VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VI KHUẨN HIẾU KHÍ OXY HOÁ HỢP CHẤT KHỬ CỦA SULFUR NHẰM TẠO MÀNG SINH HỌC ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ Ô NHIỄM Giáo viên hướng dẫn : TS Đỗ Thị Tố Uyên Sinh viên thực : Nguyễn Văn Thế Lớp : 11-02 Hà Nội – 2015 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến TS Đỗ Thị Tố Uyên – Phụ trách phịng Cơng nghệ sinh học mơi trường – Viện Cơng nghệ sinh học, người thầy tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ cho kiến thức, kinh nghiệm, lời khuyên quý báu, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình thực đề tài khóa luận Tơi xin cảm ơn tồn thể anh, chị phịng Cơng nghệ sinh học môi trường giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi có hội thực tập đơn vị giúp đỡ nhiều trình thực tập Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Vũ Thị Thanh nhiệt tình bảo, giúp đỡ tơi nhiều suốt trình thực đề tài Bên cạnh đó, tơi xin chân thành cảm ơn thầy, cô Khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại Học Mở Hà Nội với Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Viện Hàn lâm khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện giúp đỡ suốt thời gian học tập, nghiên cứu trường viện Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, đặc biệt ba mẹ bên động viên, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực khóa luận Hà Nội, ngày 22 tháng năm 2015 Sinh viên Nguyễn Văn Thế MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình trạng nhiễm sulfur mơi trường nước khơng khí 1.2 Ảnh hưởng hợp chất sulfur đến môi trường sinh vật 1.2.1 Ảnh hưởng sulfide hợp chất khử lưu huỳnh 1.2.2 Ảnh hưởng số hợp chất lưu huỳnh hữu 1.3 Khả ứng dụng lồi vi sinh vật hiếu khí để xử lý hợp chất khử lưu huỳnh nước thải khí thải 1.3.1 Khái quát vi khuẩn tham gia phân hủy hợp chất khử lưu huỳnh 1.3.2 Đặc điểm trao đổi chất 13 1.3.3 Đặc điểm trao đổi chất số vi khuẩn hiếu khí khác 15 1.3.4 Hiện trạng áp dụng phương pháp xử lý ô nhiễm vi sinh vật 15 1.4 Công nghệ biofilter ( công nghệ lọc nhỏ giọt ) 16 1.4.1 Công nghệ biofilter 16 1.4.2 Yêu cầu vật liệu lọc 16 1.4.3 Nguyên tắc hoạt động 17 1.4.4 Ưu điểm phương pháp 17 1.4.5 Chất mang sử dụng công nghệ biofilter (công nghệ lọc nhỏ giọt)18 Chương NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thết bị sử dụng 21 2.1.1 Nguyên liệu 21 2.1.2 Hóa chất, môi trường 21 2.1.3 Thiết bị dụng cụ: 22 2.1.4 Phương pháp nghiên cứu 22 2.1.5 Đánh giá khả tạo màng chủng vi khuẩn 23 2.1.6 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn lựa chọn 24 2.1.7 Phân loại, định tên xây dựng phát sinh chủng loại 25 2.1.8 Phương pháp xác định trình tự gen máy tự động 27 2.1.9 Phương pháp xây dựng phát sinh chủng loại 28 i 2.1.10 Đánh giá tính đối kháng chủng vi sinh vật môi trường nuôi cấy 28 2.1.11 Ảnh hưởng điều kiện môi trường đến khả sinh trưởng khả oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh chủng vi khuẩn lựa chọn 28 2.2 Xây dựng mơ hình thử nghiệm khả oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh vi sinh vật gắn giá thể quy mơ lít 29 2.2.1 Cấu tạo lắp đặt hồn chỉnh mơ hình 29 2.2.2 Đánh giá mật độ tế bào vi sinh vật có biofilm phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc CFU (colony forming unit) 29 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Khảo sát khả sinh trưởng oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh chủng vi khuẩn có bổ sung thiosulfate 31 3.2 Đánh giá khả tạo màng sinh học chủng tuyển chọn 34 3.3 Đặc điểm hình thái tế bào chủng NNS1, NNS7, BNS3 BNS4 35 3.4 Phân loại phân tử dựa trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA chủng vi khuẩn BNS3 37 3.4.1 Tách chiết DNA tổng số chủng vi khuẩn BNS3 37 3.4.2 Nhân đoạn gene mã hóa 16S rRNA kỹ thuật PCR 37 3.5 Đánh giá tính đối kháng chủng vi khuẩn môi trường 41 3.6 Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh trưởng oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh chủng lựa chọn 42 3.7 Thử nghiệm gắn kết chủng vi khuẩn lựa chọn số chất mang để đưa vào thiết bị xử lý 47 3.7.1 Xây dựng mơ hình thử nghiệm nghiên cứu khả oxy hóa hợp chất khử sulfur hai loại chất mang xốp nhẹ xenllulo qui mơ lít phịng thí nghiệm 47 3.7.2 Đánh giá khả oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh hai loại chất mang xốp nhẹ xenllulo qui mơ lít phịng thí nghiệm 48 3.7.3 Đánh giá mật độ tế bào vi sinh vật loại chất mang xốp nhẹ xenllulo từ mơ hình lít phịng thí nghiệm 50 KẾT LUẬN 51 KIẾN NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Biofilter : Công nghệ lọc nhỏ giọt CFU : Colony forming unit HKTS : Hiếu khí tổng số LB : Luria broth PCR : Polymerase Chain Reaction iii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hình dạng số đại diện thuộc chi Thiobacillus, Alcaligenes paracoccus Hình 1.2 Hình ảnh số đại diện vi khuẩn hiếu khí thuộc chi Paracoccus có khả oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh 11 Hình 1.3 Chu trình Calvin 13 Hình 1.4: Vịng tuần hồn lưu huỳnh sở theo L.M Prescott cộng 14 Hình 1.5: Cơng nghệ lọc nhỏ giọt (biofilter) giới 16 Hình 1.6: Sơ đồ cơng nghệ Biofilter 18 Hình 1.7: Hình thái vật liệu mang 19 Hình 2.1 Đường chuẩn sulfate 23 Hình 2.2 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 27 Hình 3.1 Khả sinh trưởng chủng vi khuẩn mơi trường thiosulfate 33 Hình 3.2 Khả oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh chủng vi khuẩn sau ngày nuôi cấy 33 Hình 3.3 Khả bắt giữ thuốc tím tinh thể 0,1% màng sinh học chủng vi khuẩn sau 48h 34 Hình 3.4 Khả tạo màng sinh học chủng vi khuẩn 35 Hình 3.5 Điện di đồ DNA tổng số chủng vi khuẩn BNS3 37 Hình 3.6 Điện di đồ sản phẩm nhân đoạn gene mã hóa 16S rRNA chủng vi khuẩn BNS3 38 Hình 3.7: Cây phát sinh chủng loại chủng vi khuẩn BNS3 40 Hình 3.8: Tính đối kháng chủng vi khuẩn BNS3, BNS4, NNS1, NNS7 41 Hình 3.9: Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng chủng vi khuẩn NNS1, NNS7, BNS3, BNS4 43 Hình 3.10 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh chủng vi khuẩn 43 Hình 3.11 Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng chủng vi khuẩn NNS, NNS7, BNS3, BNS4 44 Hình 3.12 Ảnh hưởng pH đến khả oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh chủng vi khuẩn 45 iv Hình 3.13 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh trưởng chủng vi khuẩn NNS1, NNS7, BNS3, BNS4 46 Hình 3.14 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh