PHÂN TÍCH MỐI QUAN HỆ HUYẾT THỐNG TRONG QUẦN THỂ BÒ BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE Lê Quang Nam, Nguyễn Trọng Bình, Trần Thị Thu Thủy, Nguyễn Văn Ba, Lê Anh Quỳnh, Phạm Doãn Lân Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Động vật Tóm tắt Mục tiêu nghiên cứu nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật microsatellite phần mềm phân tích phù hợp để xác định mối quan hệ huyết thống quần thể bò Mười lăm locus microsatellite phù hợp lựa chọn kết hợp với phần mềm Cervus v3.0.3 để tiến hành phân tích 70 cá thể bò biết 27 mối quan hệ mẹ - con, 11 mối quan hệ bố - mối quan hệ bố - mẹ - Với độ tin cậy 99% xác lập phần mềm kết thu hoàn toàn trùng khớp với mối quan hệ biết Qua cho thấy kỹ thuật microsatellite cặp mồi lựa chọn sủ dụng để xác định xác mối quan hệ huyết thống quần thể bò ghóp phần công tác quản lý đàn bò giống Đặt vấn đề Microsatellite đoạn lặp lại phân bố toàn hệ gen Các trình tự lặp lại bao gồm nhiều đơn vị lặp từ - bp tổng độ dài không 100 bp, ví dụ (CA)n, (GAA)m (Diethard Tautz, Manfred Renz, 1984) Microsatellite tìm thấy tất nơi hệ gen, bao gồm vùng mã hoá không mã hoá (Toth cs, 2000) Việc xác định mối quan hệ huyết thống cá thể quần thể vật nuôi nhằm hạn chế tối đa việc phối giống cận huyết xác định dòng giống cá thể mang lại lợi ích kinh tế cao Phân tích huyết thống bò thực loại thị di truyền đủ độ đa dạng Các microsatellite thường ưa dùng phân tích huyết thống isozyme, chúng đa dạng nhiều microsatellite đa hình cao xác định lập đồ bò (Barendse cs 1994; Bishop cs 1994; Georges cs 1995; Ma R.Z cs 1996), tạo điều kiện dễ dàng cho việc sử dụng chúng phân tích huyết thống Sử dụng microsatellite hiệu phân tích nhóm máu để xác định nguồn gốc đằng cha (Glowatzki-Mullis cs, 1995), chúng đơn giản có khả nhân rộng nhiều so với việc phân tích fingerprinting đa locus Southern Blotting (O'Reilly P & Wright J.M 1995) Tại Việt nam chưa có công trình khoa học nghiên cứu quan hệ huyết thống loại gia súc gia cầm, có số báo xác định quan hệ huyết thống người (Trần Văn Đôn (1999), Lê Đình Lương cs (2003), Phạm Hải Sáng Nguyễn Văn Mùi (2004)) Các nghiên cứu tiến hành vài cá thể Nhằm góp phần vào việc xây dựng phương pháp xác định mối quan hệ huyết thống quần thể bò nuôi Việt nam, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân tích mối quan hệ huyết thống quần thể bò kỹ thuật microsatellite” với mục tiêu: nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật microsatellite phần mềm phân tích huyết thống để xác định số mối quan hệ huyết thống quần thể bò Vật liệu, nội dung phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu nghiên cứu - Trong số 70 cá thể bò lấy mô tai, theo ghi chép ban đầu có 27 mối quan hệ mẹ con, 11 mối quan hệ bố - mối quan hệ bố - mẹ - - 15 locus microsatellite chọn dùng theo FAO (2004) (xem bảng 1) - Các mô tai tách ADN kít tách mô Qiagen (Đức) - Sử dụng kít phản ứng PCR đa mồi hãng Qiagen (Đức) - Hóa chất sử dụng để xác định kích thước alen máy giải trình tự CEQ8000 hãng Berman Coulter (Mỹ) - Phân tích huyết thống thực bằng phần mềm Cervus 3.0.3 (Marshall cs 1998) Bảng Tên vị trí locus NST, khoảng alen, nhiệt độ gắn mồi màu huỳnh quang locus nghiên cứu theo FAO Locus BM1824 BM2113 INRA23 ETH152 ILSTS6 HEL9 ETH225 INRA37 CSSM66 SPS115 TGLA227 TGLA122 BM1818 HAUT27 INRA63 NST 11 14 15 18 21 23 26 18 Khoảng alen 176-197 122-156 195-225 181-211 277-309 141-173 131-159 112-148 171-209 234-258 75-105 136-184 248-278 120-158 167-189 Nhiệt độ gắn mồi (°C) 55-60 55-60 55 55-60 55 52-57 55-65 57-58 55-65 55-60 55-56 55-58 56-60 57 