BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI MẠC THỊ THANH HUYỀN MSV: 1101228 NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA THÂN RỄ TAM THẤT HOANG (PANAX STIPULEANATUS TSAI & FENG) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI 2016 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI MẠC THỊ THANH HUYỀN MSV: 1101228 NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA THÂN RỄ TAM THẤT HOANG (PANAX STIPULEANATUS TSAI & FENG) Người hướng dẫn: TS Đỗ Thị Hà TS Hà Vân Oanh Nơi thực hiện: Khoa Hóa thực vật – Viện Dƣợc liệu Bộ môn Dƣợc học Cổ truyền Hà Nội – 2016 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên em xin gửi lời cám ơn đến toàn thể Ban Giám hiệu trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội Bộ môn Dƣợc học Cổ truyền tạo điều kiện cho em đƣợc làm khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo trƣờng dìu dắt, giúp đỡ em hoàn thành chƣơng trình học tập suốt năm qua Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tri ân đến TS Đỗ Thị Hà, TS Hà Vân Oanh, ThS Nguyễn Thị Duyên, ngƣời tận tình hƣớng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn đến cán nghiên cứu Khoa Hoá Thực vật – Viện Dƣợc liệu, thầy cô Bộ môn Dƣợc học Cổ truyền – Đại học Dƣợc Hà Nội giúp đỡ em trình thực khóa luận Em xin cảm ơn đề tài thuộc chƣơng trình Tây Bắc: “Ứng dụng giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu tạo sản phẩm từ hai loài thuốc Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai & Feng) vùng Tây Bắc”, 2015-2017, (Chƣơng trình Tây Bắc) tài trợ kinh phí để em thực nội dung nghiên cứu Em xin cảm ơn Trung tâm phƣơng pháp phổ ứng dụng - Viện Hoá học thuộc Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân NMR Cuối em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè ngƣời thân quan tâm, động viên giúp em hoàn thành khóa luận Dù cố gắng, nhƣng lần đầu làm nghiên cứu em khó tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp thầy cô để khoá luận thêm hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 12 tháng năm 2016 Sinh viên Mạc Thị Thanh Huyền MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I TỔNG QUAN .2 1.1 Vài nét chi Panax L 1.1.1 Vị trí phân loại phân bố chi Panax L 1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Panax L 1.1.3 Thành phần hóa học loài thuộc chi Panax L 1.1.4 Tác dụng dược lý số loài chi Panax L 1.2 Tam thất hoang (TTH) 10 1.2.1 Thực vật học .10 1.2.2 Thành phần hóa học 11 1.2.3 Tác dụng dược lý công dụng .13 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu .15 2.2 Hoá chất trang thiết bị .15 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Giám định tên khoa học 17 2.3.2 Nghiên cứu hoá học .17 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 19 3.1 Giám định tên khoa học tam thất hoang 19 3.2 Định tính nhóm chất hữu thƣờng gặp phản ứng hóa học 19 3.2.1 Định tính saponin .19 3.2.2 Định tính alcaloid .20 3.2.3 Định tính glycosid tim 20 3.2.4 Định tính flavonoid 21 3.2.5 Định tính coumarin 21 3.2.6 Định tính tanin 22 3.2.7 