Viện Đại học mở Hà nội Khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC PHẦN I TỔNG QUAN PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 26 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 Chu Thị Thảo Viện Đại học mở Hà nội Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc α-glucosidase [47] 14 Hình 1.2 Cơ chế tác dụng AGIs điều trị bệnh tiểu đường [43] 16 Hình 1.3 Cơ chế làm chậm trình hình thành glucose .17 Hình 1.4 Cấu tạo valiolamine voglibose .19 Hình 1.5 Cấu trúc hóa học số thành phần có salacia.[43] 20 Hình 1.6 Cấu tạo acarbose .22 Hình 1.7 Đậu đen 24 Hình 3.1 Kết khảo sát khả sinh tổng hợp chất ức chế amylase từ canh trường nuôi chủng Bacillus subtilis M1, BKH, DT2 chiết dung môi nước cất (A) cồn 80o (B) sau ngày lên men 1: mẫu M1, 2: mẫu BKH, 3: mẫu DT2, Mẫu mẫu kiểm chứng 35 Hình 3.2 Biểu đồ thể ảnh hưởng nguồn nguyên liệu ban đầu đến khả sinh chất ức chế α-amylase 36 Hình 3.3 Biểu đồ thể ảnh hưởng nguồn nguyên liệu ban đầu đến khả sinh chất ức chế glucoamylase 36 Hình 3.4 Biểu đồ so sánh khả sinh chất ức chế α-amylase lên men mẫu đậu Đ1 chủng Bacillus subtilis M1, BKH, ĐT2 .37 Hình 3.5 Biểu đồ so sánh khả sinh chất ức chế AMG lên men mẫu đậu Đ1 chủng Bacillus subtilis M1, BKH, ĐT2 38 Hình 3.6 Biểu đồ ảnh hưởng thời gian lên men đến khả ức chế amylase sản phẩm lên men từ mẫu đậu Đ1 39 Hình P-1: Phương trình đường chuẩn glucose 47 Chu Thị Thảo Viện Đại học mở Hà nội Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các Chalcones tổng hợp hóa học hoạt tính kìm hãm α – glucosidase chúng 19 Bảng 3.1 Một số tính chất nguyên liệu 34 Bảng P-1: Kết xây dựng đường chuẩn glucose 46 Bảng P-2 Kết ảnh hưởng nguồn nguyên liệu ban đầu đến khả sinh chất ức chế αamylase 47 Bảng P-3 Kết ảnh hưởng nguồn nguyên liệu ban đầu đến khả sinh chất ức chế AMG 47 Bảng P-4 Kết so sánh khả sinh chất ức chế α-amylase sử dụng chủng Bacillus subtilis M1, BKH, ĐT2 sau ngày lên men 48 Bảng P-5: Kết so sánh khả sinh chất ức chế AMG sử dụng chủng Bacillus subtilis M1, BKH, ĐT2 sau ngày lên men 48 Báng P-6: Kết so sánh khả sinh chất ức chế α-amylase sử dụng chủng Bacillus subtilis sau ngày lên men 49 Bảng P-7: Kết so sánh khả sinh chất ức chế AMG sử dụng chủng Bacillus subtilis sau ngày lên men 49 Bảng P-8: Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả ức chế α-amylase sản phẩm lên men từ mẫu đậu Đ1 49 Bảng P-9: Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả ức chế AMG sản phẩm lên men từ mẫu đậu Đ1 .50 Chu Thị Thảo Viện Đại học mở Hà nội Khóa luận tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Lê Thanh Hà – Bộ môn Công nghệ Sinh học – Viện Công nghệ Sinh học – Thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội hết lòng giúp đỡ, hưỡng dẫn dạy tận tình cho em suốt trình em làm luận văn tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, cán nghiên cứu, nghiên cứu sinh, học viên bạn sinh viên phòng thí nghiệm nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trình học tập thực luận văn Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy cô giáo Viện Đại học Mở Hà Nội nói chung thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học nói riêng tận tình giảng dạy,truyền đạt cho em kiến thức, kinh nghiệm quý báu suốt năm học tập rèn luyện Viện Đại học Mở Hà