BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THÙY DƢƠNG TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT N-HYDROXYBENZAMID MANG KHUNG 2-OXOINDOLIN VÀ CẦU NỐI TRIAZOL LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI - 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THÙY DƢƠNG TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT N-HYDROXYBENZAMID MANG KHUNG 2-OXOINDOLIN VÀ CẦU NỐI TRIAZOL LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƢỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC MÃ SỐ: 60720402 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Đào Thị Kim Oanh ThS Trần Thị Lan Hƣơng HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN Trong trình thực luận văn, nhận đƣợc hƣớng dẫn tận tình nhiều giúp đỡ quý báu thầy cô, đồng nghiệp, gia đình bạn bè Từ tận đáy lòng mình, xin gửi lời cảm ơn chân thành biết ơn sâu sắc tới TS Đào Thị Kim Oanh ThS Trần Thị Lan Hƣơng, ngƣời thầy dẫn tận tình tạo điều kiện tốt cho hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn anh chị em làm việc thực đề tài môn Hóa dƣợc, đặc biệt Ds Đỗ Thị Mai Dung em Lê Văn Cƣờng ủng hộ giúp đỡ nhiệt tình suốt trình nghiên cứu Tôi nhận đƣợc phối hợp giúp đỡ từ cán làm việc Khoa Hóa – trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học quốc gia Hà Nội, Viện Hóa học hợp chất tự nhiên, Viện hóa học Việt Nam, Viện Khoa học Công Nghệ Việt Nam, toàn thể thầy cô phòng, ban, thƣ viện Tôi xin chân thành cảm ơn Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình bè bạn – ngƣời sát cánh, động viên khích lệ sống học tập Hà Nội, ngày 31 tháng 03 năm 2016 Học viên Nguyễn Thị Thùy Dương MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 HISTON DEACETYLASE 1.1.1 Khái niệm, phân loại 1.1.2 Cấu trúc HDAC 1.2.3 Mối liên quan ung thƣ bất thƣờng hoạt động HDAC 1.2 CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC 1.2.1 Phân loại chất ức chế HDAC 1.2.2 Cơ chế tác dụng 1.2.3 Liên quan cấu trúc - tác dụng chất ức chế HDAC 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VỀ CÁC ACID HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC .10 1.4 NGHIÊN CỨU VỀ TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ UNG THƢ CỦA CÁC TRIAZOL 20 1.5 NGHIÊN CỨU VỀ TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ UNG THƢ CỦA CÁC ISATIN .23 Chƣơng NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 26 2.1.1 Hóa chất 26 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ .26 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 27 2.2.1 Tổng hợp hóa học .27 2.2.2 Thử tác dụng sinh học dẫn chất tổng hợp đƣợc 28 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.3.1 Phƣơng pháp tổng hợp hóa học 28 2.3.2 Phƣơng pháp thử tác dụng sinh học 29 Chƣơng THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 33 3.1 HÓA HỌC .33 3.1.1 Tổng hợp hóa học .33 3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết .44 3.1.3 Khẳng định cấu trúc 44 3.2 HOẠT TÍNH SINH HỌC .49 3.2.1 Tác dụng ức chế HDAC 49 3.2.2 Hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro 50 3.3 NGHIÊN CỨU DOCKING 50 Chƣơng BÀN LUẬN 52 4.1 TỔNG HỢP HÓA HỌC 52 4.2 KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC 53 4.2.1 Phổ hồng ngoại 53 4.2.2 Phổ khối 54 4.2.3 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân .55 4.3 HOẠT TÍNH SINH HỌC .57 4.3.1 Tác dụng ức chế HDAC2 57 4.3.2 Tác dụng thử hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ .58 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61 KẾT LUẬN 61 KIẾN NGHỊ .62 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT 13 C – NMR : Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C H – NMR : Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H AsPC-1 : Tế bào ung thƣ tụy ngƣời Dd : Dung dịch HAT : Histon acetyltranferase HDAC : Histon deacetylase HDI, HDIs : Histon deacetylase Inhibitor(s) IR : Phổ hồng ngoại MCF-7 : Tế bào ung thƣ vú ngƣời MS : Phổ khối lƣợng NCI-H460 : Tế bào ung thƣ phổi ngƣời NST : Nhiễm sắc thể PC-3 : Tế bào ung thƣ tiền liệt tuyến Rt : Nhiệt độ phòng SAHA : Acid suberoylanilid hydroxamic SKLM : Sắc ký lớp mỏng SW620 : Tế bào ung thƣ đại tràng TSA : Trichostatin A DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Enzym HDAC: phân loại, số lƣợng acid amin, vị trí, chức sinh lý cấu trúc tinh thể Bảng 1.2: Một số chất ức chế HDAC đƣợc thử lâm sàng Bảng 1.3: Khả ức chế HDAC saccarin N-hydroxybenzamid 16 Bảng 1.4: Tác dụng ức chế HDAC tế bào ung thƣ Hela N-hydroxy-4(4-(2-(3-methoxy-4-(thiophen-2yloxy)phenyl)acetamido)phenethyl)benzamid 17 Bảng 1.5: Kết đánh giá hoạt tính sinh học chất 7a-d 18 Bảng 1.6: Kết đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro Nhydroxybenzamid có vòng indon 19 Bảng 3.1: Giá trị Rf Tonc chất IVa-f 44 Bảng 3.2: Số liệu phân tích phổ IR IVa-f 45 Bảng 3.3: Số liệu phân tích phổ khối lƣợng chất IVa-f 46 Bảng 3.4: Số liệu phân tích phổ 1H-NMR 47 Bảng 3.5: Số liệu phân tích phổ 13C-NMR 48 Bảng 3.6: Kết thử tác dụng ức chế HDAC dẫn chất IVa-f phƣơng pháp huỳnh quang 49 Bảng 3.7: Kết thử hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ in vitro chất IVa-f 50 Bảng 3.8: Kết docking chất IVa-f với HDAC2 51 Bảng 4.1 So sánh hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ dãy IVa-f 20a-f 60 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Vai trò sinh học HDAC hoạt động tế bào ung thƣ Hình 1.2: Điều hòa phát triển sống sót tế bào chất ức chế HDAC Hình 1.3: Liên quan cấu trúc – tác dụng chất ức chế HDAC dẫn chất acid hydroxamic 10 Hình 1.4: HDIs có cấu trúc acid hydroxamic 11 Hình 1.5: Các acid phenylthiazol hydroxamic tƣơng tự SAHA 12 Hình 1.6: Một số acid phenylthiazol hydroxamic 13 Hình 1.7: Các dẫn chất acid biphenyl-hydroxamic .13 Hình 1.8: Các acid isoxazol-hydroxamic 15 Hình 1.9: Các triazol-hydroxamic 16 Hình 1.10: Công thức CRA-024781/ PCI-24781/Abexinostat 19 Hình 1.11: Các nucleosid có vòng triazol .21 Hình 1.12: Các chất kết hợp 3-phenylpyrazolopyrimidin 1,2,3-triazol 21 Hình 1.13: Các 4-aryl-5-cyano-2H-1,2,3-triazol .22 Hình 1.14: Các phân tử nhỏ giống Lavendustin 22 Hình 1.15: Các chất kết hợp 2,3,4,6-tetra-O-acetyl- β-D -glucopyranosyl azid với propynyl 3-[3-(aryl)-1,2,4-oxadiazol-5-yl] propionat 23 Hình 3.1: Mô hình tƣơng tác IVd với HDAC2 51 Hình 4.1: Phổ hồng ngoại IVe 54 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1.1: Tổng hợp acid isoxazol-hydroxamic 14 Sơ đồ 1.2: Tổng hợp acid triazol-hydroxamic .15 Sơ đồ 1.3: Tổng hợp 4-aryl-1,2,3-triazol 20 Sơ đồ 2.1: Tổng hợp thử hoạt tính sinh học số dẫn chất Nhydroxybenzamid mang khung 2-oxoindolin cầu nối triazol .28 Sơ đồ 3.1: Sơ đồ phản ứng tổng hợp chất IVa .33 Sơ đồ 3.2: Quy trình tổng hợp chất IIa 33 Sơ đồ 3.3: Quy trình tổng hợp chất IIIa 34 Sơ đồ 3.4: Quy trình tổng hợp chất IVa 35 Sơ đồ 3.5 Quy trình tổng hợp chất IVb 36 Sơ đồ 3.6: Quy trình tổng hợp chất IVc 38 Sơ đồ 3.7: Quy trình tổng hợp chất IVd 39 Sơ đồ 3.8: Quy trình tổng hợp chất IVe 41 Sơ đồ 3.9: Quy trình tổng hợp chất IVf 42 Sơ đồ 4.1: Cơ chế phản ứng Click 52 Sơ đồ 4.2: Cơ chế phản ứng tạo thành IVa-f………….