Định tính acid hữu .23 3.2.8 Định tính acid amin 23 3.2.9 Định tính đường khử 23 3.2.10 Định tính polysaccharid 23 3.2.11 Định tính chất béo 23 3.2.12 Định tính sterol .24 3.2.13 Định tính caroten 24 3.2.14 Định tính anthranoid 24 3.3 Chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc chất .26 3.3.1 Chiết phân đoạn từ phần mặt đất TTH .26 3.3.2 Kết phân lập tinh chế chất tinh khiết từ phân đoạn n-BuOH 27 3.4 Bàn luận 36 3.4.1 Về đặc điểm thực vật 36 3.4.2 Về hoá học 36 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .39 4.1 Kết luận 39 4.2 Đề xuất 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Giải nghĩa 13 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carbon 13 C-NMR H- NMR Phổ cộng hƣởng từ proton DCM Dicloromethan Glu Glucose Heteronuclear mutiple bond connectivity (phổ HMBC tƣơng tác carbon hydro xa nhau) Heteronuclear single quantum coherence (phổ HSQC tƣơng tác carbon hydro liên kết trực tiếp) IC50 Kl LD50 MeOH Liều ức chế 50 % đối tƣợng thử Khối lƣợng Liều gây chết 50% đối tƣợng thử Methanol n-BuOH n-butanol Rha Rhamnose SKLM Sắc ký lớp mỏng STT Số thứ tự TT Thuốc thử TTH Tam thất hoang UV254 Ánh sáng tử ngoại bƣớc sóng 254 nm UV365 Ánh sáng tử ngoại bƣớc sóng 365 nm Xyl Xylose DANH MỤC CÁC BẢNG STT Bảng 1.1 Bảng 1.2 Tên bảng Phân bố loài thuộc chi Panax L Saponin dẫn chất 20(S)-protopanaxadiol 20(S)protopanaxatriol Trang Bảng 1.3 Saponin khung dammaran khác Bảng 1.4 Saponin dẫn chất ocotillol Bảng 1.5 Saponin dẫn chất acid oleanolic Bảng 1.6 Bảng 1.7 Các polyacetylen tìm thấy số loài thuộc chi Panax L Các hợp chất saponin phân lập đƣợc từ tam thất hoang 12 Kết định tính nhóm chất hữu thƣờng Bảng 3.1 gặp thân rễ tam thất hoang phản ứng 25 hóa học Bảng 3.2 Phổ 1H, (9) [44] 13 C-NMR PS04 chất tham khảo 33 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 1.1 Tam thất hoang 10 Hình 1.2 Saponin dẫn chất acid oleanolic 11 Hình 2.1 Nguyên liệu Panax stipuleanatus Tsai & Feng tƣơi 15 Hình 3.1 Quy trình chiết xuất tam thất hoang 26 Sắc ký đồ cao tổng (T), phân đoạn n-BuOH (n-B), Hình 3.2 dicloromethan (D) n-hexan (n-H) TTH sau 27 nhúng TT H2SO4 10%/ EtOH hơ nóng Hình 3.3 Sắc ký đồ phân đoạn n-BuOH 28 Hình 3.4 Sơ đồ phân lập chất PS04 từ tam thất hoang 30 Hình 3.5 Sắc ký đồ cao n-BuOH, phân đoạn Pđ B chất PS04 31 Hình 3.6 Cấu trúc hóa học hợp chất PS04 35 Hình 3.7 Tƣơng tác carbon hydro xa (HMBC) 36 ĐẶT VẤN ĐỀ Khi nhắc tới thảo dƣợc, ngƣời ta không nhắc tới “Sâm” tác dụng quý Từ “Sâm” ngày không đƣợc dùng để nhân sâm (Panax ginseng) mà đƣợc mở rộng để số loài chi Panax L., họ Nhân sâm (Araliaceae) có tác dụng tƣơng tự nhân sâm, nhƣ sâm Mỹ, sâm tam thất, sâm Nhật, sâm Việt Nam [10] Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai & Feng) loài thuộc chi Panax L đƣợc tìm thấy Việt Nam Đây loài quí có nguy tuyệt chủng cao Việt Nam [3] Loài đƣợc dùng làm thuốc bổ, thuốc cầm máu, tăng cƣờng sinh dục, chống stress [16] Và thị trƣờng có nhầm lẫn loài với số loài khác chi (sâm vũ diệp P bipinnatifidus, sâm Việt Nam P vietnamensis), thực