B Y T TR NG I HC DC H NI DON TH TH HNG GIANG Mó sinh viờn: 1101119 KHO O ST NH HNG THU C LấN CYP3A4 THễNG QUA NH NH L LNG NIFEDIPIN BNG B HPLC KHểA LU LUN TT NGHIP DC S H NI 2016 B Y T TRNG I HC DC H NI DON TH HNG GIANG Mó sinh viờn: 1101119 KHO ST NH HNG THUC LấN CYP3A4 THễNG QUA NH LNG NIFEDIPIN BNG HPLC KHểA LUN TT NGHIP DC S Ngi hng dn: PGS.TS Phm Th Thanh H ThS V Ngõn Bỡnh Ni thc hin: B mụn Húa phõn tớch - c cht H NI - 2016 LI CM N Li u tiờn, em xin by t lũng kớnh trng v bit n sõu sc nht ti hai ngi thy ca em l PGS TS Phm Th Thanh H v ThS V Ngõn Bỡnh ging viờn b mụn Húa phõn tớch c cht trng i hc Dc H Ni, nhng ngi thy ó nhit tỡnh ch bo, ng viờn v giỳp em rt nhiu sut quỏ trỡnh thc hin v hon thnh khúa lun tt nghip Em cng xin chõn thnh cm n cỏc thy, cụ v cỏc anh ch k thut viờn ca b mụn Húa phõn tớch c cht trng i hc Dc H Ni ó to iu kin tt nht cho em quỏ trỡnh hc v nghiờn cu khoa hc ti b mụn Em cng xin gi li cm n n cỏc thy cụ Ban giỏm hiu, phũng o to cựng ton th thy cụ cỏc b mụn v cỏn b cỏc phũng ban trng i hc Dc H Ni ó trang b cho em nhng kin thc khoa hc nn tng thi gian hc di mỏi trng Cui cựng, li cm n thõn thng nht em mun gi n gia ỡnh, bn bố ó luụn bờn ng viờn v giỳp em Em xin chõn thnh cm n! H Ni, ngy 10 thỏng 05 nm 2016 Sinh viờn Doón Th Hng Giang MC LC DANH MC CC Kí HIU V CC T VIT TT DANH MC CC BNG DANH MC CC HèNH T VN Chng TNG QUAN 1.1 TNG QUAN V CHUYN HểA THUC 1.1.1 Nguyờn lý ca chuyn húa thuc 1.1.2 Vi nột v Cytochrom P450 1.1.3 CYP3A4 v s tng tỏc thuc qua CYP3A4 1.1.4 ng hc enzym 1.2 TNG QUAN V NIFEDIPIN 1.2.1 Cụng thc cu to 1.2.2 Tớnh cht lý húa 1.2.3 Dc lý v c ch tỏc dng 1.2.4 Dc ng hc 1.2.5 Cỏc nghiờn cu in vitro s dng nifedipin lm c cht ỏnh giỏ nh hng ca thuc lờn CYP3A4 10 1.3 TNG QUAN V GLYCYL FUNTUMIN 11 1.3.1 Cụng thc cu to 11 1.3.2 Tớnh cht lý húa: 11 1.3.3 Tỏc dng dc lý 12 1.3.4 Ch nh v liu dựng: 12 1.3.5 Cỏc nghiờn cu dc ng hc ca glycyl funtumin 12 Chng I TNG V PHNG PHP NGHIấN CU 15 2.1 NGUYấN VT LIU V THIT B 15 2.1.1 i tng nghiờn cu 15 2.1.2 Nguyờn liu, thit b 15 2.2 NI DUNG NGHIấN CU 16 2.3 PHNG PHP NGHIấN CU 17 2.3.1 Chun b cỏc mu chy sc ký 17 2.3.2 Kho sỏt v xỏc nh iu kin sc ký 17 2.3.3 Thm nh phng phỏp 17 2.3.4 ng dng chng trỡnh sc ký ó la chn kho sỏt nh hng ca glycyl funtumin lờn enzym CYP3A4 thụng qua nh lng nifedipin 17 2.3.5 Phng phỏp x lý kt qu 18 Chng THC NGHIM, KT QU V BN LUN 19 3.1 CHUN B CC MU CHY SC Kí 19 3.1.1 La chn dung mụi pha mu 19 3.1.2 Chun b cỏc dung dch lm vic 19 3.2 THM NH LI PHNG PHP NH LNG NIFEDIPIN BNG PHNG PHP HPLC 21 3.2.1 La chn ct sc ký 21 3.2.2 La chn tc dũng 25 3.3 THM NH PHNG PHP PHN TCH 28 3.3.1 phự hp ca h thng 28 3.3.2 c hiu 28 3.3.3 tuyn tớnh 30 3.3.4 Gii hn phỏt hin v gii hn nh lng 31 3.3.5 ỳng, lp li 32 3.4 KHO ST NH HNG CA GLYCYL FUNTUMIN LấN CYP3A4 THễNG QUA C CHT NIFEDIPIN 33 3.4.1 Xỏc nh thi gian phn ng 33 3.4.2 Kho sỏt li cỏc thụng s chuyn húa ca nifedipin qua CYP3A4 34 3.4.3 Phn ng ỏnh giỏ nh hng ca glycyl funtumin lờn CYP3A4 36 3.5 BN LUN 40 KT LUN V XUT 42 TI LIU THAM KHO DANH MC CC Kí HIU V CC T VIT TT Ch vit tt Ch y ACN Acetonitril AMA Dung dch amoni acetat CYP3A4 Cytochrom P450, family 3, subfamily A, polypeptid DAD Detector mng diod (Diode Array Detector) DNIF Dehydronifedipin [E] Nng mol ca phõn t enzym FDA Cc Qun lý dc phm v thc phm M (The United States Food and Drug Administration) GF Glycyl Funtumin HPLC Sc ký lng hiu nng cao (High Performance Liquid Chromatography) LC MS/MS Sc ký lng ph hai ln (Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry) LC UV Sc ký lng vi detector hp th bc x t ngoi (Liquid Chromatography with Ultraviolet Detection) LOD Gii hn phỏt hin (Limit of Detection) LOQ Gii hn nh lng (Limit of Quantification) MeOH Methanol NADPH -nicotinamid adenin dinucleotid-2-phosphat kh NIF Nifedipin NXB Nh xut bn RS phõn gii RSD% lch chun tng i (Relative Standard Deviation) [S] Nng mol ca phõn t c cht SF H s i xng (Symmetry Factor) SD lch chun (Standard Deviation) S/N T l tớn hiu/nhiu ng nn (Signal/Noise) Spic Din tớch pic STT S th t TEA Triethylamin TB Giỏ tr trung bỡnh TLTK Ti liu tham kho UV Bc x t ngoi (Ultraviolet) DANH MC CC BNG STT Bng Tờn bng Bng 1.1 Bng 1.2 Bng 1.3 Bng 3.1 Cỏch pha cỏc dung dch chun lm vic NIF 20 Bng 3.2 Kt qu kho sỏt phự hp ca h thng sc ký 28 Bng 3.3 Cỏch pha dóy chun NIF 30 Bng 3.4 Kt qu kho sỏt khong tuyn tớnh ca NIF 30 Bng 3.5 Kt qu xỏc nh t s S/N 32 Bng 3.6 Kt qu ỳng, lp li ca NIF 32 10 Bng 3.7 11 Bng 3.8 12 Bng 3.9 Mt s nghiờn cu tng tỏc thuc in vivo qua CYP3A4 Mt s nghiờn cu tng tỏc thuc in vitro qua CYP3A4 Mt s nghiờn cu in vitro ỏnh giỏ nh hng ca thuc lờn CYP3A4 thụng qua tc chuyn húa NIF Kt qu din tớch pic ca NIF v DNIF theo thi gian phn ng Kt qu xỏc nh tc chuyn húa NIF qua CYP3A4 Kt qu tc chuyn húa NIF qua CYP3A4 dóy phn ng Trang 5 10 33 35 38 DANH MC CC HèNH STT Hỡnh Ni dung Hỡnh 1.1 th phng trỡnh Michaelis Menten Hỡnh 1.2 th phng trỡnh Lineweaver Burk Hỡnh 1.3 Hỡnh 1.4 Cụng thc cu to ca nifedipin Hỡnh 1.5 S chuyn húa, thi tr ca nifedipin 10 Hỡnh 1.6 Cụng thc cu to ca Glycyl Funtumin Hydroclorid 11 Cỏc kiu c ch enzym c bn: cnh tranh (a), khụng cnh tranh (b), phi cnh tranh (c), hn (d) Trang Sc ký ca NIF trờn ct Zorbax C18 tc Hỡnh 3.1 dũng 1,2 ml/phỳt (a);1,0 ml/phỳt (b); 0,5 ml/phỳt (c); 22 0,3 ml/phỳt (d) Hỡnh 3.2 Sc ký ca NIF trờn ct Eclipse XDB C18 23 Sc ký ca dung dch NIF trờn ct Eclipse XDB Hỡnh 3.3 C18 vi t l pha ng (45 : 18 : 37) (a); (42 : 18 : 40) (b); (32 : 18 : 50) (c); (52 : 18 : 30) (d) tc 24 dũng 1,0 ml/phỳt Sc ký ca dung dch NIF trờn ct Apollo C18 5u Hỡnh 3.4 10 Hỡnh 3.5 11 Hỡnh 3.6 12 Hỡnh 3.7 13 Hỡnh 3.8 14 Hỡnh 3.9 Xỏc nh LOD, LOQ bng cỏch tớnh S/N 31 15 Hỡnh 3.10 th din tớch pic ca NIF v DNIF theo thi gian 34 vi tc dũng 1,0 ml/phỳt Sc ký ca dung dch NIF vi tc dũng 1,0 ml/phỳt (a); 0,8 ml/phỳt (b); 0,5 ml/phỳt (c) Sc ký ca dung dch NIF kho sỏt Sc ký ca mu trng (a), mu nn (b), mu chun n (c), mu phn ng (d) th biu din s ph thuc gia nng v din tớch pic ca NIF 25 26 27 29 31 phn ng 16 Hỡnh 3.11 17 Hỡnh 3.12 18 Hỡnh 3.13 19 Hỡnh 3.14 th Michaelis Menten chuyn húa NIF qua CYP3A4 th phng trỡnh Lineweaver Burk xỏc nh Km v Vmax ca NIF th mụ t nh hng ca GF lờn chuyn húa NIF qua CYP3A4 th biu din tc to thnh DNIF dóy phn ng 35 36 39 39 Din tớch pic (mAU.s) 34 600 500 400 300 200 100 Thi gian phn ng 50 100 150 NIF DNIF 200 Thi gian (phỳt) Hỡnh 3.10 th din tớch pic ca NIF v DNIF theo thi gian phn ng Theo kt qu trờn, chỳng tụi la chn thi gian phn ng l 20 phỳt, l khong thi gian cú mc chuyn húa NIF cao nht cho phộp tin hnh thc nghim vi nng CYP3A4 thp, tit kim chi phớ 3.4.2 Kho sỏt li cỏc thụng s chuyn húa ca nifedipin qua CYP3A4 - cỏc dung dch chun NIF, cỏc ng Eppendorf cha CYP3A4, NADPH v m phosphat pH 7,4 37oC vi phỳt - Trn 50 àl dung dch chun NIF ln lt cỏc nng 7,5; 15; 30; 45; 90; 120; 150 àM vi 50 àl CYP3A4 10 nM v 100 àl m phosphat pH 7,4, thờm 50 àl NADPH 0,2 mM Nng cui cựng hn hp phn ng l: nM CYP3A4; 0,04 mM NADPH, v NIF cỏc