chủng vi khuẩn 46 Hình 3.15: Mơ hình xử lý quy mơ 5l sau lắp ráp hồn chỉnh (A): Chất mang xốp nhẹ (B): Chất mang xenllulo 48 Hình 3.16 Khả oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh mơ hình gắn chất mang xenllulo (a) xốp nhẹ (b) quy mơ lít 49 Hình 3.17: Khả oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh hai mơ hình có gắn chất mang xenllulo xốp nhẹ quy mơ lít sau 21 ngày thử nghiệm 49 v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 So sánh đặc điểm vật liệu mang xốp mút xenllulose 20 Bảng 2.1 Các loại môi trường nuôi cấy 21 Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn tuyển chọn 31 Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái tế bào chủng lựa chon 36 Bảng 3.3 Mức độ tương đồng chủng BNS3 so với số chủng vi khuẩn ngân hàng Gen (NCBI) 39 Bảng 3.4: Mật độ tế bào loại chất mang 50 vi LỜI MỞ ĐẦU Xã hội ngày phát triển, nhà máy công nghiệp mọc lên ngày nhiều với khu dân cư, khu đô thị, tất yếu dẫn đến môi trường ngày suy thối Cùng với nhiễm mơi trường đất nước ô nhiễm môi trường không khí hoạt động phát triển người gây Sự phát triển giao thông vận tải, công nghiệp, nông nghiệp, du lịch ảnh hưởng lớn đến mơi trường khơng khí Ơ nhiễm khí vấn đề thời cấp bách quốc gia giới riêng quốc gia Các nguồn nước thải sinh hoạt hay công nghiệp chứa nhiều chất độc như: chất hữu cơ, kim loại nặng, vi sinh vật gây bệnh đặc biệt hợp chất chứa lưu huỳnh Sự ô nhiễm không ảnh hưởng xấu đến hệ sinh thái mà cịn gây tác động khơng tốt đến sức khỏe cộng đồng Vì vậy, vấn đề bảo vệ môi trường, bảo vệ nguồn nước - không khí nhiệm vụ cấp bách tồn giới Trong năm qua, có nhiều cơng trình nghiên cứu cho thấy việc ứng dụng biện pháp sinh học vào xử lý nguồn nước thải giàu chất hữu – đặc biệt nguồn nước thải có chứa hợp chất lưu huỳnh – mang lại hiệu cao an toàn cho môi trường Trong số trường hợp, hợp chất khử lưu huỳnh trở thành điện tử cho q trình dị hóa bị oxy hóa thành sulphate Một số lồi vi sinh vật có khả tận dụng nguồn lượng để chuyển hóa ATP thành lượng Trong điều kiện hiếu khí, nhiều nhóm vi khuẩn oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh thành sulphate loài vi khuẩn thuộc chi: Thiobacillus, Alcaligenes, Pseudomonas, Paracoccus, … Trên giới, việc sử dụng nhóm vi khuẩn tham gia xử lý ô nhiễm (đặc biệt việc loại bỏ sulfide nước khơng khí) biết đến qua nhiều nghiên cứu ứng dụng thực tế Ở Việt Nam, việc ứng dụng vi sinh vật vào xử lý nước – khí thải đánh giá hiệu quả, xong lĩnh vực đòi hỏi thời gian cơng nghệ phù hợp, trước tình hình nhiễm môi trường mức báo động việc nghiên cứu nhóm vi sinh vật để đưa vào ứng dụng cần thiết Vì vậy, chúng tơi đặt cho nhiệm vụ “ Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn hiếu khí oxy hóa hợp chất khử sulfur nhằm tạo màng sinh học ứng dụng xử lý ô nhiễm “ với nội dung nghiên cứu chính: Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh điều kiện hiếu khí từ tập đồn vi khuẩn có phịng Cơng nghệ sinh học môi trường – Viện công nghệ sinh học Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân loại chủng tuyển chọn nhằm định hướng ứng dụng thực tiễn Thử nghiệm gắn kết chủng vi khuẩn lựa chọn số chất mang để đưa vào thiết bị xử lý Như vậy, với