BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐẶNG THỊ HUYỀN TRANG MÃ SINH VIÊN: 1101527 NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ CAO TỪ DƯỢC LIỆU ĐỊA HOÀNG DI THỰC TRỒNG TẠI HUYỆN QUẢN BẠ, HÀ GIANG VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG HÀ NỘI – 2016 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐẶNG THỊ HUYỀN TRANG MÃ SINH VIÊN: 1101527 NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ CAO TỪ VỊ THUỐC SINH ĐỊA DI THỰC TRỒNG TẠI HUYỆN QUẢN BẠ, HÀ GIANG VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ Người hướng dẫn : TS Bùi Hồng Cường Nơi thực : Bộ môn Dược học cổ truyền Công ty CPPT Dược liệu Anvy Hà Giang HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN Với kính trọng lòng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Bùi Hồng Cường – người trực tiếp hướng dẫn, bảo truyền đạt kinh nghiệm quý báu động viên, hỗ trợ mặt từ bước hoàn thiện khóa luận Tôi xin chân thành cảm ơn DS Nguyễn Thị Hương Thảo Công ty CPPT Dược liệu Anvy Hà Giang nhiệt tình giúp đỡ thời gian làm thực nghiệm nghiên cứu đề tài Tôi xin trân trọng cảm ơn toàn thể Thầy Cô giáo anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược học cổ truyền, Bộ môn Thực vật, Bộ môn Dược liệu - Trường đại học Dược Hà Nội hỗ trợ kịp thời tạo điều kiện cho trình học tập, nghiên cứu môn Nhân dịp xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu toàn thể các Thầy Cô giáo Trường đại học Dược Hà Nội dạy dỗ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian học tập trường Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình và các bạn động viên, khích lệ nhắc nhở, sát cánh bên tôi, động lực lớn giúp vượt qua khó khăn Do thời gian làm thực nghiệm kiến thức thân có hạn, khóa luận còn có nhiều thiếu sót Tôi mong nhận góp ý thầy cô, bạn bè để khóa luận hoàn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 12 tháng năm 2016 Sinh viên Đặng Thị Huyền Trang MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan thực vật 1.1.1 Vị trí phân loại Địa hoàng 1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.3 Nguồn gốc phân bố 1.1.4 Trồng trọt 1.1.5 Bộ phận dùng 1.2 Tổng quan thành phần hóa học 1.2.1 Iridoid glycosid .3 1.2.2 Glycosid khác 1.2.3 Saccharid 1.2.4 Amino acid yếu tố vi lượng 1.2.5 Acid vô 1.2.6 Ester acid béo 1.3 Tổng quan tác dụng sinh học 1.3.1 Tác dụng cầm máu 1.3.2 Tác động lên trình đông máu 1.3.3 Tác động hệ tạo máu tủy xương 1.3.4 Tác dụng chống khối u 1.3.5 Trên hệ thống miễn dịch 1.3.6 Tác dụng tim mạch 1.3.7 Tác dụng hệ thần kinh trung ương 1.3.8 Tác dụng hệ tạo xương 1.3.9 Tác động hệ nội tiết chuyển hóa đường glucose 1.3.10 Tác dụng chống oxi hóa, chống lão hóa 1.3.11 Tác dụng ức chế tiết acid dịch vị chống viêm loét dày 10 1.3.12 Tác dụng thận .10 1.3.13 Bảo vệ gan 10 1.3.14 Tác dụng vi trùng 11 1.3.15 Tác động da 11 1.3.16 Tác dụng chống dị ứng 11 1.4 Tác dụng công dụng theo Y học cổ truyền .11 1.4.1 Tính vị, quy kinh 11 1.4.2 Công - Chủ trị 11 1.4.3 Thận trọng .12 1.4.4 Tác dụng không mong muốn 12 1.4.5 Liều dùng 12 1.4.6 Bài thuốc có Địa hoàng 