nng 1,5; 3; 6; 9; 18; 24; 30 àM - Tin hnh cỏc mu trờn 37oC, thi gian 20 phỳt - Sau 20 phỳt, bt hot enzym bng cỏch thờm 50 àl ACN - Chy sc ký cỏc mu phn ng trờn, thi gian phõn tớch l 13 phỳt Tớnh nng NIF trc v sau phn ng bng ng chun xõy dng ngy Kt qu xỏc nh tc chuyn húa V ca NIF theo cỏc nng NIF [S] qua CYP3A4 c trỡnh by bng 3.8 v hỡnh 3.11 T hỡnh 3.11 cho thy rng, nng c cht NIF bóo hũa l 30 àM Do ú, cỏc thụng s chuyn húa NIF qua CYP3A4 cú th c xỏc nh thay i khong nng NIF t 30 àM 35 Bng 3.8 Ktt qu qu xỏc nh tc chuyn húa NIF qua CYP3A4 STT [S] (àM) [S] (t = 0) [S] (t = 20 phỳt) thc t thc t (àM) (àM) V 1/[S] 1/V (àM/phỳt) (àM-1) (àM/phỳt)-1 1,5 2,95 2,15 0,0401 0,667 24,9 4,20 2,83 0,0684 0,333 14,6 6,43 4,49 0,0971 0,167 10,3 9,48 7,07 0,120 0,111 8,30 18 17,6 14,8 0,141 0,0556 7,08 24 23,6 19,9 0,181 0,0417 5,51 30 30,7 28,4 0,113 0,0333 8,87 0,2 0,18 0,16 V (àM/phỳt) 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 10 15 20 Nng NIF (àM) 25 30 35 Hỡnh 3.11 th th Michaelis Menten chuyn n húa NIF qua CYP3A4 Xỏc nh nh cỏc thụng s s chuyn húa Vmax v Km ca NIF daa vo phng trỡnh tr ng thng ng Lineweaver Burk biu th mi quan h giaa 1/[S] v 1/V (hỡnh 3.12) Phng trỡnh ỡnh Lineweaver Burk: y = 28,4x + 5,66 (R = 0,986) 36 Thụng s chuyn chuy húa ca NIF qua CYP3A4: Km = 5,01 àM; Vmax = 0,177 0,17 àM/phỳt Hai giỏ tr Km v Vmax xỏc nh c cng phự hp vi ktt qu qu thc nghim cỏc nghiờn cu tr c ú [8], [33] Khong nng c chtt NIF c kho sỏt l 1,5 - 30 àM tng ng ng v vi 1/3 Km n Km, t yờu cu v khong nng tin cy xỏc nh nh cỏc thụng ss Michaelis Menten (khong nng c cht ớt nht bao ph t 1/2 Km n n Km [19]) 1/V (àM/phỳt)-1 30 y = 28,4x + 5,66 R = 0,971 25 20 15 10 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1/[S] (àM-1) Hỡnh 3.12 3.1 th phng trỡnh Lineweaver Burk xỏc nh Km v Vmax ca NIF 3.4.3 Phn ng ng ỏnh giỏ nh hng ca glycyl funtumin lờn CYP3A4 - cỏc dung dch ch chu chun lm vic NIF pha theo quy trỡnh nh bng 3.1, cỏc dung dch GF, cỏc ng ng Eppendorf ch cha CYP3A4, NADPH v m m phosphat pH 7,4 37oC vi phỳt - Chun b dóy phn n ng c t tờn nh sau: 37 Thnh phn STT Chng õm GF 36 ng/ml GF 7,2 ng/ml Cỏc dung CYP3A4 m NADPH GF 180 GF 36 dch chun 10 nM phosphat 0,2 mM ng/ml ng/ml NIF pH 7,4 50 àl 50 àl 100 àl 50 àl 0 50 àl 50 àl 50 àl 50 àl 50 àl 50 àl 50 àl 50 àl 50 àl 50 àl - cỏc mu trờn 37oC, thi gian 20 phỳt - Sau 20 phỳt, bt hot enzym bng cỏch thờm 50 àl ACN - Chy sc ký cỏc mu phn ng trờn, thi gian phõn tớch l 13 phỳt Tớnh nng NIF sau phn ng bng ng chun xõy dng ngy Kt qu tc chuyn húa NIF qua CYP3A4 dóy phn ng c th hin bng 3.9 v hỡnh 3.13 38 Bng 3.9 Kt qu tc chuyn húa NIF qua CYP3A4 dóy phn ng [S] 1/[S] (àM) (àM-1) 1.5 STT Chng õm GF 36 ng/ml GF 7,2 ng/ml V 1/V V 1/V V 1/V (àM/phỳt) (àM/phỳt)-1 (àM/phỳt) (àM/phỳt)-1 (àM/phỳt) (àM/phỳt)-1 0,667 0,0847 11,8 0,0342 29,2 0,0292 34,3 0,333 0,125 7,97 0,0762 13,1 0,0546 18,3 0,167 0,194 5,14 0,119 8,38 0,113 8,85 12 0,0833 0,300 3,34 0,414 2,41 0,338 2,96 18 0,0556 0,554 1,80 0,758 1,32 0,578 1,73 30 0,0333 1,16 0,864 1,13 0,888 1,22 0,818 Phng trỡnh Lineweaver y = 16,5x + 1,46 y = 44,7x 0,744 y = 53,7x 0,816 Burk (R = 0,974) (R = 0,996) (R = 0,998) 39 Chng õm 40 GF 36 ng/ml y = 53,7x - 0,816 R = 0,996 35 GF 7,2 ng/ml 1/V (àM/phỳt)-1 30 25 y = 44,7x - 0,743 R = 0,992 20 15 10 y = 16,5x + 1,46 R = 0,950 05 00 00.000 00.000 00.000 00.000 00.000 1/[S] (àM-1) 00.001 00.001 00.001 Hỡnh 3.13 th mụ tt nh hng ca GF lờn chuyn n húa NIF qua CYP3A4 Kt qu trờn bng ng 