B ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC s PHẠM HÀ NỘI TẠ THÙY TRANG NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA NaCl TỚI ĐÔNG THÁI TÍCH LŨY MÔT SỐ CHẤT TRAO ĐỔI, HOAT • ĐÔ• ENZYM CHỐNG OXY HÓA Ở MẦM ĐÂU TƯƠNG LUẬN VĂN THẠC s ĩ SINH HỌC HÀ NỘI, 2015 B ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC s PHẠM HÀ NỘI TẠ THÙY TRANG NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA NaCl TỚI ĐÔNG THÁI TÍCH LŨY MÔT SỐ CHẤT TRAO ĐỔI, HOAT • ĐÔ• ENZYM CHỐNG OXY HÓA Ở MẦM ĐÂU TƯƠNG Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC s ĩ SINH HỌC HÀ NỘI, 2015 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, xin chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Văn Mã tận tình bảo, huớng dẫn tạo điều kiện giúp hoàn thành công trình nghiên cứu Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể thầy, cô thuộc khoa Sinh - Kỳ thuật Nông nghiệp, cán Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học Chuyển giao Công nghệ - Truờng ĐH Su Phạm Hà Nội giúp đỡ, đóng góp nhiều ý kiến quý báu tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian học tập nghiên cứu truờng Tôi xin chân thành cảm ơn NCS Nguyễn Thị Thao - Truờng Đại học Su phạm Hà Nội nhiệt tình giúp đỡ suốt trình thực đề tài Tôi xin gửi đến gia đình bạn bè, nguời bên cạnh, ủng hộ động viên suốt trình học tập nhu nghiên cứu khoa học lời biết ơn chân thành sâu sắc Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2015 Tác giả Tạ Thùy Trang LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực không trùng lặp với đề tài khác Tôi xin cam đoan thông tin trích dẫn luận văn đuợc rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2015 Tạ Thùy Trang BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT ROS : Các dạng oxy hoạt hóa SOD : Superoxit dismutaza CAT : Catalaza POD : Peroxidaza MỤC LỤC Lời cảm ơn Lời cam đoan Bảng ký hiệu chữ viết tắt Mục lục Danh mục bảng Danh mục hình MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tà i Mục đích nghiên cứu 3 Nhiệm vụ nghiên cứu Đối tuợng phạm vi nghiên cứu 4.1 Đối tượng nghiên cứu .3 4.2 Phạm vỉ nghiên u Những đóng góp Chuơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU .4 1.1 Một số đặc điểm sinh truởng mầm đậu tuơng 1.2 Ảnh huởng nhiễm mặn đến sinh truởng, phát triển tính chống chịu mặn thực vật 1.2.1 Đất nhiễm mặn 1.2.2 Ảnh hưởng nhiễm mặn đến sinh trưởng, phát triển thực vật 1.2.3 Tỉnh chổng chịu mặn thực v ậ t 10 1.3 Tình hình nghiên cứu ảnh huởng nhiễm mặn khả chịu mặn đậu tuơng 13 1.4 Vai trò prolin, glyxin betain chống chịu stress thực vật 15 1.4.1 Vai trò prolin chổng chịu stress thực vật 15 1.4.2 Vai trò glyxin betain chổng chịu stress thực vật 17 1.5 Vai trò enzym superoxit dismutaza, catalaza, peroxidaza chống chịu stress thực v ậ t 19 1.5.1 Vai trò enzym superoxit dismutaza chổng chịu stress thực vật 20 1.5.2 Vai trò enzym catalaza chổng chịu stress thực vật .21 1.5.3 Vai trò enzym peroxidaza chổng chịu stress thực vật 22 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 24 2.1 Đối tượng nghiên cứu 24 2.2 Phương pháp nghiên cứu 24 2.2.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 24 2.2.2 Phương pháp phân tích tiêu 25 2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu 32 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Ảnh hưởng NaCl tới động thái tích lũy prolin, glyxin betain mầm đậu tương 34 3.1.1 Ảnh hưởng NaCl tới động thái tích lũy prolỉn mầm đậu tương 34 3.1.2 Ảnh hưởng NaCl tới động thái tích lũy glyxỉn betaỉn mầm đậu tương 40 3.2 Ảnh hưởng NaCl tới động thái hoạt độ enzym superoxit dismutaza, catalaza, peroxidaza mầm đậutương 45 3.2.1 Ảnh hưởng NaCl tới động thái hoạt độ enzym superoxit dismutaza mầm đậu tương .45 3.2.2 Ảnh hưởng NaCl tới động thái hoạt độ enzym catalaza mầm đậu tương 49 3.2.3 Ảnh hưởng NaCl tới động thái hoạt độ enzym peroxỉdaza mầm đ ậu tương 53 3.3 Ảnh hưởng NaCl tới sinhtrưởng mầm đậu tương 57 3.3.1 Ảnh hưởng NaCl tới tỷ lệ nảy mầm mầm đậu tương 57 3.3.2 Ảnh hưởng NaCl tới khả sinh trưởng mầm 59 KẾT LUẬN 67 Kết luận 67 Kiến nghị 68 DANH MỤC CÁC TÀI LIỆUTHAMKHẢO 69 PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Ảnh hưởng NaCl tới động thái tích lũy prolin