…………………………53 ĐẶT VẤN ĐỀ Histon deacetylase (HDAC) histon acetyltransferase (HAT) enzym quan trọng tham gia vào trình điều hoà biểu gen Nhiều nghiên cứu cho thấy huy động mức HDAC có khả gây nên sai lệch trình phiên mã, làm kích thích phát triển tế bào ung thƣ [23, 53] Do đó, HDAC mục tiêu phân tử hấp dẫn cho nghiên cứu phát triển thuốc điều trị ung thƣ [21, 29, 47] Trong số loại chất ức chế HDAC đƣợc tổng hợp công bố nay, dẫn xuất acid hydroxamic có hoạt tính tốt, đặc biệt dẫn xuất acid hydroxamic - acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA, Zolinza®), đƣợc FDA phê duyệt năm 2006 cho điều trị u lympho da tế bào T (CTCL) Nhiều nghiên cứu tập trung vào N-hydroxybenzamid, số có nhiều hợp chất có tác dụng ức chế HDAC mạnh [9, 20, 21, 32, 53] Các nhà khoa học nhận nhiều hợp chất chứa vòng indolin tự nhiên tổng hợp hóa học, mà đặc biệt isatin thể tác dụng bật điều trị ung thƣ lâm sàng [29, 32] Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu dị vòng 1,2,3-triazol có tác dụng nhiều tế bào ung thƣ mức độ in vitro [6] Do đó, với mục đích thiết kế N-hydroxybenzamid có vòng indolin nhƣ nhóm khóa hoạt động cầu nối triazol, tiến hành thực đề tài: “Tổng hợp thử hoạt tính sinh học số dẫn chất N-hydroxybenzamid mang khung 2-oxoindolin cầu nối triazol” với mục tiêu chính: Tổng hợp đƣợc số dẫn chất N-hydroxybenzamid mang khung 2oxoindolin cầu nối triazol Thử tác dụng ức chế enzym histon deacetylase tác dụng gây độc tế bào dẫn chất tổng hợp đƣợc số dòng tế bào ung thƣ ngƣời 32 Li X., et al (2015), "Development of N-hydroxybenzamide derivatives with indole-containing cap group as histone deacetylases inhibitors", Bioorg Med Chem, 23(19), pp 6258-70 33 Li Z., et al (2014), "Targeting histone deacetylases for cancer therapy: from molecular mechanisms to clinical implications", Int J Biol Sci, 10(7), pp 757-70 34 Lobera M., et al (2013), "Selective class IIa histone deacetylase inhibition via a nonchelating zinc-binding group", Nat Chem Biol, 9(5), pp 319-25 35 Ma X., et al (2009), "Identification of LIV1, a putative zinc transporter gene responsible for HDACi-induced apoptosis, using a functional gene screen approach", Mol Cancer Ther, 8(11), pp 3108-16 36 Marson C M., et al (2007), "Structure–activity relationships of aryloxyalkanoic acid hydroxyamides as potent inhibitors of histone deacetylase", Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 17(1), pp 136-141 37 Matthew W., et al (2006), "Rapid discovery and structure-activity profiling of novel inhibitors of human immunodeficiency virus type protease enabled by the copper(I)-catalyzed synthesis of 1,2,3-triazoles and their further functionalization", J Med Chem., 49, pp 7697-7710 38 Michael J G., et al (2008), "A copper(I)-catalyzed 1,2,3-triazole azidealkyne click compound is a potent inhibitor of a multidrug-resistant HIV-1 protease variant", J Med Chem., 51, pp 6263–6270 39 Minoru YoshidaS, et al (1990), "Potent and specific inhibiton of emammalian histone deacetylase both in vivo and in vitro by trichostatin A", The Journal Of Biological Chemistry, 265(28), pp 17174-17179 40 Morvin M, et al (1976), "Mannich bases of isatin as mitodepressive agent", Acta Pharm Jugoslav, 26(1), pp 67-73 41 Mottamal M., et al (2015), "Histone deacetylase inhibitors in clinical studies as templates for new anticancer agents", Molecules, 20(3), pp 3898-941 42 Patpi S R., et al (2012), "Design, synthesis, and structure-activity correlations of novel