3.9, chỳng tụi nhn nh thy tc phn ng chuyn húa NIF qua CYP3A4 cú xu hng gim gi cú mt GF vi c hai nng 36 ng/ml v 7,2 ng/ml so sỏnh vii dóy ch chng õm Xu hng ny cng cú th nhn thy theo dừi tc to thnh sn np phm phn ng DNIF qua hỡnh 3.14 90 Din tớch pic DNIF (mAU.s) 80 70 60 50 40 30 Chng õm 20 GF 36 ng/ml 10 GF 7,2 ng/ml 0 10 15 20 Nng NIF (àM) 25 30 Hỡnh 3.14 th biu din tc to thnh DNIF dóy phn ph ng 35 40 Tuy nhiờn, vỡ iu kin thc nghim khụng cho phộp nờn chỳng tụi cha th tin hnh lp li nhiu ln thớ nghim ny, vy chỳng tụi cha th a kt lun chc chn liu GF cú c ch CYP3A4 hay khụng cú th a kt lun cui cựng thỡ phi tin hnh thớ nghim lp li ti iu kin ny v th tip trờn cỏc iu kin khỏc v nng enzym v nng GF 3.5 BN LUN V s ng dng phng phỏp HPLC, hin phng phỏp ny c s dng ph bin c nh tớnh ln nh lng cú nhiu u im hn so vi cỏc phng phỏp phõn tớch khỏc Cỏc u im ú l: - Tớnh chn lc cao: tỏch riờng cht cn phõn tớch cỏc cht khỏc cú cựng mt mu cho kt qu cú ỳng v lp li cao - Cú th nh tớnh, nh lng nhiu thnh phn hn hp m khụng cn tỏch riờng cỏc cht, cho phộp tit kim thi gian, dung mụi, húa cht v ớt b sai s giai on tỏch chit Thớch hp phõn tớch cỏc mu cha nhiu cht khỏc v nn mu phc nh phõn tớch hn hp ca phn ng enzym m chỳng tụi tin hnh khúa lun ny V ỏp dng chng trỡnh sc ký ó c xõy dng t trc ú [7], chỳng tụi ó cú mt ớt thay i so vi chng trỡnh sc ký c, ú l thay i ct sc ký, gim tc dũng, tng nng mui KH2PO4 dung mụi pha mu, khụng s dng chun ni nh lng NIF u im so vi chng trỡnh c: - Tng hiu lc tỏch NIF v cỏc phõn hy, chuyn húa ca nú Pic rt cõn xng v gn - Tit kim dung mụi pha ng, gim ỏp sut u ct nhng thi gian phõn tớch khụng di - Khụng cn s dng cht chun ni nờn quỏ trỡnh phõn tớch n gin hn v tit kim chi phớ Thit b HPLC ó c trang b a s cỏc phũng thớ nghim cỏc trng i hc, cỏc vin khoa hc chuyờn ngnh cú liờn quan, cỏch s dng khụng quỏ 41 phc tp, cú chớnh xỏc cao ti ó thc nghim trờn mụ hỡnh in vitro s dng phng phỏp HPLC v ó tớnh toỏn li cỏc thụng s chuyn húa ca NIF qua CYP3A4 theo thuyt Michaelis Menten, thu c kt qu Km = 5,01 àM v Vmax = 0,177 àM/phỳt, phự hp vi cỏc d liu thc nghim trc ú l Km = 6,92 àM [8] v Km = 4,5 àM [33] Do vy cú th ỏnh giỏ nh hng ca mt thuc lờn hot tớnh ca CYP3A4 thụng qua c cht l NIF v s dng phng phỏp HPLC nh lng nng c cht Hot cht c ỏnh giỏ l GF V kt qu ca thớ nghim ỏnh giỏ nh hng ca GF lờn CYP3A4 Cỏc kt qu s b ny cho thy GF cú th gõy c ch CYP3A4 iu kin th nghim in vitro Nhỡn vo hỡnh 3.13 chỳng tụi nhn thy rt cú th GF tỏc ng n CYP3A4 theo nhiu hn mt kiu c ch enzym c bn hay gp nh ó trỡnh by mc 1.1.4 Trong thi hn ca ti, chỳng tụi mi ch tin hnh th nghim trờn nng GF l cỏc nng nh ca GF huyt tng dựng liu n 0,6 mg tiờm tnh mch (36 ng/ml) v tiờm bp (7,2 ng/ml) trờn ngi tỡnh nguyn khe mnh [10] Kt qu ny khỏc bit so vi kt qu nghiờn cu ca tỏc gi o Th Mai Anh l GF hu nh khụng gõy c ch hay cm ng CYP trờn th v chut nht trng [1] Tuy nhiờn, kt qu nghiờn cu trờn ng vt cha chc phn nh ỳng trờn ngi v mc liu dựng cho th v chut nht trng thc nghim cao gp nhiu ln mc liu dựng cho ngi 42 KT LUN V XUT KT LUN Qua quỏ trỡnh thc hin ti, chỳng tụi ó t c nhng kt qu sau: 1- La chn c ct sc ký phự hp vi chng trỡnh tỏch ó c xõy dng trc ú [7] So vi chng trỡnh c ti liu tham kho [7], chỳng tụi ó thay i tc dũng v dung mụi pha mu, khụng s dng chun ni, cỏc iu kin khỏc gi nguyờn Chng trỡnh sc ký c la chn nh sau: - H thng HPLC vi detector DAD - Ct sc ký Apollo C18 5u (4,6 x 150 mm, àm) - Pha ng: MeOH : ACN : AMA 0,04M : TEA 10% (2,5 : : : 0,05) vi pH 7,4 - Bc súng: 236 nm - Tc dũng: 0,5 ml/ phỳt - Th tớch tiờm: 20 àl Chng trỡnh ci tin cho kt qu nh sau: pic ca NIF v cỏc sn phm phõn hy quang hc v sn phm chuyn húa ca nú tỏch hon ton, vi phõn gii ln (Rs > 3,7), thi gian lu khụng cỏch quỏ xa, h s i xng cao (0,8 SF 1,5) 2- Thm nh li phng phỏp phõn tớch ó la chn Kt qu thm nh chng trỡnh sc ký ó la chn cho thy s phự hp vi cỏc tiờu ca mt phng phỏp phõn tớch sinh hc theo hng dn ca FDA [38] + Phng phỏp cú c hiu cao, cỏc thnh phn hn hp phn ng khụng nh hng n vic nh lng NIF phng phỏp ny + Phng phỏp cú lp li tt (RSD% = 3,90%), ỳng cao (91,66 99,81%), cú s ph thuc tuyn tớnh gia ỏp ng vi nng cht phõn tớch vi h s tng quan hi quy R = 0,9999 43 + Chỳng tụi ó xỏc nh li gii hn nh lng (LOQ) v gii hn phỏt hin (LOD) ca NIF Kt qu: LOQ = 0,5625 àM, LOD = 0,1875 àM, thp hn so vi nghiờn cu trc õy xõy dng chng trỡnh sc ký ti liu [7] Vy cú th ng dng chng trỡnh sc ký cú ci tin ny tin hnh thc nghim cho khúa lun 3- ng dng phng phỏp nh lng nifedipin bng HPLC ỏnh giỏ nh hng ca glycyl funtumin lờn s chuyn húa qua isozym CYP3A4 Kt qu nh sau: Trong dóy nng c kho sỏt, nhn thy cú xu hng gim tc phn ng chuyn húa ca NIF qua CYP3A4 trờn c nng GF (36 v 7,2 ng/ml) Tuy nhiờn, kt lun c GF cú c ch CYP3A4 hay khụng, c ch theo mụ hỡnh v khong nng no thỡ cn phi tip tc lp li nghiờn cu ny v m rng vựng kho sỏt nng GF v nng enzym XUT GF hin c s dng rng rói vi ch nh h tr iu tr ung th v cỏc trng hp suy gim dch khỏc Hin cỏc nghiờn cu v dc ng hc v tng tỏc thuc i vi GF cha nhiu, m ch yu l tin hnh trờn mụ hỡnh in vivo Vỡ thi gian nghiờn cu v iu kin cú hn nờn cũn nhiu cha gii quyt c nờn chỳng tụi cú mt s xut nh sau: - Tin hnh lp li nghiờn cu ny vi s lng mu ln hn cú th tớnh toỏn thng kờ, a c kt lun chớnh thc - Tip tc nghiờn cu nh hng ca GF lờn s chuyn húa ca CYP3A4 ngi tỏi t hp da trờn c cht nifedipin nhng vi cỏc nng enzym thp hn c cht bóo hũa c enzym, v vi cỏc nng GF khỏc khng nh c chc chn hn kh nng c ch CYP3A4 ca GF cng nh ỏnh giỏ c kiu c ch (nu cú) - Tin hnh nghiờn cu s chuyn húa ca glycyl funtumin qua CYP3A4 ngi tỏi t hp TI LIU THAM KHO Ti liu ting Vit o Th Mai Anh (2003), Nghiờn cu nh hng ca Aslem trờn h thng enzym Cyt-P450 gan ca ng vt thớ nghim, Lun thc s dc hc, Trng i hc Dc H Ni, H Ni B Y T (2009), Dc in Vit Nam IV, NXB Y hc, H Ni B Y T (2002), Dc th Quc gia Vit Nam, ln xut bn th nht, tr.24322434, NXB Y hc, H Ni o Kim Chi v cng s (2005), Hon thin quy trỡnh sn xut thuc tiờm Aslem iu hũa dch, Bỏo cỏo tng kt khoa hc v k thut ca d ỏn KC10-DA13 Nguyn Th Ngc Dao, Th Tuyờn, Nguyn Thỏi Bing (2005), nh hng ca Rụtunin sunphỏt lờn h thng enzym xytụchrụm P450 gan chut, Tp sinh hc, 27(2), tr.82-88 Quý Hai (2004), Chuyờn enzym, Ti liu lu hnh ni b trng i hc Khoa hc Hu, Tha Thiờn Hu Phm Th Thanh H, Nguyn Th Thu Huyn (2015), Xõy dng phng phỏp nh lng ng thi nifedipin v cht chuyn húa dehydronifedipin bng sc ký lng hiu nng cao, Nghiờn cu dc Thụng tin thuc, 2, tr.11-16 Phm Th Thanh H, Nguyn Th Thanh Nhi (2015), Xõy dng phng phỏp ỏnh giỏ nh hng ca thuc lờn cytochrom P450 3A4 thụng qua chuyn húa nifedipin, Tp dc hc, s 469, tr.16-21 Trn c Hu, Nguyn ỡnh Hin, Thỏi Duy Thỡn, Nguyn Vn Thc (2007), Húa Dc 1, tr.194, NXB Y hc, H Ni 10 T Mnh Hựng, Nguyn Hong Anh, Lờ Thu Huyn, Nguyn Th Huyn Trõm, Phựng Th Vinh, o Kim Chi (2012), Nghiờn cu dc ng hc ng tiờm bp v tiờm tnh mch ca glycyl funtumin (Aslem) trờn ngi tỡnh nguyn khe mnh, Tp Dc hc, s 436, tr.22-28 11 T Mnh Hựng, Lờ Th Thu Huyn, Phựng Th Vinh, Nguyn Hong Anh, o