh học kháng ung thư, kháng đột biến (anti-metastatic), ức chế miễn dịch (immunomodulatory), kháng oxy hóa, kháng viêm, diệt sâu bọ (insecticidal), kháng khuẩn, hạ lipit máu, hạ đường huyết, chống lão hóa, bảo vệ hệ thần kinh thận Những nghiên cứu gần cho biết polysaccharide diện C sinensis thể đa dạng hoạt tính sinh học : chống oxy hóa, ức chế miễn dịch, chống xơ vữa động mạch, nucleoside mang đa tác dụng macrophage cordycepin có hoạt tính ức chế phát triển khối u ức chế miễn dịch 1.2 NHỮNG NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CỦA CÁC LOÀI NẤM THUỘC CHI CORDYCEPS Các hợp chất Cordycepin (3’-deoxyadenosine), 3’-amino-3’- deoxyadenosine, homocitrullyl aminoadenosine, adenine, cordycepic acid D- mannitol cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps từ năm 1950 Khóa Luận Tốt Nghiệp Lê Tấn Lộc 7.5 Hz, chứng tỏ hai proton vị trí nhị trục giúp xác định đơn vị đường β-Dglucopyranose Phổ HSQC, HMBC kết hợp với phổ COSY giúp xác định vị trí lại phần đường β-D-glucopyranose Từ liệu phổ so sánh với liệu phổ ergosterol 3-O-β-Dglucopyranoside [31] Hợp chất T3 xác định ergosterol 3-O-β-D-glucopyranoside H CH3 H3C CH3 H CH3 OH H H O O HO HO H H H HO H H Hình 3.3: Cấu trúc hợp chất T3 3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT TT1 Hợp chất TT1 (700.0 mg) thu được từ phân đoạn A1 có đặc điểm sau:  Chất bột vô định hình màu trắng  Bắt UV, hình với thuốc thử vanillin/H SO cho vết màu tím  Phổ 1H-NMR (DMSO-d ) Phụ lục  Biện luận cấu trúc hợp chất phổ TT1 Phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu nhóm methyl H -18 (δ H 0.63, s), H -19 (δ H 0.95, s), H -26 (δ H 0.83, d, 7.5 Hz), H -27 (δ H 0.84, d, 7.0 Hz), H -28 (δ H 0.92, d, 6.5 Hz), H -21 (δ H 1.03, d, 6.5 Hz) Trong nhóm H -18 chuyển dịch vùng từ trường cao đặc trưng cho khung sườn ergostane [1] So sánh liệu phổ 1H-NMR TT1 với T3 cho thấy liệu phổ hai hợp chất hoàn toàn tương đồng với ngoại trừ biết phân tử đường β-Dglucopyranose vùng từ 3.00 ppm đến 5.00 ppm proton H-3 dịch chuyển vùng từ trường thấp Điều chứng tỏ hợp chất TT1 phần aglycon hợp chất T3 12 Khóa Luận Tốt Nghiệp Lê Tấn Lộc Từ kiện phổ so sánh với liệu phổ ergosterol [7], hợp chất T1 kết luận ergosterol H CH3 H3C CH3 H HO CH3 H H Hình 3.4: Cấu trúc hợp chất TT1 13 Khóa Luận Tốt Nghiệp Lê Tấn Lộc Bảng 3.1: Dữ liệu phổ NMR hợp chất T3, ergosterol 3-O-β-Dglucopyranoside[1],TT1 ergosterol[7] N T3 (*) δ H , J (Hz) 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’A 6’B 3.56 (m) 5.52 (m) 5.33 (m) 0.57 (s) 0.86 (s) 1.00 (d, 6.5) 5.17 (dd, 15.0, 8.0) 5.23 (dd, 15.5, 7.0) 0.80 (d, 7.0) 0.79 (d, 6.5) 0.87 (d, 7.0) 4.23 (d, 7.5) 2.98 (m) 3.07 (m) 3.12 (m) 3.00 (m) 3.63 (m) 3.40 (m) δC 37.7 30.0 75.6 37.7 140.0 119.4 116.0 141.0 45.4 37.0 22.6 38.4 42.4 53.8 21.0 27.9 55.0 11.8 15.9 36.7 20.5 135.3 131.5 42.0 32.5 19.7 19.6 17.3 100.9 73.5 76.7 70.1 76.7 61.1 61.1 Ergosterol 3-O-β-D(**) glucopyranoside δ H , J (Hz) δC 38.0 30.6 4.06 (m) 76.8 38.0 140.2 6.64 (m) 120.1 6.46 (m) 117.0 141.0 46.4 37.5 21.3 39.3 43.0 54.8 23.4 28.7 55.8 0.66 (s) 12.2 0.95 (s) 16.4 40.8 1.09 (d, 6.8) 21.4 5.24 136.1 (dd, 15.6, 7.6) 5.30 132.5 (dd, 15.6, 