55-58 Màu huỳnh quang D4 D2 D4 D4 D2 D4 D3 D4 D2 D3 D4 D4 D3 D3 D3 - Việc tiến hành thí nghiệm phân tích kết phần mềm tiến hành Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào – Động vật, viện Chăn Nuôi, từ tháng năm 2009 đến tháng 12 năm 2009 2.2 Nội dung nghiên cứu - Tách ADN từ mẫu mô tai thu - Chạy multiplex PCR 15 locus microsatellite - Xác định kích thước alen locus máy CEQ8000 70 cá thể bò - Xác định mối quan hệ huyết thống phần mềm Cervus - So sánh kết thu từ phần mềm Cervus với kết ghi chép ban đầu 2.3 Phương pháp nghiên cứu - Tách ADN theo protocol kít tách ADN từ mô hãng Quiagen - Phản ứng multiplex PCR: 15 cặp mồi microsatellite chuẩn hoá phản ứng PCR đa mồi Thành phần phản ứng chu trình nhiệt multiplex PCR cụ thể sau: Mix I: mastermix 7.5 ul, H2O 3.7ul, CSSM66 0.6ul, INRA063 0.5ul, INRA037 0.3ul, SPS115 0.5ul.; Mix II: mastermix 7.5ul, H2O 5.3ul, HAUT27 0.3ul, BM1824 0.5ul, TGLA227 0.3ul; Mix III: mastermix 7.5ul, H2O 3.9ul, ILSTS 0.5ul, BM1818 0.4ul, ETH152 0.3ul HEL9 0.6ul; Mix IV: mastermix 7.5ul, H2O 3.7ul, BM2113 0.6ul, ETH225 0.6ul, TGLA122 0.3ul, INRA023 0.4ul; Chu trình nhiệt cho multiplex PCR mix: tiền biến tính 950 C 15’, 30 chu kỳ gồm biến tính 940 C 30”, gắn mồi 530 C 1’, kéo dài 720 C 1’, bảo quản 40 C - Xác định kích thước alen locus microsatellite máy giải trình tự CEQ8000 µl tất sản phẩm multiplex-PCR sau bổ sung 25 µl đệm SLS (Sample Loading Solution Beckman Coulter) 0.15 µl thang ADN chuẩn (DNA Size standard Beckman Coulter) tiến hành phân tách hệ thống điện di mao quản máy giải trình tự tự động CEQ8000 hãng Beckman Coulter Kích thước alen phân tích tự động phần mềm Genetics analysis system cho máy CEQ8000 (phiên 9.0) - Xác định số mối quan hệ bố (mẹ) – phần mềm Cervus Danh sách kiểu gen locus microsatellite xử lý phần mềm Cervus, thiết lập độ tin cậy cho cặp bố (mẹ) - mức 99% để tìm số mối quan hệ huyết thống theo hướng sau: + Xác định mối quan hệ mẹ - + Xác định mối quan hệ bố - + Xác định mối quan hệ bố - mẹ - Kết thảo luận 3.1 Kết tách ADN Sau tách chiết ADN từ mẫu mô tai, kết kiểm tra gel điện di agarose 1% nhuộm với ethydium bromid chụp ảnh (ảnh 1) Kết ảnh cho thấy băng thu sáng rõ, không bị đứt gãy nên đủ điều kiện chạy multiplex PCR Ảnh Ảnh chụp kết điện di kiểm tra ADN agarose 1% 3.2 Kết xác định kích thước alen máy giải trình tự CEQ8000 Kết phân tích alen 15 locus microsatellite toàn mẫu bò nghiên cứu cho đỉnh alen rõ ràng sắc nét Ảnh đại diện cho kết phân tích kích thước microsatelltie, kết chạy mix mẫu 26 27, với mồi HEL9, ETH152, BM1818 ILSTS006 m ix D _ 2 0 T 160.82 161 HEL9 50000 190.77 191 ETH152 40000 30000 262.23 262 BM1818 20000 10000 270.77 270 BM1818 297.90 297 ILSTS006 Dye Signal 150 175 200 225 S iz e ( n t) 250 275 300 m ix E _ 2 0 T 3 2 1 5 5 0 0 0 0 0 0 0 0 Dye Signal 0 0 0 0 150.31 151 HEL9 160.71 161 HEL9 190.74 191 ETH152 150 175 270.61 270 BM1818 264.34 264 BM1818 200.50 201 ETH152 200 225 S iz e ( n t) 250 275 297.95 297 ILSTS006 300 Ảnh Kết xác định kích thước alen máy CQ8000 Các khoanh tròn alen chung locus cá thể 3.3 Kết xác định mối quan hệ huyết thống 3.3.1 Xác định số cặp mẹ - Kết phân tích 27 mối quan hệ me –con đa biết theo ghi chép ban đầu cho thấy với độ tin cậy 99%, phần mềm Cervus cho kết định trùng khớp hoàn toàn 27/27 cặp mẹ theo ghi chép ban đầu Kết thể bảng Bảng Kết xác định mối quan hệ mẹ - với độ tin cậy 99% Số cặp mẹ - theo ghi chép Số locus so sánh mẹ Kết định Độ tin cậy kết định huyết thống từ phần mềm 27 13, 14, 15 27/27 99% 3.3.2 Xác định số cặp bố - Tương tự, với độ tin cậy 99%, phần mềm Cervus xác