chủng vi sinh vật khác, chủng vi khuẩn Paracoccus sp BNS3 mà chúng tơi phân lập góp phần làm phong phú thêm số lượng chủng vi khuẩn thuộc chi Paracoccus nói riêng hệ sinh vật có khả oxy hố hợp chất khử lưu huỳnh nói chung, phục vụ cho công nghệ phân hủy sinh học nước thải ô nhiễm sulfide sau Nhằm tăng hiệu xủ lý sulfide chủng vi khuẩn Paracoccus sp BNS3 nói riêng hỗn hợp chủng vi khuẩn NNS1, NNS7, BNS4 tiến hành xác định yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng khả oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh chúng 3.5 Đánh giá tính đối kháng chủng vi khuẩn môi trường Các loại vi sinh vật khác thích hợp điều kiện mơi trường khác Khi thay đổi môi trường yếu tố môi trường bất lợi tức thay đổi điều kiện sống hạn chế gây ức chế đến phát triển vi sinh vật Trên thực tế mơi trường ni cấy có diện nhiều chủng vi sinh vật khác chắn có cạnh tranh chất dinh dưỡng, không gian sống chủng vi sinh vật lẫn Nhằm sử dụng chủng vi khuẩn để làm nguồn giống cho mơ hình thử nghiệm với quy mơ lít sau Chúng tơi tiến hành nuôi cấy chủng giống môi trường thiosulfate thạch nuôi điều kiện giống để đánh giá tính đối kháng chủng vi khuẩn lựa chọn Sau 48h thu kết hình 3.7: Hình 3.8: Tính đối kháng chủng vi khuẩn BNS3, BNS4, NNS1, NNS7 Từ hình 3.8 cho thấy, chủng lựa chọn ria cho cắt đôi phát triển tốt, đường ria rõ nét khơng có tượng bị đứt đoạn hay khơng mọc vị trí cắt Điều chứng tỏ trình sinh trưởng phát triển 41 không xảy tượng ức chế phát triển lẫn Qua đó, chúng tơi tiến hành đưa chủng giống vào thiết bị xử lý 3.6 Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh trưởng oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh chủng lựa chọn Việc tuyển chọn số chủng vi khuẩn hiếu khí có khả xử lý hợp chất khử lưu huỳnh nước thải khí thải phục vụ cho cơng nghệ phân hủy sinh học nguồn nước thải khí thải sau Vì lí cần xác định điều kiện mơi trường ảnh hưởng đến q trình sinh trưởng phát triển khả xử lý hợp chất khử lưu huỳnh từ kiểm sốt q trình theo mong muốn Các yếu tố ảnh hưởng lớn nhất, trực tiếp đến sinh trưởng, phát triển khả xử lý hợp chất khử sulfur vi sinh vật nhiệt độ, pH, nguồn nitơ Ảnh hưởng nhiệt độ Nhiệt độ mơi trường với vi sinh vật có mối quan hệ mật thiết, nhiệt độ mơi trường khơng ảnh hưởng đến cường độ sinh trưởng phát triển lồi vi sinh vật mà cịn ảnh hưởng đến khả oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh Mỗi lồi vi sinh vật có nhiệt độ phát triển tối thiểu, tối thích tối đa mà chúng chịu đựng khác Để tìm nhiệt độ tối thích chủng vi khuẩn hiếu khí này, chúng tơi nghiên cứu khả sinh trưởng, phát triển khả oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh nhiệt độ 25oC, 30oC, 37oC, 45oC, bổ sung 10% giống, sau 48h nuôi cấy tiến hành kiểm tra khả sinh trưởng khả oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh chủng vi khuẩn Nghiên cứu thực ngày Kết thể qua hình 3.8 3.9 42 Hình 3.9: Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng chủng vi khuẩn NNS1, NNS7, BNS3, BNS4 Hình 3.10 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh chủng vi khuẩn Từ hình 3.8 3.9 nhận thấy, chủng vi khuẩn khả sinh trưởng oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh tốt nhiệt độ 30oC