12 1.5 Tổng quan cao đặc 13 1.5.1 Định nghĩa .13 1.5.2 Phương pháp điều chế cao đặc 13 1.5.3 Yêu cầu chất lượng với cao đặc 14 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 15 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ dùng cho nghiên cứu 16 2.1.3 Hóa chất, thuốc thử .16 2.2 Nội dung nghiên cứu 17 2.2.1 Đánh giá chất lượng dược liệu đưa vào nghiên cứu 17 2.2.2 Xây dựng quy trình bào chế cao 17 2.2.3 Khảo sát số tiêu đề xuất xây dựng tiêu chuẩn cao 17 2.3 Phương pháp nghiên cứu .18 2.3.1 Đánh giá chất lượng dược liệu 18 2.3.2 Bào chế cao đặc 19 2.3.3 Khảo sát số tiêu đề xuất xây dựng tiêu chuẩn cao 20 Chương THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ 21 3.1 Đánh giá chất lượng dược liệu 21 3.1.1 Mô tả dược liệu .21 3.1.2 Vi phẫu 21 3.1.3 Soi bột 23 3.1.4 Định tính .24 3.1.5 Độ ẩm 28 3.1.6 Tro toàn phần 28 3.1.7 Tro không tan acid .28 3.1.8 Tạp chất .28 3.1.9 Kim loại nặng 28 3.1.10 Chất chiết dược liệu 29 3.1.11 Định lượng catalpol, acteosid 29 3.2 Bào chế cao đặc 31 3.3 Khảo sát số tiêu chất lượng đề xuất xây dựng tiêu chuẩn cao 32 3.3.1 Cảm quan: thể chất, màu sắc, mùi vị .32 3.3.2 Độ ẩm 32 3.3.3 Định tính .33 3.3.4 Định lượng catalpol acteosid 37 3.3.5 Hiệu suất chiết catalpol acteosid 38 BÀN LUẬN 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT ALT Alanin aminotransferase AST Aspartat aminotransferase CN Cao đặc Địa hoàng chiết nước CPPT Cổ phần phát triển CTY Mẫu Địa hoàng Công ty Anvy trồng ĐC Mẫu Địa hoàng chuẩn DD Dung dịch DĐTQ 2010 Dược điển Trung Quốc 2010 DĐVN IV Dược điển Việt Nam IV Et30 Cao đặc Địa hoàng chiết ethanol 30o Et50 Cao đặc Địa hoàng chiết ethanol 50o Et70 Cao đặc Địa hoàng chiết ethanol 70o GACP Thực hành tốt trồng trọt thu hái thuốc (Good Agriculture and Collection Practice) HPLC Sắc kí lỏng hiệu cao (High-performance Liquid Chromatography) SKLM Sắc kí lớp mỏng TCCS Tiêu chuẩn sở TTR Mẫu Địa hoàng Trung Quốc DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Kết phân tích sắc kí đồ dịch chiết Địa hoàng sau phun thuốc thử bước sóng 366 nm 27 Bảng 3.2 Kết đinh lượng catalpol mẫu dược liệu công ty 30 Bảng 3.3 Kết đinh lượng acteosid mẫu dược liệu công ty 31 Bảng 3.4 Hiệu suất bào chế cao .32 Bảng 3.5 Độ ẩm cao đặc 33 Bảng 3.6 Kết phản ứng mẫu cao với thuốc thử Fehling .34 Bảng 3.7 Kết phân tích sắc kí đồ mẫu cao Địa hoàng sau phun thuốc thử bước sóng 366 nm 36 Bảng 3.8 Hàm lượng catalpol Hc (%) acteosid H’c (%) mẫu cao 38 Bảng 3.9 Hiệu suất chiết catalpol acteosid 39 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 2.1 Địa hoàng công ty trồng Hình 2.2 Mẫu công ty cung cấp 15 Hình 2.3 Mẫu Địa hoàng chuẩn Hình 2.4 Mẫu Địa hoàng Trung Quốc 15 Hình 2.5 Hệ thống sắc kí hiệu cao Linomat 16 Hình 2.6 Thông số quy trình chiết 19 Hình 3.1 Mẫu địa hoàng công ty sây khô 21 Hình 3.2 Vi phẫu rễ củ Địa hoàng 22 Hình 3.3 Vi phẫu chi tiết rễ củ Địa hoàng .23 Hình 3.4 Một số đặc điểm vi học bột Địa hoàng .24 Hình 3.5 Hình ảnh trước (T) sau (S) phản ứng dược liệu với thuốc thử Fehling .24 Hình 3.6 Sắc kí đồ dịch chiết dược liệu sau phun thuốc thử quan