mầm đậu tương đầu gây mặn (pg/g) 36 Bảng 3.2 Ảnh hưởng NaCl tới động thái tích lũy prolin mầm đậu tương ngày gây mặn (pg/g) 36 Bảng 3.3 Ảnh hưởng NaCl tới động thái tích lũy glyxin betain mầm đậu tương đầu gây mặn (mg/g) 41 Bảng 3.4 Ảnh hưởng NaCl tới động thái tích lũy glyxin betain mầm đậu tương ngày gây mặn (mg/g) .41 Bảng 3.5 Ảnh hưởng NaCl tới động thái hoạt độ enzym SOD mầm đậu tương đầu gây mặn (U/g) 46 Bảng 3.6 Ảnh hưởng NaCl tới động thái hoạt độ enzym SOD mầm đậu tương ngày gây mặn (U/g) 46 Bảng 3.7 Ảnh hưởng NaCl tới động thái hoạt độ CAT mầm đậu tương đầu gây mặn (U /g) 50 Bảng 3.8 Ảnh hưởng NaCl tới động thái hoạt độ CAT mầm đậu tương ngày gây mặn (U /g) 50 Bảng 3.9 Ảnh hưởng NaCl tới động thái hoạt độ enzym POD mầm đậu tương đầu gây mặn (U/g) 54 Bảng 3.10 Ảnh hưởng NaCl tới động thái hoạt độ enzym POD mầm đậu tương ngày gây mặn (U/g) 54 Bảng 3.11 Ảnh hưởng củaNaCl đến tỷ lệ nảy mầm đậu tương (%) .57 Bảng 3.12 Ảnh hưởng nồng độ NaCl đến khối lượng tươi mầm đậu tương (g) 60 Bảng 3.13 Ảnh hưởng nồng độ NaCl đến khối lượng khô mầm đậu tương (g) 62 Bảng 3.14 Ảnh hưởng nồng độ NaCl đến chiều dài mầm đậu tương (mm/mầm) 64 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ tác động muối tới thực vật .10 Hình 1.2 Sơ đồ phản ứng chịu muối thực v ậ t 12 Hình 1.3 Vai trò sinh lý prolin điều kiện stress 17 Hình 1.4 Mô hình chống chịu stress thực vật glyxin betain 19 Hình 3.1 Đồ thị ảnh hưởng NaCl tới động thái tích lũyprolin mầm đậu tương đầu gây m ặn 37 Hình 3.2 Đồ thị ảnh hưởng NaCl tới động thái tích lũy prolin_ở mầm đậu tương ngày gây m ặn 37 Hình 3.3 Đồ thị ảnh hưởng NaCl tới động thái tích lũy glyxin betain mầm đậu tương đầu gây mặn 42 Hình 3.4 Đồ thị ảnh hưởng NaCl tới động thái tích lũy glyxin betain mầm đậu tương ngày gây mặn 42 Hình 3.5 Đồ thị ảnh hưởng NaCl tới động thái hoạt độ enzym SOD mầm đậu tương đầu gây m ặn 47 Hình 3.6 Đồ thị ảnh hưởng NaCl tới động thái hoạt độ enzym SOD mầm đậu tương ngày gây m ặn 47 Hình 3.7 Đồ thị ảnh hưởng NaCl tới động thái hoạt độ enzym CAT mầm đậu tương đầu gây m ặn 51 Hình 3.8 Đồ thị ảnh hưởng NaCl tới động thái hoạt độ enzym CAT mầm đậu tương ngày gây m ặn 51 Hình 3.9 Đồ thị ảnh hưởng NaCl tới động thái hoạt độ enzym POD mầm đậu tương đầu gây m ặn 55 Hình 3.10 Đồ thị ảnh hưởng NaCl tới động thái hoạt độ enzym POD mầm đậu tương ngày gây mặn .55 Hình 3.11 Biểu đồ ảnh hưởng củaNaCl đến tỷ lệ nảy mầm đậu tương 57 Hình 3.12 Biểu đồ ảnh hưởng nồng độ NaCl đến khối lượng tươi mầm đậu tương 60 Hình 3.13 Biểu đồ mức độ suy giảm tích lũy chất khô mầm đậu tuơng duới ảnh huởng nồng độ N aC l 62 Hình 3.14 Biểu đồ ảnh huởng nồng độ NaCl đến chiều dài mầm đậu tuơng 64 Các nhà khoa học ý sâu vào hướng tìm hiểu ảnh hưởng muối đến trình sinh lí, hình thành chất có vai trò bảo vệ, nhiên nghiên cứu nhiều điều chưa làm rõ chế ảnh hưởng muối, động thái tích lũy chất trao đổi hoạt động chất chống oxy hóa hạt trình nảy mầm thực vật nói chung đậu tương nói riêng, giai đoạn nảy mầm giai đoạn sinh trưởng ban đầu quan trọng mẫn cảm với stress môi trường Một số nghiên cứu lúa, cải dầu, đậu tương, đậu xanh , cho thấy prolin glyxin betain có vai trò quan trọng việc điều hòa thẩm thấu, bảo vệ làm giảm tác hại điều kiện nhiễm mặn trồng [9] [10] [14] [39] [42][51][57] Ngoài dạng oxy hoạt hóa (ROS) gốc tự superoxit anión ( 2’ ), peroxyt hydro (H20 2) gốc hydroxyl (’HO) sinh suốt trình trồng gặp điều kiện nhiễm mặn; ROS gây ảnh hưởng nghiêm trọng, làm phá vỡ trao đổi chất bình thường thông qua trình ôxy hoá chất béo, protein axit nucleic Để chống lại ảnh hưởng xấu dạng ROS, kết nghiên cứu Karuppanapandian T., J-C Moon, Manoharan, w Kim (2011); s Mutlu, c Kim, K Ồ Atici and B Nalbantoglu (2009), thực vật hình thành chế bảo vệ khác nhau, chủ yếu dựa vào enzym có hoạt tính phân huỷ hợp chất oxy hoá superoxit dismutaza (SOD) triệt tiêu gốc superoxit ( 2'~) hay catalaza (CAT), peroxidaza (POD), alkyl hydroperoxit, glutathion reductaza có tác dụng phân huỷ peroxit hydro (H20 2) [37] [56] [58] Chính lý trên, thực đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng NaCl tới động thái tích lũy số chất trao đổi, hoạt độ enzym chống oxy hóa mầm đậu tương” Nghiên cứu động