Nội Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè động viên, chăm sóc, đóng góp ý kiến giúp đỡ trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn tốt nghiệp Hà Nội, ngày … tháng … năm 2012 Sinh viên Chu thị thảo Chu Thị Thảo Viện Đại học mở Hà nội Khóa luận tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu luận văn tốt nghiệp Các kết nghiên cứu khóa luận hoàn toàn trung thực, số liệu tính toán hoàn toàn xác chưa công bố công trình nghiên cứu Chu Thị Thảo Viện Đại học mở Hà nội Khóa luận tốt nghiệp ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, với phát triển kinh tế, đời sống người dân ngày cải thiện Tuy nhiên với thay đổi lối sống,chế độ ăn uống nhiều chất béo, giảm chất xơ với ô nhiễm môi trường ngày tăng khiến người dân phải đối mặt nhiều với bệnh mang tính xã hội cộng đồng tiểu đường, tim mạch, ung thư…Trong đái tháo đường bệnh hiểm nghèo chiếm vị trí thứ sau tim mạch ung thư [1,3] Tại Việt Nam, có khoảng 4,5 triệu người mắc bệnh tiểu đường có tới 65% người phát bệnh muộn.Hơn bệnh tiểu đường nguyên nhân nhiều bệnh hiểm nghèo, điển hình bệnh tim mạch vành, tai biến mạch máu não, mù mắt, suy thận liệt dương, hoại thư Vì bệnh tiểu đường xếp vào bệnh trọng điểm phòng chữa trị bệnh mãn tính [1] Tính đến thời điểm tại, có tới 150 triệu người mắc bệnh tiểu đường toàn giới Con số tăng lên 220 triệu người vào năm 2010, số dự báo tăng xấp xỉ 300 triệu người vào năm 2025 Trong tiểu đường tuyp chiếm 90% số người mắc bệnh.[25] Ngày nay, y học có nhiều phương pháp loại thuốc đặc hiệu để điều trị bệnh tiểu đường như: tiêm insulin; dùng loại thuốc nhóm Biguanides; Sulphonylurea, Glinidines, Thiazolidinediones, chất ức chế αglucosidase (alpha glucosidase inhibitors- AGIs) [14] Một loạt AGIs sử dụng để điều trị bệnh tiểu đường như: voblibose, acarbose, miglitol Tuy nhiên loại thuốc có nhược điểm gây tác dụng phụ cho người dùng như: đầy bụng, tiêu chảy, buồn nôn, chướng bụng đau, ngứa, phát ban, rối loạn chức gan [46] Touchi sản phẩm tạo đậu tương lên men truyền thống Nhiều nghiên cứu chứng minh touchi ức chế hoạt động enzyme α- Chu Thị Thảo Viện Đại học mở Hà nội Khóa luận tốt nghiệp glucosidase [15, 16, 17, 19, 30] Khi người ăn thực phẩm có nguồn gốc cacbohydrate để tạo maltose sucrose (disaccharides), Maltose sucrose bị thủy phân glucosidase thành monosaccharides (glucose fructose) để sau tuần hoàn khắp thể Với khả ức chế hoạt tính αglucosidase, chất chiết touchi làm giảm tỷ lệ tiêu hóa hấp thụ maltose sucrose ruột non để glucose máu không tăng đột ngột Ngày nay, chất chiết touchi trở thành loại thực phẩm chức dụng rộng rãi nước Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc…cho phòng chống hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường.[ [11,15] Ở nước ta, nghiên cứu tổng hợp AGIs đặc biệt từ đậu đen lên men nấm men, vi khuẩn hạn chế Trong đó, chế phẩm có khả kìm hãm glucosidase dùng cho người bị bệnh tiểu đường ngoại nhập với giá thành cao Trước tình hình trên, tiến hành thực đề tài: ‛‛ Nghiên cứu điều kiện lên men đậu đen Bacillus subtilis để thu hoạt chất kìm hãm α- glucosidase ” Nội dung đề tài gồm phần: - Tuyển chọn loại đậu đen lên men Bacillus subtilis cho hoạt tính kìm hãm α- glucosidase cao -Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis lên men cho