Đang tải... (xem toàn văn)
Chondroitin một polymer mạch thẳng, cấu tạo từ các đơn vị cơ bản là disaccharide acid D-glucuronic (GlcA) và N-acetyl-D-galactosamine (GalNAc), các gốc đường này được sulfate hóa hay không bị sulfate hóa. Chiều dài của chuỗi thì khác nhau, khoảng 200 – 250 đơn vị disaccharide. Disaccharides của Chondroitin sulfate có thể khác nhau về số lượng và vị trí sulfate hóa. Các vị trí sulfate hóa thông thường sẽ tạo thành các loại chondroitin sulfate: Chondroitin-4-sulfate (CS4): gốc sulfate gắn ở vị trí C-4 của GalNAc, có nhiều ở mô sụn, CS có thể kết hợp với protein tạo nên chondromucoit. Chondroitin-6-sulfate (CS6): gốc sulfate gắn ở vị trí C-6 GalNAc. Chondroitin-2,6-sulfate: gốc sulfate gắn ở vị trí C-2 của GlcA và C-6 GalNAc. Chondroitin-4,6-sulfate: gốc sulfate gắn ở vị trí C-4 và C-6 GalNAc. Mỗi chuỗi Chondroitin sulfate có thể chứa nhiều disaccharide và sẽ có chiều dài khác nhau. Phần sulfate là một polysaccharide phức tạp, không đồng nhất với sự khác nhau về mật độ điện tích và khối lượng phân tử, dẫn đến ảnh hưởng đến đặc tính hóa học và tác dụng sinh dược học.
Nhóm 4: Định lượng Chondroitin Sulfate từ ống hô hấp gà ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÁO CÁO MÔN HỌC CÁC PP PHÂN TÍCH TRONG NGHIÊN CỨU THỰC PHẨM ĐỀ TÀI: PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CHONDROITIN SULFATE TỪ ỐNG CỔ GÀ GVHD: TS Phan Ngọc Hòa HVTH: Nhóm Page Nhóm 4: Định lượng Chondroitin Sulfate từ ống hô hấp gà MỤC LỤC Tổng quan Chondroitin Sulfate (CS) 1.1 Cấu trúc Chondroitin Sulfate (CS) Chondroitin polymer mạch thẳng, cấu tạo từ đơn vị disaccharide acid D-glucuronic (GlcA) N-acetyl-D-galactosamine (GalNAc), gốc đường sulfate hóa hay không bị sulfate hóa Chiều dài chuỗi khác nhau, khoảng 200 – 250 đơn vị disaccharide Disaccharides Chondroitin sulfate khác số lượng vị trí sulfate hóa Các vị trí sulfate hóa thông thường tạo thành loại chondroitin sulfate: Chondroitin-4-sulfate (CS4): gốc sulfate gắn vị trí C-4 GalNAc, có nhiều mô sụn, CS kết hợp với protein tạo nên chondromucoit Chondroitin-6-sulfate (CS6): gốc sulfate gắn vị trí C-6 GalNAc Chondroitin-2,6-sulfate: gốc sulfate gắn vị trí C-2 GlcA C-6 GalNAc Chondroitin-4,6-sulfate: gốc sulfate gắn vị trí C-4 C-6 GalNAc Mỗi chuỗi Chondroitin sulfate chứa nhiều disaccharide có chiều dài khác Phần sulfate polysaccharide phức tạp, không đồng với khác mật độ điện tích khối lượng phân tử, dẫn đến ảnh hưởng đến đặc tính hóa học tác dụng sinh dược học Page Nhóm 4: Định lượng Chondroitin Sulfate từ ống hô hấp gà Hình 1: Các dạng Chondroitin sulfate (CS) Chondroitin sulfate năm loại glycosaminoglycan (GAGs) bao gồm: Chondroitin sulfate, Heparan sulfate, Keratan sulfate, Dermatan sulfate acid Hyaluronic (HA) GAGs polysaccharide mạch dài thẳng, chứa chuỗi lặp lặp lại, đơn vị bao gồm hexosamin (N-acetylglucosamin N-acetylgalactosamin) acid uronic (acid glucuronic iduronic) Hình 2: Các loại glycosaminoglycan (GAGs) Kato (1994) Bernfield (1999) nhận thấy Chondroitin sulfate thường gắn với protein liên kết o-lycosid tạo thành proteoglycan (PG), hợp chất hữu thuộc nhóm mucopolysaccharide Sự kết hợp nhóm sulfate (SO 42-) gốc đường với nhóm cacboxyl (-COO-) gốc acid làm cho phân tử Chondroitin sulfate mang điện tích âm nhiều Page Nhóm 4: Định lượng Chondroitin Sulfate từ ống hô hấp gà (amonic polysaccharide) dễ dàng liên kết đồng hóa trị với protein cấu tạo PG Chuỗi Chondroitin sulfate gắn với nhóm –OH gốc serine số protein Hình 3: Cấu trúc proteoglycans Proteoglycan (PG) gắn kết với acid Hyaluronic (HA) tạo thành phức hệ thủy động có khả nén thuận nghịch cần thiết cho sụn để chống lại nén ép biến dạng nhỏ Dưới điều kiện bình thường, nước bị hút vào sụn GAG tích điện âm bị đính mạng lưới Khi có lực lên bề mặt sụn làm bị biến dạng hay méo mó (ví dụ lực để chịu đựng trọng lượng nặng) nước sụn