7.6) 43.1 33.4 0.88 (d, 6.8) 19.9 0.89 (d, 6.8) 20.1 0.99 (d, 6.8) 17.9 5.05 (d, 7.3) 102.6 4.06 (m) 75.3 4.29 (m) 78.5 4.29 (m) 71.7 3.99 (m) 78.2 5.30 (m) 62.9 4.58 (m) 62.9 TT1 (***) (***) Ergosterol δ H , J (Hz) δ H , J (Hz) 3.64 (m) 3.63 (m) 5.57 (m) 5.38 (m) 5.57 (m) 5.39 (m) 0.63 (s) 0.95 (s) 0.82 (s) 0.84 (s) 2.26 (m) 1.04 (d) 1.03 (d, 6.5) 5.17 (dd , 15.0, 7.5) 5.23 (dd, 15.5, 7.5) 0.83 (d, 7.5) 0.84 (d, 7.0) 0.92 (d, 6.5) 5.17 (dd) 5.21 (dd) 0.91 (d) 0.94 (d) 0.86 (d) (*) ghi DMSO; (**)ghi C5D5N5 (***)ghi CDCl3 14 Khóa Luận Tốt Nghiệp Lê Tấn Lộc CHƯƠNG : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 KẾT LUẬN Từ loài nấm Cordyceps neovolkiana, tiến hành điều chế thu cao ethanol thô Cao ethanol thô hòa tan nhiều lần methanol, tách riêng phần kết tủa dịch methanol thô Sau tiến hành phương pháp sắc ký cột sắc ký bảng mỏng cao methanol thô thu hợp chất T3 TT1 xác định ergosterol 3-O-βD-glucopyranoside ergosterol H CH3 H3C H CH3 H CH3 H3C CH3 CH3 H CH3 OH H H O O HO HO H H H HO HO H H H H T3 TT1 Hình 4.1: Cấu trúc hợp chất T3 hợp chất TT1 4.2 KIẾN NGHỊ Vì điều kiện thời gian vật chất không cho phép, nên phạm vi đề tài này, khảo sát phân đoạn cao A1, A3 Trong thời gian tới, có điều kiện tiến hành khảo sát phân đoạn cao lại Đồng thời tiến hành thử nghiệm số hoạt tính sinh học loại cao hợp chất cô lập 15 Khóa Luận Tốt Nghiệp Lê Tấn Lộc TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Ahmad V U., Basha A., “Spectroscopic data of steroid glycosides: Cholestanes, ergostanes, withanolides, stigmastane", Springer, New York, USA, pp 359–522, 2006 [2] Boros C., Hamilton S M., Katz B., Kulanthaivel P., “Comparison of balanol from Verticillium balanoides and ophiocordin from Cordyceps ophioglossoides”, J Antibiot (Tokyo), 47, 1010–1016, 1994 [3] Chatterjee R., Srinivasan K S., Maiti P C., “Cordyceps sinesis (Berkeley) Saccardo: structure of cordycepic acid”, J Am Pharm Assoc Am Pharm Assoc (Baltimore), 46, 114–118, 1957 [4] Cheung JK1, Li J., Cheung AW., Zhu Y., Zheng KY., Bi CW., Duan R., Choi RC., Lau DT., Dong TT., Lau BW., Tsim KW., “Cordysinocan, a polysaccharide isolated from cultured Cordyceps, activates immune responses in cultured T-lymphocytes and macrophages: signaling cascade and induction of cytokines”, J Ethnopharmacol., 124(1), 61-8, 2009 [5] Chun K Lob, Jerry K H Cheungb, Shang Q Zhub, Karl W K Tsimb, “A polysaccharide isolated from Cordyceps sinensis, a traditional Chinese medicine, protects PC12 cells against hydrogen peroxide-induced injury, Life Sciences 73, 2503–2513”, 2003 [6] Cunningham K G., Manson W., Spring F S., Hutchinson S A., “Cordycepin, a metabolic product isolated from cultures of Cordyceps militaris (Linn.) Link”, Nature, 166, 949, 1950 [7] Huneck S., Yoshimura I., “Intendification of lichen substance”, Springer, Berlin, 391, 1997 [8] Isaka M., Kongsaeree P., Thebtaranonth Y., “Bioxanthracenes from the insect pathogenic fungus Cordyceps pseudomilitaris BCC 1620 II Structure elucidation.” , J Antibiot (Tokyo), 54, 36–43, 2001 16 Khóa Luận Tốt Nghiệp [9] Lê Tấn Lộc Isaka M., Tanticharoen M., Kongsaeree P., Thebtaranonth Y., “Structures of cordypyridones A-D, antimalarial N-hydroxy- and N-methoxy-2-pyridones from the insect pathogenic fungus Cordyceps nipponica.”, J Org Chem., 66, 4803–4808, 2001 [10] Kaczka E A., Trenner N R., Arison B., Walker R W., Folkers K., “Identification of cordycepin, a metabolite of Cordyceps militaris, as 3’-deoxyadenosine”, Biochem Biophys Res Commun., 14, 456–457, 1964 [11] Kawaguchi N., Ohmori T., Takeshita Y., Kawanishi G., Katayama S., Yamada H., “Occurrence of Gal beta (1—3) GalNAc-Ser/Thr in the linkage region of polygalactosamine containing fungal glycoprotein from Cordyceps ophioglossoides”, Biochem Biophys Res Commun., 140, 350–356, 1986 [12] Kim K M., Kwon Y G., Chung H T., Yun Y G., Pae H O., Han J A., Ha K S., Kim T W., Kim Y M., “Methanol extract of Cordyceps pruinosa inhibits in vitro and in vivo inflammatory mediators by suppressing NF-kappaB activation”, Toxicol Appl Pharmacol., 190, 1–8, 2003 [13] Kim S W., Hwang H J., Xu C P., Sung J M., Choi J W., Yun J W., “Optimization of submerged culture process for the production of mycelial biomass and exo-polysaccharides by Cordyceps militaris C738”, J Appl Microbiol., 94, 120–126, 2003 [14] Kim S W., Xu C P., Hwang H J., Choi J W., Kim C W., Yun J W., “Production and characterization of exopolysaccharides from an enthomopathogenic fungus Cordyceps militaris”, NG3 Biotechnol Progr., 19, 428–435, 2003 [15] Krasnoff S B., Reátegui R F., Wagenaar M M., Gloer J B., Gibson D M., “Cicadapeptins I and II: new Aib-containing peptides from the entomopathogenic fungus Cordyceps heteropoda”, J Nat Prod 68: 5-50, 2005 [16] Kneifel H., Konig W A., Loeffler W., Muller R., “Ophiocordin, an antifungal antibiotic of Cordyceps ophioglossoides Arch.”, Microbiol., 113, 121–130, 1977 [17] Kredich N M., GuarinoA J., “Homocitrullyl amino adenosine, a nucleoside isolated from Cordyceps militaris”, J Biol Chem., 236, 3300–3302, 1961 17 Khóa Luận Tốt Nghiệp [18] Lê Tấn Lộc Li S P., Li P., Dong T T., Tsim K W., “Anti-oxidationactivity of different types of natural Cordyceps sinensis and cultured Cordyceps mycelia”, Phytomedicine, 8, 207– 212, 2001 [19] Li S P., Li P., Dong T T., Tsim K W., “Determination of nucleosides in natural Cordyceps sinensis and cultured Cordyceps mycelia by capillary electrophoresis”, Electrophoresis, 22, 144–150, 2001 [20] Li S P., Li P., Lai C M., Gong Y X., Kan K K., Dong T T., Tsim K W., Wang Y T., “Simultaneous determination of ergosterol, nucleosides and their bases from natural and cultured Cordyceps by pressurised liquid extraction and high-performance liquid chromatography”, J Chromatogr A, 1036, 239–243, 2004 [21] Liu J M., Zhong, Y R., Yang Z., Cui S L., Wang F H., “Chemical constituents of Cordyceps militaris (L.) Link.”