thái tích lũy số chất có khả bảo vệ động thái hoạt độ so enzym chống oxy hóa đậu tương trình bị nhiễm mặn nồng độ NaCl khác suốt trình nảy mầm đậu tương Nghiên cứu góp phần làm rõ vai trò chất chống oxy hóa chế chống chịu thực vật; đặc biệt giai đoạn nảy mầm hạt, thời kỳ quan trọng phát triển cá thể thực vật, giai đoạn tạo tiền đề cho sinh trưởng, phát triển chúng Mục đích nghiền cứu - Nghiên cứu động thái tích lũy số chất trao đổi động thái hoạt độ số enzym chống oxy hóa đậu tương trình bị nhiễm mặn nồng độ NaCl khác suốt trình nảy mầm đậu tương để góp phần làm rõ vai trò chúng chế chống chịu giai đoạn nảy mầm hạt Nhiệm vụ nghiền cứu - Động thái hàm lượng số chất trao đổi (prolin, glyxin betain) mầm đậu tương sinh trưởng trình gây mặn nồng độ NaCl khác - Động thái hoạt độ số enzym chống oxy hóa (superoxit dismutaza, catalaza, peroxidaza) mầm đậu tương sinh trưởng trình gây mặn nồng độ NaCl khác - Tỷ lệ nảy mầm hạt điều kiện mặn; sinh trưởng mầm: chiều dài mầm, khối lượng tươi, khối lượng khô mầm đậu tương trình gây mặn nồng độ NaCl khác Đối tuợng phạm vi nghiền cứu 4.1 Đối tượng nghiên cứu: Giống đậu tương ĐT22 4.2 Phạm vi nghiên cứu \ Tập trung nghiên cứu giai đoạn nảy mầm điều kiện phòng thí nghiệm Những đóng góp - Vấn đề nghiên cứu chất chống oxy hóa tiến hành nhiều nước giới Việt Nam nghiên cứu Bên cạnh đó, nghiên cứu sâu động thái tích lũy chất trao đổi hoạt độ enzym chống oxy hóa giai đoạn nảy mầm ý Nghiên cứu lần đóng góp động thái tích lũy prolin, glyxin betain enzym chống oxy hóa SOD, CAT, POD đậu tương Việt Nam bản, hệ thống giai đoạn nảy mầm Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Một số đặc điểm sinh trưởng mầm đậu tương Có nhiều định nghĩa nảy mầm hạt đưa Theo ASOA (1981) “Sự nảy mầm hoạt động tiếp tục sinh trưởng phôi vỏ hạt thoái hoá nhú lên” Đây định nghĩa tiếp tục sinh trưởng hạt ngủ nghỉ sau hình thành phát triển Trong trình ngủ nghỉ hạt không hoạt động trao đổi chất lượng hoạt động diễn thấp Đối với hạt đậu tương, sau trồng hạt ngấm nước nhanh trừ vài giống đặc biệt loại hoang dại khả ngấm nước chậm Trong điều kiện thuận lợi, rễ xuất sau trồng 1-2 ngày Rễ gọi rễ chính, phát triển nhanh xuống phía dưới, đến ngày thứ - rễ phụ bắt đầu xuất Sau - ngày mầm xuất đẩy lên khỏi mặt đất sinh trưởng mạnh phần trụ mầm dưới, lúc đầu mầm có màu vàng nhạt, sau có màu xanh sau chuyển sang màu vàng rụng xuống Thực chất trình nảy mầm trình biến đổi sinh lí, sinh hoá mạnh mẽ diễn hạt, chuẩn bị cho hình thành non Sự nảy mầm bắt đầu hấp thu nước nhờ chế hút trương hạt Sau kết thúc ngủ nghỉ, hạt bắt đầu tăng tính thủy hóa keo nguyên sinh chất, giảm tính ưa mỡ độ nhớt keo, dẫn đến biến đổi sâu sắc đột ngột trình trao đổi chất hạt liên quan đến nảy mầm Đặc trưng tăng mạnh mẽ hoạt tính enzym thủy phân phân giải polisaccarit, protein chất phức tạp khác thành chất đơn giản dẫn đến thay đổi hoạt động thẩm thấu Các sản phẩm thủy phân dùng làm nguyên liệu cho trình hô hấp tăng lên mạnh mẽ phôi hạt, vừa làm tăng áp suất thẩm thấu hạt giúp cho trình hút nước vào hạt nhanh chóng [5] [19] [21] Trong trình hạt nảy mầm diễn trình: - Sự hoạt hóa nước trương nước; - Hình thành hoạt hóa enzym; - Động viên chất dự trữ - tích lũy lượng; - Phôi bắt đầu sinh trưởng, rễ mầm phá rách vỏ hạt; - Sinh trưởng tiếp tục mầm [6] Sự phân chia mang tính tương đối, giai đoạn không độc lập mà có xen kẽ lẫn nhau, bù trừ cho Giai đoạn nảy mầm giai đoạn trình sinh trưởng phát triển đậu tương, yêu cầu giai đoạn phải có đủ nước, nhiệt độ oxy: - Yếu tố nước: Nước yếu tố nảy mầm hạt muốn nảy mầm phải trải qua trình hút nước Nước cần thiết cho enzym hoạt động, phá vỡ vỏ hạt vận chuyển chất Hạt đậu tương hút nước đến lần khối lượng khô, nhiều so với trồng khác, ví dụ hạt ngô hút nước từ 1,5 đến lần khối lượng khô - Yếu tố nhiệt độ: Sự nảy mầm hạt tổ hợp trình bao gồm nhiều phản ứng pha khác nhau, nhiệt độ Nhiệt độ từ 25- 30°c thích hợp trình nảy mầm hạt đậu tương Nếu nhiệt độ nhỏ 10°c hạt nảy mầm kéo dài 12-15 ngày mọc Nếu cao 30°c hạt nảy mầm nhanh mầm yếu - Yeu tố oxy: Khi hạt hấp thụ đủ nước, cường độ hô hấp hạt tăng nhanh đặc biệt hô hấp hiếu khí Do cần nhiều oxy để tế bào hạt hô hấp hiếu khí theo chu trình Crebs