có kháng cự lại lực nước với GAG cản trợ vật lý tạo khối aggrecan-hyaluronate Hình 4: Cấu trúc sụn Chondroitin Sulfate ống hô hấp gà Page Nhóm 4: Định lượng Chondroitin Sulfate từ ống hô hấp gà 1.2 Vai trò Chondroitin sulfate có nhiều sụn khớp nhiều mô khác như: xương, dây chằng, đĩa đệm đốt sống, động mạch chủ, giác mạt (mắt) da Chiều dài chuỗi khác nhau, khoảng 200 – 250 đơn vị disaccharide Các vị trí sulfate hóa chưa nghiên cứu hiểu rõ ràng mật độ xuất vị trí sulfate hóa tùy vào tuổi vị trí Sulfate hóa vị trí thứ có nhiều sụn non, sâu hơn, chưa trưởng thành sulfate hóa vị trí thứ tìm thấy sụn trưởng thành, già hơn, mỏng Thêm vào đó, khác thường sulfate hóa thường xuất sụn bị viêm khớp Chondroitin sulfate sụn khớp - Các công trình nghiên cứu năm gần cho thấy Chondroitin (sụn vi cá mập) có tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh lý xương khớp, chondroitin tham gia vào cấu trúc màng tế bào, có thành phần sợi chun mạch máu lớn, chiếm tỷ lệ cao chất mô sụn xương nên bảo đảm cho sụn xương có độ mà có tính đàn hồi - Chondroitin nguyên liệu chủ yếu trình tái tạo mô sụn xương Chất có tác dụng ức chế enzym elastase (enzyme chất trung gian gây thoái hóa sụn khớp); kích thích trình tổng hợp proteoglycan (là glycoprotein có tỷ lệ glucid cao) nên định dùng bổ trợ chứng hư thoái hóa khớp Ở nhiều nước, chondroitin sulfat xem chế phẩm bổ sung dinh dưỡng; nhiều bác sĩ chuyên khoa phối hợp với glucosamin sulfat (một hợp chất thiên nhiên khác) dùng vào điều trị viêm xương khớp có tác dụng tốt Chondroitin sulfate mắt - Tại mắt, Chondroitin sulfate có tác dụng quan trọng cấu trúc suốt đàn hồi giác mạc, trì hoạt động sinh lý bình thường mắt Các nhà nghiên cứu Page Nhóm 4: Định lượng Chondroitin Sulfate từ ống hô hấp gà thấy Chondroitin sulfate có thành phần phim nước mắt, góp phần bảo vệ tế bào biểu mô giác mạc - Khi nhỏ vào mắt, Chondroitin Sulfate tạo nên lớp nhầy giữ cho nước mắt lưu lại bề mặt nhãn cầu lâu hơn, chống khô mắt Với phát này, Chondroitin sulfate dùng thuốc nhỏ mắt để phòng ngừa điều trị tình trạng khô mắt Ngoài ra, Chondroitin sulfate sử dụng để điều chế chất nhầy - chất thường dùng phẫu thuật lấy thể thủy tinh đặt thủy tinh thể nhân tạo nhằm bảo vệ biểu mô nội mô giác mạc Tác dụng chữa bệnh ung thư Cá mập loại cá mắc bệnh ung thư Tần suất bị ung cá mập phần triệu, loài cá khác tần suất mắc bệnh 2-3% Lý giải cho khả kỳ diệu chất chondroitin sulfat có sụn vi cá mập Các khối ung thư phát triển nhanh, nên phải luôn tạo mạch máu nhằm đáp ứng nhu cầu cao máu chất bổ dưỡng cho phát triển, tăng trưởng mạnh Để làm việc khối ung thư luôn sinh chất angiogenesis có tác dụng kích thích trình tạo sinh tân mạch Nếu hoạt chất angiogenesis bị ức chế, tân mạch không tạo ra, khối u thiếu máu nuôi, tế bào ung thư không sinh sản được, khối u ngừng tăng trưởng, bệnh ung thư bị chặn lại Người ta thấy chất chondroitin sụn vi cá mập ức chế hoạt chất angiogenesis Chondroitin sulfate tế bào - Chondroitin sulfate tham gia cấu trúc tế bào bào quan, bảo đảm cho tế bào thực chức ngăn chặn thoái hoá tế bào - Chondroitin sulfate mạch máu - Chondroitin sulfate tham gia cấu trúc màng mạch máu, góp phần đảm bảo tính đàn hồi đặc biệt mạch máu lớn có nhiều sợi chun Chondroitin sulfate có vai trò quan trọng - Chondroitin sulfate mô, đặc biệt mô liên kết: gân - - dây chằng, Chondroitin sulfate đảm bảo tính đàn hồi 1.3 Nguồn gốc Nguồn nguyên liệu chứa nhiều Chondroitin sulfate chủ yếu động vật loài gia súc, gia cầm: heo, bò, gà Chúng tập trung chủ yếu vào mô sụn như: (keel) ức gà, chân gà, tai Page Nhóm 4: Định lượng Chondroitin Sulfate từ ống hô hấp gà heo, sụn khí quản bò, mũi heo, sụn chim… nguồn khác vi cá mập, sụn cá chứa chúng Hình 5: Nguyên liệu chứa Chondroitin Sụn từ xương hàm cá sấu sụn gà (keel) thực phẩm chứa nhiều chondroitin sulfate, 14.84 14.08% tính theo trọng