BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI   LÊ THIÊN KIM MÃ SINH VIÊN: 1101276 ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT XUẤT OXOSTEPHANIN TỪ THÂN, LÁ CÂY CỦ DÒM (STEPHANIA DIELSIANA Y.C WU) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2016 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI   LÊ THIÊN KIM MÃ SINH VIÊN: 1101276 ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT XUẤT OXOSTEPHANIN TỪ THÂN, LÁ CÂY CỦ DÒM (STEPHANIA DIELSIANA Y.C WU) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Quốc Huy TS Hoàng Quỳnh Hoa Nơi thực Bộ môn Thực vật HÀ NỘI – 2016 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Quốc Huy TS Hoàng Quỳnh Hoa, người thầy, người cô hướng dẫn, tạo điều kiện học tập, nghiên cứu tốt nhất, động viên khích lệ em suốt trình thực đề tài Em xin cảm ơn thầy cô Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội, Thầy Trần Văn Ơn, Thầy Nghiêm Đức Trọng, Chị Phạm Thị Linh Giang; chị kỹ thuật viên: Chị Thoa, Chị Hiền, Chị Hạnh, giúp đỡ em, dạy nhiều kinh nghiệm quý báu thời gian em làm thực nghiệm Bộ môn Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược liệu, tạo điều kiện cho em sử dụng bể chiết siêu âm, giúp em hoàn thành nội dung nghiên cứu Cảm ơn Bác Sâm Bác Lan, hai người giúp cháu có mẫu nghiên cứu cho đề tài Đặc biệt, em xin cảm ơn Chị Nguyễn Thị Thùy Linh, tớ cám ơn cậu: Bạn Đinh Xuân Chung, hỗ trợ, giúp đỡ cung cấp tài liệu quý giá cho em/tớ suốt thời gian qua Có hai người bên cạnh, khóa luận em/tớ hoàn thành thời hạn Cuối cùng, Con xin cảm ơn ba mẹ sinh thành, nuôi nấng cho môi trường giáo dục thật tốt Xin cảm ơn hai chị yêu em: Chị Hà Chị Tâm; bạn Nam Anh, bên cạnh em/tớ suốt thời gian qua Đây động lực để em vững tin bước đường nghiên cứu khoa học Thưa thầy cô, anh chị bạn, cố gắng chắn báo cáo khóa luận em chắn nhiều khiếm khuyết Đây tâm huyết thứ em tự hào thời điểm Em kỳ vọng khóa luận em đến với bạn nghiên cứu khoa học khác thật trọn vẹn Do đó, em mong nhận ý kiến phê bình, nhận xét thầy cô môn, anh chị bạn để em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Sinh Viên Lê Thiên Kim MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 LOÀI STEPHANIA DIELSIANA Y.C WU 1.1.1 Đặc điểm thực vật phân bố 1.1.2 Thành phần hoá học .4 1.1.3 Tác dụng sinh học công dụng 1.1.3.1 Tác dụng sinh học độc tính .7 1.1.3.2 Công dụng 1.2 OXOSTEPHANIN .9 1.2.1 Công thức phân tử, tính chất vật lý 1.2.2 Một số nghiên cứu oxostephanin 10 1.3 TỔNG QUAN VỀ CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU 11 1.3.1 Khái niệm 11 1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới chất lượng dịch chiết 11 1.3.2.1 Những yếu tố thuộc dược liệu 11 1.3.2.2 Những yếu tố thuộc dung môi 12 1.3.2.3 Những yếu tố thuộc kỹ thuật 13 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 16 2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 16 2.1.2 Thiết bị hóa chất 17 2.1.2.1 Thiết bị máy móc dụng cụ thí nghiệm 17 2.1.2.2 Hóa chất 18 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 18 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.3.1 Thẩm định phương pháp định lượng oxostephanin dược liệu HPTLC áp