hoạt tính kìm hãm αglucosidase cao -Lựa chọn thời gian lên men đậu đen lên men Bacillus subtilis cho hoạt tính kìm hãm α- glucosidase cao Chu Thị Thảo Viện Đại học mở Hà nội Khóa luận tốt nghiệp PHẦN I TỔNG QUAN 1.1 Bệnh tiểu đường phương pháp điều trị Bệnh tiểu đường (hay gọi bệnh đái tháo đường) bệnh rối loạn chuyển hóa carbohydrate insulin tuyến tụy bị thiếu hay giảm tác động thể, biểu mức đường máu cao 7mmol/l Glucose từ ruột vào máu tồi từ máu vào tế bào Insulin hormone có chức vận chuyển đường vào bên tế bào để trở thành lượng Khi thiếu insulin, đường không vận chuyển vào bên tế bào mà bị thải theo đường nước tiểu, người cảm thấy mệt mỏi, khát nước giảm cân Insulin điều hòa lượng đường máu mức bình thường Nếu tụy tạng không tạo insulin hay thể không sử dụng insulin, đường không vào bên tế bào, nguyên nhân nhiều bệnh hiểm nghèo như: tao biến mạch máu não, mù mắt, suy thận, liệt dương, hoại thư…Bệnh tiểu đường có tốc độ gia tăng nhanh giới nói chung Việt Nam nói riêng Theo tổ chức WHO, năm 1985 giới ước tính có khoảng 30 triệu người mắc bệnh tiểu đường Sau 10 năm (năm 1995) số lên đến 110 triệu người Năm 2000 có 180 triệu người số dự báo tăng xấp xỉ 330 triệu người, chiếm tỉ lệ 5,4% dân số toàn cầu vào năm 2030, chủ yếu đái tháo đường tuýp chiếm tỉ lệ 8595%.[34] Việt Nam nước phát triển,bệnh tiểu đường tăng lên nhanh chóng theo thời gian Theo số liệu điều tra quốc gia năm 2002-2003, tỷ lệ mắc bệnh nước 2,7%, chủ yếu tập trung độ tuổi lao động 30-64 tuổi (chiếm tỉ lệ 10,5%) chiếm tỉ lệ cao vùng đô thị khu công nghiệp (4,4%), đặc biệt thành phố lớn Hiện nay, tỷ lệ bệnh tiểu đường xếp thứ ba sau u bướu, tim mạch.[1] Chu Thị Thảo Viện Đại học mở Hà nội Khóa luận tốt nghiệp Cùng với gia tăng tỉ lệ mắc bệnh chi phí dành cho việc quản lý, chăm sóc điều thị bệnh tiểu đường tăng theo Hiện chi phí dành cho bệnh nhân tiểu đường khoảng 153-286 tỷ USD/năm dự kiến đến năm 2025 số lên tới 213-396 tỷ USD, chiếm 7-13% ngân sách y tế giới [2].Gánh nặng kinh tế đặt lớn, đặc biệt nước phát triển, kinh tế gặp nhiều khó khăn, điều kiện chăm sóc sức khỏe hạn chế Bệnh nhân tiểu đường chia thành nhóm -Tiểu đường tuýp 1: Do tế bào bê-ta bị phá hủy, gây nên thiếu hụt insulin tuyệt đối cho thể (nồng độ insulin giảm thấp hoàn toàn) Đái tháo đường tuýp chiếm tỷ lệ khoảng 5-10% bệnh dái tháo đường giới Đái tháo đường tuýp phụ thuộc nhiều vào yếu tố gen (di truyền) thường phát trước 40 tuổi Đa số trường hợp chuẩn đoán mắc bệnh đái tháo đường người trạng gày, nhiên người béo không loại trừ Người mắc bệnh đái tháo đường tuýp có đời sống phụ thuộc insulin hoàn toàn -Tiểu đường tuýp hay gọi tiểu đường không lệ thuộc insulin: chiếm tỷ lệ chủ yếu bệnh tiểu đường Chiếm tỷ lệ khoảng 90% đái tháo đường giới Nguyên nhân kháng insulin quan đích kèm theo suy giảm chức tế bào bê-ta suy giảm chức tế bào bê-ta kèm theo kháng insulin quan đích Đái tháo đường tuýp không phụ thuộc nhiều vào yếu tố di truyền, thường phát vào sau 40 tuổi Người mắc bệnh tiểu đường tuýp thường trạng béo Có thể điều trị bệnh cách thay đổi thói quen ăn uống, kết hợp dùng thuốc để kiểm soat đường huyết Tuy nhiên trình thực không tốt bệnh nhân phải điều trị cách dùng insulin [39] Đối với người bị bệnh tiểu đường xét nghiệm đường máu lúc đói nồng độ đường máu lúc đói nồng độ đường có giad trị ≥7,8mmol/l; thời Chu Thị Thảo Viện Đại học mở Hà nội Khóa luận tốt nghiệp gian gần tổ chức y tế giới đưa khuyến cáo số đường máu ≥ 7mmol/l chuẩn đoán đái tháo đường Bởi vì, lượng đường máu ≥ 7mmol/l người bệnh có nguy mắc bệnh tim mạch nguy khác dẫn đến tử vong can thiệp kịp thời.