đề tài: “Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học thân rễ Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai & Feng)” để góp phần xây dựng dấu vân tay hóa học cho tam thất hoang, làm sở cho việc phân biệt loài với loài khác Mục tiêu đề tài là: Chiết tách xác định số thành phần hóa học thân rễ tam thất hoang Để đạt đƣợc mục tiêu trên, đề tài thực nội dung sau: Giám định tên khoa học mẫu nghiên cứu Định tính nhóm chất hữu thƣờng gặp mẫu nghiên cứu phản ứng hóa học Chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập đƣợc CHƢƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Vài nét chi Panax L 1.1.1 Vị trí phân loại phân bố chi Panax L Vị trí chi Panax L hệ thống phân loại thực vật Takhtajan (1987) [1]: Giới Thực vật (Planta) Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoa hồng (Rosidae) Bộ Hoa tán (Apiales) Họ Ngũ gia bì (Nhân sâm) (Araliaceae) Chi Panax L Theo trang The Plant list [74] có 12 loài thứ dƣới loài thuộc chi Panax L đƣợc chấp nhận Phân bố 12 loài nhƣ bảng sau: Bảng 1.1 Phân bố loài thuộc chi Panax L [74] STT Loài Phân bố Từ dãy Himalaya đến miền trung Panax bipinnatifidus Seem Trung Quốc, tìm thấy Việt Nam Panax ginseng C.A.Mey Panax japonicus (T.Nees) C.A.Mey Vùng Viễn đông Nga, Hàn Quốc, Đông bắc Trung Quốc Nhật Bản, Hàn Quốc Panax notoginseng (Burkill) Miền nam Trung Quốc số F.H.Chen nơi Việt Nam Panax pseudoginseng Wall Nê-pan Panax quinquefolius L Canada, Mỹ Phụ lục 2.1: Phổ 1H- NMR (tiếp) Phụ lục 2.2: Phổ 13C-NMR Phụ lục 2.2: Phổ 13C-NMR (tiếp) Phụ lục 2.2: Phổ 13C-NMR (tiếp) Phụ lục 2.2: Phổ 13C-NMR (tiếp) Phụ lục 2.3: Phổ HMBC Phụ lục 2.3: Phổ HMBC (tiếp) Phụ lục 2.3: Phổ HMBC (tiếp) Phụ lục 2.3: Phổ HMBC (tiếp) Phụ lục 2.3: Phổ HMBC (tiếp) Phụ lục 2.3: Phổ HMBC (tiếp) Phụ lục 2.4: Phổ HSQC Phụ lục 2.4: Phổ HSQC (tiếp) Phụ lục 2.4: Phổ HSQC (tiếp) Phụ lục 2.4: Phổ HSQC (tiếp) [...]... Dƣợc liệu 2.3.2 Nghiên cứu về hoá học 2.3.2.1 Phương pháp định tính Định tính các nhóm chất hữu cơ thƣờng gặp trong dƣợc liệu theo phƣơng pháp hóa học ghi trong sách Thực tập Dƣợc liệu và Dƣợc liệu học tập 1, trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội [11], [2] 2.3.2.2 Phương pháp tách chiết, phân lập và xác định cấu trúc chất tinh khiết từ tam thất hoang Phƣơng pháp chiết xuất Thân rễ Tam thất hoang đƣợc chiết hồi lƣu... Liên Sơn thuộc tỉnh Lào Cai, Việt Nam [5] 1.2.2 Thành phần hóa học Các kết quả nghiên cứu thành phần hóa học trƣớc đây của tam thất hoang chỉ ra rằng phần thân rễ TTH chứa nhiều saponin khung oleanan (hầu hết đều là saponin dẫn chất acid oleanolic) với hàm lƣợng tƣơng đối cao cùng một số saponin khung dammaran với hàm lƣợng thấp Năm 1985, nhóm các nhà nghiên cứu ở Trung Quốc phân lập 2 saponin dẫn chất... tháo đƣờng, giảm đau chống viêm [10] 1.2 Tam thất hoang (TTH) 1.2.1 Thực vật học Tam thất hoang còn gọi là dã tam thất Tên khoa học: Panax stipuleanatus Tsai & Feng, thuộc họ Ngũ gia bì (Nhân sâm) Araliaceae Tam thất hoang thuộc cây thảo, sống lâu năm, cao 25 – 75 cm; thân rễ mập nằm