dụng để định lượng oxostephanin dịch chiết dược liệu 18 2.3.1.1 Phương pháp định lượng oxostephanin dược liệu HPTLC 18 2.3.1.2 Thẩm định phương pháp định lượng oxostephanin HPTLC áp dụng cho định lượng oxostephanin dịch chiết 20 2.3.2 Đánh giá số yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất oxostephanin từ thân, Củ dòm (Stephania dielsiana Y.C Wu) 23 2.3.2.1 Lựa chọn yếu tố xây dựng mô hình khảo sát 23 2.3.2.2 Xử lý dịch chiết tính toán kết 26 2.3.2.3 Xử lý số liệu 26 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 29 3.1 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT KẾT QUẢ 29 3.1.1 Thẩm định phương pháp định lượng oxostephanin dược liệu HPTLC áp dụng để định lượng oxostephanin dịch chiết dược liệu 29 3.1.1.1 Độ đặc hiệu 29 3.1.1.2 Tính tuyến tính 30 3.1.1.3 Độ thích hợp hệ thống 31 3.1.1.4 Độ 32 3.1.2 Đánh giá số yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất oxostephanin từ dược liệu thân, Củ dòm 33 3.1.2.1 Kết chiết xuất định lượng oxostephanin dịch chiết mẫu nghiên cứu 33 3.1.2.2 Xử lý số liệu đánh giá mối quan hệ yếu tố khảo sát tới kết 36 3.2 BÀN LUẬN 41 3.2.1 Thẩm định phương pháp định lượng oxostephanin dược liệu HPTLC 41 3.2.2 Đánh giá số yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất oxostephanin từ dược liệu thân, Củ dòm 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT EtOH Ethanol FV Độ tin cậy (Fidelity value) HPTLC Sắc ký lớp mỏng hiệu cao (High Performance Thin Layer Chromatography) HPLC High performance liquid chromatography MeOH Methanol NXB Nhà xuất oxo oxostephanin pp Page STT Số thứ tự DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng STT Bảng 1.1 Bảng 1.2 Các alcaloid phân lập từ loài Stephania dielsiana Y.C Wu Đặc điểm số phổ oxostephanin Trang 5-6 9-10 Ví dụ độ phân cực (thông qua số điện môi Ɛ), độ Bảng 1.3 nhớt (ƞ), sức căng bề mặt (δ) khả hòa tan chất 12-13 số loại dung môi Bảng 1.4 Bảng 2.1 Bảng 2.2 Ưu, nhược điểm số phương pháp chiết xuất thường gặp Tỷ lệ thêm chuẩn dung dịch chấm sắc ký Cỡ rây (kim loại) rây phân loại kích thước bột dùng đề tài 14-15 22 23 Các kích thước lựa chọn để nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng Bảng 2.3 kích thước dược liệu đến trình chiết xuất 24 oxostephanin Bảng 2.4 Danh sách mã hóa mẫu thực nghiệm theo điều kiện chiết xuất 26 Bảng 2.5 Mã hóa yếu tố khảo sát (factors) Bảng 3.1 Nồng độ oxostephanin chuẩn diện tích pic đáp ứng 30 Bảng 3.2 Giá trị diện tích pic, chiều cao pic Rf vết 31 Bảng 3.3 Kết khảo sát độ 32 Bảng 3.4 Dãy chuẩn hệ số tương quan dãy chuẩn oxostephanin 27-28 33-34 Hàm lượng oxostephanin trung bình dịch chấm sắc Bảng 3.5 ký, % trung bình oxostephanin cắn chiết từ dược liệu 27 mẫu thử 35 Bảng 3.6 Bảng 3.7 Bảng 3.8 Bảng 3.9 Bảng 3.10 Bảng 3.11 Kết phân tích phương sai phần mềm R lượng oxostephanin thu chiết xuất dược liệu Giá trị R2 thu dùng lệnh lm Summary So sánh hàm lượng oxostephanin thu theo giá trị nhóm biến số Kết phân tích phương sai phần mềm R hàm lượng oxostephanin cắn dịch chiết dược liệu Bảng tóm tắt kết so sánh hàm lượng oxostephanin cắn dịch chiết cặp giá trị biến số Giá trị diện tích pic mẫu chuẩn 0,09 mg/ml 36 