Kim Chi, (2011), Bc u nghiờn cu dc ng hc ng tiờm bp v tiờm tnh mch ca Aslem trờn chú, Tp Kim nghim thuc, 9(32), tr.14-17 12 Ngụ Quc Thng (2012), Xõy dng phng phỏp nh lng ng thi nifedipin v cht chuyn húa dehydronifedipin bng HPLC, Khúa lun tt nghip Dc s, trng i hc Dc H Ni, H Ni 13 Nguyn Xuõn Thng, o Kim Chi, Phm Quang Tựng, Nguyn Vn ng (2005), Húa sinh hc, tr.138-166, NXB Y hc, H Ni 14 Mai Tt T, V Th Trõm (2007), Dc lý hc 1, tr.31-33, NXB Y hc, H Ni 15 Mai Tt T, V Th Trõm (2013), Dc lý hc 2, tr.66-68, NXB Y hc, H Ni Ti liu ting Anh 16 Akiyoshi T, Ito M, Murase S, et al (2013), Mechanism-based Inhibition Profiles of Erythromycin and Clarithromycin with Cytochrome P450 3A4 Genetic Variants, Drug Metabolism and Pharmacokinetics, 28(5), pp.411-415 17 Friedrich H, Nada A, Bodmeier R (2005), Solid State and Dissolution Rate Characterization of Co-Ground Mixtures of Nifedipine and Hydrophilic Carriers, Drug Development and Industrial Pharmacy, 31, pp.719-720 18 Galetin A, Ito K, Hallifax D, Houston JB (2005), CYP3A4 Substrate Selection and Substitution in the Predict of Potential Drug Drug Interactions, The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 314, pp.180-190 19 Galetin A, Clarke SE, Houston JB (2003), Multisite Kinetic Analysis of Interactions Between Prototypical CYP3A4 Subgroup Substrates: Midazolam, Testosteron, and Nifedipine, Drug Metabolism And Disposition, 31, pp.1108-1116 20 Garcia MA, Solans C, Aramayona JJ, Fraile LJ, Bregante MA (1998), A common method for the determination of several calcium channel blockers using an HPLC system with ultraviolet detector, Talanta, 47, pp.1245-1254 21 Guengerich FP (1993), Cytochrome P450 Enzymes, American scientist, 81, pp.440-447 22 Guengerich FP (1999), Cytochrome P450 3A4: Regulation and role in drug metabolism, Annual Review of Pharmacology and Toxicology, 39, pp.1-17 23 Guengerich FP, Martin MV, Beaune PH, Kremers P, Wolff T, Waxman DJ (1986), Characterisation of rat and human liver microsomal cytochrome P-450 forms involved in nifedipine oxidation, a prototype for genetic polymorphism in oxidative drug metabolism, The Journal of Biological Chemistry, 261(11), pp.5051-5060 24 Kleinbloesem CH, Harten JV, Wilson JPH, Danhof M, Brummelen PV, Breimer DD (1986), Nifedipine: Kinetics and hemodynamic effects in patients with liver cirrhosis after intravenous and oral administration, Clinical Pharmacology and Therapeutics, 40, pp.21-28 25 Lin JH, Lu AY (1998), Inhibition and induction of cytochrome P450 and the clinical implications, Clinical Pharmacokinetics, 35, pp.361-390 26 Lorusso P, et al (2008), Effect of coadministration of ketoconazol, a strong CYP3A4 inhibitor, on pharmacokinetics and tolerability of motesanib diphosphate (AMG 706) in patients with advanced solid tumors, Investigational New Drugs, 26(5), pp.455-456 27 Meyer UA (1996), Overview of enzymes of drug metabolism, Journal of Pharmacokinetics and Biopharmaceutics, 24, pp.449-459 28 Mitchell JR, et al (1974), Acetaminophen-induced hepatic injury: protective role of glutathione in man and rationale for therapy, Clinical Pharmacology and Therapeutics, 16, pp.676-684 29 Narahashi T (1994), Ion Channels of Excitable Cells, Academic Press, USA, pp.198 30 Gupta N (2013), A drug-drug interaction study between the strong CYP3A4 inhibitor ketoconazole (keto) and ixazomib citrate (MLN9708), an investigational, orally active proteasome inhibitor, in patients with