ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC LÊ XUÂN PHƢƠNG LÊ XUÂN PHƢƠNG CHỌN TẠO GIỐNG LÚA CHỊU MẶN BẰNG PHƢƠNG PHÁP CHỈ THỊ PHÂN TỬ CHO VÙNG VEN BIỂN ĐỒNG BẰNG SÔNG HỒNG CHỌN TẠO GIỐNG LÚA CHỊU MẶN BẰNG PHƢƠNG PHÁP CHỈ THỊ PHÂN TỬ CHO VÙNG Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học VEN BIỂN ĐỒNG BẰNG SÔNG HỒNG Mã số: 60 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÊ HÙNG LĨNH Thái Nguyên - 2014 Thái Nguyên - 2014 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN i ii LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN Tôi xin cam đoan luận văn công trình nghiên cứu hướng dẫn TS Lê Hùng Lĩnh, giúp đỡ cán Bộ môn Sinh học phân tử - Viện Di truyền nông nghiệp Các số liệu, kết luận văn trung thực chưa công bố công trình khác Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm số liệu luận văn Để hoàn thành luận văn thạc sỹ này, xin bày tỏ biết ơn sâu sắc tới TS Lê Hùng Lĩnh - Trưởng Bộ môn sinh học phân tử - Viện Di truyền Nông Nghiệp, người hướng dẫn, bảo tận tình giúp đỡ suốt trình thực đề tài hoàn chỉnh luận văn Bên cạnh đó, xin chân thành cảm ơn hướng dẫn, giúp đỡ quý báu, nhiệt tình tập thể cán thuộc: Bộ môn Sinh học phân tử - Viện Di truyền Nông nghiệp Khoa Khoa học sống, Đại học Khoa học Thái Nguyên Thái Nguyên, ngày 19 tháng năm 2014 Tác giả luận văn Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình, đồng nghiệp bạn bè động viên, khích lệ, chia sẻ khó khăn suốt trình học tập nghiên cứu Thái Nguyên, ngày 19 tháng năm 2014 Lê Xuân Phƣơng Tác giả luận văn Lê Xuân Phƣơng Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii iv DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH Bảng Tên bảng Trang Bảng 1.1 Dự báo mức gia tăng trung bình toàn cầu nhiệt độ không khí Hình Tên hình trang mực nước biển theo kịch biến đổi khí hậu khác Hình 1.1 Dự báo thay đổi mực nước biển đến năm 2100 Bảng 2.1 Thông tin thị phân tử NST1 29 Hình 1.2 Diễn biến nhiệt độ quy mô toàn cầu khu vực Bảng 2.2 Thành phần dinh dưỡng môi trường Yoshida 35 Hình 1.3 Diễn biến nhiệt độ (a) lượng mưa (b) Việt Nam 11 Bảng 2.3 Đánh giá tiêu chuẩn cải tiến (SES) qua quan sát mức hại mặn 50 năm 11 giai đoạn mạ (IRRI, 1997) 37 Hình 1.4 Diễn biến mực nước biển trạm hải văn Hòn Dấu 12 Bảng 3.1 Kết lọc mặn sau tuần giống 43 Hình 2.1 Vị trí thị NST1 Locus gen Saltol 28 Bảng 3.2 Hình 2.2 Sơ đồ phương pháp MABC ……………… ……………………33 478 44 Bảng 3.3 Kết lọc mặn sau tuần dòng 50 Bảng 3.4 3.1 (P1) FL478 (P2) 46 2013 Giao Thủy, Nam Định 51 Hình 3.2 Bảng 3.5 Năng suất yếu tố cấu tăng suất dòng tham g 2013 53 1F1 47 Hình 3.3 Bảng 3.6 1F1 48 2014 Giao Thủy, Nam Định 55 Bảng 3.7 Năng suất yếu tố cấu thành suất dòng tham gia thí Hình 3.4 1F2 49 nghiệm Giao Thủy, Nam Định 2014 57 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ TT Từ viết tắt ANLT BĐKH CNSH Cs CTAB EB ENSO FAO IPCC 10 IRRI 11 MABC 12 MAS 13 NST 14 PCR 15 QTL/QTLs 16 SSR 17 18 19 20 TBE TE TGST WB v vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT MỤC LỤC Nội dung An ninh lương thực Biến đổi khí hậu Công nghệ sinh học Cộng Cetyl trimethyl amonium bromide Extraction buffer El Nino Southern Oscillation Tổ chức lương thực giới Uỷ ban liên phủ biến đổi khí hậu Liên hiệp quốc Lời cam đoan i The International Rice Research Institute - Viện Nghiên cứu lúa quốc tế Marker assisted backcrossing - Chọn giống hồi giao nhờ thị phân tử Marker assisted selection - Chọn lọc nhờ thị phân tử Nhiễm sắc thể Polymerase Chain Reaction - Phản ứng trùng hợp chuỗi Tính cấp thiết đề tài Quantitative Trait Loci(s) - Locus kiểm soát tính trạng số lượng Simple Sequence repeat - Sự lặp lại trình tự đơn giản Tris - Bric Acid - EDTA Tris - EDTA Thời gian sinh trưởng Ngân hàng giới Lời cám ơn ii Danh mục bảng iii Danh mục hình iv Danh mục từ viết tắt v Mục lục vi MỞ ĐẦU Mục tiêu nghiên cứu đề tài Nội dung Nghiên cứu Ý nghĩa đề tài 4.1 Ý nghĩa khoa học 4.2 Ý nghĩa thực tiễn Đối tượng phạm vi nghiên cứu đề tài 5.1 Đối tượng nghiên cứu 5.2 Phạm vi nghiên cứu Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình BĐKH Thế giới Việt Nam 1.1.1 Tình hình BĐKH Thế giới 1.1.2 Ảnh hưởng BĐKH Việt Nam 10 1.2 Nghiên cứu di truyền chọn giống lúa chịu mặn 13 1.2.1 Cơ sở di truyền tính chống chịu mặn lúa 13 1.2.2 Ứng dụng thị phân tử chọn tạo giống lúa chịu mặn 16 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vii viii 1.2.3 Nghiên cứu lập đồ QTL/gen Saltol chịu mặn từ giống lúa Pokkali 18 3.2.3 Sử dụng thị phân tử xác định cá thể mang locus gen chịu mặn 1.2.4 Ứng dụng phương pháp chọn tạo giống thị phân tử tạo quần thể BC1F2 48 giống lúa chịu mặn 19 3.3 Đánh giá vật liệu sử dụng nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn 49 1.2.5 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn nước 23 3.3.1 Đánh giá tính chịu mặn dòng lúa chọn tạo điều kiện nhân tạo 49 Chƣơng VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 3.3.2 Đánh giá đặc tính nông sinh học, yếu tố cấu thành suất khả 2.1 Vật liệu nghiên cứu 28 chịu mặn dòng tạo mang QTL/Saltol vụ mùa 2013 51 2.2 Địa điểm nghiên cứu 30 3.3.3 Đánh giá đặc tính nông sinh học, yếu tố cấu thành suất khả 2.3 Nội dung nghiên cứu 30 chịu mặn dòng tạo mang QTL/Saltol vụ xuân 2014 55 2.4 Phương pháp nghiên cứu 30 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 2.4.1 Phương pháp lai hữu tính giống lúa cho nhận gen 30 Kết luận 59 2.4.2 Phương pháp chọn lọc nhờ thị phân tử lai trở lại (MABC) 32 Kiến nghị 59 2.4.3 Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng 34 Tài liệu tham khảo 60 2.4.4 Phương pháp thử độ mặn nhân tạo 34 2.4.5 Phương pháp tách chiết DNA phân tích di truyền thị phân tử 37 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 43 3.1 Kết đánh giá xác định vật liệu bố mẹ nghiên cứu chọi tạo giống lúa chịu mặn 43 3.1.1 Kết đánh giá khả chịu mặn giống lúa điều kiện nhân tạo 43 ịnh vật liệu bố mẹ 3.1.2 Kết 44 3.2 Kết chọn tạo dòng lúa chịu mặn từ tổ hợp lai TL6/FL478 45 ữa FL478 TL6 45 3.2.1 Kết kiể dụng thị phân tử xác định cá thể mang locus gen chịu mặn quần thể BC1F1 47 