sát ánh sáng trắng (Hình A), 254 nm (Hình B) 366 nm (Hình C) 26 Hình 3.7 Hình ảnh trước (T) sau (S) phản ứng mẫu cao đăc với thuốc thử Fehling 33 Hình 3.8 Sắc kí đồ dịch chiết mẫu cao sau phun thuốc thử quan sát ánh sáng trắng (Hình A) 254 nm (Hình B) 34 Hình 3.9 Sắc kí đồ dịch chiết mẫu cao sau phun thuốc thử quan sát bước sóng 366 nm 35 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong y học cổ truyền, Địa hoàng (Rhemannia glutinosa (Gaertn.) Libosch) dược liệu quý Từ rễ củ Địa hoàng chế biến Sinh địa Thục địa [20] Sinh địa vị đắng, tính lạnh, tác dụng nhiệt lương huyết, sinh tân khát Thục địa vị ngọt, tính ấm, tác dụng tư âm dưỡng huyết [11] Nhiều nghiên cứu chứng minh Địa hoàng hợp chất phân lập từ Địa hoàng (catalpol, acetosid,…) có tác dụng hạ đường huyết, lợi tiểu, chống khối u,…[57] Với công dụng tuyệt vời thế, từ xa xưa Địa hoàng sử dụng phổ biến nhiều thuốc Tuy nhiên, xã hội phát triển, yêu cầu sản phẩm tốt, tiện dụng, việc sử dụng thuốc thang nhiều bất tiện: khó bảo quản, chế biến lâu, uống nhiều, khó kiểm soát tác dụng Nắm bắt xu ấy, nhiều công ty Dược định hướng nghiên cứu phát triển Dược liệu cổ truyền kết hợp với bào chế đại, có Công ty CPPT Dược liệu Anvy Hà Giang Cụ thể dược liệu Địa hoàng, công ty trồng thực nghiệm giống di thực từ Trung Quốc Hà Giang theo quy trình GACP Với tiềm nguồn Địa hoàng tự cung này, để đảm bảo bước phát triển tiếp theo, câu hỏi đặt dược liệu có đảm bảo chất lượng không bào chế để sản phẩm thành công tới tay người tiêu dùng Để trả lời câu hỏi trên, đề tài “Nghiên cứu điều chế cao từ dược liệu Địa hoàng di thực Quản Bạ, Hà Giang khảo sát số tiêu chất lượng” thực với mục tiêu: - Đánh giá chất lượng dược liệu Địa hoàng Công ty CPPT dược liệu Anvy Hà Giang trồng Hà Giang - Bào chế cao đặc Địa hoàng phương pháp chiết nóng với dung môi nước ethanol - Khảo sát số tiêu chất lượng đề xuất xây dựng tiêu chuẩn cao PHỤ LỤC Phụ lục Tổng kết kết đánh giá dược liệu Tiêu Chỉ tiêu Yêu cầu Kết NX DĐVN Mô tả Củ khô, hình dạng không Hình 3.1 Đạt IV hình thuôn, khoảng phình to, Lớp bần gồm nhiều hàng tế bào hình Hình 3.2 Đạt chữ nhật Mô mềm bao gồm tế Hình 3.3 chuẩn hai đầu nhỏ, dài cm đến 12 cm, đường kính cm đến cm Loại củ nhỏ hình dải, dẹt, cong queo xoắn lại, mặt màu nâu đen nâu xám, nhăn nheo nhiều, có đường vân lượn cong nằm ngang không Củ nặng, chất tương đối mềm, dai, khó bẻ gãy Mặt bẻ màu nâu đen đen bóng, dính, mùi thơm nhẹ, vị Vi phẫu bào thành mỏng, tế bào tiết với chất tiết màu hồng Trong libe có tế bào tiết gặp Libe – gỗ cấp phát triển Mạch rây gần tầng sinh libe – gỗ Tầng sinh libe – gỗ xếp thành vòng liên tục Gỗ cấp chạy vào đến tâm, gồm bó gỗ thưa phân cách tia ruột rộng, gồm nhiều hàng tế bào Soi bột Bột màu nâu thẫm, mảnh bần màu Hình 3.4 Đạt nâu nhạt, nhìn từ mặt bên gồm tế bào hình chữ nhật xếp đặn, tế bào mô mềm gần tròn, tế bào tiết chứa giọt dầu màu vàng cam hay đỏ cam, mạch mạng đường kính tới 92 m Định tính Xuất tủa màu đỏ gạch Xuất phản kết tủa ứng hóa học đỏ gạch Định tính Sắc ký đồ dung dịch thử phải có Mục sắc kí vết có màu sắc Rf với 3.1.4.2 lớp