Tuy nhiên dải nhiệt độ từ 25-37oC chủng vi khuẩn hiếu khí có khả sinh trưởng hoạt tính oxy hóa thiosulfate tốt Điều chứng tỏ chủng lựa chọn thuộc 43 nhóm vi sinh vật ưa ấm trung bình (Mesophiles) ưa thích trung bình khoảng 2040oC (tối ưu 30oC-37oC) [2] Vì vậy, chúng tơi chọn 30oC nhiệt độ tối ưu cho chủng vi khuẩn sinh trưởng oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh cho mơ hình thử nghiệm lít sau Ảnh hưởng pH pH yếu tố quan trọng có ảnh hưởng đến phát triển vi sinh vật nói chung khả oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh chủng vi sinh vật nói riêng Độ pH đo nồng độ H+ OH- dịch ni Để khảo sát pH thích hợp trình sinh trưởng khả nằn oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh, chủng lựa chon ni cấy mơi trường thiosulfate có pH từ 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 nhiệt độ tối ưu 30oC Cứ sau 48h nuôi cấy tiến hành kiểm tra khả sinh trưởng khả oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh chủng vi khuẩn Nghiên cứu thực ngày Kết thể qua hình 3.10 3.11: Hình 3.11 Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng chủng vi khuẩn NNS, NNS7, BNS3, BNS4 44 Hình 3.12 Ảnh hưởng pH đến khả oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh chủng vi khuẩn Khả sinh trưởng khả oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh chủng tốt pH Tuy nhiên, pH 6, pH 8, pH 9, pH 10 chủng có khả oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh tốt Điều phù hợp với nghiên cứu trước ảnh hưởng pH tới phát triển vi sinh vật, hầu hết môi trường tự nhiên có pH nằm khoảng 5-9, hầu hết vi sinh vật phát triển tối ưu khoảng đó, ví dụ E Coli phát triển mơi trường có pH từ 4,4 - [2] Vì vậy, chúng tơi chọn pH pH tối ưu cho chủng vi khuẩn sinh trưởng oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh cho mơ hình thử nghiệm lít sau Ảnh hưởng nitơ Các chất dinh dưỡng đa lượng vi lượng có ý nghĩa lớn q trình nuôi cấy chủng vi sinh vật Hiểu nguyên tố, hàm lượng cấu thành tế bào, nguồn gốc chất dinh dưỡng chức chúng tế bào vi sinh vật cần thiết nghiên cứu tối ưu hóa mơi trường ni cấy lên men sản xuất sản phẩm cơng nghiệp Nitơ ngun tố đa lượng có ý nghĩa lớn q trình ni cấy, có chức xây dựng nên acid amin, nucleotit axit nucleic coenzyme Do đó, chúng tơi sử dụng hai nguồn nitơ vô hữu gồm: NH4Cl, NaNO3, KNO3 cao men để tiến hành nghiên 45 cứu Nghiên cứu thực ngày Kết thể hình 3.12 3.13 Hình 3.13 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh trưởng chủng vi khuẩn NNS1, NNS7, BNS3, BNS4 Hình 3.14 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh chủng vi khuẩn Từ hình cho thấy, chủng vi khuẩn có khả sinh trưởng khả oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh tốt nguồn nitơ vô hữu cơ, nhiên chủng vi khuẩn có khả sinh trưởng oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh tốt bổ sung nguồn nitơ cao men, riêng chủng BNS4 nguồn nitơ 46 NaNO3 Cao men nguồn đạm nhiều loài vi sinh vật ưa thích Cao men chứa acid amin, peptid, vitamin tan nước loại hydratcarbon Tuy nhiên sử dụng cao men để sản xuất công nghiệp bổ sung vào môi trường nuôi cấy xử lý ngồi trường đắt Từ hình 3.13 cho thấy chủng vi khuẩn sinh trưởng oxy hóa hợp chất khử sulfur tốt