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ giống MAS giảm giá thành thời gian Chọn giống nhờ thị MỞ ĐẦU phân tử kỹ thuật hiệu cho phép chọn lọc trực tiếp hệ gen cá Tính cấp thiết đề tài Biến đổi khí hậu (BĐKH) thách thức lớn nhân loại kỷ 21 BĐKH dẫn đến nhiều thay đổi bất thường thời tiết, tác động nghiêm trọng đến sản xuất, đời sống môi trường BĐKH thể quần thể Chọn giống nhờ thị phân tử sử dụng thị để kiểm tra di truyền dòng bố mẹ cá thể lai Từ kiểm soát alen đặc biệt cá thể quần thể làm tăng tính biến động tính cực đoan tượng thời tiết Bằng phương pháp chọn giống nhờ thị phân tử lai trở lại (Marker nguy hiểm bão, tố, lốc, thiên tai thời tiết khô nóng, lũ, ngập úng, hay assisted backcrossing - MABC), nhà chọn giống nước pháp triển hạn hán, rét hại, xâm nhập mặn, sâu bệnh, làm ảnh hưởng lớn đến sản xuất giới thành công mang lại kết việc tạo giống lúa vừa có nông nghiệp Hậu BĐKH Việt Nam nghiêm trọng suất cao, vừa có khả chống chịu với điều kiện phi sinh học bất nguy hữu cho mục tiêu xoá đói giảm nghèo, cho việc thực lợi ngập chìm, mặn chống chịu sâu bệnh Những giống lúa mục tiêu thiên niên kỷ phát triển bền vững đất nước giúp cho vùng bờ biển giảm bớt thiệt hại ảnh hưởng biến đổi khí Cây lúa trồng quan trọng Việt Nam, đồng thời nguồn thức ăn quan trọng cho nửa dân số giới Việt Nam nước xuất gạo đứng hàng thứ giới sau Thái Lan Lúa gạo nguồn thu ngoại tệ lớn nông nghiệp xuất Việt Nam nguồn thức ăn 86 triệu dân số nước Đồng Sông Hồng đồng sông Cửu Long có sản lượng gạo 17% 50% hậu [21], [22] Từ vấn đề nêu trên, việc ứng dụng công nghệ chọn giống nhờ thị phân tử để chọn tạo giống lúa có suất cao, có khả chống chịu mặn vấn đề cấp thiết Vì xây dựng đề tài: “Chọn tạo giống lúa chịu mặn phương pháp thị phân tử cho vùng ven biển Đồng sông Hồng” Mục tiêu nghiên cứu đề tài [5] Đáp ứng sản lượng lúa Việt Nam cần thiết cho ứng phó với điều Sử dụng phương pháp chọn giống thị phân tử chọn tạo giống lúa kiện biến đổi khí hậu Do vậy, chọn tạo giống lúa suất cao chống chịu chịu mặn đáp ứng nhu cầu giống lúa cho vùng ven biển Đồng Sông mặn cần thiết có ý nghĩa cho an toàn lương thực tăng thu Hồng ứng phó với tác động biến đổi khí hậu nhập nông dân vùng chịu ảnh hưởng biến đổi khí hậu Chọn giống thị phân tử (Marker assisted selection - MAS) phương pháp thiết thực, hiệu việc chuyển locus gen quy định tính trạng di truyền số lượng (Quantitative Trait Loci - QTL) hay gen đích vào Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu đánh giá vật liệu bố mẹ nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn - Ứng dụng thị phân tử xác định cá thể mang locus gen Saltol giống Phương pháp MAS cho phép rút ngắn trình chọn lọc, chọn lọc tính trạng khó đắt tiền hay nhiều gen lúc Chọn Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ - Đánh giá trồng thử nghiệm dòng chịu mặn chọn tạo Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu đề tài phương pháp chọn giống nhờ thị phân tử Xác định dòng chịu mặn 5.1 Đối tƣợng nghiên cứu triển vọng phục vụ công tác phát triển giống lúa chịu mặn cho sản xuất - Giống lúa FL478 mang QTL/Saltol (gen chịu mặn) nhập từ Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế (The International Rice Research Institute IRRI) Ý nghĩa đề tài 4.1 Ý nghĩa khoa học Ứng dụng phương pháp chọn giống thị phân tử để chọn tạo giống lúa chịu mặn giúp chọn lọc nhanh xác nguồn gen chịu mặn hệ chọn tạo giống, nhờ rút ngắn thời gian chọn lọc đồng ruộng, giảm số lượng cá thể gieo trồng hàng vụ, giảm diện tích gieo trồng, - Giống TL6 Là giống lúa chịu thâm canh khá, chống chịu tốt với số sâu bệnh hại như: bệnh Đạo ôn, khô vằn bạc Phẩm chất gạo ngon, thơm, cơm mềm, không dính Gieo cấy vụ năm, có tiềm cho suất cao - Các thị phân tử có liên quan sử dụng nghiên cứu giảm lao động nặng nhọc, giảm chi phí cho thí nghiệm đồng ruộng 5.2 Phạm vi nghiên cứu góp phần tăng đầu tư cho nghiên cứu phòng thí nghiệm cách chuẩn Thí nghiệm triển khai tại: Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp (Từ Liêm, Hà Nội); Huyện Giao Thuỷ, Nam Định mực 4.2 Ý nghĩa thực tiễn - Những thành công bước đầu việc ứng dụng thị phân tử để chọn Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2012 đến năm 2014 lọc cá thể lai mở hướng ứng dụng rộng rãi công tác chọn tạo giống nói chung, không với đặc tính chịu mặn mà nhiều đặc tính nông sinh học quý khác - Kết nghiên cứu đề tài chọn tạo số dòng/giống lúa chịu mặn cho vùng ven biển Đồng Sông Hồng nơi chịu ảnh hưởng nặng nề biến đối khí hậu - Bổ sung thêm sở lý luận công tác chọn tạo giống lúa thị phân tử kế thừa phương pháp chọn giống truyền thống Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình BĐKH Thế giới Việt Nam 1.1.1 Tình hình BĐKH Thế giới Biến đổi khí hậu hoạt động trực tiếp gián tiếp người gây ra, làm thay đổi thành phần khí toàn cầu BĐKH gây ảnh hưởng tiêu cực đến sống người lĩnh vực, môi trường kinh tế-xã hội Trong 150 năm qua, nhiệt độ bình quân bề mặt trái đất giai đoạn 1900-2005 tăng khoảng 0,80 C; nhiệt độ đại dương tăng 0,50 C nhiệt độ bình quân bề mặt toàn cầu tăng 0,760C [20] Sự nóng lên toàn cầu gây nên khí hậu thay đổi nhiều hơn, biến đổi mưa gia tăng tần suất, cường độ tính biến động Hình 1.1 Dự báo thay đổi mực nước biển đến năm 2100 (Nguồn: IPCC, 2007) [20] tính cực đoan tượng thời tiết nguy hiểm bão, lốc, thiên tai liên quan đến nhiệt độ mưa thời tiết khô nóng, lũ, ngập lụt, hạn hán, rét hại, xâm nhập mặn, dịch bệnh dẫn đến mực nước biển bình quân toàn cầu dâng cao Theo nhà khoa học BĐKH toàn cầu nước biển dâng cho thấy, đại dương nóng lên đáng kể từ cuối thập kỷ 1950 Các nghiên cứu từ số liệu quan trắc toàn cầu cho thấy, mực nước biển trung bình toàn cầu thời kỳ 1961-2003 dâng với tốc độ 0,5 - 1,8mm/năm [20] Dự báo thay đổi mực nước biển diễn biến nhiệt độ quy mô toàn cầu đến năm 2100 thể hình 1.1 hình 1.2 Hình 1.2 Diễn biến nhiệt độ quy mô toàn cầu khu vực (Nguồn: IPCC AR4 WG-I Report, 2007) [20] Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Các từ viết tắt: nhà khoa học, thập kỷ vừa qua, mực nước biển dâng nhanh - CCSR/NIES: Trung tâm nghiên cứu hệ thống khí hậu