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 14, 608–609, 1989 [22] Methacanon P., Madla S., Kirtikara K., Prasitsil M., “Structural elucidation of bioactive fungi-derived polymers”, Carbohydrate Polymers, 60, 199–203, 2005 [23] Ng T B., Wang H X., “Pharmacological actions of Cordyceps, a prized folk medicine”, Journal of Pharmacy and pharmacology, 57, 1509–1519, 2005 [24] Rongmin Yu, Yin Yin, Wei Yang, Weili Ma, Lin Yang, Xiujuan Chen, Zhang Zhang, Bin Ye, Liyan Song, “Structural elucidation and biological activity of a novel polysaccharide by alkaline extraction from cultured Cordyceps militaris”, Carbohydrate Polymers 75, 166–171, 2009 [25] Rukachaisirikul V., Pramjit S., Pakawatchai C., Isaka M., Supothina S “10- membered macrolides from the insect pathogenic fungus Cordyceps militaris BCC 2816”, J Nat Prod., 67, 1953–1955, 2004 [26] Wang J., Kan L., Nie S., Chen H., Cui S W., Phillips A O., Phillips G O., Li Y., Xie M., “Comparison of chemical composition, bioactive components and antioxidant activity of natural and cultured Cordyceps sinensis”, LWT - Food Science and Technology, 63, 2-7, 2015 [27] Wu Y L., Sun C R., & Pan Y J., “Studies on isolation and structural features of a polysaccharide from the mycelium of a Chinese edible fungus (Cordycepsm sinensis)”, Carbohydrate Polymers, 63, 251–256, 2006 18 Khóa Luận Tốt Nghiệp [28] Lê Tấn Lộc Xiao J H., Chen D X., Wan W H., Hu X J., Qi Y., Liang Z Q., “Enhanced simultaneous production of mycelia and intracellular polysaccharide in submerged cultivation of Cordyceps jiangxiensis using desirability functions”, Process Biochemistry, 41, 1887–1893, 2006 [29] Yang M L., Kuo P C., Hwang T L., Wu T S., “Anti-inflammatory Principles from Cordyceps sinensis”, J Nat Prod., 74, 1996–2000, 2011 [30] Yu R M., Song L Y., Zhao Y., Bin W., Wang L., Zhang H.,et al., “Isolation and biological properties of polysaccharide CPS-1 from cultured Cordyceps militaris”, Fitoterapia., 75, 465–472, 2004 [31] Yu R M., Wang L., Zhang H., Zhou C X., Zhao Y., “Isolation, purification and identification of polysaccharides from cultured Cordyceps militaris”, Fitoterapia., 75, 662–666, 2004 [32] Yu R M., Yang W., Song L Y., Yan C Y., Zhang Z., Zhao Y., “Structural characterization and antioxidant activity of a polysaccharide from the fruiting bodies of cultured Cordyceps militaris”, Carbohydrate Polymers, 70, 430–436, 2007 19 PHỤ LỤC 5.6 5.4 5.2 5.0 4.8 4.6 4.4 4.2 4.0 3.8 3.6 3.4 3.2 3.0 f1 (ppm) 5.523 5.516 5.330 5.324 5.319 5.247 5.216 5.202 5.187 5.171 4.894 4.885 4.867 4.863 4.858 4.853 0.573 0.877 0.863 0.859 0.803 0.789 0.776 0.998 0.985 H H 18 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0 H H HO HO O HO 1.8 1.6 H 21 19 1.4 1.2 1.0 0.8 2.78 26, 27 3.16 6.30 6.77 1.29 1.32 22 4.26 19 1.12 0.92 1.33 23 0.97 1.15 1.18 2.32 2.05 1.09 0.877 0.863 0.859 0.803 0.789 0.776 0.573 1.248 1.454 1.844 3.639 3.613 3.545 3.406 3.383 3.118 3.067 3.015 2.997 2.891 2.882 4.867 4.863 4.858 4.853 4.437 4.425 4.413 4.242 4.227 5.216 5.202 5.187 5.171 5.523 5.516 Phụ lục Phổ 1H-NMR hợp chất T3 dung môi DMSO-d6 1.00 CS-T3-DMSO-1H H3C CH3 CH3 CH3 O OH H H H 26, 27 28 H 18 28 21 6'-OH 1' 2' 0.6 24 13 42 145 140 22 23 135 130 125 12 10 40 38 120 36 115 20 34 110 32 105 30 100 25 16 11 28 26 24 f1 (ppm) 95 90 15 22 1' 85 26 20 28 21 18 16 2' 75 80 f1 (ppm) 11.801 22.561 20.944 20.527 19.755 19.450 17.312 15.924 27.900 29.575 32.463 42.375 42.013 38.362 37.684 36.944 36.702 Phụ lục Phổ 13C hợp chất T3 dung môi DMSO-d6 19 14 70 27 12 4' 6' 65 60 HO HO 18 