tạo nhiều ATP, cung cấp cho trình tổng hợp phân tử hữu cơ, đặc biệt protein Khi có đủ nước, oxy, nhiệt độ hạt hút nước trương lên, men proteinaza, amylaza v.v chứa hạt bắt đầu hoạt động chuyển chất dự trữ dạng phức tạp sang đơn giản cung cấp cho trình hình thành tế bào quan phận phôi trình nảy mầm [5] [6] 1.2 Ảnh hưởng nhiễm mặn đến sinh trưởng, phát triển tính chống chịu mặn thực vật 1.2.1 Đất nhiễm mặn Dự báo đến cuối kỷ XXI, nhiệt độ trung bình tăng lên khoảng từ 2,0 - 4,5°c mực nước biển toàn cầu tăng từ 0,18m - 0,59m hậu biến đổi khí hậu Nước biển dâng dẫn đến xâm thực nước mặn vào nội địa, ảnh hưởng trực tiếp đến nguồn nước ngầm, nước sinh hoạt nước đất sản xuất nông - công nghiệp FAO ước tính toàn cầu với tổng diện tích đất mặn 397 triệu đất kiềm 434 triệu Trong số 230 triệu đất tưới tiêu, 45 triệu (chiếm 19,5%) đất bị nhiễm mặn; số gần triệu 500 vùng đất nông nghiệp khô hạn, 32 triệu (chiếm 2,1%) đất nhiễm mặn [66] Việt Nam đất bị nhiễm mặn có diện tích khoảng triệu Tập trung chủ yếu đồng sông Cửu Long, có 700 ngàn đất mặn nhiễm mặn, địa bàn bị mặn xâm nhập vào sâu nội đồng từ 30 - 40km Dự báo vào năm 2030, khoảng 45% diện tích khu vực đồng sông Cửu Long bị nhiễm mặn cục gây thiệt hại mùa màng nghiêm trọng lũ lụt ngập úng Nếu kế hoạch đối phó, phần lớn diện tích đồng sông Cửu Long ngập trắng nhiều thời gian năm thiệt hại ước tính 17 tỷ USD Ngoài ra, tỉnh duyên hải miền Trung Quảng Bình, Hà Tĩnh, Ninh Thuận diện tích đất nhiễm mặn lên đến vài chục ngàn Biến đổi khí hậu kéo theo thay đổi thời tiết, ảnh hưởng trực tiếp đến trồng, sản xuất nông, lâm, công nghiệp nuôi trồng, đánh bắt thủy - hải sản Đặc biệt xuất dịch bệnh khan lương thực, nước Đất mặn đất chứa lượng muối hòa tan nước vùng rễ làm thiệt hại đến sinh trưởng trồng Mức độ gây hại tùy thuộc vào loài trồng, giống cây, thời gian sinh trưởng cây, yếu tố môi trường kèm Theo định nghĩa hội khoa học Mĩ công bố đất mặn đất có độ dẫn điện EC cao 4dS/m điều kiện nhiệt độ 25°c, pH nhỏ 8,5 [1], Mặn hóa trình xâm nhiễm tích tụ muối kim loại kiềm môi truờng đất, nuớc môi truờng thành phần từ chỗ chua bị mặn trở thành mặn Trong loại muối NaCl loại gây mặn điển hình * Dựa vào nguồn gốc, đặc điểm tích lũy muối, nguời ta chia trình mặn hóa thành loại: - Ảnh huởng nuớc biển; - Quá trình mặn hóa lục địa; - Quá trình mặn hóa thứ sinh 1.2.2 Ảnh hưởng nhiễm mặn đến sinh trưởng, phát triển thực vật Độ mặn yếu tố môi truờng tàn bạo hạn chế suất trồng hầu hết loại trồng nhạy cảm với độ mặn nồng độ cao muối đất Đối với hầu hết trồng, tăng nguồn nuớc ngầm tăng độ mặn có tác động tiêu cực đến tăng truởng thực vật nảy mầm hạt giống Nhu độ mặn đất tăng, thực vật ngày khó khăn việc tìm lấy nuớc từ đất Mức độ muối cao tạo cân chất dinh duỡng đất số muối định gây độc hại cho trồng Hậu tức thời độ mặn đến trồng không thích nghi với muối bao gồm tuợng nhu rụng lá, cháy lá, chậm phát triển, hạt giống nảy mầm chết [65] Phản ứng chung thực vật muối làm giảm sinh truởng [32], Trong đất mặn, thực vật chịu mặn ngừng sinh truởng chức sinh lý bị kìm hãm Nồng độ muối cao kìm hãm sinh truởng mạnh Muối nuớc đất ức chế tăng truởng thực vật hai lý Thứ nhất, diện muối dung dịch đất làm giảm khả lấy nuớc trồng, dẫn đến việc giảm tốc độ tăng truởng Điều đuợc gọi hiệu ứng thẩm thấu thâm hụt nuớc độ mặn Thứ hai, nhiều luợng muối thâm nhập vào dòng nuớc gây nên tổn thuơng cho tế bào vận chuyển điều gây việc tiếp tục giảm tăng truởng Điều gọi hiệu ứng riêng biệt muối ion thặng dư muối Mặn làm tăng phân hủy diệp lục, ức chế trình tổng hợp sắc tố, giảm diện tích dẫn đến trình quang hợp giảm mạnh [48][54] Trong điều kiện mặn hô hấp tế bào diễn mạnh, hiệu lượng thấp, phần lớn lượng trình phân huỷ thải dạng nhiệt làm cho tế bào thiếu ATP để hoạt động [24] [30] [47] [59] [60] Phân huỷ mạnh, tổng hợp lại yếu nên không bù đủ lượng vật chất hô hấp phân huỷ, chất dự trữ bị hao hụt, không sinh trưởng được, còi cọc, suất thấp Đất nhiễm mặn ảnh hưởng đến hoạt động sinh lý như: - Việc dư thừa muối đất làm tăng áp suất thẩm thấu dung dịch đất Cây lấy nước chất khoáng từ đất nồng độ muối tan đất nhỏ nồng độ dịch bào rễ, tức áp suất thẩm thấu sức hút nước rễ phải lớn áp suất thẩm thấu sức