lượng sụn khô (Bảng 1) Chondroitin sulfate keel gà sụn chiếm (16,8%) [báo cáo Luo et al.] Hàm lượng chondroitin sulfate từ sụn khác như: sụn xương ức cá sấu 11,55%, sụn khí quản cá sấu 9,51%, sụn vây cá mập 9,6%, sụn sườn cá sấu 5,56%, sụn cá đuối 5,27% (Bảng 1) Sự khác biệt hàm lượng chondronitin sulfate khác loài, địa điểm sinh sống, phương pháp phân tách trích xuất khác cho loại sụn Bảng Tỷ lệ loại chondroitin sulfate (CS) từ loài động vật khác Page Nhóm 4: Định lượng Chondroitin Sulfate từ ống hô hấp gà Bảng Tỷ lệ loại chondroitin sulfate (CS) từ loài động vật khác Page Nhóm 4: Định lượng Chondroitin Sulfate từ ống hô hấp gà Theo phân tích thành phần chondroitin sunfate từ sụn nguồn điển hình tự nhiên Phân tử lượng chondroitin sulfate từ động vật có sừng heo: 14 - 26 kDa, từ cá mập cá đuối cao (50 -70 kDa) Ở động vật có sừng tỷ lệ chondroitin-4-sulfate: 61% chondroitin-6-sulfate: 33%, gà chondroitin-4-sulfate: 72% heo chondroitin-4-sulfate: 80% Cá đuối có chodroitin-6-sulfate: 39%, chondroitin disulfate: 15% cá mập có chondroitin-6-sulfate: 50%, chondroitin disulfate: 18% Các phương pháp phân tích hàm lượng chất dinh dưỡng từ ống hô hấp gà Nhìn chung, có nhiều phương pháp chuẩn dùng để phân tích hàm lượng protein, hàm lượng carbohydrate, hàm lượng lipid, hàm lượng tro, độ ẩm… kể đến như: AOAC, FAO FBN, TCVN, ISO… Báo cáo tham khảo phương pháp phân tích Trung Tâm (QUATEST 3), đối tượng phân tích vào nhóm: Thịt sản phẩm thịt 2.1 Xác định độ ẩm (phương pháp chuẩn) Viện dẫn: TCVN 8135:2009 (tương đương ISO 1442:1997) Nguyên tắc: Trộn kỹ phần mẫu thử với cát sấy 103 oC ± oC đến khối lượng không đổi Vật liệu: Page Nhóm 4: Định lượng Chondroitin Sulfate từ ống hô hấp gà Cát sử dụng khả hút ẩm tốt Thông thường, hàm lượng ẩm thịt cao, sấy thông thường, ẩm không thoát triệt để Vì vậy, phương pháp dùng cát loại nguyên liệu hỗ trợ trình sấy Sạch, rửa axit, cỡ hạt lọt qua sàng cỡ lỗ 1,4 mm giữ lại sàng cỡ lỗ 250 µm Trước sử dụng, sấy cát nhiệt độ 150 oC đến 160 oC bảo quản lọ có nắp đậy kín khí Chú thích: Nếu không sẵn có cát (được rửa axit), cát làm sau: Rửa cát dòng nước chảy Đun sôi cát với axit clohydric loãng, ρ20 = 1,19 g/ml, pha loãng (1:1), 30 phút liên tục khuấy Lặp lại trình đun sôi với phần khác axit axit màu vàng sau sôi Rửa cát nước cất âm tính với phép thử clorua Sấy cát 150 °C đến 160 °C để bảo quản Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường cụ thể sau: - Thiết bị đồng hóa điện cơ, có khả đồng hoá mẫu phòng thử nghiệm Thiết bị gồm: máy cắt quay tốc độ cao, máy xay có gắn đục lỗ, - đường kính lỗ không 4,0 mm Đĩa đáy phẳng, sứ kim loại (ví dụ, niken, nhôm, thép không gỉ), đường kính 60 mm cao khoảng 25 mm Đũa thủy tinh mỏng, đầu bằng, dài đường kính đĩa (5.2) Tủ sấy, làm nóng điện, có khả hoạt động 103 °C ± °C Bình hút ẩm, chứa chất hút ẩm hiệu quả, ví dụ silica gel Cân phân tích, cân xác đến 0,001 g Lấy mẫu & chuẩn bị - Lấy 200 g mẫu đại điện Đồng hóa mẫu phòng thử nghiệm Chú ý để nhiệt độ mẫu nguyên liệu không tăng 25 °C Lưu trữ vào vật chứa kín bảo quản để mẫu không bị giảm chất lượng Phân tích mẫu thử vòng 24 h sau đồng hóa Cách tiến hành Dùng đũa thủy tinh để trộn mẫu đĩa Chuyển vào đĩa lượng ~ 5-8 g, sấy khô đĩa Sấy với mẫu đũa thủy tinh ~2 h tủ sấy 103 °C Lấy đĩa với mẫu, đũa thủy tinh khỏi tủ sấy đặt bình hút ẩm Để đĩa với mẫu đũa thủy tinh nguội đến nhiệt độ phòng, cân xác đến 0,001 g (mo) Page 10 Nhóm 4: Định lượng Chondroitin Sulfate từ ống hô hấp gà - α khác nhiều khả tách rõ rãng, tối ưu từ 1,5 - Độ phân giải: Đặc trưng cho mức độ tách chất khỏi điều kiện sắc ký, đại lượng biểu thị rõ ba khả cột sắc ký là: giải hấp, chọn lọc, hiệu tách Độ phân giải peak cạnh tính theo công thức: Hay - Độ phân giải đạt R = 1,5 Hệ số bất đối AF: Cho biết mức độ cân đối pic sắc ký, tính theo công thức: Trong đó: + W1/2: chiều rộng pic đo 1/2 