Viện nghiên vùng phía Tây Thái Bình Dương phía Đông Ấn Độ Dương [20] cứu môi trường Quốc gia; Sử dụng mô hình CCSR/NIES AGCM + CCSR BĐKH ảnh hưởng trực tiếp đến ngành nông nghiệp, ngành cung cấp lương thực cho người phải đứng trước thách thức vô OGCM Models 1890-2100 - CCCma: Trung tâm phân tích xây dựng mô hình khí hậu Canada to lớn, khu vực tập trung trồng lúa nhiều giới lại có nguy bị xâm nhiễm mặn mực nước biển dâng cao Do đó, cần phải có Sử dụng mô hình CGCm2 Model 1900-2100 - CSIRO: Tổ chức nghiên cứu công nghiệp khoa học sức khỏe Sử giống lúa có khả chịu ngập độ mặn cao Bên cạnh đó, theo báo cáo FAO (2010), 800 triệu đất dụng mô hình CSIRO-Mk2 model 1961-2100 - Hadley Centre: Trung tâm nghiên cứu dự báo khí hậu Hadley Sử dụng mô hình HADCM3 model 1950-2099 toàn giới bị ảnh hưởng nghiêm trọng muối khoảng 20% diện tích tưới (khoảng 45 triệu ha) ước tính bị vấn đề xâm nhiễm mặn theo mức độ khác Mặt khác, tài liệu “Tác động mực nước biển dâng cao đến - GFDL: Phòng nghiên cứu biến động chất lỏng theo địa vật lý Sử dụng mô hình R30 Model 1961-2100 nước phát triển: Phân tích so sánh” Ngân hàng Thế giới (WB) thực tháng 2/2007 đánh giá tác động mực nước biển dâng cao - MPI-M: Viện khí tượng Max Planck Sử dụng mô hình tất nước phát triển cách sử dụng số đồng thị với kịch khác mực nước biển dâng cao WB ECHAM4/OPYC coupled model 1990-2100 - NCAR PCM: Trung tâm nghiên cứu khí Quốc gia Mỹ Sử dụng chia 84 nước phát triển ven biển thành nhóm theo văn phòng khu vực WB gồm: Mỹ Latin Caribê (25 nước); Trung Đông Bắc Phi (13 mô hình PCM model 1980-2099 - NCAR CSM: Trung tâm cứu khí Quốc gia Mỹ Sử dụng mô hình CSM Model 2000-2099 nước); Châu Phi cận Xahara (29 nước); Đông Á (13 nước); Nam Á (4 nước) Các kết nghiên cứu cho thấy 0,31% (194.309 km2) vùng lãnh thổ 84 nước phát triển bị ảnh hưởng mực nước biển dâng cao 1m Tuy nhiên, mực nước biển thay đổi không đồng toàn đại Tỷ lệ bị ngập tăng lên 1,2% theo kịch nước biển dâng cao 5m Cho dương giới: Một số vùng tốc độ dâng gấp vài lần tốc độ dâng dù tỷ lệ nhỏ song có khoảng 56 triệu người (hay 1,28% dân số) 84 trung bình toàn cầu mực nước biển số vùng khác lại hạ nước phát triển bị ảnh hưởng mực nước biển dâng cao 1m Với kịch thấp Xu tăng mực nước trung bình xuất hầu hết trạm nước biển dâng cao 1m, Bahamas (khu vực Mỹ latinh Caribê) nước quan trắc toàn cầu, mặc dù, xuất số khu vực có xu hướng bị ảnh hưởng nặng xét diện tích bị ảnh hưởng (12% tổng diện tích) giảm bờ biển phía Đông Nam Mỹ khu vực ven biển phía Nam Việt Nam đứng đầu danh sách 10 nước bị ảnh hưởng dân số, khu vực đô Alaska Đông Bắc Canada, vùng biển Scandinavia Theo số báo cáo Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 10 thị đất ngập nước (khoảng 10%) Nông nghiệp Ai Cập bị ảnh hưởng Ghi chú: nhiều nhất, gần 13% 28% diện tích đất ngập nước Việt Nam, Jamaica - a: Sự đánh giá đánh giá từ hệ thống mô hình, bao gồm Belize bị ảnh hưởng mực nước biển dâng cao 1m Xét tất mô hình khí hậu đơn giản, số mô hình Trái đất có mức tạp vừa phải thị, theo Báo cáo WB, Việt Nam nằm danh sách nước bị ảnh số lớn mô hình hoàn lưu toàn cầu khí – đại dương (AOGCMs) hưởng nhiều với Ai Cập, Suriname Bahamas [14] - b: Hàm lượng khí nhà kính (KNK) cố định năm 2000 lấy từ Dự báo mức gia tăng trung bình toàn cầu nhiệt độ không khí mực nước biển theo kịch biến đổi khí hậu khác thể bảng 1.1 Bảng 1.1 Dự báo mức gia tăng trung bình toàn cầu nhiệt độ không khí mực nước biển theo kịch biến đổi khí hậu khác (Nguồn: IPCC 2007) [20] Biến đổi nhiệt độ (0C) (Giai đoạn 2090 – 2099 so với giai đoạn 1980-1999)a Mức dâng cao mục nước biển(m) (Giai đoạn 2090 – 2099 so với giai đoạn 1980 – 1999) Đánh giá tốt Phạm vi xảy Phạm vi mô hình sở ngoai trừ biến đổi động lực dòng chảy băng tương lai Hàm lượng KNK không đổi mức năm 2000b 0,6 0,3 - 0,9 - Kịch B1 1,8 1,1 – 2,9 0,18 – 0,38 Kịch A1T 2,4 1,4 – 3,8 0,20 – 0,45 Kịch B2 2,4 1,4 – 3,8 0,20 – 0,43 Kịch A1B 2,8 1,7 – 4,4 0,21 – 0,48 Kịch A2 3,4 2,0 – 5,4 0,23 – 0,51 Kịch A1F1 4,0 2,4 – 6,4 0,26 – 0,59 Trường hợp Số hóa Trung tâm Học liệu AOGCMs 1.1.2 Ảnh hƣởng BĐKH Việt Nam Cũng nước khác giới, khí hậu đã, biến đổi lãnh thổ Việt Nam Kết phân tích số liệu khí hậu cho thấy biến đổi chủ yếu yếu tố khí hậu mực nước biển sau: - Nhiệt độ: Trong 50 năm qua (1958 - 2007), nhiệt độ trung bình năm Việt Nam tăng lên khoảng từ 0,50C đến 0,70C Nhiệt độ mùa đông tăng nhanh nhiệt độ mùa hè nhiệt độ vùng khí hậu phía Bắc tăng nhanh vùng khí hậu phía Nam (hình1.3a) Nhiệt độ trung bình năm thập kỷ gần (1961 - 2000) cao trung bình năm thập kỷ trước (1931 - 1960) Nhiệt độ trung bình năm thập kỷ 1991 - 2000 Hà Nội, Đà Nẵng, thành phố Hồ Chí Minh cao trung bình thập kỷ 1931 1940 0,8; 0,4 0,60C Năm 2007, nhiệt độ trung bình năm nơi cao trung bình thập kỷ 1931 - 1940 0,8 - 1,30C cao http://www.lrc-tnu.edu.vn/ thập kỷ 1991 - 2000 0,4 - 0,50C Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 37 38 trưởng dựa vào điểm đánh giá chuẩn SES (Standard Evaluation System) - Nghiền mẫu với nitơ lỏng eppendorf (hoặc cối) thành dạng bột mịn, nghiền để mẫu nitơ lỏng IRRI Bảng 2.3 Đánh giá tiêu chuẩn cải tiến (SES) qua quan sát mức hại mặn giai đoạn mạ (IRRI, 1997) Mức độ Khả chống Quan sát chịu Sinh trưởng bình thường, triệu chứng, rễ phát triển mạnh Sinh trường gần bình thường, vài trắng cuộn Sinh trưởng bị chậm lại, hầu hết bị cuộn lại, vài vươn Hoàn toàn ngừng tăng trưởng, hầu hết bị khô, số chết Tất chết chết (khô) Chống chịu cao - Cho mẫu vào eppendorf 2ml cho 1ml đệm chiết (100mM Tris HCl, pH 8): 500mM NaCl: 50mM EDTA, pH 8,0): 0,07% - Mercaptol ethanol) đảo đều, giữ đá thêm 50 l SDS 10% - Đặt vào nồi cách thủy ủ 30 phút 65 0C, đảo cho dịch trộn - Ly tâm 13500 vòng/phút 20 phút Chống chịu Mức trung bình - Lấy đổ dịch phía sang eppendorf Thêm 1ml isopropanol alcohol để vào tủ 40C cho kết tủa khoảng 30 phút (hoặc qua đêm) không để vào tủ lạnh sâu -200C gây tượng kết tủa muối - Ly tâm 13500 vòng/phút 25 phút Mẫn cảm Mẫn cảm cao - Đổ hết dịch giữ lại tủa đáy eppendorf Cho 400 l đệm TE (10mM Tris HCl pH=8,0; 0,5 mM EDTA pH=8,0) cho vào tủ 