ngang, có nhiều vết lõm do vết thân để lại, ít phân nhánh Mỗi khóm thƣờng có 1 thân mang lá, ít khi 2-3 Lá kép chân vịt,... NaOH 10% Không thấy xuất hiện màu hồng Nhận xét: Dƣợc liệu không có anthranoid Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ thƣờng gặp trong thân rễ của Tam thất hoang bằng phản ứng hóa học đƣợc tóm tắt trong bảng 3.1 25 Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ thƣờng gặp trong thân rễ Tam thất hoang bằng phản ứng hóa học TT Nhóm chất Phản ứng Phản ứng tạo bọt 1 2 Saponin Alcaloid 4 5 6 Glycosid tim Flavonoid... [22]  Công dụng Tam thất hoang có tác dụng tán ứ Sách đỏ Việt Nam, 2007 ghi “tất cả các bộ phận của cây đều có công dụng làm thuốc; thân rễ thƣờng đƣợc dùng làm thuốc bổ, cầm máu, tăng cƣờng sinh dục, chống stress Lá, nụ hoa dùng làm trà uống có tác dụng kích thích tiêu hóa, an thần” [16] 15 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu Mẫu nghiên cứu là thân rễ TTH thu hái... ethanol Phƣơng pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc dựa trên các thông số vật lý và các phƣơng pháp phổ bao gồm: phổ cộng hƣởng từ hạt nhân, tham khảo cơ sở dữ liệu phổ của các tài liệu đã công bố để biện giải cấu trúc chất phân lập đƣợc 19 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 3.1 Giám định tên khoa học tam thất hoang Tam thất hoang đƣợc thu hái... và R2, từ dịch chiết methanol của thân rễ TTH [52] COOR2 R1O OR Hình 1.2 Saponin dẫn chất acid oleanolic Năm 2002, trên cơ sở phân tích bằng HPLC-MS/MS, nhóm nghiên cứu ở Đại học Toyama (Nhật Bản) phát hiện thêm thành phần saponin khung dammaran gồm các ginsenosid Rb1, Rc, Rb3 và Rd với hàm lƣợng nhỏ từ dich chiết ethanol của TTH đƣợc thu hái ở Trung Quốc [36] Năm 2010, nhóm nghiên cứu của Chun L đã... trong thân rễ tam thất hoang có chứa các nhóm chất: saponin, acid amin, acid hữu cơ, đƣờng khử, polysaccharid; không thấy sự có mặt các nhóm chất: alcaloid, glycoside tim, flavonoid, coumarin, sterol, chất béo, caroten, tanin, anthranoid 3.3 Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc chất 3.3.1 Chiết các phân đoạn từ phần dưới mặt đất TTH Thân rễ TTH rửa sạch, thái lát mỏng, phơi khô, cân 1 kg, rồi chiết. .. hình cầu có khi hơi dẹt, hạt dẹt, có nội nhũ mịn [62] 1.1.3 Thành phần hóa học chính của các loài thuộc chi Panax L 1.1.3.1 Hợp chất saponin Saponin đƣợc xem là thành phần hoạt chất chính trong các loài thuộc chi Panax L Các nhà khoa học đã chiết tách và xác định cấu trúc gần 300 saponin từ các loài thuộc chi này [67], gồm các saponin dẫn chất của 20 4 (S)-protopanaxadiol và 20 (S)-protopanaxatriol, saponin... sát sơ bộ các nhóm chất hóa học có trong thân rễ TTH - Tiến hành: Định tính các nhóm chất thƣờng gặp trong dƣợc liệu theo phƣơng pháp hóa học ghi trong sách Thực tập dƣợc liệu và Dƣợc liệu học tập 1, trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội 3.2.1 Định tính saponin Hiện tượng tạo bọt: Cho vào ống nghiệm 1g dƣợc liệu và 5ml EtOH 70% đặt trên nồi cách thủy trong 10 phút, lọc nóng đƣợc dịch chiết EtOH Lấy 1 ml dịch