chiều cao pic + a: khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép cong phía trước vị - trí 1/2 chiều cao peak Trong phép định lượng, yêu cầu: 0,9≤ AF ≤2 Số đĩa lý thuyết N: đặc trưng cho hiệu lực cột Nếu gọi L chiều cao cột sắc ký, chiều cao đĩa tính công thức: Trong đó: L chiều cao cột sắc ký 3.1.3 Sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) sử dụng để xác định loại cồn phổ biến methanol ethanol thức uống dùng để xác định cồn dihydric trihydric a) Cột điều kiện sắc ký Pha tĩnh phổ biến để xác định cồn loại nhựa trao đổi cation mạnh Nhựa bao gồm sunfonat liên kết ngang với styrene divinylbenzene dạng hydro, canxi, chì Cơ chế trao đổi ion chế trình tách monosaccharide cồn, nguyên nhân liên kết nhóm hydroxyl với ion trái dấu cố định nhựa Quá trình trao đổi ion bị ảnh hưởng chất ion trái dấu (Pb 2+, Ca2+, H+) định hướng không gian nhóm hydroxyl Lợi việc sử dụng sắc ký trao đổi ion so với sắc ký thông thường hay sắc ký pha đảo sắc ký trao đổi ion thường không yêu cầu dung môi hữu methanol acetonitrile; thay vào nước tinh khiết dung dịch muối pha loãng, nhiệt độ cột yếu tố để kiểm soát phân giải peak Page 24 Nhóm 4: Định lượng Chondroitin Sulfate từ ống hô hấp gà Một ứng dụng quan trọng loại cột xác định đồng thời cồn, đường acid hữu đồ uống có cồn loại nước ép trái (Monošík et al.2013) Thời gian lưu acid hữu với pKa < đặc biệt chịu ảnh hưởng pH dung môi thay đổi nhỏ thời gian lưu đường cồn quan sát thấy nồng độ 2,0-12 mM H 2SO4 (pha động) thí nghiệm thời gian lưu acid hữu tăng mức độ khác tùy thuộc vào số lượng nhóm cacboxylic (Paredes et al 2006) Lợi việc sử dụng pha động dung dịch nước dò kép, sử dụng tia UV đầu đò khúc xạ (RI) để định lượng hàng loạt hợp chất tốt Đầu đò khúc xạ (RI) phát carbohydrates cồn UV đồng thời phát acid hữu hợp chất thơm số hợp chất khác (Castellari et al 2001) b) Đầu dò Hầu hết đầu dò phổ biến phòng thí nghiệm đầu dò khúc xạ (RI) tán xạ ánh sáng (ELSD), hai có giới hạn phát Độ nhạy thấp vấn đề nồng độ cồn cần xác định thấp 0,1 g/L Ngoài ra, có phương pháp khối phổ (LC/MS), máy dò điện hóa Trong đó, phương pháp sử dụng máy dò điện hóa áp dụng rộng rãi chi phí tương đối thấp Cồn phản ứng với chất có oxy hóa bề mặt điện cực, tạo dòng điện tử đo Như vậy, điện cực khác phát triển để phát cồn có chọn lọc nhạy cảm với phát dòng điện, ví dụ điện cực niken (Stitz Buchberger 1991), ruthenium dựa biến đổi điện cực để xác định ethanol mẫu co1 nồng độ cồn thấp giấm (Cataldi et al 1996) Ưu điểm việc sử dụng đầu đò điện cực độ nhạy cao so với đầu dò HPLC truyền thống khác UV RI, ví dụ với điện cực kim cương giới hạn phát tìm thấy cồn đơn khoảng từ 20 đến 25 µg/L Hạn chế đầu dò điện cụ cần bảo trì liên tục Mặt khác, lĩnh vực ứng dụng khoa học phân tích kết hợp HPLC với đầu dò phi truyền thống khác ví dụ quang phổ hồng ngoại Vì hầu hết hợp chất hấp thụ vùng hồng ngoại, FTIR coi máy dò chung cho sắc ký lỏng Hơn nữa, phổ FTIR cung cấp thông tin chi tiết tính chất hợp chất phân tích với dấu hiệu riêng mà thường cho phép xác nhận danh tính chất phân tích mà không cần máy dò khối phổ Một nhược điểm kết hợp pha động có tính acid thường sử dụng với cột trao đổi ion làm suy giảm độ suốt cửa sổ CaF2 tế bào dòng chảy Để đối phó với pH thấp pha động thông thường, đề xuất tế bào dòng chảy phủ màng polymer mỏng để bảo vệ khỏi bị suy thoái acid (Vonach et al 1998), màng phải thường xuyên thay Page 25 Nhóm 4: Định lượng Chondroitin Sulfate từ ống hô hấp gà Một đầu dò khác áp dụng cho phân riêng HPLC sử dụng nước tinh khiết pha động đầu dò ion hóa lửa (FID) Để làm điều mà không cần tắt FID, buồng hóa cho phép hình thành luồng hạt nhỏ (ví dụ, máy phun sương) bắt buộc để làm bay dung môi trước đưa vào máy dò (Young et al 2012) Một phương pháp giảm tốc độ lưu lượng nước cách giảm bớt đường kính cột tăng nhiệt độ cột Để tránh độ khuyếch tán chất