650C ủ phút Dùng pipet nhỏ búng nhẹ hoà tan tủa, bước có - Để đánh giá khả chịu mặn sử dụng thang điểm đánh giá thể giữ 40C qua đêm - Cho l Rnase (10mg/ml) vào eppendorf Ủ 37oC khoảng tiêu chuẩn cải tiến (bảng 2.2) để ghi triệu chứng quan sát ngộ độc muối, cho điểm phân biệt kiểu gen nhiễm kiểu gen chống chịu vừa phải 2.4.5 Phƣơng pháp tách chiết DNA phân tích di truyền thị - Thêm 400 l đệm CTAB (0,2M Tris HCl (pH 8,0): 2M NaCl: 0,05M EDTA (pH 8,0): 2% CTAB, đặt vào nhiệt độ 650C 15 phút, thỉnh phân tử thoảng trộn, lắc a Phương pháp tách CTAB Phương pháp CTAB cải tiến sở phương pháp Shagai – Maroof (năm 1984) Quy trình thực gồm bước: - Lá giống lúa nghiên cứu cắt lấy mẫu sau cấy -3 tuần Mẫu lấy vào sáng sớm lúc nồng độ muối thấp, enzym hoạt động điều kiện tốt để tách chiết ADN Số hóa Trung tâm Học liệu tiếng http://www.lrc-tnu.edu.vn/ - Cho tủ hút, thêm vào 800 l chloroform/isoamyl alcohol (24:1), lắc trộn từ – phút nhằm loại bỏ protein - Ly tâm 13500 vòng/phút 10 phút Dung dịch bên eppendorf tách thành phần Sử dụng pipet hút chuyển dịch phía sang eppendorf Nếu chưa chiết lại lần chloroform/isoamyl alcohol (24:1) Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 39 40 - Thêm 2,5 lần thể tích ethanol 96% giữ tủ lạnh sâu (-200C) - Ly tâm 13500 vòng/phút 30 phút, loại bỏ cồn để giữ lại tủa - Thực bước với 35 chu kỳ, sau chu kỳ cuối chạy thêm 720C phút sau bảo quản nhiệt độ 40C - Sau chạy PCR xong, cất giữ mẫu nhiệt độ 0C Trước đem trắng đáy ống - Rửa tiếp 400 l cồn 70% đưa vào máy ly tâm 13500 phân tích phải nhỏ thuốc nhuộm Ethidium Bromide vào mẫu, sau vòng/phút phút Dùng pipet rút bỏ cồn giữ lại tủa, cho vào máy làm đưa vào máy PCR gây biến tính 940C 5phút sau để mẫu vào khô chân không khoảng 10 phút làm khô tủa (ADN), sau cho 100 l TE khay đựng đá lạnh tiến hành tra mẫu DNA vào gel điện di (10: 1) vào eppendorf hoà tan tủa c Phương pháp điện di gel agarose 0,8% - Giữ ADN tủ lạnh sâu (- 20 C) để sử dụng cho bước nghiên cứu - Nguyên tắc : DNA tích điện âm không đổi nhờ khung phosphate đặt điện trường, phân tử DNA dịch chuyển từ cực âm sang cực b Kỹ thuật PCR với mồi SSR dương phân tử DNA có khối lượng điện tích khác phân tách Các chu trình phản ứng PCR với mồi SSR, qua bước: o Bước biến tính: chu kỳ biến tính mẫu DNA nhiệt độ 94 C - Mục đích : Nhằm phân tách đoạn DNA có kích thước khác nhau, xác định có mặt đoạn DNA quan tâm 5phút, 30 giây o Bước gắn mồi: thực 55 C 30 giây * Chuẩn bị gel o Bước tổng hợp thực nhiệt độ 720C 30 giây - Cân 0,8g agarose cho vào 100 ml đệm TBE nhiệt độ phòng, khuấy - Thành phần phản ứng máy khuấy từ, để yên phút, cho vào lò vi sóng – mục đích làm nóng STT Thành phần Thể tích (µl) H2O (nước cất lần) 5,3 Buffer 10X - Đổ gel vào khuôn gel lắp lược dNTPs (2mM) - Khi gel nguội, đặt khuôn gel vào buồng điện di, tháo lược đổ đệm MgCl2 (5mM) 0,6 Mồi thuận (5µM) 0,5 Mồi nghịch (5µM) 0,5 Taq Polymerase (5U/µl) 0,1 DNA (20ng/µl) Tổng số 10 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ chảy gel không tạo bọt - Làm nguội gel đến 50-55oC, thêm 1µl Ethidium Bromide vào chạy vào khay gel cho đệm cao mặt gel khoảng 3-5mm * Kỹ thuật điện di gel agarose - Khi gel nguội, đặt khuôn gel vào buồng điện di, tháo lược đổ đệm chạy vào khay gel cho đệm cao mặt gel khoảng 3-5mm - Nạp DNA mẫu DNA chuẩn vào giếng tương ứng theo thứ tự mẫu Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 41 42 - Đậy nắp, cắm điện cực Bỏ kẹp hai bên kính, lấy miếng lót cao su ra, lắp vào bể điện di cho - Điện di 30 phút với điện 100-120V không để lại bọt khí kính, thêm đệm TBE 0,5x ngập mặt gel khoảng - Lấy gel ra, cho vào máy chụp UV, chụp bước sóng 254nm 0,5cm d Phương pháp điện di gel polyacrylamide 6% không biến tính Chuẩn bị dung dịch 6%,acrylamide từ dung dịch gốc 40% acrylamide (19:1 = acrylamide 380g; bisacrylamide 20g lít dung dịch)  Chuẩn bị kính Rửa kính xà phòng sau rửa lại nước cất để khô tự nhiên lau giấy lau, Chọn mặt kính bám gel, lau lại nước cất khử trùng lần sau lau lại cồn 70% lần Giữ kính dài, kẹp miếng lót cao su từ đầu kính đến hết kính, miếng lót phải bịt kín góc Sau đặt kẹp hai bên kính dài Rút lược tra khoảng l mẫu cho giếng (đã thêm dye) mẫu chạy với marker chuẩn 25bp Điện di từ 1,5 – 5h 100V tùy kích thước cặp mồi pcr tùy nồng độ gel  Nhuộm gel Sau điện di xong, tháo kính, lấy gel cho vào hộp kín có chứa TBE 0,5X Cho dung dịch nhuộm Syber Safe l cho gel, ngâm 30 phút Sau chụp ảnh máy soi UV e Phương pháp xử lý số liệu - Thí nghiệm đồng ruộng xử lý liệu qua chương trình Irristat 5.0, Excel 2010 Lau kính ngắn lần nước cất khử trùng sau lau lại với 70% Đặt kính ngắn lên kính dài cho không bị hở dùng kẹp kẹp chặt hai kính với - Đánh giá vật liệu bố mẹ sử dụng nghiên cứu phương pháp IRRI phương pháp lọc mặn Yoshida cs (1976) - Phân tích đánh giá đa hình DNA dòng giống bố mẹ tổ  Chuẩn bị dung dịch gel Dung dịch chuẩn bị cốc đong với khuấy từ thêm thành phần 50 l TEMED (N,N,N’,N’-Tetraethyl - ethylendiamine) 250 l APS 20%, 2,5ml TBE 10X, 7,5ml 40% acrylamide, 39,44 ml H2O) Đổ từ góc gel đầy kính ngắn, cài lược cho để hợp lai triển vọng theo thị lựa chọn qua thông tin công bố thông tin tự lựa chọn, thiết kế sở đồ phân tử công bố gen quan tâm Chọn thị cho đa hình dòng giống bố mẹ tổ hợp lai lược hướng vào Sau 15 phút gel đông lại dùng  Điện di Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 43 44 Chƣơng 3.1.