advanced solid tumors or lymphoma, 2013 American Society of Clinical Oncology Annual Meeting, USA 31 Nelson DR (1999), Cytochrome P450 and the individuality of species, Archives of Biochemistry and Biophysics, 369, pp.1-10 32 Orlando R, et al (2003), Effect of the CYP3A4 inhibitor erythromycin on the pharmacokinetics of lignocaine and its pharmacologically active metabolites in subjects with normal and impaired liver function, The Journal of Clinical Pharmacology, 55(1), pp.86-93 33 Patki KC, Moltke LL, Greenblatt DJ (2003), In Vitro Metabolism of Midazolam, Triazolam, Nifedipine, and Testosterone by Human Liver Microsomes and Recombinant Cytochromes P450: Role of CYP3A4 and CYP3A5, Drug Metabolism and Disposition, 31, pp.938-944 34 Pelkonen O, et al (1998), Inhibition and induction of human cytochrome P450 (CYP) enzymes, Xenobiotica, 28, pp.1203-1253 35 Peracchia C (1994), Handbook of Membrane Channels: Molecular and Cellular Physiology, Academic Press, USA, pp.194 36 Swart PJ, et al (2006), Pharmacokinetic effect of ketoconazol on solifenacin in healthy volunteers, Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology, 99(1), pp.33-36 37 Sweetman SC, et al (2009), Martindale: The Complete Drug Reference, 36th edition, Pharmaceutical Press, United Kingdom, pp.1154, 1350-1354 38 U.S Department of Health and human Services, Food and Drug Administration, Centre for Drug Evalution and Research (2001), Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation for Human studies 39 Waller DG, Renwick AG, Gruchy BS, George CF (1984), First pass metabolism of nifedipine in man, British Journal of Clinical Pharmacology, 18, pp.951-954 40 Yamazaki H, Urano T, Hiroki S, Shimada T (1996), Effects of Erythromycin and Roxithromycin on oxidation of Testosterone and Nifedipine Catalyzed by CYP3A4 in Human Liver Microsomes, The Journal of Toxicological Sciences, Vol 21, pp.215-226 41 Yamazaki H, Nakano M, Imai Y, Ueng YF, Guengerich FP, Shimada T (1996), Roles of cytochrome b5 in the oxidation of testosterone amd nifedipine by recombinant cytochrome P450 3A4 and by human liver microsomes, Archives of Biochemistry and Biophysics, 325, pp.174-182 42 Zhao Y, Hellum BH, Liang A, Nilsen OG (2012), The in vitro inhibition of human CYP1A2, CYP2D6 and CYP3A4 by tetrahydropalmatine, neferine and berberine, Phytotherapy Research, 26(2), pp.277-283 Ti liu ting c 43 Horster FA, Duhm B, Maul W, Medenwald H, Patzschke K, Wegner LA (1972), Klinische Untersuchungen zur Pharmakokinetik von radioaktiv markiertem 4- (2 - Nitrophenyl) - 2,6 - dimethyl - 1,4 - dihydropyridin -3,5 dicarbonsọure dimethylester, Arzneimittel Forschung, 22, pp.330-334 [...]... ảnh hưởng của GF lên CYP3A4, tạo tiền đề cho nghiên cứu tương tác giữa GF với các thuốc khác Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài Khảo sát ảnh hưởng thuốc lên CYP3A4 thông qua định lượng nifedipin bằng HPLC với mục tiêu: 2 1- Thẩm định lại phương pháp định lượng nifedipin trong hỗn hợp phản ứng với CYP3A4 bằng HPLC 2- Ứng dụng để đánh giá ảnh hưởng của GF lên CYP3A4 3 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN... lựa chọn để khảo sát ảnh hưởng của glycyl funtumin lên enzym CYP3A4 thông qua định lượng nifedipin * Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng 18 - Hỗn hợp phản ứng để xác định các thông số chuyển hóa của nifedipin qua CYP3A4 bao gồm: cơ chất NIF, enzym CYP3A4 người tái tổ hợp và coenzym NADPH - Hỗn hợp phản