hút nước đất Nếu độ mặn đất tăng cao đến mức sức hút nước đất vượt sức hút nước rễ không lấy nước đất mà nước vào đất gây nên tượng hạn sinh lý Cây không hấp thu nước trình thoát nước diễn làm cân nước gây nên hạn sinh lý Việc tăng áp suất thẩm thấu đất mặn mức nguyên nhân quan trọng gây hại cho trồng đất mặn Tỉ lệ nảy mầm hạt họ Đậu nói chung, đậu tương nói riêng giảm mạnh điều kiện thiếu nước [45] [64], - Sự tổng hợp xytokinin bị ngừng rễ quan tổng hợp phytohocmon nên thiếu xytokinin, ảnh hưởng đến sinh trưởng quan mặt đất [19][21 ] - Nồng độ gây độc muối phá huỷ tính thấm màng tế bào Điều dẫn đến bị mặn khả kiểm tra nồng độ photpho vô nội tế bào chất trao đổi khác, kìm hãm vận chuyển tích cực chất qua màng tế bào rễ tế bào [19][21] Sự hút khoáng rễ bị ức chế nên thiếu chất khoáng Do thiếu photpho nên trình photphoryl hoá bị kìm hãm thiếu lượng - Sự vận chuyển phân bố chất đồng hoá mạch libe bị kìm hãm nên chất hữu tích luỳ ảnh huởng đến trình tích luỳ vào quan dự trữ [19][21] - Mặn làm thay đổi hoạt động enzym gây rối loạn trao đổi chất, đặc biệt trao đổi protein Mặn làm chuyển huớng từ trao đổi C 02của axit hữu sang tổng hợp axit amin nên bị mặn có khuynh huớng tích luỳ axit amin amit - Khi thực vật tiếp xúc với stress muối, gây suy giảm việc vận chuyển electron, sau dạng oxy hoạt hóa (ROS) đuợc sản xuất loại bào quan lục lạp ty thể Việc sản xuất ROS cao, cân trở nên nghiêm trọng muối áp suất thẩm thấu gây nhiều tác động bất lợi tới tế bào thực vật, bao gồm tổn thuơng cấu trúc màng bào quan, ức chế enzym, phân hủy sắc tố, peroxy hóa lipit; công đại phân tử bao gồm axit nucleic, cuối dẫn đến chết tế bào [13] Ngoài ion Na+ ảnh huởng lớn lên vi sinh vật có đất quanh rễ bên bị ảnh huởng Lipman Sharp (1912) tìm NaCl nồng độ duới 0,5%, gây ảnh huởng đến trình cố định đạm vi khuẩn có nốt sần, Na2S04 thể tính độc nồng độ 1,2% [41] Có thể dễ dàng nhận thấy, ảnh huởng đất nhiễm mặn lên sinh truởng phát triển thực vật không nhỏ Mặn ảnh huởng tiêu cực đến giai đoạn phát triển trồng; kìm hãm sinh truởng, từ làm giảm suất, chất luợng, sản luợng nông nghiệp Đặc biệt giai đoạn nảy mầm giai đoạn đầu thời kỳ sinh truởng hầu hết thực vật nhạy cảm với độ mặn đất Các hạt nảy mầm bị ảnh huởng mạnh tác dụng thẩm thấu muối, làm tăng tỷ lệ non bị chết mọc không tốt [64], Sơ đồ tác động muối tới thực vật đuợc thể hình 1.1 10 Hình 1.1 Sơ đồ tác động muối tới thực vật (theo Nguyễn Văn Mã, 2015) [13] 1.2.3 Tính chống chịu mặn thực vật Quá trình đáp ứng với điều kiện stress thực vật chia làm bước: phản ứng với stress (phản ứng không đặc thù) thích ứng đặc thù (thời gian dài) Trong giai đoạn phản ứng với stress hình thành chế bảo vệ (không đặc thù) nhanh để trả lời tác động có hại bên (mặn, hạn, nhiệt độ cao ), đảm bảo sống sót ngắn thể kể việc bắt đầu hình thành chế thích ứng đặc thù đảm bảo Các chế thích ứng đặc thù hình thành sau thời gian tác động tương đối dài, giúp đảm bảo cho phát triển thể thực vật diễn “bình thường” điều rkiện thay đổi Khrrkết thúc tác động stress, thể thực vật chuyển sang giai đoạn phục hồi Trong đó, tác động stress kéo dài vượt ngưỡngrkhả tự bảo vệ bắt đầu giai đoạn tổn thương chí dẫn đến chết thực vật [13] Đe có chế đáp ứng hiệu stress mặn, thực vật tự phát triển khả cảm ứng thành phần siêu thẩm thấu ion Na+ trình stress mặn Hai phương thức cảm ứng chứng minh chế đáp ứng muối NaCl mang nhiều khác biệt so với chế đáp ứng với stress thẩm thấu túy Nồng độ muối cao dung dịch đất tạo stress thẩm thấu vùng rễ Và vùng 11 rễ để chống chịu lại với việc ion muối bên tế bào cao tự điều chỉnh hạ thấp cách bơm trở lại môi truờng nhờ sử dụng ATP [13] [62] Các thực vật chịu mặn có khả tự điều chỉnh thẩm thấu để làm tăng áp suất thẩm thấu tế bào vuợt áp suất thẩm thấu đất Tốc độ thời gian điều chỉnh thẩm thấu phụ thuộc vào loài thực vật Tuỳ thuộc vào thực vật mà có cách điều chỉnh thẩm thấu khác Trong nghiên cứu gần đây,các chất bảo vệ ngoại sinh nhu chất bảo vệ thẩm thấu (prolin, glyxin betain, trehaloza, vv), hormon trồng (axit gibberellic, axit jasmonic, brassinosteroit, axit salicylic, vv), chất chống oxy hóa (axit ascorbic, glutathion, tocopherol, vv), phân tử tín hiệu (nitricoxit, hydrogen