[39] Mặc dù biến chứng bệnh tiểu đường diễn biến từ từ khoảng thời gian dài cuối gây tàn phế chí đe dọa tính mạng Một số biến chứng quan trọng bao gồm:[3,5] • Biến chứng tim mạch máu: tiểu đường làm tăng nguy bị bệnh tim mạch, bao gồm bệnh mạch vành với đau thắt ngực, nhồi máu tim, tai biến mạch máu não, xơ vữa động mạch tăng huyết áp • Biến chứng thần kinh: đường huyết tăng cao gây tôn thương thành mạch máu nhỏ (mao mạch) nuôi dưỡng sợi thần kinh, đặc biệt chân Tổn thương gây triệu chứng: châm chích kiến bò, tê chân, nóng rát hay đau thường ngón chân,ngón tay lan dần lên Nếu đường huyết không kiểm soát tốt gây tất cảm giác chi làm tăng nguy bị nhiễm trùng chân, đoạn chi • Biến chứng thận: thận chứa hàng triệu búi mạch máu nhỏ có chức lọc chất thải khỏi thể Bệnh tiểu đường làm tổn thương hệ thống Cuối dẫn tới suy thận hay bệnh thận giai đoạn cuối phục hồi được, phải chạy thận nhân tạo hay ghép thận • Biến chứng mắt: tiểu đường gây tổn thương mạch máu võng mạc (bệnh võng mạc tiểu đường) dẫn tới giảm thị lực Tiểu đường làm tăng nguy bị bệnh ly khác đục thủy tinh thể glaucoma • Biến chứng chân: tiểu đường gây tổn thương thần kinh chân giảm cung cấp máu tới chi Nếu không điều trị kịp thời, vết thương hay nốt phồng bị nhiễm trùng Đối với tổn thương trần trọng Chu Thị Thảo 10 Viện Đại học mở Hà nội Khóa luận tốt nghiệp glucoamylase loại đậu D1, EZ3 lên men chủng Bacillus subtilis M1 thời gian ngày, ngày, ngày Kết thể hình 3.3 3.4 Hình 3.2 Biểu đồ thể ảnh hưởng nguồn nguyên liệu ban đầu đến khả sinh chất ức chế α-amylase Hình 3.3 Biểu đồ thể ảnh hưởng nguồn nguyên liệu ban đầu đến khả sinh chất ức chế glucoamylase Chu Thị Thảo 36 Viện Đại học mở Hà nội Khóa luận tốt nghiệp Kết cho thấy dùng chủng Bacillus subtilis M1 để lên men mẫu đậu Đ1 EZ3 sau khoảng thời gian lên men nhau, mẫu đậu đen Đ1 cho hoạt tính ức chế α –amylasevà glucoamylase cao Do mẫu đậu Đ1 lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu Đồng thời hoạt tính kìm hãm có xu hướng tăng ngày thứ giảm ngày thứ Do lên men ngày thời gian thích hợp để thu hồi hoạt chất kìm hãm từ đậu đen lên men bới B subtilis M1 3.4 Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis cho hoạt tính ức chế cao Ta tiến hành lên men đậu Đ1 chủng Bacillus subtilis M1, BKH, ĐT2 sau khoảng thời gian ngày, ngày Sau xác định hoạt tính ức chế amylase mẫu để tìm chủng lên men đậu Đ1 cho hoạt tính ức chế cao Kết biểu diễn đồ thị 3.5 3.6 Hình 3.4 Biểu đồ so sánh khả sinh chất ức chế α-amylase lên men mẫu đậu Đ1 chủng Bacillus subtilis M1, BKH, ĐT2 Chu Thị Thảo 37 Viện Đại học mở Hà nội Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.5 Biểu đồ so sánh khả sinh chất ức chế AMG lên men mẫu đậu Đ1 chủng Bacillus subtilis M1, BKH, ĐT2 Kết cho thấy lên men đậu đen Đ1 chủng Bacillus subtilis M1, BKH, DT2, sau khoảng thời gian lên men nhau, chủng Bacillus subtilus M1 cho hoạt tính kìm hãm α –amylasevà glucoamylase cao chủng Do chủng Bacillus subtilus M1 lựa chọn để lên