phân tích cột, pha động làm nóng trước trước vào cột Để có kết tốt, tốc độ lưu lượng nước phải giữ 10 30 mL/phút Mặt khác, với mục đích có độ nhạy cao việc xác định cồn, sắc ký lỏng nhiệt độ cao (HTLC) gần nghiên cứu Những lợi HTLC so với HPLC giảm độ nhớt pha động, khuếch tán cao chất phân tích thông qua lỗ xốp pha tĩnh tốc độ tương tác chất phân tích pha tĩnh cao Kết cải thiện đáng kể hình dạng peak hợp chất phân cực thu Hơn nữa, nước tinh khiết pha động phân cực nhiệt độ môi trường Do đó, sức mạnh rửa giải thường thấp sắc ký lỏng pha đảo nhiệt độ cao khả rửa giải thích hợp với phân tách HPLC pha đảo Hơn nữa, nước nhiệt độ cao dễ dàng tương thích với chế độ đầu dò mà thường không sử dụng HPLC cổ điển, chẳng hạn FID, cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Các hạn chế HTLC không ổn định nhiệt pha tĩnh truyền thống Như vậy, vấn đề tránh cách sử dụng vật liệu chịu nhiệt độ cao pha tĩnh có nhiều liên kết ngang bề mặt Một số ví dụ pha tĩnh hai oxit kim loại zirconia titanic, carbon graphitic xốp polyme hữu cơ, cột đá nguyên khối (Guiochon, 2007) Các vật liệu sau làm mảnh silica xốp gọi silica Các thu trình trùng hợp ống cột Vật liệu cho phép hoạt động nhanh hơn, dẫn đến thời gian phân tích ngắn so với pha tĩnh truyền thống, làm việc lưu lượng thấp c) Chuẩn bị mẫu Việc chuẩn bị mẫu để xác định cồn phụ thuộc vào trạng thái mẫu Trong đồ uống, thường pha loãng trực tiếp mẫu sau khí dung dịch sử dụng sóng siêu âm trình lọc qua màng lọc membrane 0.45- 0.2μm trước tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký (Kuligowski et al.2010) Trong vài trường hợp, cột HPLC cần làm để thời gian sử dụng thiết bị dài để tránh chất thành phần mẫu làm nhiễu phổ Quá trình làm kéo dài gọi SPE Trong hầu hết trường hợp, ví dụ rượu vang nước trái cây, C18 hay cột SAX SPE ướt methanol dùng để lọc mẫu, cách đó, chất màu giữ lại cột (Blanco Gomis et al 1988) Page 26 Nhóm 4: Định lượng Chondroitin Sulfate từ ống hô hấp gà d) Ví dụ Trong nghiên cứu Zhang cộng (2010), tác giả sử dụng phương pháp HPLC để xác định nồng độ ethanol trình lên men ethanol đồng thời từ lõi bắp Hình 8: Hệ thống sắc ký lỏng cao áp • • • • • Đầu dò RID-10A Cột Aminex HPX-87H (Bio-Rad Labs, Hercules, CA) Nhiệt độ cột: 65oC Pha động: mM H2SO4 (0.6mL/min) Tất mẫu ly tâm để loại bỏ sinh khối tế bào chất không tan nước khác, sau lọc qua màng lọc 0,22 µm trước phân tích 3.1.4 Ưu – nhược điểm Ưu điểm Độ nhạy cao Xác định xác nồng độ Chondroitin Sulfate dung dịch Nhược điểm Tốn Đòi hỏi kỹ thuật viên phải có kỹ tốt 3.2 Quang phổ 3.2.1 Lịch sử phát triển Vào năm 1854 nhà hóa học Bunsen người Đức phát minh đèn khí đốt khí gas butan C4H10 người ta thường gọi làđèn Busen, điều đặc biệt đem loại hóa chất, khoáng vật đốt đèn khí điều kì lạ xảy ra, lửa bị đổi màu, muối nhôm cho màu xanh cây, muối mangan cho màu tím, muối Natri cho màu vàng, đặc Page 27 Nhóm 4: Định lượng Chondroitin Sulfate từ ống hô hấp gà tính làm cho Busen nghĩ phân tích thành phần hóa học chất qua màu lửa lại có khó khăn khác thân lửa đèn khí có màu nhuộm vàng có màu lam nhạt gây cản trở việc phân tích Nghe tin Bunsen chế tạo đèn khí đặc biệt định ứng dụng vào lĩnh vực phân tích hóa chất, nên Kirchoff (người Đức) hợp tác với ông thử quan sát ánh sáng mà hợp chất phát lửa đèn khí qua lăng kính tam giác làm màu sắc hợp chất rõ nói xác tập hợp vạch có màu định dải quang phổ giúp việc xác định thành phần hợp chất rõ ràng hơn, hai ông người phát phương pháp nên Bunsen Kirchhoff nhận phát minh cho thành công họ qua phương pháp phân tích quang phổ hấp thụ nhiệt 3.2.2 Sự hình thành phổ phân tử: xạ điện từ trạng thái lượng phân tử Sự xạ điện từ Bức xạ điện từ: dạng lượng truyền không gian có chất sóng hạt Bản chất sóng: Bước sóng, chu kỳ, tần số, số sóng, vận tốc truyền sóng, giao thoa Bản chất hạt: đặc trưng quang tử (photon) mang lượng Phân