mỏng vết sắc ký đồ dung dịch Đúng Đạt đối chiếu Độ ẩm 11,5% Đạt Tro toàn phần Không 5,0% 3,6% Đạt Tro không tan 0,3% Không 16,0% acid Tạp chất Không 2,0% Kim loại 0,0% Đạt Không 20 ppm Chất chiết 86,1% dược liệu DĐTQ Định lượng 2010 catalpol Định lượng acteosid ≥ 0,2 2,1% Đạt ≥ 0,02 0,03% Đạt Phụ lục Khối lượng dược liệu đem chiết mDL khối luợng cao đặc thu mcao (g) Mẻ CN Et30 Et50 Et70 mDL 105,73 50,10 50,32 102,52 mcao 75,08 38,21 36,15 73,15 mDL 107,20 50,28 51,21 104,95 mcao 81,5 38,01 39,28 73,48 mDL 106,16 51,21 50,10 101,61 mcao 83,38 39,04 37,08 71,58 Phụ lục Các thông số mẫu chuẩn catalpol, acteosid định lượng dược liệu Mẫu Catalpol chuẩn Acteosid chuẩn Lần mt Nồng độ (mg) (mg/ml) 5,1 0,05 Sc 187 187,5 188 187,2 188 185,8 4,9 0,01 Độ lêch chuẩn- SD Sc (trung bình) 139,8 139,2 139,2 139,5 139,9 140,1 187,3 0,82 139,6 0,3 Phụ lục Các thông số chất chuẩn catalpol chuẩn, acteosid định lượng cao Mẫu Lần mt (mg) Nồng độ(mg/ml) Sc Sc (trung bình) ± SD Catalpol 2,6 0,052 150,1 149,8 ± 0,63 chuẩn 150,7 149,3 149,7 149,8 148,9 Acteosid 5,1 0,01 418,4 chuẩn 419,1 418,4 417,9 417,9 417,9 418,3 ± 0,48 Phụ lục Kết đinh lượng catalpol, acteosid mẫu dược liệu công ty Mẫu thử Mẫu thử Mẫu thử mt* (mg) 744,7 754 761,8 Diện tích pic catalpol mẫu thử St 1185,1 1227 1211,5 2,1 2,2 2,1 m’t * (mg) 744,7 754 761,8 Diện tích píc acteosid mẫu thử S’t 141,2 151,8 112,3 ̅̅̅̅ (%) Hàm lượng Verbascoside – 𝐻′𝑐 0,03 0,04 0,03 ̅̅̅̅ (%) Hàm lượng Catalpol - 𝐻𝑐 Ghi chú: *: khối lượng dược liệu tính theo khối lượng khô Phụ lục Kết đinh lượng catalpol acteosid mẫu cao Catalpol Acteosid Mẫu mt * St Hc ̅ ± SD H m’t * CN1 964,3 1257,8 2,3 2,1 ± 0,2 499,8 CN2 1064 1281,6 2,1 515,2 CN3 959,4 1097,5 500,5 Et30(1) 978,2 1488,4 2,6 Et30(2) 966,3 1502,5 Et30(3) 989 H’c 190,1 0,02 169 200,9 0,03 2,7 476,3 212,5 0,03 1510,6 2,7 470,9 199,6 0,03 Et50(1) 1135,2 1839,5 2,8 588,6 275,4 0,03 Et50(2) 1205,5 1766,5 2,5 571,4 234,1 0,02 1635 2,8 494,4 203,8 0,02 Et70(1) 1456,4 2207,2 2,6 584,3 266,4 0,03 Et70(2) 998,4 1607,3 2,8 589,6 291,6 0,03 Et70(3) 991,8 1581,8 2,8 550,2 265,5 0,03 999,8 2,7 ± 0,2 2,7 ± 0,1 Ghi chú: *: khối lượng cao tính theo khối lượng khô ̅ ± SD H 0,02 ±0,00 0,02 475,5 Et50(3) 2,7 ± 0,1 St’ 0,03 ± 0,00 0,03 ± 0,00 0,03 ± 0,00 Phụ lục Sắc kí đồ mẫu dược liệu Địa hoàng quan sát ánh sáng trắng, 254 nm 366 nm Phụ lục Sắc kí mẫu cao quan sát ánh sáng trắng, 254 nm 366 nm Phụ lục Thông số pic HPLC Phụ lục 9.1 Định lượng mẫu chuẩn catalpol (phần định lượng cao) Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU * s) 8,0 149,8 Phụ lục 9.2 Định lượng catalpol mẫu cao nước (1) Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU * s) 8,0 1257,8 Phụ lục 9.3 Định lượng catalpol mẫu cao ethanol 30% (1) Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU * s) 7,9 1488,4 Phụ lục 9.4 Định lượng catalpol mẫu cao ethanol 50% (1) Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU * s) 7,9 1839,5 Phụ lục 9.5 Định lượng catalpol mẫu cao ethanol 70% (1) Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU * s) 7,8 2207,2 Phụ lục 9.6 