dibenzo[b,d]furan, dibenzo[b,d]thiophene, and Nmethylcarbazole clubbed 1,2,3-triazoles as potent inhibitors Mycobacterium tuberculosis", J Med Chem, 55(8), pp 3911-22 of 43 Peckham Haley (2013), "Epigenetics: The dogma-defying discovery that genes learn from experience", International Journal of Neuropsychotherapy, 1(1), pp 9-20 44 Po C Chen, et al (2008), "Synthesis and structure-activity relationship of histone deacetylase (HDAC) inhibitors with triazole-linked cap group", Bioorg Med Chem, 16(9), pp 4839-53 45 Roya K.F, et al (2008), Programmed cell death in cancer progression and therapy, Springer: Berlin, 615 46 Somoza J R., et al (2004), "Structural snapshots of human HDAC8 provide insights into the class I histone deacetylases", Structure, 12(7), pp 1325-34 47 Taddei M., et al (2014), "Lactam based 7-amino suberoylamide hydroxamic acids as potent HDAC inhibitors", Bioorg Med Chem Lett, 24(1), pp 61-4 48 Tapadar S., et al (2009), "Isoxazole moiety in the linker region of HDAC inhibitors adjacent to the Zn-chelating group: effects on HDAC biology and antiproliferative activity", Bioorg Med Chem Lett, 19(11), pp 3023-6 49 Trott O., et al (2010), "AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading", J Comput Chem, 31(2), pp 455-61 50 Vannini A., et al (2004), "Crystal structure of a eukaryotic zinc-dependent histone deacetylase, human HDAC8, complexed with a hydroxamic acid inhibitor", Proc Natl Acad Sci U S A, 101(42), pp 15064-9 51 Vinh A., et al (2008), "A novel histone deacetylase inhibitor reduces abdominal aortic aneurysm formation in angiotensin II-infused apolipoprotein E-deficient mice", J Vasc Res, 45(2), pp 143-52 52 Witt O., et al (2009), "HDAC family: What are the cancer relevant targets?", Cancer Lett, 277(1), pp 8-21 53 Xu W S., et al (2007), "Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action", Oncogene, 26(37), pp 5541-5552 PHỤ LỤC Phụ lục 1-1 đến 1-6: Phổ IR chất IVa-f Phụ lục 2-1 đến 2-6: Phổ MS chất IVa-f Phụ lục 3-1 đến 3-6: Phổ 1H-NMR chất IVa-f Phụ lục 4-1 đến 4-6: Phổ 13C-NMR chất IVa-f Phụ lục 1-1: Phổ hồng ngoại chất IVa Phụ lục 1-2: Phổ hồng ngoại chất IVb Phụ lục 1-3: Phổ hồng ngoại chất IVc Phụ lục 1-4: Phổ hồng ngoại chất IVd Phụ lục 1-5: Phổ hồng ngoại chất IVe Phụ lục 1-6: Phổ hồng ngoại chất IVf Phụ lục 2-1: Phổ khối lƣợng chất IVa Phụ lục 2-2: Phổ khối lƣợng chất IVb Phụ lục 2-3: Phổ khối lƣợng chất IVc Phụ lục 2-4: Phổ khối lƣợng chất IVd Phụ lục 2-5: Phổ khối lƣợng chất IVe Phụ lục 2-6: Phổ khối lƣợng chất IVf Phụ lục 3-1: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân1H-NMR chất IVa Phụ lục 3-2: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân1H-NMR chất IVb Phụ lục 3-3: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân1H-NMR chất IVc Phụ lục 3-4: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân1H-NMR chất IVd Phụ lục 3-5: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân1H-NMR chất IVe Phụ lục 3-6: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân1H-NMR chất IVf Phụ lục 4-1: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân13C-NMR chất IVa Phụ lục 4-2: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân13C-NMR chất IVb Phụ lục 4-3: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân13C-NMR chất IVc Phụ lục 4-4: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân13C-NMR chất IVd Phụ lục 4-5: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân13C-NMR chất IVe Phụ lục 4-6: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân13C-NMR chất IVf