men đậu đen Đ1 Kết bảng 3.5 3.6 lần cho thấy hoạt tính kìm hãm α –amylasevà glucoamylase ngầy lên men thứ cao ngày thứ chủng nghiên cứu 3.5 Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả ức chế amylase sản phẩm lên men từ mẫu đậu Đ1 Sau lên men loại đậu Đ1 nhờ vi khuẩn Bacillus subtilis M1, ta tiến hành xác định ảnh hưởng thời gian lên men đến khả ức chế amylase cách: xác định khả ức chế amylase mẫu thủy phân khoảng thời gian khác ngày, ngày, ngày Chu Thị Thảo 38 Viện Đại học mở Hà nội Khóa luận tốt nghiệp Kết đánh giá trình bày hình 3.7 Hình 3.6 Biểu đồ ảnh hưởng thời gian lên men đến khả ức chế amylase sản phẩm lên men từ mẫu đậu Đ1 Từ kết trên, ta thấy thời gian lên men khoảng từ đến ngày khả ức chế α-amylase tăng dần, ngày thứ hoạt tính ức chế đạt cao ( 98,99% α-amylase, 100% glucoamylase) Trong khoảng thời gian từ ngày lên men thứ đến hoạt tính ức chế giảm rõ rệt Chu Thị Thảo 39 Viện Đại học mở Hà nội Khóa luận tốt nghiệp PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Sử dụng nước cất làm dung môi để tách chiết hợp chất kìm hãm mẫu đậu sau lên men Trong loại đậu Đ1 EZ3, chọn loại đậu Đ1 cho hoạt tính ức chế amylase cao lên men chủng Bacillus subtilis M1 Trong chủng Bacillus subtilis M1, BKH, DT2, chủng Bacillus subtilis M1 lên men đậu đen cho hoạt tính ức chế amylase cao Thời gian lên men cho hoạt tính ức chế amylase cao ngày 4.2 Kiến nghị Xác định hoạt tính ức chế α-glucosidase sản phẩm lên men đậu đen B subtilis M1 Tối ưu điều kiện tách chiết hoạt chất ức chế α-glucosidase Xây dựng qui trình thu nhận hoạt chất ức chế α-glucosidase sản phẩm lên men đậu đen B subtilis M1 Chu Thị Thảo 40 Viện Đại học mở Hà nội Khóa luận tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Tạ Văn Bình (2006), bệnh đái tháo đường tăng glucose máu, NXB y học, Hà Nội Phùng Thanh Hương, Trần văn Ơn, Nguyễn Thùy Dương, Nguyễn Văn Tuấn (2010), ‘‘ Tác dụng hạ đường huyết dân gian miền núi phía bắc Việt Nam ’’, tạp chí Dược học số (412), tr 28-33 Nguyễn Phú Kháng (2008), Bệnh học nội khoa cấp II, nhà xuất Quân đội nhân dân, Hà Nội Trương Hương Lan cộng (2005-2007), ‘‘ Nghiên cứu công nghệ sản xuất thức ăn từ nông sản có tác dụng giảm hàm lượng đường máu’’, Báo cáo khoa học Viện công nghệ thực phẩm Nguyễn Văn Nguyện, Nguyễn Hương Trà, Nguyễn Hồng Hà(2007), ‘‘Nghiên cứu thăm dò công nghệ chiết xuất chất touchi từ đậu tương lên men’’, Báo cáo khoa học Viện Cơ điện NN công nghệ STH Lương Đức Phẩm (1998), Công nghệ vi sinh vật, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, Hà Nội 7.Đỗ Trung Quân (2006), Biến chứng bệnh đái tháo đường điều trị, NXB y học, 2006 Đỗ Thị Ánh Nguyệt, Nuyễn Trần Thị Giáng Hương, Nguyễn Duy Thuần, Nguyễn Viết Thân, Nguyễn Thị Kim Quế (2009), ‘‘ Bước đầu đánh giá tác dụng hạ đường huyết rễ chóc máu (Salacia cochinchinensis) chuột nhắt bị tăng đường huyết streptozocin’’, Tạp chí dược học(399), tr 28-32 Nguyễn Thị Hoài Trâm (2007), ‘‘ Nghiên cứu công nghệ sản xuất thực phẩm chức bổ sung từ vi sinh vật’’ Báo cáo tổng kết đề tài Viện Công nghệ Thực phẩm 10 Bùi Kim Thúy (2008), ‘‘ Nghiên cứu công nghệ sản xuất fructooligosaccharides làm thực phẩm chức năng’’, Báo cáo cáo khoa học Viện công nghệ thực phẩm Chu Thị Thảo 41 Viện Đại học mở Hà nội Khóa luận tốt nghiệp Tài liệu tiếng Anh : 11 Application for the approval of touchi extract under regulation (EC) No 258/97 of the european parliament and of the council of 27 january 1997 concerning novel foods and novel food ingredients CBC Co, Ltd July 3, 2008 12 Barbesgaard, P., Heldt- Hansen, H P., Diderichsen, B (1992), ‘‘On the safety of Aspergillus oryZae: a review’’, Appl Microbiol Biotechnol 36: 569572 13 Eduardo Borges de Melo, Adriane da Silveira Gomes and Ivone Carvalho (2006), ‘‘α-and β-Glucosidase inhibitors: chemical structure and biological activity’’, Tetrahedron 62, 10277-10302 14 Floris Alexander van de Laar (2008), ‘‘Alpha-glucosidase inhibitors in the early treatment of type diabetes’’, Vascular Health and Risk Management (6), pp 1189-1195 15 Fujita Hiroyukia, Yamagami Tomohidea, Ohshima Kazunorib (2001), ‘‘Efficacy and safety of Touchi Extract, an α-glucosidaza inhibitor derived from fermented soybeans, in non-insulin-dependent diabetic mellitus’’, Journal of Nutritional Biochemistry 12,pp 351-356 16 Hiroyuki Fujita, Tomohide Yamagami and Kazunori Ohshima, (2001), “ Long- Team Ingestion of a Fermented Soybean-Derived Touchi-Extract with α-glucosidaza Inhibitory Activity Is safe and Effective in Humans with Borderline and Mild Type-2 Diabetes’’, The journal of nutrittion 23, pp 20152108 17 Hiroyuki Fujita, Tomohide Yamagami, (2001), ‘‘Fermented Soybeanderived Touchi-Extract with anti- diabetic effect via α-glucosidaza inhibitory action in a long-term admonistration study with KKAy mice ”, Life Sciences 70, pp.219- 227 18 Ingavat, N., Dobereiner, J., Wiyakarutta, S., Mahidol, C., Ruchirawat, S., Kittakoop, P.(2009), ‘‘Aspergilluso A, an alpha-glucosidase inhibitor from the marine- derived fungus Aspergillus aculeatus’’, J Nat Prod 72(11), pp.20492052 Chu Thị Thảo 42 Viện Đại học mở Hà nội Khóa luận tốt nghiệp 19 Jing Chen, Yong- Qiang Cheng, Kohji Yamaki, Li-Te Li, (2007), ‘‘Anti- αglucosidaza activity of Chinese traditionally fermented soybean (douchi), Food Chemistry 103, pp.1091-1096 20 Kameda, Y., Asano, N., Yoshikawa, M., Takeuchi, M., Yamaguchi, T., Matsui, K., Horri, S and Fukase, H.(1984), ‘‘Valiolamine, a new αglucosidaza inhibiting aminocyclitol produced by Streptomyces hygroscopicus J Antibiot’’ 37, pp 1301-1307 21 Kita, A., Matsui, H.,Somoto, A.,Kimura, A., Takata, M.,& Chiba, S., (1991), ‘‘ substrate specificity and subsite affinities of crystalline αglucosidase from Aspergillus oryzae ’’, Agric Biol Chem 55, pp.2327-2335 22 Kling M A (2002), ‘‘Biogeography of Aspergillus species in soil and litter’’, Mycologia 94, pp 21-27 23 Kling M A (2007), ‘‘Identification of commom Aspergillus species’’, Centraabureau voor Schimmelcultures, Utrecht, The Netherlands (39 24 Kwon, O S., Park, S.H., Yun, B S., Pyun, Y.R., Kim, C.J.(2000), ‘‘Cyclo (Dehydroala-L-Leu) an alpha-glucosidase inhibitor from Penicillium sp.f70614’’, the journal of antibiotics 53 (9), pp.954-958 25 Li Y., Wen, S., Kota, B P., Peng, G Q., Yamahara, J., Roufogalis, B D (2005), ‘‘punica granatum flower extract, a potent alpha-glucosidase inhibitor improves postprandial hyperglycemia in Zucker diabetic fatty rats’’, j Ethnorphamamacol 99, pp 39-44 26,Mitsuo Hayashia, Nobuo Sakairi, Hiroyqgshi Kuzuhara, Riken, Motoyuki Yajima (1989), ‘‘ Synthesis