tử tồn nhiều chuyển động Chuyển động phân tử quay hạt nhân Chuyển động tuần hoàn hạt nhân với Chuyển động thay đổi hướng toàn phần Sự thay đổi trạng thái lượng tử phân tử dẫn đến biến thiên lượng Δ� Phân tử trạng thái kích thích ngắn 10-9 đến 10-6 giây không bền vững, có xu hướng nhanh chóng quay trạng thái lượng ban đầu, gọi phục hồi hay quay trở Page 28 Nhóm 4: Định lượng Chondroitin Sulfate từ ống hô hấp gà Năng lượng phân tử lưu giữ ba dạng quay, dao động điện tử Δ�= Δ� quay + Δ�dao động +Δ�điện tử Hiện tượng xạ điện từ phân tử gây nên bước chuyển lượng quay, dao động điện tử phân tử nguồn gốc loại phổ hấp thụ 3.2.3 Cơ sở khoa học Định luật LamBert – beer Độ hấp thu dung dịch tỷ lệ thuận với chiều dày l lớp dung dịch tỷ lệ thuận với nồng độ C dung dịch A = k.l.C Khi: l = 1cm C = mol/L A = ε hệ số hấp thu phân tử ε (L.mol-1.cm-1) gọi hệ số tắt phân tử Tại bước sóng, chất có hệ số hấp thu phân tử khác ε xác định thực nghiệm Tính chất định luật LamBert – beer Sự phụ thuộc D C: D = f(c) Đo mật độ quang dãy dung dịch có nồng độ khác cuvet bước sóng גnhất định (d, = גconst), đường biểu diễn D = f(C) đường thẳng Với chất với tia sáng khác cho đường đồ thị khác Dùng phương trình để phân tích định lượng Page 29 Nhóm 4: Định lượng Chondroitin Sulfate từ ống hô hấp gà Phổ hấp thụ: Đo mật độ quang dung dịch cuvet (l, C = const) bước sóng khác ta đường biểu diễn phổ hấp thụ dung dịch D = f()ג Tính cộng tính: mật độ quang phụ thuộc vào số phần tử hấp thụ ánh sáng nằm đường ánh sáng truyền qua A = e lC = e1lC1 +e2lC2 + …+ enlCn = l.Σni=1 ei Ci Giải toán phân tích nhiều chất màu dung dịch chiều dày cuvet để tăng giảm độ hấp phụ quang 3.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến bước sóng hấp thụ a) Ảnh hưởng dung môi Bước sóng hấp thu cường độ hấp thu hợp chất chịu ảnh hưởng dung môi Sự tác động dung môi khác lên phân tử làm thay đổi mức lượng giửa trạng thái kích thích Sự tác động dung môi lên phân tử làm sinh ra: chuyển dịch xanh chuyển dịch đỏ Những dung môi phân cực buớc sóng hấp thu ngắn so với bình thường Page 30 Nhóm 4: Định lượng Chondroitin Sulfate từ ống hô hấp gà Ví dụ chuyển dịch n→ π* nhóm cacbonyl mạch phân tử Trong phân tử hữu có phân cực vị trí C +-O-, dung môi phân cực vị trí có tương tác điện tử n với cực dung môi làm bền trạng thái điện tử n (năng lượng giảm) Sự giảm lượng trạng thái n làm tăng mức chênh lệch lượng n → π* , ∆E tăng dẫn tới bước sóng hấp thu giảm nên ta gọi dịch chuyển xanh Phổ hấp thu phân tử đồng phân nhau, khác nhóm CH phân tử hữu mà cấu trúc phân tử có liên hợp, bước sóng hấp thu phân tử tăng lên so với độ dài mạch C Nguyên nhân tượng mạch C dài hiệu ứng liên hợp tăng, dẫn tới mức độ chêch lệch hai trạng thái kích thích giảm Bước sóng hấp thu có xu hướng phía có bước sóng dài (dịch chuyển đỏ) b) Ảnh hưởng liên hợp Sự liên hợp p-π hay π- π làm cho trạng thái kích thích điện tử π* bền có lượng thấp dẫn tới bước sóng hấp thu dài c) Ảnh hưởng pH Mỗi hợp chất phức màu bền, có thành phần xác định tồn ổn định vùng pH thích hợp d) Ảnh hưởng thời gian Có nhiêu hợp chất phức màu có độ hấp thu UV – VIS tăng theo thời gian đến lúc định Song có hợp chất sau thời gian giảm nhanh, có chất vừa sinh hấp thụ tốt, song thời gian ngắn khả hấp thụ mất, thê phải chọn Page 31 Nhóm 4: Định lượng Chondroitin Sulfate từ ống hô hấp gà thời gian đo phù hợp hợp chất cụ thể, tai phải khảo sát phụ thuộc D vào thời gian t, từ chọn thời gian đo sau phản ứng tạo phức màu e) Nhiệt độ Nhiệt độ có ảnh hưởng đến cường độ hấp thu UV-VIS chất ảnh hưởng không lớn f) Điều kiện chọn thuốc thử Xảy nhanh hoàn toàn theo hướng có tính chất định lượng Tạo sản phẩm hợp chất bền, ổn định không thay đổi thành phần thời gian định để thực phép đo Sản phẩm phải có hệ sô hấp thu lớn tốt Không có phản ứng phụ sinh sản phẩm làm cản trở việc đo sản phẩm Sản phẩm sinh để