định toàn 11/11 mối quan hệ bố - theo ghi chép Bảng Kết xác định mối quan hệ bố - với độ tin cậy 99% Số cặp bố theo ghi chép Số locus so sánh bố - Kết định Độ tin cậy kết định huyết thống từ phần mềm 12, 13, 15 11/11 99% 3.3.3 Xác định quan hệ bố - mẹ - Với độ tin cậy 99% xác nhận phần mềm Cervus định 4/4 mối quan hệ bố - mẹ - theo ghi nhân ban đầu Bảng Kết xác định quan hệ bố - mẹ -con với độ tin cậy 99% Số mối quan hệ bố mẹ theo ghi chép Số locus so sánh bố- mẹ- 13, 14, 15 Số mối quan hệ bố mẹ định Độ tin cậy kết định huyết thống từ phần mềm 99% Như qua phân tích mẫu bò biết thông tin mối quan hệ mẹ-con, bốcon bố mẹ quần thể, kết xác định hoàn toàn trùng khớp 100% Vì khẳng định kỹ thuật microsatellite với số lượng 15 cặp mồi lựa chọn sử dụng để xác đinh xác mối quan hệ quần thể Kết luận đề nghị 4.1 Kết luận - Đã chọn mười lăm locus microsatellite có độ đa hình cao, phù hợp hoàn thiện phương pháp để xác định mối quan huyết thống quần thể bò - Phương pháp phân tích cho phép xác định mối quan hệ huyết thống quần thể trường hợp sau: xác định mối quan hệ mẹ - con; mối quan hệ bố-con mối quan hệ bố - mẹ-con - Nếu việc xác định quan hệ huyết thống tiến hành số cá thể (2, 3, 4) cần so sánh trực tiếp không qua phần mềm nhanh chóng phát Đã áp dụng thành công phương pháp để hỗ trợ Tòa Án Nhân Dân Tỉnh Sơn La vụ xử kiện tranh chấp bò nuôi 4.2 Đề nghị - Ứng dụng phương pháp việc quản lý đàn giống phục vụ công tác lai tạo vụ án tranh chấp vật nuôi xẩy số địa phương - Cần tiếp tục mở rộng nghiên cứu phương pháp xác định mối quan hệ huyết thống loài vật nuôi khác Tài liệu tham khảo Lê Đình Lương, Lưu Xuân Hoà, Nguyễn Xuân Hùng, Trịnh Đức Anh (2003) “Nghiên cứu xác định dấu ADN người Việt locut nhiễm sắc thể giới tính, Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống” Hội nghị toàn quốc lần thứ hai nghiên cứu sinh học, nông nghiệp, y học Huế Phạm Hải Sáng, Nguyễn Văn Mùi (2004) “Sơ nghiên cứu sử dụng số mồi để xác định huyết thống người” Tạp chí di truyền học ứng dụng, số 3 Trần Văn Đôn (1999) “Góp phần nghiên cứu số dấu di truyền người phục vụ công tác xác định huyết thống” Tạp chí thông tin nội vụ, số 12, tr - Barendse W., Armitage S.M., Kossarek L.M et al.(1994) “A genetic linkage map of the bovine genome” Nature Genetics, 6, 227–35 Bishop M.D., Kappes S.M., Keele J.W et al (1994) “A genetic linkage map for cattle” Genetics, 136, 619–39 Diethard Tautz, Manfred Renz (1984) “Simple sequences are ubiquitous repetitive components of eukaryotic genomes” Nucleic Acids Research, 12, 4127-4138 FAO (2004) “Measurement of Domestic Animal Diversity (MoDAD): Recommended Microsatellite Markers” Georges M., Nielsen D., Mackinnon M et al (1995) “Mapping quantitative trait loci controlling milk production in dairy cattle by exploiting progeny testing” Genetics, 139, 907–20 Glowatzki-Mullis M.-L., Gaillard C., Wigger G & Fries R (1995) “Microsatellite-based parentage control in cattle” Animal Genetics, 26, 7-12) 10 Ma R.Z., Beever J.E., Da Y et al (1996) “A male linkage map of the cattle (Bos taurus) Genome” Journal of Heredity, 87, 261–71 11 Marshall TC, Slate J, Kruuk LEB, Pemberton JM (1998) “Statistical confidence for likelihood-based paternity inference in natural populations” Molecular Ecology, 7, 639–655 12 O'Reilly P & Wright J.M (1995) “The evolving technology of DNA fingerprinting and its application to fisheries and aquaculture” Journal of Fish Biology, 47(A), 29±55.) 13 Toth, G Gaspari, Z and Jurka, J (2000) “Microsatellite in different eukaryotic genome: survey and analysis” Genome res, 10 , pp 967-981