ứng để đánh giá ảnh hưởng của glycyl funtumin lên CYP3A4 bao gồm: cơ chất NIF, chất thử GF, enzym CYP3A4 người... ký - Khoảng tuyến tính giữa nồng độ nifedipin và diện tích pic - Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng - Độ đặc hiệu - Độ lặp lại - Độ đúng 17 * Ứng dụng chương trình sắc ký đã lựa chọn để khảo sát ảnh hưởng của GF lên enzym CYP3A4 thông qua định lượng nifedipin 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Chuẩn bị các mẫu chạy sắc ký * Chuẩn bị dung môi pha mẫu Qua nghiên cứu tính chất lý hóa của... cơ chất điển hình, ta có thể nghiên cứu ảnh hưởng của một thuốc lên bất kỳ isozym nào không chỉ riêng CYP3A4 Trong các nghiên cứu in vitro về CYP3A4, có 3 cơ chất được sử dụng phổ biến nhất là testosteron, midazolam và nifedipin Trong phạm vi của khóa luận này, chúng tôi đã chọn nifedipin làm cơ chất để đánh giá ảnh hưởng của thuốc lên CYP3A4 8 1.2 TỔNG QUAN VỀ NIFEDIPIN 1.2.1 Công thức cấu tạo NO 2... độ thuốc trong huyết tương nhanh chóng giảm, không còn được phát hiện sau 3 giờ [10], [11] Do đó, GF bị nghi ngờ có chuyển hóa qua gan Hiện nay, ở Việt Nam và trên thế giới chưa có nghiên cứu nào về chuyển hóa GF qua gan cũng như nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của GF lên hệ 14 enzym CYP của người Vì vậy, trong khóa luận này, chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của GF lên CYP3A4 người tái tổ hợp thông qua định. .. gan và hơn 80% ở tế bào ruột non) [40] CYP3A4 là enzym chịu trách nhiệm xúc tác chuyển hóa nhiều nhất các thuốc lưu hành trên thị trường (hơn 50% thuốc được sử dụng trên lâm sàng) và số lượng các chất cảm ứng hay ức chế CYP3A4 tương đối nhiều [34] Vì vậy, tương tác thuốc thông qua isozym này rất phổ biến trên lâm sàng Các tương tác thuốc thông qua CYP3A4 đều liên quan đến hiện tượng cảm ứng hay ức chế... khung flavon [40] Đây được cho là một trong những cơ chế quan trọng để hiểu được bản chất của tương tác thuốc - thuốc, có ý nghĩa không nhỏ đối với việc phối hợp thuốc trên lâm sàng Trên thế giới, mô hình nghiên cứu tương tác thuốc in vitro (nghiên cứu ảnh hưởng của một chất lên CYP3A4 bằng cách theo dõi sự chuyển hóa một cơ chất điển hình qua CYP3A4 người tái tổ hợp) đã được ứng dụng phổ biến [16],... thải trừ của nifedipin [43] 1.2.5 Các nghiên cứu in vitro sử dụng nifedipin làm cơ chất đánh giá ảnh hưởng của thuốc lên CYP3A4 Bảng 1.3 Một số nghiên cứu in vitro đánh giá ảnh hưởng của thuốc lên CYP3A4 thông qua tốc độ chuyển hóa NIF TLTK Nồng độ NIF Chất khảo sát Phương pháp định lượng NIF Erythromycin Roxithromycin [40] 100 µM Troleandomycin LC – UV Ketoconazol Gestoden Ketoconazol [18] 2,5 – 100... chế CYP3A4 của các chất được khảo sát, vốn được biết đến là những chất ức chế CYP3A4, các nghiên cứu đều có tính toán tốc độ phản ứng enzym Trong khóa luận này, với cơ chất là nifedipin, chúng tôi lựa chọn khảo sát hoạt chất là glycyl funtumin do ở Việt Nam và trên thế giới chưa có nghiên cứu in vitro nào đánh giá ảnh hưởng của hoạt chất này lên hệ CYP nói chung và isozym CYP3A4 nói riêng 1.3 TỔNG QUAN... nifedipin bị thải trừ qua nước tiểu ở dạng không còn hoạt tính [37] 10 NO 2 COOCH 3 H3COOC H3 C H3COOC CYP3A4 H3 C CH 3 N H NO 2 COOCH 3 Nifedipin (NIF) N Dehydronifedipin (DNIF) NO 2 H3COOC H3 C NO 2 H3COOC COOH N CH3 CH 3 H3 C (DMP) COOH N CH 2OH (HMP) Hình 1.5 Sơ đồ chuyển hóa, thải trừ của nifedipin [43] 1.2.5 Các nghiên cứu in vitro sử dụng nifedipin làm cơ chất đánh giá ảnh hưởng của thuốc lên