đo phải co hấp thu cực đại hấp thu UV-VIS khác với cực đại hấp thụ thuốc thử nguyên hay thuốc thử phổ hấp thụ vùng đo sản phẩm tốt 3.2.5 Quang phổ UV-Vis 3.2.5.1 Giới thiệu phương pháp phổ UV-VIS Vùng phổ UV-Vis vùng nằm cận UV cận IR Được xác định từ khoảng 1801100nm Đây vùng phổ nghiên cứu nhiều áp dụng nhiều mặt định lượng Quá trình định lượng tiến hành cách đo vài bước sóng hấp thu hợp chất, sau áp dụng định luật Lambert-Beer để tính toán Nhiều hệ thiết bị đời dựa phương pháp này, ngày tối ưu hóa trình Pháp phổ UV-Vis áp dụng với phương pháp khác Phương Pháp Sắc ký trình nghiên cứu 3.2.5.2 Hệ thống thiết bị quang phổ UV-Vis a) Nguồn sáng Page 32 Nhóm 4: Định lượng Chondroitin Sulfate từ ống hô hấp gà Nguồn sáng có nhiệm vụ cung cấp xạ tương thích với trình đo Bức xạ cung cấp nguồn sáng thường chùm xạ đa sắc, bao trùm khoảng rộng phổ Tungsten Lamp Đèn Tungsten Halogen nguồn sáng phổ biến dùng máy quang phổ Đèn chứa sợi dây mảnh tungsteng đặt thủy tinh Khoảng xạ mà đèn cung cấp từ 330 đến 900 nm, dùng vùng visible Thời gian sử dụng đèn khoảng 1200h Với U= 6v cường độ lớn dây tungten bị nung đỏ đưa bầu trơ (neon, rgon) lên trạng thái kích thích phát xạ Hydrogen / Deuterium Lamps Đèn hydrogen hay deuterium cung cấp xạ vùng Ultraviolet tương ứng với dãi xạ từ 200 đến 450 nm Trong hai đèn đèn Deuterium ổn định có thời gian sử dụng khoảng 500h Đây đèn cho phổ liên tục Đèn hồ quang hidro nặng D2 cho vùng tử ngoại 180-380 nm b) Bộ lọc sóng Thu nhận chùm xạ đa sắc phát từ đèn, cho xạ đơn sắc Có hai loại thiết bị phổ biến gồm lăng kính cách tử Lăng kính (Prism) Những xạ có sóng khác bị bẻ gảy góc khác khỏi lăng kính Lăng kính làm từ thủy tinh hay thạch anh Tùy thuộc vào vật liệu làm lăng lính mà tách xạ vùng (Lăng kinh thủy tinh phù hợp với xạ vùng visible lăng kính thạch anh bao phủ hai vùng Ultraviolet Visible) Cách tử (GRATINGS) Page 33 Nhóm 4: Định lượng Chondroitin Sulfate từ ống hô hấp gà Cách tử cấu tạo với vô số khe nhỏ diện tích bề mặt khoảng 200 khe độ rộng 1cm, tùy thuộc vào góc tới chùm ánh sáng bề mặt cách tử mà hướng truyền chùm xạ phản xạ bề mặt cách tử theo hướng khác Phân loại cách tử: + Cách tử truyền suốt: Được làm thủy tinh + Cách tử phản xạ: Làm nhôm c) Bộ phận chứa mẫu Khoang hấp thu vùng tối nằm vị trí cuối đường truyền Tia xạ đơn sắc sau tách đến Thường thiết kế ống nhỏ gọi Cuvettes Cuvettes làm nhựa, thủy tinh hay thạch anh để chứa mẫu đo d) Bộ phận detecter Là phận nhận thông tin dạng tín hiệu cơ, điện, quang… chuyển hóa thành tín hiệu tương ứng giúp người sử dụng nhận Có tác dụng cảm nhận xạ điện từ sau bị hấp thụ chuyển lượng xạ thành dòng điện Cường độ dòng điện thu tỷ lệ thuận với cường độ xạ đập vào bề mặt catot Thường có: detector ống nhân quang điện detector diode quang + Ống nhân quang có chức tổ hợp tín hiệu chuyển đổi qua vài giai đoạn khuyếch đại thân ống Bản chất nguyên liệu làm cathode xác định độ nhạy phổ + Ngoài có phận khác thấu kính gương có nhiệm vụ chuyển tiếp tia sáng qua thiết bị 3.2.5.3 Các loại máy quang phổ a) Máy chùm tia Page 34 Nhóm 4: Định lượng Chondroitin Sulfate từ ống hô hấp gà Ưu điểm máy chùm tia : Giá thành thấp, thông lượng xạ qua cao độ nhạy cao Nhược điểm: có khoảng lệch thời gian tiến hành đo chuẩn mẫu xác định, có vấn đề với độ trôi Điều xảy với thiết bị cũ, thiết bị đại với tính cao ổn định khắc phục nhược điểm Vì máy quang phổ chùm tia có ứng dụng cao phòng thí nghiệm b) Máy quang phổ chùm tia Máy hai chùm tia phát triển để loại thay đổi cường độ đèn lần đo Mẫu trắng mẫu thử Ưu điểm thiết bị hai chùm tia: Cho độ xác cao mẫu đo mẫu đối chứng đo lúc Nhược điểm giá thành cao, độ nhạy thấp cấu trúc quang học phức tạp hơn, độ tin cậy thấp 3.2.5.4 Ưu điểm quang phổ tử ngoại khả kiến Khả áp dụng rộng: - Phần lớn chất hữu cơ, vô cơ, hóa sinh hấp thụ trực tiếp hấp thụ không trực tiếp - Khoảng 90% phân