HO 17 55 H H O 14 50 45 40 35 30 20.944 20.527 19.755 19.450 17.312 15.924 11.801 45.421 42.375 42.013 38.362 37.684 36.944 36.702 32.463 29.575 27.900 54.956 53.793 61.065 76.654 75.557 73.489 70.096 100.869 115.998 119.378 140.459 139.707 135.321 131.484 CS-T3-DMSO-13C H 25 CH3 H3C CH3 H CH3 O OH H H H H H 10 3', 5' 20 15 10 CS-T3-DMSO-HSQC 10 CH3 H3C 20 CH3 H 30 CH3 40 50 OH H H 60 O H O HO HO 70 H 80 H HO H 90 H 100 110 120 130 140 150 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 f2 (ppm) 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 f1 (ppm) Phụ lục Phổ HSQC hợp chất T3 dung môi DMSO-d6 H CS-T3-DMSO-HMBC 26, 27 19 18 28 22 5' 1' 4' 2' 18 28 26 27 10 19 20 30 25 24 40 14 50 17 60 6' 4' 2' 70 3' 5' 80 90 100 1' H 23 CH3 110 H3C 22 CH3 H 120 CH3 130 140 OH H H 150 O O HO HO H 160 H H HO 170 H H 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 f2 (ppm) 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 f1 (ppm) Phụ lục Phổ HMBC hợp chất T3 dung môi DMSO-d6 3' 6'-OH 23 21 H CH3 H3C CH3 H CH3 CS-T3-DMSO-COSY OH H H O H O 2'-OH Phụ lục Phổ COSY hợp chất T3 dung môi DMSO-d6 4'-OH H HO 3'-OH H H H 23 6'-OH 22 1' 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 5' 3' 2' 3.0 4' 6' 3.5 6' 4.0 4.5 5.0 5.5 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 f2 (ppm) 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 f1 (ppm) HO HO 2.31 5.6 5.4 5.2 5.0 4.8 4.6 4.4 4.2 4.0 3.8 3.6 3.4 3.2 3.0 f1 (ppm) 2.8 2.6 1.13 1.10 1.09 1.03 2.310 2.307 2.283 2.255 2.491 2.487 2.482 2.477 2.463 2.458 2.454 2.449 5.580 5.575 5.569 5.564 5.395 5.389 5.384 5.378 5.373 5.248 5.217 5.203 5.194 5.179 5.148 Phụ lục Phổ 1H-NMR hợp chất TT1 dung môi CDCl3 5.8 1.00 HO 2.4 2.2 2.0 1.042 1.029 0.946 0.923 0.910 0.845 0.830 0.816 0.630 2.491 2.487 2.482 2.477 2.463 2.458 2.454 2.449 2.310 2.307 2.283 3.661 3.653 3.647 3.639 3.630 3.625 3.616 5.580 5.575 5.569 5.564 5.395 5.389 5.384 5.378 5.373 5.248 5.233 5.217 5.203 5.194 5.179 5.164 5.148 CS-TT1-CDCL3-13C H 1.8 CH3 H3C CH3 26 H 1.6 CH3 H 28 1.4 1.2 1.0 18 19 H 27 21 23 22 0.8 0.6 [...]...Khóa Luận Tốt Nghiệp Lê Tấn Lộc (Cunningham và cộng sự, 1950 [6]; Chatterjee và cộng sự, 1957 [3]; Kredich và Guarino, 1961 [16]; Kaczka và cộng sự, 1964 [10]; Liu và cộng sự 1989 [20]) Một nghiên cứu gần đây chứng tỏ có sự khác nhau về thành phần và hàm lượng các hợp chất hóa học giữa nấm tự nhiên và nấm nuôi cấy Nấm nuôi cấy chứa hàm lượng của polysaccharide, adenine và... (125 MHz) và 2D-NMR tại phòng Phân tích Trung tâm trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh, số 227, Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, thành phố Hồ Chí Minh 2.2 NGUYÊN LIỆU Loài nấm Cordyceps neovolkiana được cung cấp từ TS Đinh Minh Hiệp – Ban quản lý khu Nông nghiệp công nghệ cao thành phố Hồ Chí Minh 2.3 QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM Sinh khối nấm tươi 3.5 kg được làm sạch, để khô, nghiền nhỏ thu được bột... TT1 Hình 4.1: Cấu trúc của hợp chất T3 và hợp chất TT1 4.2 KIẾN NGHỊ Vì điều kiện về thời gian và vật chất không cho phép, nên trong phạm vi của đề tài này, chúng tôi chỉ khảo sát trên phân đoạn cao A1, A3 