37 37 39 40 42 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Tên hình ảnh STT Trang Hình 1.1 Hình ảnh loài Stephania dielsiana Y.C Wu Hình 1.2 Cấu trúc hóa học oxostephanin Hình 2.1 Hình 2.2 Hình 2.3 Hình 2.4 Hình 3.1 Hình 3.2 Hình 3.3 Hình 3.4 Vườn trồng thân, Củ dòm xã Tản Lĩnh, Ba Vì, Hà Nội Hệ thống máy sắc ký HPTLC hãng CAMAG Rây sử dụng cho máy xay rây sử dụng cho phân loại kích thước bột Giao diện phần mềm R Kết chồng pic mẫu thử, mẫu chuẩn mẫu trắng Mỗi liên hệ nồng độ diện tích pic mẫu chuẩn (A) mẫu chuẩn (B) Công thức tính trị số R2 Biểu đồ so sánh hàm lượng oxostephanin kích thước dược liệu 16 17 23 28 29 31 36 38 Biểu đồ so sánh hàm lượng oxostephanin cặp Hình 3.5 giá trị biến số nhóm dung môi phương pháp chiết 39 ĐẶT VẤN ĐỀ Bình vôi (Stephania Lour.), chi lớn giới thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae) từ lâu sử dụng phổ biến nhiều thuốc để chữa bệnh đau đầu, ngủ, [11] Củ dòm hay Củ gà ấp (Stephania dielsiana Y.C Wu) loài Bình vôi ghi Sách đỏ Việt Nam [34] Người dân địa phương Ba Vì thường dùng củ, thân để điều trị tê thấp đau nhức, đau dày Oxostephanin alcaloid quan trọng phát loài S dielsiana, [10], [15] Năm 2014, oxostephanin thiết lập chất đối chiếu có độ tinh khiết 99,90% [27] đề xuất phương pháp định tính định lượng [15], [25], [30] Sử dụng phương pháp khảo sát hàm lượng hoạt chất oxostephanin phận dùng khác (củ, thân, lá) loài Củ dòm cho thấy hàm lượng hoạt chất oxostephanin thân (có thể thu hái quanh năm) cao đáng kể so với củ [25], [30] Về tác dụng sinh học, oxostephanin chứng minh có tác dụng ức chế cao 05 dòng tế bào ung thư thử nghiệm: dòng tế bào ung thư buồng trứng (OVCAR8), ung thư cổ tử cung (HeLa), ung thư gan (HepG2), ung thư vú (MDA-MB-231) ung thư cuống phổi phế nang (H358) [16] Những kết cho thấy tiềm phát triển, ứng dụng loài S dielsiana hoạt chất oxostephanin dược học y học Hướng tới ứng dụng phân đoạn giàu oxostephanin để phát triển sản phẩm từ dược liệu Củ dòm thực tiễn sản xuất, cần nghiên cứu điều kiện trình chiết xuất, nhiên qua tham khảo tài liệu nay, có nghiên cứu tối ưu hóa trình chiết xuất alcaloid toàn phần từ củ loài S dielsiana [43], chưa có nghiên cứu quy trình chiết xuất hay đánh giá yếu tố ảnh hưởng tới hàm lượng oxostephanin chiết đối tượng thân loài S dielsiana Từ lý trên, đề tài “Đánh giá số yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất oxostephanin từ thân, củ Dòm (Stephania dielsiana Y.C Wu)” thực với mục tiêu sau: viii gốc cánh hoa tuyến) - 9a (cành non cụm hoa non màu tía, cách hoa màu cam, cụm hoa đực sim tán kép, lưng vỏ có hàng gai) Theo tài liệu [3’]: Khóa phân loại chi Stephania Lour., đường dẫn: 1b 12b-19b-27b-31b-34b-36b => Stephania dielsiana Theo tài liệu [4’]: tên khoa học đầy đủ loài thu hái là: Stephania dielsiana Y.C Wu Theo tài liệu [5’]: tên thường gọi loài Stephania dielsiana là: Củ dòm, tên khác Bình vôi nhựa tím, Cà tòm (dân tộc Tày - Tuyên Quang), Củ gà ấp ix PHỤ LỤC GIAI ĐOẠN XAY VÀ RÂY PHÂN LOẠI BỘT DƯỢC LIỆU * Tóm tắt giai đoạn xay rây phân loại bột dược liệu Tiến hành: Dược liệu đem xay với hai cỡ rây máy xay khác (8 mm mm), sau rây phân loại qua cỡ rây 1400, 