tích phòng thí nghiệm bệnh viện Độ nhạy cao: - Giới hạn dò khoảng 10-4 đến 10-5M, mở rộng đến 10-6 chí 107 M với thủ tục bổ sung Độ chọn lọc từ trung bình đến cao - Có thể hấp thụ chất mà tách khỏi hỗn hợp Độ xác cao - Sai số nằm khoảng 1-5% 3.2.5.5 Ứng dụng phổ UV-Vis phân tích thực phẩm a) Định tính Page 35 Nhóm 4: Định lượng Chondroitin Sulfate từ ống hô hấp gà Các cực đại hấp thụ đặc trưng định tính chất nên hay dùng để định tính Ví dụ: + Dung dịch nước Vitamin B12 có cực đại 278 nm, 361 nm 550 nm + Chloramphenicol có cực đại 278 nm + Dexamethanson có cực đại 240 nm + W.Garnjanagoonchorn cộng sự, 2006 ứng dụng phổ UV-VIS thể định tính thành phần Choidroitin sunfate có sụn động vật khác nhau, sử dụng chất nhuộm màu 1,9-Demetylmethylene Bule, hấp thu bước sóng 525nm b) Định lượng Phương pháp đường chuẩn Sử dụng vùng tuyến tính gọi đường chuẩn phương pháp phân tích Vùng tuyến tính rộng hay hẹp vùng nồng độ tùy theo vào độ hấp thụ phân tử ε chất phân tích hay sản phẩm với thuốc thử màu định Nói chung, hợp chất nhạy phổi UV-VIS vùng tuyến tính hẹp lùi phía nồng độ thấp Do thích hợp để xác định lượng vết chất Các bước tiến hành Chất cần xác định tạo phức bền với thuốc thử môi trường xác định có pH xác định Song song với trình người ta tiến hành loạt bình định mức Ở bình có chứa dung dịch chất cần xác định có nồng độ xác định, tiến hành tạo phức điều kiện với mẫu cần xác định Lúc ta dãy màu chuẩn có độ màu tăng dần theo nồng độ mà pha Người ta gọi dãy chuẩn Đo độ hấp thụ A dãy chuẩn ứng với nồng độ Dựng đường thẳng A theo C từ xác định giá trị Ax đồ thị từ tìm giá trị Cx Ứng dụng dùng: phân tích protein, phân tích Carbonhydrat, phân tích hàm lượng kim loại thực phẩm phân tích số tiêu nước Page 36 Nhóm 4: Định lượng Chondroitin Sulfate từ ống hô hấp gà Tài liệu tham khảo Takuo Nakano, Mirko Betti and Zeb Pietrasik (2010) Extraction, Isolation and Analysis of Chondroitin Sulfate Glycosaminoglycans Recent Patents on Food, Nutrition & Agriculture, 2, 61-74 Johanne Martel-Pelletier, Aina Farran, Eulàlia Montell, Josep Vergés and JeanPierre Pelletier (2015) Discrepancies in Composition and Biological Effects of Different Formulations of Chondroitin Sulfate Molecules 20, 4277-4289 Nicola Volpi (2009) Quality of different chondroitin sulfate preparations in relation to their therapeutic activity Journal of Pharmacy and Pharmacology (JPP), 61: 1271-1280 Yves Henrotin & Cécile Lambert.(2013) Chondroitin and Glucosamine in the Management of Osteoarthritis: An Update Curr Rheumatol Rep 15:361 Paul M Coates, Joseph M Betz, Marc R Blackman, Gordon M Cragg, Mark Levine, Joel Moss, Jeffrey D White (2010) Encyclopedia of Dietary Supplements Informa Healthcare Patrick du Souich, Antonio G García, Josep Vergés, Eulàlia Montell (2009) Immunomodulatory and anti-inflammatory effects of chondroitin sulphate J Cell Mol Med Vol 13, No 8A, 2009 pp 1451–1463 Vilim Šimanek, Vladimir Křen, Jitka Ulrichova, Jiři Gallo (2005) The Efficacy Of Glucosamine And Chondroitin Sulfate In The Treatment Of Osteoarthritis: Are These Saccharides Drugs Or Nutraceuticals? Biomed Papers 149(1), 51–56 Marit Aursand (chair), Heidi Amlund, Aksel Bernhoft, Gro-Ingunn Hemre, Bjørn M Jensen, Trond Møretrø, Live L Nesse, Birger Svihus, Ole Torrissen (2008) Assessment of glucosamine and chondroitin in feed Norwegian Scientific Committee for Food Safety (VKM) Terry A Clyburn, M.D., Catherine Ambrose, Ph.D., Richard Beaver, M.D., Gloria Gogola, M.D., A Kevin Raymond, M.D., Terry L Blasdel, D.V.M The Evaluation of Glucosamine/Chondroitin-Sulfate and Hyaluronate on Cartilage Healing – A Rabbit Animal Injury Model Page 37 Nhóm 4: Định lượng Chondroitin Sulfate từ ống hô hấp gà 10 Dr Craig W Martin (2013) Glucosamine And Chondroitin Sulfate For Osteoarthritis Clinical Services – Worker and Employer Services Page 38