peroxyt, vv), polyamin (spermidin, spermin, putrescin), nguyên tố vi luợng (selen, silic, vv) đuợc tìm thấy có hiệu việc giảm nhẹ ảnh huởng muối gây thiệt hại trồng Chúng có vai trò quan trọng việc đảm bảo cân thẩm thấu với không bào vừa bảo vệ trực tiếp phân tử protein cấu trúc ribosom khỏi tác động nồng độ Na+ cao chất nguyên sinh [9] [10] [13] [14] [17] [34] [35] [36] [39] [44] [46] [50] [53] [57] Trong điều kiện bình thuờng, gốc tự luôn có sản sinh thể thực vật Các gốc tự nội sinh cần thiết cho trình tổng hợp nhu phân huỷ chất chu trình chuyển hoá tế bào Do gốc tự có hoạt tính sinh học mạnh, nên tăng mức cho phép gây tổn thuơng tế bào làm phát sinh nhiều vấn đề phức tạp Chính mà thể thực vật hình thành hệ thống chất chống oxy hoá (antioxidant) có vai trò khử chất oxy hoá gốc tự gây độc hại đến tế bào Hệ thống giải độc gồm enzym phi enzym Ngoài enzym chống oxy hóa, enzym thủy phân nhu amylaza phosphataza liên quan đến phản ứng stress [2] [3] [13] [37] [56] [58] Yeu tố stress mặn làm thay đổi số đặc tính thực vật Chúng có nhỏ, giảm số luợng khí khổng, tăng độ mọng nuớc, làm dày tầng cutin sáp phủ lá, giảm hình thành mô dẫn, lignin hoá rễ sớm Do sinh truởng chậm phận mặt đất nên giảm tỷ lệ thân lá/rễ Tất đặc 12 điểm giúp cho giảm dẫn nước thoát nước để trì cân nước điều kiện đất mặn Phản ứng trồng môi trường mặn phức tạp, tổng hợp nhiều yếu tố riêng lẻ Các nghiên cứu triển khai nhiều đối tượng thực vật thống tác động điều kiện stress môi trường tế bào thực vật xảy phản ứng không đặc trưng tương tự nhau: tăng tính thấm màng sinh chất, tăng cường vào xytosol Ca+2 từ môi trường hay từ phận bên không bào, lưới nội chất ty thể, chuyển dịch pH tế bào phía axit, tăng độ nhớt chất nguyên sinh kèm theo tăng tập trung sợi actin, tăng hấp thụ oxy, tăng sử dụng ATP, tạo gốc tự đồng thời sản sinh chất chống oxy hóa, tăng bơm H+ màng sinh chất màng nội chất, tăng hàm lượng prolin, tăng cường tổng hợp protein stress, tăng tổng hợp etylen ABA, giảm sinh trưởng phân chia tế bào [13] Sơ đồ phản ứng chịu muối thực vật tác giả Nguyễn Văn Mã tổng hợp thể hình 1.2 Hình 1.2 Sơ đồ phản ửng chịu muối thực vật (theo Nguyễn Văn Mã, 2015) [13] 13 1.3 Tình hình nghiền cứu ảnh hưởng nhiễm mặn khả chịu mặn đậu tưung Việc nghiên cứu ảnh hưởng nhiễm mặn khả chịu mặn nhiều nước giới Việt Nam nghiên cứu nhiều loài khác nhau, có đậu tương Trong hầu hết loại đất mặn, Na+ cation gây độc hại lớn cho trồng nói chung đậu tương nói riêng Zhu JK (2002) cho khả chịu mặn trồng tượng phức tạp có liên quan đến trình sinh hóa sinh lý thay đổi hình thái học phát triển [63] Đậu tương loại trồng nhạy cảm với muối Trong đậu tương, stress mặn ức chế nảy mầm tăng trưởng mầm, làm giảm nốt sần rễ, làm giảm tích lũy sinh khối suất [7] [14] [16] [39] [42] [53] [64] Với gia tăng độ mặn, tỷ lệ phần trăm tích lũy protein, thời gian tích tụ dầu, protein hàm lượng dầu, protein hạt đậu tương giảm, tỷ lệ phần trăm dầu tăng Tuy nhiên, suất dầu protein giảm độ mặn tiếp tục tăng lên [38] Các nghiên cứu rằng, đậu tương chống chịu theo nhiều chế khác có tương quan chế chống chịu riêng biệt lực chống chịu tổng thể trình gặp nhiễm mặn Theo Nguyễn Văn Mã (2015) cho thực vật nói chung đậu tương nói riêng có phản ứng chống chịu stress muối sau: (i) Điều chỉnh thẩm thấu cân ion tế bào; (ii) Kiểm soát hút ion rễ; (iii) Kiểm soát vận chuyển muối cây; (iv) Chống chịu stress oxy hóa; (v) Phản ứng tổn thương phục hồi [13] Hay Tsui Hung Phang, Guihua Shao Hon Ming Lam (2008) tổng hợp nên chế chống chịu stress muối đậu tương nói riêng phân loại thành bốn loại chính, bao gồm: 14 (i) trì cân ion nội môi; (ii) điều chỉnh để đáp ứng với stress thẩm thấu; (iii) phục hồi cân oxy hóa; (iv) trình chuyển hóa thích ứng cấu trúc [53] khả chịu mặn đậu tương, trước hết phải nói đến chế tích lũy trì nồng độ cao chất hòa tan tế bào nhằm đảm bảo cạnh tranh nước với môi trường nhiễm muối chống lại tượng hạn sinh lý Vai trò rễ khả điều chỉnh áp suất thẩm thấu tế bào liên quan trực tiếp đến trình nhiễm mặn, rễ phát triển mạnh làm gia tăng lượng nước chồi qua làm loãng nồng độ muối chế chống chịu mặn hiệu Hiện nay, nghiên cứu sâu phản ứng hạt giống đậu tương chịu mặn nảy mầm hai mức độ sinh lý proteomic protein GPD, GST9, GST10, protein PM36 hạt giống chín sinh lý xác định có liên quan đến stress muối trình hạt đậu tương nảy mầm có vai trò bảo vệ chịu đựng stress muối [62] Một chế bật khả chịu mặn đậu tương nâng cao khả năng, hoạt động chống lại phá vỡ độc tính tác nhân oxy hóa hệ thống giải độc để nhằm khôi phục lại cân oxy hóa giảm thiểu thiệt hại stress oxy hóa thứ cấp Hệ thống gồm có hoạt động enzym chống oxy hóa (SOD, CAT, POD); chất chống oxy hóa phi enzym (axit ascobic (AsA), carotenoit (Car) glutathion (GSH)) tìm thấy rễ đậu tương trình gặp stress muối [2] [3] [36] [39] [53] Stress muối giảm tăng trưởng đậu tương gây thay đổi giải phẫu học đặc điểm tăng tổng hợp cutin biểu bì thay đổi cấu trúc mạch gỗ hóa gỗ chúng thân đậu tương, gây việc tăng nhanh chóng phát triển xylem hợp chất phenolic thân đậu tương Đây đại diện cho chế thích ứng việc chống áp lực stress mặn đậu tương [28] Khi phân tích thành phần hóa sinh chịu mặn, nghiên cứu cho rằng, trồng nói chung đậu tương nói riêng gặp mặn có 15 tượng tăng lên hoạt độ enzym, hàm lượng ABA, hàm lượng prolin, glyxin betain, nồng độ ion K+, loại đường, axit hữu cơ, để bảo vệ thể khỏi ảnh hưởng tiêu cực mặn; giảm tích lũy C 02, bảo vệ cấu trúc hoạt tính nguyên protein axit nucleic [10] [16] [36] [39] [46] [53] 1.4 Vai trò prolin, glyxin betain chống chịu stress thực vật 1.4.1 Vai trò prolin chống chịu stress thực vật Prolin có công thức phân tử C5H 9NO2 , a- amino axit có khả hòa tan mạnh nước, giữ nước lấy nước cho tế bào Phân tử prolin có cấu trúc vòng (pirolidin), cấu trúc tạo nên cho prolin hình dáng vững axit amin khác Prolin tích lũy nhiều loài thực vật, mô lá, mô phân sinh chóp rễ thực vật, tích lũy hạt phấn bị làm khô, tích lũy chóp rễ sinh trưởng tế bào thực vật nuôi cấy môi trường huyền phù thích nghi với điều kiện stress nước Prolin bảo vệ màng tế bào chống lại ảnh hưởng bất lợi tập trung cao ion vô nhiệt độ Prolin tích lũy gặp điều kiện bất lợi mặn, hạn, nhiệt độ thấp cao, kim loại nặng, bị nhiễm bệnh, thiếu dinh dưỡng, ô nhiễm môi trường tia uv [12] Đã có nhiều công trình nghiên cứu nước nước đối tượng thực vật khác nhau, để tìm hiểu chế tổng hợp, chuyển hóa, tích lũy prolin liên quan đến vai trò chống chịu stress thực vật, có stress mặn [8] [9] [10] [11] [13] [14] [16] [39] [52] [57], Prolin thuộc nhóm chất điều hòa thẩm thấu, việc tích lũy prolin xảy nhanh chóng sau thực vật bắt đầu gặp stress muối Và tích lũy ban đầu phản ứng với stress muối Ngoài vai trò chất điều chỉnh thẩm thấu nội bào; prolin góp phần ổn định cấu trúc màng tế bào; trực tiếp hay gián tiếp tác động tới chất phân tử lớn, giúp chúng giữ vững cấu trúc không gian hoạt tính sinh học nhờ ổn định môi trường thủy hóa nguyên vẹn protit Prolin góp phần ổn định gốc tự do, đệm oxi hóa khử tế bào điều kiện stress Tác động chống oxy hóa prolin thể 16 điểm chúng làm bất hoạt nhổm hydroxyl hợp chất phản ứng mạnh khác sinh gặp stress gây kìm hãm vận chuyển điện tử lục lạp ty thể Bên cạnh đó, prolin có vai trò quan trọng việc dập tắt oxy singlet ( ^ 2) với carotenoid lục lạp Nó có chức hydrotrope tương thích với protein; giảm toan tế bào chất, trì tỷ lệ NADP+/NADPH thích hợp giúp ổn định trạng thái oxy hóa khử ngăn ngừa tổn thương máy quang hợp, tương thích với trao đổi chất Ngoài ra, phá vỡ nhanh chóng prolin sau giảm nhẹ stress cung cấp đầy đủ chất khử để hỗ trợ oxy hóa ty lạp thể phosphoryl hóa sinh ATP cho việc phục hồi khỏi stress sửa chữa thiệt hại stress gây Hơn nữa, prolin biết tín hiệu phản ứng nhanh gen stress muối Prolin điều hòa pH tế bào chất, bảo vệ trình trao đổi chất đậu tương, gặp tress mặn có phản ứng sinh hóa để bảo vệ thể, cụ thể gia tăng tích lũy hàm lượng prolin số chất điều hòa thẩm thấu khác, nhằm làm giảm áp suất thẩm thấu không bào, giữ cân thẩm thấu tế bào [10] [14] [36] [39] Ngoài việc tăng hàm lượng prolin ảnh hưởng stress mặn gây cảm ứng kích hoạt tổng hợp prolin từ glutamat giảm việc sử dụng tổng hợp protein nâng cao việc tích lũy protein Như vậy, prolin nguồn lượng chuyển hóa nitơ stress tích lũy prolin dường cung cấp lượng cho phát triển tồn tại, từ đậu tương chống chịu với tượng nhiễm mặn [39] Như vai trò sinh lý prolin điều kiện stress tổngrkết trình bày theo sơ đồ thể hình 1.3 [...]