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN Với mục đích cải tiến tính trạng chịu mặn giống lúa trồng phục 3.1 Kết đánh giá xác định vật liệu bố mẹ nghiên cứu vụ nhu cầu giống chịu mặn cho vùng ven biển Đồng Sông Hồng, chọi tạo giống lúa chịu mặn 3.1.1 Kết đánh giá khả chịu mặn giống lúa sử dụng phương pháp chọn giống thị thị phân tử nhằm chuyển gen chịu mặn saltol điều kiện nhân tạo Kết lọc mặn giống lúa nghiên cứu có bổ sung NaCl 6‰ vào dung dịch Yoshida thể qua bảng 3.1 K Bảng 3.1 Kết lọc mặn sau tuần giống Tên giống TT 3.2 Cấp hại sau tuần xử lý NaCl 6‰ Lặp Lặp Lặp Trung bình Pokkali đối chứng kháng 1 1.7 IR29 (mẫn cảm) 7 7.7 Bảng 3.2 FL478 Chỉ tiêu Giống FL478 Giống TL6 Ch giống lúa IR29 có biểu tổn thương, tăng trưởng bị ngưng lại hoàn toàn, Viện lúa Quốc tế IRRI 130 - 140 ngày (xuân muộn) 105 – 110 ngày (mùa sớm) 95 – 104 cm 21-23 cm hầu hết bị khô, vài chồi bị chết (điểm 7) tất bị 6-9 bông/khóm – bông/khóm 109 hạt/bông 95 – 103 hạt/bông Trung bình Tiềm năng suất cao, đạt 79 tấn/ha (vụ Đông Xuân), đạt – tấn/ha (vụ Hè thu) FL478 giống cho gen 3 1.7 TL6 7 7 Nguồn gốc TGST Theo đánh giá tính chịu mặn giống lúa IRRI, 1997 Cao chết khô (điểm 9) tiến hành quan sát, đánh giá theo tiêu chuẩn SES Sau tuần xử lý mặn nồng độ NaCl 6‰ giống IR29 sinh trưởng bị ngưng lại hoàn toàn, hầu hết bị khô (điểm 7) giống Năng suất 130-137 ngày (vụ Xuân), 108 – 115 ngày (vụ Mùa) 110-115 cm 19-22 cm Pokkali sinh trưởng bình thường, xuất vài có vết trắng, lại (điểm 1-3) tương đương với giống FL478 (điểm 1-3) Trong đó, giống TL6 khả chịu mặn nên sau tuần, hầu hết thí nghiệm bị khô Số hóa Trung tâm Học liệu Từ bảng thông tin cho thấy giống FL478 có thời gian sinh trưởng tương đương TL6, thuận lợi cho việc lai tạo giống nhận cho gen http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 45 46 Bên cạnh đó, từ việc đánh giá khả chống chịu mặn nồng độ khu vực QTL/Saltol từ AP3206 (tại vị trí 11,2Mb) đến RM10825 (tại vị muối NaCl 6‰ giống TL6, FL478, IR29, Pokkali, thu trí 13,3Mb) Các thị sử dụng việc sàng lọc cá thể số kết sau: mang gen đích quần thể FL478 TL6 Vị trí thị phân tử đa Các giống ngừng sinh trưởng, hầu hết bị khô, vài chồi bị hình QTL Saltol từ 11,2 Mb đến 13,3 Mb, cụ thể: AP3206 (11,2 Mb); chết, đặc biệt giống IR29, giống chuẩn nhiễm, nhập từ IRRI, bị RM3412b (11,6 Mb); RM10748 (11,8 Mb); RM493 (12,3 Mb); RM140(12,3 chết hoàn toàn sau tuần xử lý mặn Tuy nhiên, giống lúa TL6 Mb) RM10825 (13,3 Mb) điều kiện đánh giá bị ngưng sinh trưởng, bị khô, chí vài Trong khuôn khổ luận văn này, sử dụng thị chồi bị chết, đó, nhận thấy giống TL6 khả chống RM3412b RM493 hai thị cho đa hình với giống TL6 để sàng lọc chịu mặn thí nghiệm cá thể mang QTL/Saltol quần thể lai 3.1) Trong đó, giống FL478 có khả chịu mặn điểm tương đương với giống chuẩn kháng Pokali có khả chịu mặn tốt nhất, giống trồng phổ biến số nước Nam Đông Nam châu Á, có Việt Nam Như vậy, từ việc thu thập đánh giá đặc điểm nông sinh học, tiềm năng suất tính chống chịu mặn giống lúa, xác định vật liệu sử dụng nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn giống FL478 làm nguồn cho QTL/Saltol giống TL6 làm nguồn nhận QTL/Saltol 3.2 Kết chọn tạo dòng lúa chịu mặn từ tổ hợp lai TL6/FL478 saltol đa hình 3.1 Kết kiểm tra FL478 TL6 Kế thừa từ kết quả, vật liệu phương pháp nghiên cứu thị phân tử có liên quan nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn từ dự án “Tạo giống lúa chịu ngập chìm chịu mặn thích nghi với điều kiện nước biển dâng cho vùng bờ biển đồng Việt Nam” phủ Đan đa hình giống TL6 (P1) FL478 (P2) Đa hình hai giống lúa phát chiều dài khác đoạn lặp lại khuyếch đại phản ứng PCR sử dụng cặp mồi SSR Việc nhận dạng đa hình ADN giống cho gen nhận gen với thị liên kết chặt điều kiện tiên để sử dụng Mạch tài trợ giai đoạn 2010-2012, xác định có thị phân tử nằm Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 47 48 thị phân tử nhằm phát có mặt gen kháng cá thể lai Tương tự, chạy điện di với thị RM493 15 cá q 1F1, thu nhận băng điện di Trong 15 cá thể nghiên cứu, chọn cá thể mang số 1, 2, 4, 6, 8, 9, 11, 12, 14 cá thể mang QTL/Saltol nhờ vào hiển thị băng DNA giống với dòng locus gen chịu mặn quần thể BC1F1 bố mang gen Saltol dòng mẹ TL6 (Hình 3.3) Trong hệ BC1F1, sử dụng 15 cá thể BC1F1 từ hạt lai F1 TL6 FL478 Khi lúa tuần tuổi, tiến hành thu nhận mẫu 15 cá thể thuộc quần thể BC1F1 để phân tích DNA, kiểm tra có mặt QTL/Saltol, cá thể đeo thẻ theo số thứ tự dòng thứ tự thu mẫu Hai thị phân tử RM493 RM3412b sử dụng để xác định cá thể Hình 3.3 BC1F1 mang gen QTL/Saltol quần thể BC1F1 Kết xác định cá thể BC1F1mang QTL/Saltol thị phân tử RM493 thể kết băng điện di hình 3.2 Kết hợp hai thị RM493 RM3412b sàng lọc cá thể mang QTL/Saltol Qua phân tích hình 3.2, chọn cá thể đánh số 1, 2, 4, 7, 9, 11, 13, 14, 15 cá thể mang QTL/Saltol (ký hiệu H) có TL6 FL478 BC1F1 F2 3.2.3 Sử dụng thị phân tử xác định cá thể mang locus gen chịu mặn quần thể BC1F2 Từ cá thể thu nhận quần thể BC1F1, tiến hành tự thụ để tạo quần thể BC1F2 Các cá thể gieo trồng thu nhận mẫu để kiểm tra gel polyacrylamide nhằm xác định cá thể mang gen đồng hợp tử nhờ vào việc sử dụng thị phân tử liên kết chặt với gen Saltol RM493 Kết sau chạy điện di gel polyacrylamide thể hình 3.4 Qua kết chạy điện di với 20 cá thể quần thể BC1F2, Hình 3.2 BC1F1;; - Số hóa Trung tâm Học liệu BC1F1 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ xác đị Số hóa Trung tâm Học liệu 2, http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 49 50 Saltol (hình 3.4 Bảng 3.3 Kết lọc mặn sau tuần dòng TT Tên dòng/giống BC1F3, BC1F4 Cấp hại sau tuần xử lý NaCl 6‰ Lặp Lặp Lặp Trung bình Dòng số 01 3.0 Dòng số 02 3 3.7 Dòng số 03 3 3.0 Dòng số 04 3.0 Dòng số 05 3 3.0 Dòng số 11 3 3.7 Dòng số 12 3 2.3 Dòng số 13 3 3.0 Dòng số 14 3 3.7 10 Dòng số 15 3 3.0 23 Pokkali (chuẩn kháng) 1 1.7 24 IR29 (mẫn cảm) 7 7.7 25 FL478 1.7 26 TL6 7 6.3 Hình 3.4 BC1F2 P1: TL6, P2: FL478, A: TL6, H: dị hợp tử, B: FL478, từ 1-20: cá thể Sau tuần xử lý mặn nồng độ NaCl 6‰ giống IR29 sinh trưởng bị ngưng lại hoàn toàn, hầu hết bị khô (điểm 7) giống BC1F2 3.3 Đánh giá vật liệu sử dụng nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn Pokkali sinh trưởng bình thường, xuất vài có vết trắng, lại (điểm 1-3) tương đương với giống FL478 ( 3.3.1 Đánh giá tính chịu mặn dòng lúa chọn tạo điều - 12 kiện nhân tạo Kết lọc mặn dòng lúa nghiên cứu có bổ sung NaCl 6‰ vào dung dịch Yoshida thể qua bảng 3.3 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 51 52 3.3.2 Đánh giá đặc tính nông sinh học, yếu tố cấu thành Chiều cao dòng thí nghiệm lệch 0,6cm suất khả chịu mặn dòng đƣợc tạo mang QTL/Saltol coi cao so với giống TL6 đối chứng 0,2cm sai vụ mùa 2013 số cho phép Như vậy, thí nghiệm vụ mùa dòng giống đối chứng 3.3.2.1 