of ‘‘Dihyroacarbose’’, an alpha-glucosidase inhibitor having a pseudo-tetrasaccharide structure’’, Carbohydrate Research 194, pp 233-246 27 Nguyen, H T., Kim, S.M (2009), ‘‘three compounds with potent alphaglucosidase inhibitory activity purified from sea cucumber’’ Stichopus japonicas 28 Nippon Supplement Inc Research and Development Department (1999), ‘‘Safety Test of Touchi Extract after Bolus Administration in Healthy subjects’’,nippon supplement inc research and development department, Osaka, Japan Chu Thị Thảo 43 Viện Đại học mở Hà nội Khóa luận tốt nghiệp 29 Schimidt, D., D., Fromer, W., Muller, L., Junge, B., Wingender, W., And Truscheit, E (1977), ‘‘alpha-glucosidase inhibitor, new complex oligosacharides of microbial origin” , Naturwissenshaften 64, pp 535-636(56 30 Enzymatic assay of α-glucosidase (EC.3.2.1.20) 31 Yun-Ping Zhu, Li-Jun Yin, Yong- Qiang Cheng, KohJi Yamaki, Yutaka Mori, Yi- Cheng Su, Li- Te Li (2007), ‘‘Effects of sources of carbon and nitrogen on production of α-glucosidase inhibitor by a newly isolated strain of Bacillus subtilis B2’’, 737-747 32 McCater, J.D and Withers, S.G (1994), ‘‘Mechanism of enzymeatic glucoside hydrolysis’’, Curr Opin Struct Biol 4: 885-892 33 Woo Duck Seo, Hyun Sun Lee, Min Suk Yanga, Ki Hun Park (2005), " Sulfonamide chalcone as a new class of a-gluccosidase inhibitors " , Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 15, pp.5514-5516 34 World Health Organization (2006), "Definition and diagnosis of Diabetes mellitus and intermediate hyperglycaemia ", report of a WHO\IDF consultation, pp.1,2,3,10,27,37 35 Yong-Mu Kim ,Myeong-Hyeon Wang and Hae-lk Rhee (2004), "A novel a-glucosidase inhibitor from pine bark" , carbohydrate Research 339, pp.715717 36 Yoshikawa, M., Murakami, T., Shimada, H., Matsuda, H., Yamahare, J., Tanabe, G., Muraoka, O (1997),"Salaconol,potent antidiebetic ptinciple with unique thiosugar sulfonium sulfate structure from the ayuvedic tradition medical Salacia reticulate in sri lanka and India" Tetrahedron Lett 38, pp.8367-8370 37 Young in Know,Hyeog-Jin Son Kil Ahn and Chung IL Hong (2002), "Novel @-Glucosidase Inhibitors, CKD-711 by Streptomyces sp CK-4416", The Journal of antibiotics 55 (5),pp.462-466 38 Yun-Ping Zhu, Li-Jun Yin,Yong-Qiang Chen , Kohji Yamaki, (2008), " Effects of sources of carbon and nitrogen on production of @-glucosidase inhibitor by a newly isolated strain of bacillus subtilis B2", Food Chemistry 109,pp.737-742 Chu Thị Thảo 44 Viện Đại học mở Hà nội Khóa luận tốt nghiệp PHỤ LỤC I.cách pha dung dịch cần thiết I.1 Dung dịch DNS DNS (3,5 dinitro salicylic) : 10,6g NaOH : 19,8g Nước cất : 1416ml Hòa tan chất sau thêm vào: Muối K-Na Tartrate : 306g Phenol (nóng chảy 50oC) : 7,6ml Sodium metabisulphate (Na2S2O5) : 8,3g I.2 Môi trường LB Cao nấm men : 0,5g Pepton : 1g Glucose : 1g Nacl : 1g Nước cất : 100ml I.3 Dung dịch α-amylase 0,05% Trước tiên ta pha dung dịch α-amylase 0,5% : Enzyme α-amylase : 0,1g Nước cất : 20ml Voltex dung dịch trên, pha loãng 10 lần nước cất ta dung dịch αamylase 0,05% Đem bảo quản tủ lạnh I.4 Dung dịch enzyem AMG 0,05% Chu Thị Thảo 45 Viện Đại học mở Hà nội Khóa luận tốt nghiệp Enzym AMG : 0,1ml Nước cất : 20ml Voltex dung dịch trên, pha loãng 10 lần nước cất ta dung dịch AMG 