... hóa ở mầm đậu tương Nghiên cứu về động thái tích lũy một số chất có khả năng bảo vệ và động thái hoạt độ một so enzym chống oxy hóa ở đậu tương trong quá trình bị nhiễm mặn ở các nồng độ NaCl khác nhau trong suốt quá trình nảy mầm của đậu tương Nghiên cứu này góp phần làm rõ vai trò của các chất chống oxy hóa trong cơ chế chống chịu của thực vật; đặc biệt là ở giai đoạn nảy mầm của 3 hạt, là một thời... thể của thực vật, giai đoạn tạo tiền đề cho sự sinh trưởng, phát triển của chúng 2 Mục đích nghiền cứu - Nghiên cứu về động thái tích lũy một số chất trao đổi và động thái hoạt độ một số enzym chống oxy hóa ở đậu tương trong quá trình bị nhiễm mặn ở các nồng độ NaCl khác nhau trong suốt quá trình nảy mầm của đậu tương để góp phần làm rõ vai trò của chúng trong cơ chế chống chịu của ở giai đoạn nảy mầm. .. giai đoạn nảy mầm của hạt 3 Nhiệm vụ nghiền cứu - Động thái hàm lượng một số chất trao đổi (prolin, glyxin betain) của mầm đậu tương sinh trưởng trong quá trình gây mặn ở các nồng độ NaCl khác nhau - Động thái hoạt độ một số enzym chống oxy hóa (superoxit dismutaza, catalaza, peroxidaza) của mầm đậu tương sinh trưởng trong quá trình gây mặn ở các nồng độ NaCl khác nhau - Tỷ lệ nảy mầm của hạt trong điều... thế giới nhưng ở Việt Nam còn rất ít được nghiên cứu Bên cạnh đó, nghiên cứu sâu về động thái tích lũy các chất trao đổi và hoạt độ của các enzym chống oxy hóa ở giai đoạn nảy mầm còn ít được chú ý cho đến nay Nghiên cứu này lần đầu tiên đóng góp về động thái tích lũy prolin, glyxin betain và các enzym chống oxy hóa SOD, CAT, POD ở đậu tương tại Việt Nam cơ bản, hệ thống ở giai đoạn nảy mầm 4 Chương... các chất có vai trò bảo vệ, tuy nhiên các nghiên cứu cho đến nay còn nhiều điều chưa làm rõ cơ chế ảnh hưởng của muối, động thái tích lũy các chất trao đổi và hoạt động của các chất chống oxy hóa ở hạt trong quá trình nảy mầm của thực vật nói chung và đậu tương nói riêng, và giai đoạn nảy mầm này là một giai đoạn sinh trưởng ban đầu quan trọng hết sức mẫn cảm với stress môi trường Một số nghiên cứu. .. đựng stress muối [62] Một cơ chế nổi bật của khả năng chịu mặn trong đậu tương là nâng cao khả năng, các hoạt động chống lại và phá vỡ độc tính của các tác nhân oxy hóa do hệ thống giải độc để nhằm khôi phục lại sự cân bằng oxy hóa và giảm thiểu thiệt hại do stress oxy hóa thứ cấp Hệ thống này gồm có hoạt động của các enzym chống oxy hóa (SOD, CAT, POD); các chất chống oxy hóa phi enzym (axit ascobic... trưởng của mầm: chiều dài mầm, khối lượng tươi, khối lượng khô của mầm đậu tương trong quá trình gây mặn ở các nồng độ NaCl khác nhau 4 Đối tuợng và phạm vi nghiền cứu 4.1 Đối tượng nghiên cứu: Giống đậu tương ĐT22 4.2 Phạm vi nghiên cứu \ Tập trung nghiên cứu trong giai đoạn nảy mầm ở điều kiện phòng thí nghiệm 5 Những đóng góp mới - Vấn đề nghiên cứu về các chất chống oxy hóa đã được tiến hành ở nhiều... hoạt tính phân huỷ các hợp chất oxy hoá như superoxit dismutaza (SOD) triệt tiêu gốc superoxit ( 0 2'~) hay catalaza (CAT), peroxidaza (POD), alkyl hydroperoxit, glutathion reductaza có tác dụng phân huỷ peroxit hydro (H20 2) [37] [56] [58] Chính vì những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài Nghiên cứu ảnh hưởng của NaCl tới động thái tích lũy một số chất trao đổi, hoạt độ enzym chống oxy hóa ở. .. 1.1 Một số đặc điểm sinh trưởng của mầm đậu tương Có rất nhiều định nghĩa về sự nảy mầm của hạt được đưa ra Theo ASOA (1981) “Sự nảy mầm là hoạt động tiếp tục sinh trưởng của phôi khi vỏ hạt thoái hoá và cây con nhú lên” Đây là định nghĩa tiếp tục sinh trưởng của hạt đã ngủ nghỉ sau khi hình thành và phát triển Trong quá trình ngủ nghỉ của hạt không hoạt động trao đổi chất và năng lượng hoặc hoạt động. .. của thực vật được tác giả Nguyễn Văn Mã tổng hợp được thể hiện ở hình 1.2 Hình 1.2 Sơ đồ phản ửng chịu muối của thực vật (theo Nguyễn Văn Mã, 2015) [13] 13 1.3 Tình hình nghiền cứu về ảnh hưởng của nhiễm mặn và khả năng chịu mặn của đậu tưung Việc nghiên cứu ảnh hưởng của nhiễm mặn và khả năng chịu mặn đã được nhiều nước trên thế giới và Việt Nam nghiên cứu ở nhiều loài cây khác nhau, trong đó có đậu