Đánh giá hình thái số dòng chịu mặn Giao Thủy, Nam Định vụ mùa 2013 Bảng 3.4 Một số đặc điểm nông học hình thái dòng lúa tham gia thí nghiệm 2013 Giao Thủy, Nam Định TT Tên TGST Chiều Chiều dài Độ thoát Số dòng/giống (ngày) cao đòng cổ gié/bông (cm) (cm) (cm) có chiều cao Trong điều kiện nhiễm mặn xảy đồng ven biển, vụ mùa thường gặp bão gió mạnh với chiều cao thấp 100cm phù hợp cho canh tác khu vực này, cấy giảm đổ gãy vào Lá đòng yếu tố quan trọng định đến tích lũy tinh bột hạt, ảnh hưởng trực tiếp tới suất Nhất vụ mùa, điều kiện thời tiết vào mùa mưa đồng sông hồng, đòng ổn định nên ảnh hưởng trực tiếp đến trọng lượng khô hạt Qua thí nghiệm cho thấy chiều dài đòng giống TL6 23,6cm; dòng 24,5 ; dòng Dòng 105 100,5 24,5 2,9 10,6 Dòng 105 100 25,6 3,2 10,6 Dòng 12 105 100,6 23,7 2,7 10,6 TL6 105 98,6 23,6 2,4 10,0 lúa, độ thoát cổ dài điều kiện thời tiết ven biển gió nhiều CV 2,3 1,25 2,7 0,8 làm có bị gãy cổ Trong thí nghiệm dòng tham gia có độ dài LSD(5%) 3,4 3,2 2,7 1,6 25,6 dòng 12 23,7 Là phù hợp với giống gieo trồng Độ thoát cổ yếu tố gián tiếp định đến suất cổ ngắn dao động khoảng 2,7cm (dòng 12) đến 3,2 cm (dòng 1) giống đối chứng 2,4cm Số gié yếu tố định số hạt Các hình thái số dòng chịu mặn Giao Thủy, Nam Định vụ mùa 2013 thể bảng 3.4 bông, thí nghiệm số gié trung bình 10 gié 3.3.2.2 Đánh giá yếu tố cấu thành suất số dòng Từ bảng 3.4 cho thấy: chịu mặn Giao Thủy, Nam Định vụ mùa 2013 TGST dòng thí nghiệm giống giống với giống đối chứng 105 ngày, với thời gian sinh trưởng 105 ngày phù hợp với Các yếu tố cấu thành suất số dòng chịu mặn Giao Thủy, Nam Định vụ mùa 2013 thể bảng 3.5 cấu mùa vụ đồng sông hồng Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 53 54 Bảng 3.5 Năng suất yếu tố cấu tăng s Thủy - Nam Định có biến đổi khí hậu mưa nhiều kéo dài suốt tháng đến hết tháng vào thời kỳ lúa trỗ nên ảnh hưởng đến tỷ lệ giao phấn 2013 TT Tên Số TL6 nên làm cho có tỷ lệ lép cao Hạt chắc/bông lép/bông 7,15 126,35 24,67 20,75 84,35 57,4 7,65 122,45 19,67 20,34 85,74 57,5 7,61 119,23 16,33 21,08 86,07 56,6 Dòng Bông/khóm Dòng Dòng Dòng 12 P1000 Hạt hạt (gram) NSLT NSTT Tạ/ha Tạ/ha Trọng lượng nghìn hạt có thay đổi, tất dòng có trọng lượng nghìn hạt cao TL6 20,1 (gram/1000 hạt), dòng 20,75 (gram/1000 hạt); dòng 20,34 (gram/1000 hạt) dòng 12 21,08 (gram/1000 hạt) Nguyên nhân khác trình lai tạo chuyển gen NSLT yếu tính dựa thu thập tiêu cấu thành suất NSLT TL6 73,72 (tạ/ha) thấp so với dòng mang gen 6,76 120,58 17,33 20,10 73,72 53,4 CV 4,47 4,52 4,32 5,61 LSD(5%) 5,34 12,91 6,75 8,36 Chú thích: NSTL – Năng suất lý thuyết; NSTT – Năng suất thực tế dòng 84, 35 (tạ/ha); dòng 85,74 (tạ/ha) dòng 12 86,07 (tạ/ha) NSTT suất thực chất thu ruộng thí nghiệm, tất biện pháp kỹ thuật tác động vào lúa với mục đích cuối Số khóm yếu tố định trực tiếp đến suất nâng cao NSTT Trong thí nghiệm NSTT TL6 thấp hẳn so với lúa, thí nghiệm ta thấy số khóm dao động từ 7,15 (dòng 1) dòng tham gia thí nghiệm, điều TL6 sinh trưởng đến 7,65 (dòng 4) nhiều so với giống đối chứng 6,67 Điều cho phát triển tốt môi trường bị nhiễm mặn Trong đó, dòng khác có thấy ruộng thí nghiệm bị nhiễm mặn dòng TL6 mang QTL NSTT dòng 57,4 (tạ/ha); dòng 57,5 (tạ/ha) dòng 12 56,6 chịu mặn sinh trưởng tốt so với giống TL6 không mang QTL chịu mặn (tạ/ha) cao so với TL6 Số hạt yếu tố cuối định đến suất Tóm lại, vụ mùa 2013 gặp khó khăn thời tiết biến đổi lúa, hạt vào tốt tỷ lệ mẩy cao nâng cao khối lượng khô hạt khí hậu, mưa nhiều vào giai đoạn lúa trỗ kết thí nghiệm giúp tăng suất Qua bảng theo dõi tiêu cấu thành suất phản ánh chân thực hiệu phương pháp chuyển QTL chịu nhận thấy dòng tham gia thí nghiệm có số hạt mặn vào giống lúa TL6 Thí nghiệm tiến hành điều kiện nhiễm 126,35 (dòng 1); 122,45 (dòng 4) 119,23 (dòng 12), giống TL6 mặn tự nhiên tiêu đo nông học suất thu 120,58 giống có mang QTL chịu mặn sinh trưởng phát triển tốt Số hạt lép bông, cá dòng giống đối chứng TL6 cao so điều kiện đất canh tác bị nhiễm mặn Tuy nhiên kết đánh giá với vụ khác, điều lý giải rằng, vụ mùa năm 2013 Giao Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 55 56 vụ mùa, cần có thêm thí nghiệm vụ xuân để có đánh giá Từ bảng 3.6 cho thấy: khách quan canh tác với cấu năm vụ miền bắc TGST lúa tính từ lúc hạt thóc nảy mầm chín, 3.3.3 Đánh giá đặc tính nông sinh học, yếu tố cấu thành TGST dài hay ngắn phụ thuộc vào giống lúa, mùa vụ gieo trồng kỹ thuật suất khả chịu mặn dòng đƣợc tạo mang QTL/Saltol Qua bảng 3.6, TGST dòng ngày, dòng 12 có thời vụ xuân 2014 gian sinh trưởng 130 ngày với thời gian sinh trưởng TL6, dòng só 3.3.3.1 Đánh giá hình thái số dòng chịu mặn Giao Thủy, Nam Định vụ xuân 2014 Quá trình sinh trưởng, phát triển lúa phụ thuộc vào đặc tính di số có thời gian sinh trưởng 135 ngày nhiều giống TL6 đối chứng ngày, Tuy nhiên, với thời gian sinh trưởng ngày không khác nhiều sản xuất truyền giống điều kiện ngoại cảnh đặc biệt điều kiện khí hậu Về tiêu đánh giá chiều cao cây, kết nghiên cứu cho thấy không vùng, mùa vụ cụ thể, Theo dõi đặc tính nông học có biến động đáng kể tăng trưởng chiều cao dòng, giống phản ánh mức độ chịu thâm canh phạm vi sản xuất Hầu hết dòng có chiều cao lớn so với đối chứng giống TL6 dòng/giống góp phần khai thác tiềm năng suất giống, (90,3cm), Tuy nhiên, chiêu cao dòng cao TL6 chi không đáng kể Trong vụ xuân 2014, thí nghiệm tiến hành điều kiện tự nhiên Giao Thủy, Nam Định với dòng chịu mặn tuyển chọn từ hệ BC1F2, Kết đánh giá đặc điểm nông học dòng thể qua bảng 3.6 từ 3cm – 6cm coi chiều cao cá dòng nhau, cụ thể dòng 96,5cm; dòng 95,6cm; dòng 12 93,7cm Về tiêu đánh giá đòng, kết nghiên cứu cho thấy có sai khác không nhiều dòng tham gia thí nghiệm giống đối chứng với nhau, Trong đó, chiều dài đòng TL6 24,6cm ; dòng 25,3cm; dòng Bảng 3.6 Một số đặc điểm nông học hình thái dòng lúa tham gia thí nghiệ 2014 Giao Thủy, Nam Định Chiều dài đòng (cm) 25,3 Độ thoát cổ (cm) 2,6 Số gié/bông 135 Chiều cao (cm) 96,5 Dòng 135 95,6 24,6 1,6 11,6 Dòng 12 130 93,7 25,2 3,1 10,7 TL6 130 90,3 24,6 1,3 11,3 CV 4,02 1,72 0,63 1,3 LSD(5%) 3,24 2,56 2,11 3,45 TT