710, 355, 250 180 phân đoạn kích thước Phương pháp rây bột: - Rây bột theo thứ tự giảm dần cỡ rây, cố gắng giảm thiểu bay bụi - Đối với rây số 1400, 710, 355: lấy 20 g tới 30 g bột lên rây Lắc rây theo chiều ngang quay tròn 10 phút rây đến thấy (hoặc có ít) tiểu phân lọt xuống qua rây - Đối với rây số 250, 180: tiến hành bột thô, mẫu bột lấy để rây không 10 g lắc rây 30 phút rây tới xong - Trường hợp gặp bít mắt rây trình rây chải cẩn thận mắt rây, tách rời đống tụ lại rây Phân loại bột: Bảng a Ký hiệu phân đoạn bột Ký hiệu Ý nghĩa > 1400 Tiểu phân nằm rây số 1400 710 – 1400 Tiểu phân lọt qua rây 1400 nằm rây số 710 355 – 710 Tiểu phân lọt qua rây 710 nằm rây số 355 250 – 355 Tiểu phân lọt qua rây 355 nằm rây số 250 180 – 250 Tiểu phân lọt qua rây 250 nằm rây số 180 < 180 Tiểu phân nằm rây 180 x * Kết xay rây phân loại bột dược liệu: Kết sau: Bảng b Khối lượng hiệu suất xay, rây dược liệu Khối lượng dược Tổng khối lượng bột thu % hao liệu trước xay (g) (sau rây phân loại) hụt Xay lần (8 mm) 2800,65 2790,36 0,34 Xay lần (3 mm) 850 836,16 1,63 Hình Phân bố kích thước tiểu phân bột dược liệu rây phân loại Bảng c Phân loại kích thước dược liệu theo cỡ rây 1400, 710, 355, 250, 180 Kích thước Xay với rây mm Xay với rây mm >1400 710-1400 355-710 250-355 180-250 50%), phân đoạn bột thô [7] Trong đó, kích thước từ 710-1400 nhiều xay có cỡ rây mm, kích thước 355-710 nhiều xay có cỡ rây mm Cũng dựa theo Bảng c, bột dược liệu toàn phần sau xay với cỡ rây mm bột thô (93,50% phần tử qua rây số 1400, định nghĩa bột thô 95%) hay bột nửa thô, nửa mịn [7] Nhưng xay với mắt rây mm, bột dược liệu sau xay bột thô (96,97% phần tử qua rây số 1400, có 33,52% phần tử qua rây số 355) Do, bột thô, bột nửa thô bột nửa mịn định nghĩa phụ lục 3.5 – Dược điển Việt Nam IV có chồng chéo phân đoạn kích thước loại bột (Bảng d) Trong phân đoạn, đặc biệt bột thô nửa thô, khoảng cách kích thước phần tử rộng (từ 1400 đến 355, tức gấp gần lần kích thước): Bảng d Quy định kích thước bột theo Dược điển [7] Kích thước Loại bột >1400 Bột thô 710-1400 355-710 250-355 180-250 Summary(analysis) dạng quan hệ) cho giá trị R2 > oxo [...]... một dung dịch c a c c chất hòa tan trong dung môi, đư c gọi là dịch chiết [14] 1.3.2 C c y u tố ảnh hưởng tới chất lượng dịch chiết C 3 nhóm y u tố ảnh hưởng đến chất lượng dịch chiết là: - Những y u tố thu c về dư c liệu; - Những y u tố thu c về dung môi; - Những y u tố thu c về kỹ thuật chiết xuất 1.3.2.1 Những y u tố thu c về dư c liệu Chất lượng dư c liệu liên quan tr c tiếp đến chất lượng dịch... lượng oxostephanin trong dư c liệu thân, lá c y C dòm (Stephania dielsiana Y. C Wu) bằng HPTLC khi áp dụng để định lượng oxostephanin trong dịch chiết dư c liệu - Đánh giá ảnh hưởng c a c c y u tố: kích thư c dư c liệu, dung môi và phương pháp chiết xuất, đến quá trình chiết xuất oxostephanin từ thân, lá c y C dòm (Stephania dielsiana Y. C Wu) 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 LOÀI STEPHANIA DIELSIANA Y. C WU... đúng c a phương pháp c thể đư c chấp nhận với khoảng sai số rộng hơn do nền mẫu lớn và quá trình chiết tách ph c tạp, giới hạn RSD c thể dao động từ ± 2,0 % đến ± 10,0 % ho c hơn, tuy nhiên c n c biện giải về giới hạn n y [36] 23 2.3.2 Đánh giá một số y u tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất oxostephanin từ thân, lá c y C dòm (Stephania dielsiana Y. C Wu) 2.3.2.1 Lựa chọn c c y u tố và x y dựng... - Nghiên c u sự ảnh hưởng c a c c y u tố kích thư c dư c liệu, dung môi và phương pháp chiết xuất đến quá trình chiết xuất oxostephanin từ dư c liệu thân, lá c y C dòm (Stephania dielsiana Y. C Wu): o Lựa chọn c c giá trị c a từng biến số, thiết kế mô hình thí nghiệm, tiến hành chiết xuất dư c liệu theo mô hình đã x y dựng o Định lượng oxostephanin thu đư c sau chiết xuất bằng HPTLC theo phương pháp... trình trao đổi chất, chất dự trữ ho c chất thải c a c y C c tạp n y c thể c ho c không c trong dư c liệu, thường g y c n trở cho quá trình chiết xuất [4], [14] 1.3.2.2 Những y u tố thu c về dung môi Độ phân c c của dung môi liên quan đến khả năng hòa tan c c chất, tỉ lệ thuận với hằng số điện môi Độ phân c c dung môi quyết định sự c mặt c a c c thành phần sẽ c trong dịch chiết [5] Nói chung, dung... i 𝑋̅ là giá trị trung bình c c Rf 21 Phương pháp HPTLC đư c coi là c tính đ c hiệu hay chọn l c đối với chất c n phân tích nếu: (i) S c ký đồ c a mẫu thử cho c c vết chính c c ng hình dạng, màu s c, giá trị Rf với c c vết chính trong s c ký đồ c a mẫu chuẩn; (ii) S c ký đồ c a c c mẫu trắng không xuất hiện c c vết tương ứng với c c vết chính trên s c ký đồ c a mẫu chuẩn - Giá trị đề nghị chấp nhận... khuếch tán chất tan vào dịch chiết giảm, thời gian thẩm thấu qua vách giảm làm cho quá trình chiết nhanh hơn Tuy nhiên, c ng chia nhỏ nguyên liệu, tính chọn l c của quá trình c ng giảm, dịch chiết c ng c nhiều tạp chất làm cho lượng cao chiết nhiều lên, thành phần ph c tạp và khó tách c c chất hơn [4] Khu y trộn: bằng c ch khu y trộn sẽ tăng t c độ khuếch tán [14] 14 Phương pháp chiết xuất: - C c phương... r y 2000/355); đối với thân thường làm thành bột nửa mịn (qua r y 355/180) Dựa trên định nghĩa kích thư c bột [7], nhóm nghiên c u lựa chọn c c phân đoạn sau tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng c a kích thư c dư c liệu đến quá trình chiết xuất oxostephanin từ dư c liệu thân, lá c y C dòm (Stephania dielsiana Y. C Wu) (Bảng 2.3): Bảng 2.3 C c kích thư c lựa chọn để nghiên c u đánh giá ảnh hưởng c a kích... hình khảo sát Trong c c y u tố ảnh hưởng đến quy trình chiết xuất (Phần 1.3.2.), c c y u tố sau đ y đư c lựa chọn để khảo sát trong th c nghiệm: 1) Kích thư c dư c liệu; 2) Dung môi chiết xuất; 3) Phương pháp chiết xuất 1) Kích thư c dư c liệu (m c độ chia nhỏ dư c liệu): - C ch tiến hành: o Dư c liệu đư c xay nhỏ bằng m y nghiền bột Hammer Mill Grinder Herb với 2 loại mắt r y kích thư c 8 mm và 3 mm (Hình... không cho chất tan đi qua Do đó, để chiết đư c c c chất tan trong tế bào, phải phá h y chất nguyên sinh bằng c ch làm đông vón bằng nhiệt (s y ho c phơi khô) ho c bằng c n (c n hơi ho c cồn nóng) [14] - Một số tạp chất trong dư c liệu: thường gặp khi chiết xuất dư c liệu: bao gồm pectin, gôm, chất nh y, tinh bột, chất béo, dầu mỡ, sáp, nhựa, enzym, và c c chất hóa h c kh c là c c sản phẩm c a quá trình