Định lượng mẫu chuẩn acteosid (phần định lượng cao) Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU * s) 7,1 418,4 Phụ lục 9.7 Định lượng acteosid mẫu cao nước (3) Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU * s) 7,1 169,0 Phụ lục 9.8 Định lượng acteosid mẫu cao ethanol 30% (1) Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU * s) 7,2 200,9 Phụ lục 9.9 Định lượng acteosid mẫu cao ethanol 50% (1) Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU * s) 7,2 275,4 Phụ lục 9.10 Định lượng acteosid mẫu cao ethanol 70% (1) Thời gian lưu (phút) 7,1 266,4 Phụ lục 9.11 Định lượng mẫu chuẩn catalpol (phần định lượng dược liệu) Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU * s) 8,5 188,0 Phụ lục 9.12 Định lượng catalpol dược liệu (2) Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU * s) 8,4 1227,0 Phụ lục 9.13 Định lượng mẫu chuẩn acteosid (phần định lượng dược liệu) Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU * s) 17,1 139,9 Phụ lục 9.14 Định lượng acteosid dược liệu (2) Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU * s) 17,0 151,8 Phụ lục 10: Đề xuất xây dựng Tiêu chuẩn sở cho dược liệu Địa hoàng Chỉ tiêu Phương pháp đánh giá Yêu cầu Mô tả Cảm quan Tương tự chuyên luận Vi phẫu Thử theo DĐVN IV, phụ lục 12.18 riêng Địa hoàng, DĐVN Soi bột Thử theo DĐVN IV, phụ lục 12.18 IV Định tính Thử theo DĐVN IV, chuyên luận riêng PƯHH Địa hoàng Định tính Theo DĐVN IV, chuyên luận riêng Địa Trên sắc ký đồ dung SKLM hoàng với thay đổi: - Thêm chất chuẩn catalpol, pha màu giá trị Rf thành dung dịch khoảng với vết sắc ký đồ 0,5 mg /ml dược liệu đối chiếu, - Lượng dịch phun: 2µl phải có vết - Hiện màu: thuốc thử vanillin- giá trị Rf màu sắc với vết Độ ẩm dịch thử phải có vết acid sulfuric sắc ký đồ dung dịch Bước sóng quan sát: 366 nm catalpol chuẩn DĐVN IV, phụ lục 9.6, phương pháp Không 14% xác định khối lượng làm khô Tro toàn Thử theo DĐVN IV, phụ lục 9.8, Không 5% phương pháp phần Tro tan không Thử theo DĐVN IV, phụ lục 9.7, Không 1% phương pháp acid Thử theo DĐVN IV, phụ lục 12.11 Tạp chất Kim loại Thử theo DĐVN IV, phụ lục 9.4.8, Không 20 ppm phương pháp nặng Chất Không 1% chiết DĐVN IV, phụ lục 12.10, phương pháp Không 65,0% /dược liệu ngâm lạnh, dung môi nước Hàm lượng Theo mục 3.1.11.1 Không 1,5% catalpol Hàm lượng Theo mục 3.1.11.2 Không 0,02% acteosid Phụ lục 11 Đề xuất xây dựng số tiêu chuẩn cao đặc Địa hoàng Tiêu chuẩn Phương pháp Yêu cầu Hình thức, Cảm quan Thể chất mềm dẻo, đặc quánh, mịn, đồng Màu nâu đen bóng, mùi thơm đặc mùi vị trưng, vị Độ ẩm DĐVN IV, phụ lục 9.6, Dưới 20% Định tính Theo mục 3.1.4 Thể phép thử định tính Địa hoàng Kim loại Thử theo DĐVN IV, phụ Không 20 ppm nặng lục 9.4.8, phương pháp Giới hạn Thử theo DĐVN IV, phụ Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được: nhiễm lục 13.6 khuẩn không 104 g Tổng số Enterobacteria: không 500 g Nấm mốc: không 100 g Không có Salmonella 10 g Không có: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus Hàm lượng Theo mục 3.3.4.1 Không 2,0 % catalpol Hàm lượng Theo mục 3.3.4.2 acteosid Không 0,02 %