Tên dòng/giống TGST (ngày) Dòng 11,3 Chú thích: TGST – Thời gian sinh trưởng Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 24,3cm; dòng 12 25,2cm Về tiêu chiều dài cổ bông, theo kết đánh giá, sai khác dòng với giống đối chứng, giao động từ 1,6 cm (dòng ) đến 3,1 cm (dòng 12 ) TL6 đối chứng 1,3cm Từ số liệu đo đếm được, số gié/bông dòng giống đối chứng, Tuy nhiên, chênh lệch không nhiều, Từ 10,7 (dòng 12) đến 11,6 (dòng 4) giống đối chứng 11,3cm Bước đầu đánh giá tính trạng kiểu hình nhận thấy khác nhiều kiều hình giống mang QTL chịu mặn chuyển phương pháp MAS giống đối chứng nhận QTL Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 57 58 3.3.3.2 Đánh giá yếu tố cấu thành suất số dòng Số lượng hạt/bông yếu tố quan trọng cuối định đến kết thí nghiệm tất biện pháp kỹ thuật nhằm mục đích nâng chịu mặn Giao Thủy, Nam Định vụ xuân 2014 Song song với việc đánh giá đặc điểm nông sinh học sinh trưởng cao số hạt để nâng cao suất, Số hạt dòng hình thái, tiến hành đánh giá yếu tố cấu thành suất dòng dao động khoảng từ 123,8 hạt (dòng 12) đến 131,63 hạt (dòng 4), chịu mặn thí nghiệm, Các tiêu theo dõi gồm: tổng số hạt/bông, số giống đối chứng TL6 124,19 hạt số hạt lép 4,68 hạt chắc/bông, số hạt lép/bông, Đây tiêu đóng vai trò quan hạt/bông, dòng tham gia thí nghiệm dòng 9,45 hạt/bông ; dòng trọng việc định suất lúa, Kết thể 8,31 hạt/bông dòng 12 10,65 hạt/bông Khác hẳn với vụ mùa 2013 thời bảng 3.7 tiết vụ xuân 2014 tỷ lệ hạt vào cao mẩy hạt thời tiết vụ Bảng 3.7 Năng suất yếu tố cấu thành suất dòng tham gia thí nghiệm Giao Thủy, Nam Định 2014 P1000 Tên Số Hạt Hạt Dòng Bông/khóm chắc/bông lép/bông 7.67 128.24 9,45 21.8 96,49 61 6.67 131.63 8.31 21.72 85,81 61 6.67 123.8 10,65 21.93 81,49 59,4 6.67 124.19 4,68 21.14 78,8 58,8 CV 4,47 4,52 LSD(5%) 5,34 12,91 Từ bảng 3.7 cho thấy: 4,32 6,75 5,54 7,61 TT Dòng Dòng Dòng 12 TL6 hạt (gram) NSLT xuân thường ổn định Trọng lượng nghìn hạt cao vụ mùa 2013, có ổn định NSTT thời tiết, dòng 21,8 (gram/1000hạt); dòng 21,72 (gram/1000hạt) (Tạ/ha) (Tạ/ha) dòng 12 21,93 (gram/1000hạt) giống đối chứng TL6 21,14 (gram/1000hạt) NSLT dòng là: dòng 96,44 (tạ/ha); dòng 85,81 (tạ/ha); dòng 12 81,49 (tạ/ha) giống TL6 đối chứng 78,8 (tạ/ha); rõ ràng dòng TL6 có QTL chịu mặn thích nghi tốt với vùng đồng ven biển NSTT dòng thu thí nghiệm vụ mùa là: dòng dòng 6,1 (tạ/ha); dòng 12 59,4 (tạ/ha) giống TL6 đối chứng 58,8 (tạ/ha) Như vậy, với NSTT thể thích nghi tốt Số bông/khóm yếu tố định cấu thành suất, giống TL6 có QTL chịu mặn Số bông/khóm tùy thuộc vào mật độ cấy, điều kiện đất đai, thời tiết, lượng Qua đánh giá thêm lần vụ xuân 2014 phân bón, chế độ nước… Do đó, yếu tố có ảnh hưởng thuận tới nhận thấy dòng mang gen ưu giống gốc TL6, điều suất, Từ số liệu bảng cho thấy, số bông/khóm dòng/giống kiện đất nhiễm mặn cho thấy dòng thí nghiệm tương đương 6,67 bông/khóm giống đối chứng, trừ dòng 7,67 thành công việc dùng phương pháp MAS để chuyển QTL chịu mặn Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 59 60 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO Kết luận Tiếng Việt 1.1 Đã đánh giá vật liệu bố mẹ nghiên cứu chọn tạo giống lúa Đỗ Hữu Ất (2005), “Ứng dụng kỹ thuật hạt nhân để cải tạo giống lúa chịu chịu mặn, cụ thể: mặn cho vùng đồng ven biển Bắc bộ”, TT Khoa học Công nghệ - Giống FL 478 có khả chịu mặn điểm sau tuần xử lý mặn nồng Hạt nhân, 4/2005, 28-30 độ muối NaCL6‰, tương đương với giống chuẩn kháng Pokali có khả Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang (2003), Cơ sở di truyền tính chống chịu chịu mặn tốt thiệt hại môi trường lúa, Nxb Nông nghiệp, TP Hồ - Giống TL khả chống chịu mặn, lại có chất lượng Chí Minh tiềm cho suất cao Bùi Chí Bửu, Nguyễn Duy Bảy, Phùng Bá Tạo, Đỗ Xuân Trường 1.2 Ứng dụng thị phân tử xác định cá thể (ký hiệu số 2,14, 17, Nguyễn Thị Lang (2000), “chọn tạo giống lúa cho vùng bị nhiễm mặn 18) hệ BC1F2 cá thể đồng hợp tử vị trí locus gen Saltol, đồng sông Cửu Long”, Omon Rice 8: 16-26 - có nồng độ NaCl 6‰ Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2004), Di truyền phân tử, Nxb Nông Nghiệp, TP Hồ Chí Minh 1.3 Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (1995), Ứng dụng công nghệ sinh học (D1, D4, D12) cải tiến giống lúa, Nxb Nông Nghiệp, TP Hồ Chí Minh 6 Nguyễn Thị Lang (2002), Những phương pháp công nghệ Kiến nghị sinh học Nxb Nông Nghiệp, TP Hồ Chí Minh 2.1 Tiếp tục trồng thử nghiệm đánh giá khả thích ứng dòng Nguyễn Thị Lang, Phạm Thị Xim, Bùi Chí Bửu (2008), “Nghiên cứu ứng D1, D4 D12 chọn tạo với nhiều mùa vụ vùng sinh thái khác dụng thị phân tử chọn tạo giống lúa chịu mặn kỹ thuật nuôi để đánh giá khả thích nghi ứng phó với điều kiện BĐKH cấy túi phấn”, Tạp chí Nông nghiệp Phát triển Nông thôn, (8/2008), tỉnh ven biển Đồng Sông Hồng 13-17, ISSN, 0866-7020 2.2 Nghiên cứu cách có hệ thống đặc điểm sinh lý, sinh hóa Đỗ Khắc Thịnh, Nguyễn Ngọc Quỳnh, Dương Ký, Nguyễn Văn Huấn đánh giá khả chịu mặn dòng/giống tạo nhằm phát (1997), “Kết tuyển chọn giống lúa mùa FRG67 cho vùng đất phèn, triển mở rộng sản xuất nhiễm mặn, ảnh hưởng thuỷ triều ven thành phố Hồ Chí Minh”, Tạp chí Nông nghiệp Công Nghiệp Thực Phẩm, (11/1997), tr 475-476 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 61 62 Ngô Đình Thức (2006), Nghiên cứu phát triển giống lúa chống chịu mặn 17 Flowers, T J and Yeo A.R (1988), “Salinity and rice: A physiological cho vùng đồng sông Cửu Long, Luận án tiến sĩ nông nghiệp, trường approach to breeding for resistance”, School of biological sciences, Đại học Nông lâm TP.HCM University of Sussex, Brighton, U.K, pp.993-959 10 Vương Đình Tuấn, Fukutu Y., Yano M Ban T (2000), “Lập đồ 18 Gregorio G.B, Senadhira D., Mendoza R.D., Manigbas N.L.,Rosxas J.P., xác định vị trí gen di truyền số lượng ảnh hưởng đến tính chống chịu Guerta C.Q (2002), “Progress in breeding for salinity tolerance and mặn lúa (Oryza satica)”, Omon Rice, 8: tr27-35 associated abiotic stresses in rice”, Field crio Research Elsevier Tiếng Anh 11 Bonilla P., Dvorak J., Mackill D.J., Deal K and Gregorio G (2002), “RFLP and SSLP mapping of salinity