0,05% Đem bảo quản tủ lạnh I.5 dung dịch tinh bột 0,5% Tinh bột tan : 5g Nước cất : 100ml Khấy đều, dùng lò vi sóng làm nóng dung dịch để tạo điều kiện cho tinh bột tan II Xây dựng đường chuẩn glucose Từ dung dịch glucose 0,25% ta tính toán để thu dung dịch glucose có nồng độ cần dùng: Bảng P-1: Kết xây dựng đường chuẩn glucose STT Nồng độ Glucose (mg/ml) dd Glucose (µl) nước cất (µl) OD (575nm) 0.25 2000 0.931 0.2 1600 400 0.737 0.15 1200 800 0.529 0.1 800 1200 0.32 0.05 400 1600 0.09 Chu Thị Thảo 46 Viện Đại học mở Hà nội Khóa luận tốt nghiệp Hình P-1: Phương trình đường chuẩn glucose III Kết Ảnh hưởng nguồn nguyên liệu ban đầu đến khả ức chế amylase Bảng P-2 Kết ảnh hưởng nguồn nguyên liệu ban đầu đến khả sinh chất ức chế α-amylase Chủng ODkc Đ1- lên men ngày ODtn ODsm Δ OD % ức chế 0,198 0,591 0,488 0,095 47,8 Đ1- lên men ngày 0,198 0,137 0,135 0,196 98,99 Đ1- lên men ngày 0,198 0,265 0,159 0,092 46,46 EZ3-lên men ngày 0,198 0,736 0,597 0,059 29,80 EZ3-lên men ngày 0,198 0,669 0,585 0,114 57,58 EZ3-lên men ngày 0,198 0,891 0,753 0,06 30,30 Bảng P-3 Kết ảnh hưởng nguồn nguyên liệu ban đầu đến khả sinh chất ức chế AMG Chủng ODkc ODtn ODsm Δ OD % ức chế Đ1- lên men ngày 0,257 0,581 0,488 0,164 63,81 Chu Thị Thảo 47 Viện Đại học mở Hà nội Khóa luận tốt nghiệp Đ1- lên men ngày 0,257 0,135 0,135 0,257 100 Đ1- lên men ngày 0,257 0,25 0,159 0,166 64,59 EZ3-lên men ngày 0,257 0,73 0,597 0,124 48,25 EZ3-lên men ngày 0,257 0,635 0,585 0,207 80,54 EZ3-lên men ngày 0,257 0,887 0,753 0,123 47,86 VI Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis cho hoạt tính ức chế cao Bảng P-4 Kết so sánh khả sinh chất ức chế α-amylase sử dụng chủng Bacillus subtilis M1, BKH, ĐT2 sau ngày lên men Chủng ODkc ODtn ODsm Δ OD % ức chế M1 0,198 0,591 0,488 0,095 47,98 BKH 0,198 0,767 0,648 0,079 39,9 DT2 0,198 0,832 0,659 0,025 12,63 Bảng P-5: Kết so sánh khả sinh chất ức chế AMG sử dụng chủng Bacillus subtilis M1, BKH, ĐT2 sau ngày lên men Chủng ODkc ODtn ODsm Δ OD % ức chế M1 0,581 0,488 0,164 63,81 Chu Thị Thảo 0,257 48 Viện Đại học mở Hà nội Khóa luận tốt nghiệp BKH 0,257 0,763 0,648 0,142 55,25 DT2 0,257 0,832 0,659 0,084 32,68 Báng P-6: Kết so sánh khả sinh chất ức chế α-amylase sử dụng chủng Bacillus subtilis sau ngày lên men Chủng ODkc ODtn ODsm Δ OD % ức chế M1 0,198 0,137 0,135 0,196 98,99 BKH 0,198 0,201 0,134 0,131 66,16 DT2 0,198 0,444 0,283 0,037 18,69 Bảng P-7: Kết so sánh khả sinh chất ức chế AMG sử dụng chủng Bacillus subtilis sau ngày lên men Chủng ODkc ODtn ODsm Δ OD % ức chế M1 0.257 0.135 0.135 0.257 100 BKH 0.257 0.189 0.134 0.202 78.6 DT2 0.257 0.439 0.283 0.101 39.3 V Phương pháp đánh giá ảnh hưởng thời gian lên men đến khả kìm hãm amylase Bảng P-8: Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả ức chế α-amylase sản phẩm lên men từ mẫu đậu Đ1 Chu Thị Thảo 49 Viện Đại học mở Hà nội Khóa luận tốt nghiệp Thời gian OD OD tn ODsm OD % Ức chế ngày 0,198 0,591 0,488 0,095 47,98 ngày 0,198 0,137 0,135 0,196 98,99 ngày 0,198 0,265 0,159 0,092 46,46 Bảng P-9: Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả ức chế AMG sản phẩm lên men từ mẫu đậu Đ1 Mẫu OD ODtn ODsm  OD % Ức chế ngày 0,257 0,581 0,488 0,164 63,81 ngày 0,257 0,135 0,135 0,257 100 ngày 0,257 0,25 0,159 0,166 64,59 Chu Thị Thảo 50