Trong thời gian sắp tới, nếu có điều kiện chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát trên các phân đoạn cao còn lại Đồng thời chúng tôi sẽ tiến hành thử nghiệm một số hoạt tính sinh học ở các loại cao và hợp... HMBC kết hợp với phổ COSY giúp xác định các vị trí còn lại của phần đường β-D-glucopyranose Từ những dữ liệu phổ trên và so sánh với dữ liệu phổ của ergosterol 3-O-β-Dglucopyranoside [31] Hợp chất T3 được xác định là ergosterol 3-O-β-D-glucopyranoside H CH3 H3C CH3 H CH3 OH H H O O HO HO H H H HO H H Hình 3.3: Cấu trúc của hợp chất T3 3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT TT1 Hợp chất TT1 (700.0 mg) thu được... biết mất của phân tử đường β-Dglucopyranose trong vùng từ 3.00 ppm đến 5.00 ppm và proton H-3 dịch chuyển về vùng từ trường thấp Điều này chứng tỏ rằng hợp chất TT1 là phần aglycon của hợp chất T3 12 Khóa Luận Tốt Nghiệp Lê Tấn Lộc Từ những dữ kiện phổ trên và so sánh với dữ liệu phổ của ergosterol [7], hợp chất T1 được kết luận là ergosterol H CH3 H3C CH3 H HO CH3 H H Hình 3.4: Cấu trúc của hợp chất... Tương quan HMBC của phần aglycon của hợp chất T3 Trên phổ 13C-NMR xuất hiện 1 tín hiệu carbon acetal C-1’ (δ C 100.9) cùng với 5 tín hiệu carbon khác của 1 đơn vị đường glucopyranose Đơn vị đường glucopyranose liên kết với phần aglycon tại C-3 được xác định nhờ sự tương quan cho thấy sự tương tác giữa H-1’ (δ H 4.23) và C-3 (δ C 75.6) Đồng thời hằng số ghép giữa H-1’ và H-2’ là J = 11 Khóa Luận Tốt Nghiệp... cô lập từ C militaris bởi Rukachaisirikul và cộng sự (2004) [24] Krasnoff và cộng sự (2005) [15] công bố cicadapeptins I và II (các peptides chứa thành phần aminoisobutyric acid) và myriocin (kháng nấm) (51-53) từ C heteropoda Một glycoprotein với thành phần N-acetylgalactosamine [Gal-β(1→3)-Gal-NAcol galactosyl-β(1→3)-N-acetyl-galactosaminitol] được cô lập từ C ophioglossoides (Kawaguchi và cộng sự... nghiên cứu về polysaccharide từ nấm Cordyceps như Chun và cộng sự, 2003 Methacanon và cộng sự, 2005 2006 [27] ; Yu và cộng sự, 2007 [21] ; Wu, Sun và Pan, 2006 [31] ; Cheung và cộng sự, 2009 [5] ; [26] ; Xiao và cộng sự, [4] Các nghiên cứu chỉ 2 Khóa Luận Tốt Nghiệp Lê Tấn Lộc dừng ở xác định thành phần các monosaccharide và khối lượng phân tử cũng như hoạt tính sinh học Một nghiên cứu gần đây được... 74 : R1 = H 75 : R1 = CH3 14 R2 76 : R2 = HgX 77 : R2 = OH 78 : R2 = p-bromobezoyloxy 14 OH 80 81 79 Hình 1.2: Các hợp chất được cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps (tiếp) 6 Khóa Luận Tốt Nghiệp Lê Tấn Lộc CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 2.1.1 Hóa chất  Silica gel 0,04-0,06 mm, Himedia dùng cho cột sắc kí  Sắc kí bản mỏng loại Kieselgel 60F 254 (20×20), Merck  Dung môi dùng cho... adenine và adenosine cao hơn so với các loài nấm tự nhiên Li và cộng sự [17, 18] cũng tìm thấy nấm C sinensis nuôi cấy có hàm lượng nucleoside cao hơn loài tự nhiên Ergosterol hiện diện trong C sinensis được xác định bởi sắc ký bảng mỏng điều chế (Li và Li 1991; Li và cộng sự 2004) [19] Boros và cộng sự (1994) [2] công bố ophiocordin (54), một hợp chất kháng nấm và kháng khuẩn được cô lập từ C ophioglossoides