tolerance genes in chromosome of rice (Oryza sativa L.)” using recombinant inbred lines Philipp Agric Sci, 85:68–76 12 Collard B.C.Y., Mackill D.J (2008), “Marker - aide selection: an approach for precision plant breeding in the twenty first century”, Philos Trans R Soc Lonf B Biol Sci, 363: 557 - 572 13 F.A.O., AGL (2000), “Extent and causes of salt-affected soils in participating countries Global network on intergrated soil management for sustainable use of salt-affected soils Land and plant nutrition management service” 14 FAO (Food and Agriculture Organization), (2010), “Report of salt affected agriculture” Link access: (http://www.fao.org/ag/agl/agll/spush/, latest verified October 2011) 15 Flowers T.J., Koyama M.L., Flowers S.A., Sudhakar C., Singh K.P., Yeo A.R (2000), “QTL: their place in engineering tolerance of rice to salinity”, J Exp Bot, 51:99–106 16 Flowers T J (1987), “Salinity resistance in rice”, University of Sussex, pp 9-11 19 Gregorio G.B., Senadhira D (1993), “Genetic analysis of salinity tolerance in rice (Oryza sativa L.)”, Theor App.l Genet 86, pp.333-338 20 IPCC (2007) The 4th assessement report of the Intergovernmental Panel on Climate Change http://en.wikipedia.org/wiki 21 Ismail A.M, Heuter S., Thomson M.J and Wissuwa M (2007), “Geneticand Genomic approaches to develop rice germplasm for problem soils”, Plant Molecular Biology, 4: 547-570 22 Ismail A.M., Thomson M.J., Singh R.K., Gregorio G.B., Mackill D.J (2009), “Designing rice varieties adapted to coastal areas of South and Southeast Asia”, J Indian Soc Coastal Agric Res, 26: 335-362 23 Kawasaki S., Borchert C., Deyholos M.,Wang H., Brazille S., Kawai K., Galbraith D., Bohnert H.J (2001), “Gene expression profiles during the initial phase of salt stress in rice”, The Plant Cell, 13:889-905 24 Koyama M.L., Levesley A., Koebner R.M., Flowers T.J., Yeo A.R (2001), “Quantitative trait loci for component physiological traits determining salt tolerance in rice” , Plant Physiol 125:406–422 25 Lee K.S (1995), “Variability and genetics of salt tolerance in japonica rice”, University of Philippine, Los Banos, Philippine, pp.108-110 63 64 26 Lin H.X., Zhu M.Z., Yano M., Gao J.P., Liang Z.W., Su W.A., Hu X.H., 34 Prasad K.V.S.K., Sharmila P., Kumar P.A., Saradhi P.P (2000b), Ren Z.H., Chao D.Y (2004), “QTLs for Na+ and K+ uptake of the shoots “Transformation of Brassica juncea (L.) Czern with bacterial codA gene and roots controlling rice salt tolerance”, Theor Appl Genet ,108:253–260 enhances its tolerance to salt stress”, Mol Breed, 6:489–499 27 Lorieux M., Petror M., Huang N., Guiderdoni E., Ghesquier A (1996), 35 Prasad S.R., Bagali P.G., Hittalmani S., Shashidhar H.E (2000a), “Aroma in rice: genetic analysis of a quantitative trait” Theor Appl Genet “Molecular mapping of quantitative trait loci associated with seedling 93:1145–1151 tolerance to salt (Oryza sativa L.)” Curr Sci, 78:162–164 28 Mishra B., Akbar M., Seshu D.V (1990), “Genetic studies on salinity 36 Ren Z.H., Gao J.P., Li L.G., Cai X.L., Huang W., Chao D.Y., Zhu M.Z., tolerance in rice towards better productitivity in salt effected soils”, Wang Z.Y., Luan S., Lin H.X (2005), “A rice quantitative trait locus for Proceedings of the Rice Research Seminar, Jul 12-12, IRRI, Los Ba salt tolerance encodes a sodium transporter”, Nat Genet, 37:1141–1146 Laguna, pp: 25-25 29 Mishra B., Akbar M., Seshu D.V and Senadhira D (1996), “Geneticss of salinity tolerance and ionic uptake in rice”, IRRN 21:38-39 30 Munns R (2002), “Comparative physiology of salt and water stress”, Plant Cell and Envriron, 25: 239-250 31 Nandi S., Subudhi P.K., Senadhira D., Maigbas N.L., Sen-Mandi S., Huang N (1997), “Mapping QTLs for submergence tolerance in rice by AFLP analysis and selective genotyping”, Mol Gen Genet, 255:1–8 32 Narayanan K.K., Krishnaraj S., Sree Rangaswamy S.R.,(1990), “Genetic 37 Takehisa H., Shimodate T., Fukuta Y., Ueda T., Yano M., Yamayad T., Kameya T., Sato T (2004), “Identification of quantitative trait loci for plant growth of rice in paddy field flooded with salt water”, Field Crops Res, 89:85–95 38 Teng S (1994), Gene tagging for salt tolerance in rice (Oryza sativa L.), The University of Philippine, Los Banos, Laguna, Philippine, 118p 39 Thomson MJ., Ocampo M., Egdane J., Rahman M.A., Saiise AG., Adorada DL., Raiz E.T 2010 “Characterizing the Saltol quantitative trait locus for salinity tolerance in rice” Rice, 3:148-160 analysis for salt tolerance in rice, Paper presented during the Second 40 Tsunematsu H., Yoshimura A., Horushima Y., Nagamura Y., Kurata N., International Rice Genetic Symposium”, May 14-18, 1990 IRRI, Manila, Yano M., Sasaki T., Iwata N (1996), “RFLP framework map using Philippine recombinant inbred lines in rice”, Breed Sci, 46:279–284 33 Niones J.M (2004), Fine mapping of the salinity tolerance gene on 41 Wang G.L., Mackill D.J., Bonman J.M., McCouch S.R., Champoux M.C., chromosome of rice (Orysa sativa) using near-isogenic lines, MSc Nelson R.J (1994), “RFLP mapping of genes conferring complete and thesis, University of the Philippines Los Banos partial resistance to blast in a durably resistant rice cultivar”, Genetics 136:1421–1434 65 42 Xiao J., Li J., Yuan L., Tanksley S.D (1996), “Identification of QTLs affecting traits of agronomic importance in a recombinant inbred population derived from a subspecific rice cross”, Theor Appl Genet, 92:230–244 43 Yadav R., Courtois B., Huang N., McLaren G (1997), “Mapping genes controlling root morphology and root distribution in a doubledhaploid population of rice”, Theor Appl Genet , 94:619–632 44 Zhang Wen-Long, Y.W.-P., Chen Zhi-Wei, Wang Ming-Chun, Yang LiuQi, and Cai Yi-Lin (2010), “Molecular Marker-Assisted Selection for o2 Introgression Lines with o16 Gene in Corn”, Acta Agronomica Sinica , 36:1302–1309 Internet 45 http://www.gramene.org 46 http://www.monre.gov.vn 47 http://www.khoahoc.com.vn/doisong/moi-truong/tham-hoa/18435_Biendoi-khi-hau-22-trieu-nguoi-Viet-Nam-se-bi-mat-nha-cua.aspx/ngày 29/11/2007