bổ sung nguồn nitơ muối NaNO3 Trong muối NaNO3 chứa nguyên tố N cần thiết cho chủng vi khuẩn ngồi cịn chứa ngun tố Na, natri có chức xây dụng nên cation vơ tế bào, cofactor cho nhiều phản ứng enzyme [4] Hơn nữa, NaNO3 nguồn nitơ vô cơ, nguyên liệu rẻ tiền ứng dụng xử lý ô nhiễm quy mô công nghiệp khơng hiệu xử lý cao mà cịn giảm chi phí sản xuất Vì vậy, chúng tơi chọn NaNO3 nguồn nitơ tối ưu cho chủng vi khuẩn sinh trưởng oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh cho mơ hình thử nghiệm lít sau 3.7 Thử nghiệm gắn kết chủng vi khuẩn lựa chọn số chất mang để đưa vào thiết bị xử lý 3.7.1 Xây dựng mơ hình thử nghiệm nghiên cứu khả oxy hóa hợp chất khử sulfur hai loại chất mang xốp nhẹ xenllulo qui mơ lít phịng thí nghiệm Với loại giá thể xốp nhẹ xellulo tiến hành xây dựng thành cơng mơ hình thử nghiệm nghiên cứu khả oxy hóa hợp chất khử sulfur chủng vi sinh vật lựa chọn Các mơ hình đáp ứng điều kiện tối ưu để vi sinh vật sinh trưởng, phát triển quan trọng khả xử lý đạt hiệu tốt Mơ hình gồm hộp tích lít dùng để chứa mơi trường làm chất liệu nhựa dẻo, hệ thống giàn phun, chủng vi sinh vật chất mang Hệ thống giàn phun bao gồm máy thổi khí mini ống dẫn có chức sục khí nhằm cung cấp oxy cho vi sinh vật đồng thời đảo trộn môi trường nuôi Từ điều kiện thiết bị gồm máy thổi khí mini, hệ thống ống dẫn, hộp nhựa chứa giá thể, ta mơ hình hồn chỉnh hình 3.14 47 A B Hình 3.15: Mơ hình xử lý quy mơ 5l sau lắp ráp hồn chỉnh (A): Chất mang xốp nhẹ (B): Chất mang xenllulo 3.7.2 Đánh giá khả oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh hai loại chất mang xốp nhẹ xenllulo qui mơ lít phịng thí nghiệm Sau mơ hình lắp ráp hồn chỉnh, chúng tơi tiến hành chạy thử nghiệm mơ hình có gắn loại chất mang xốp nhẹ xenllulo, sử dụng nguồn giống chủng vi khuẩn BNS3, BNS4, NNS1, NNS7 môi trường thiosulfate điều kiện tối ưu Cứ sau ngày lại thay môi trường thiosulfate giữ nguyên giá thể có vi sịnh vật bám dính đó, hệ thống giàn phun Như thay môi trường lần Bằng cảm quan nhận thấy màu sắc môi trường nuôi cấy sau ngày thay đổi so với mẫu ban đầu (từ màu trắng chuyển sang màu trắng đục, màng sinh học vi sinh vật tạo bám chất mang) thể hình 3.15 Do phần khẳng định chủng nghiên cứu có khả sinh trưởng, phát triển oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh Tuy nhiên, để đánh giá xác hơn, tiến hành xác định số lượng vi sinh vật bám vật liệu mang kiểm tra khả oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh mơ mơ tả phần 2.2.2, kết thể hình 3.16: 48 a b Hình 3.16 Khả oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh mơ hình gắn chất mang xenllulo (a) xốp nhẹ (b) quy mơ lít Hình 3.17: Khả oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh hai mơ hình có gắn chất mang xenllulo xốp nhẹ quy mơ lít sau 21 ngày thử nghiệm Từ hình cho thấy hoạt tính oxy hóa thiosulfate hỗn hợp chủng chạy mơ hình tăng ổn định qua ngày ni cấy Sang ngày thứ hoạt tính giảm dần Kết phù hợp so với đường cong sinh trưởng thử nghiệm đơn chủng Từ hình 3.17, chúng tơi nhận thấy khả oxy hóa thiosulfate chất mang xenllulo tốt so với chất mang xốp nhẹ 49 3.7.3 Đánh giá mật độ tế bào vi sinh vật loại chất mang xốp nhẹ xenllulo từ mơ hình lít phịng thí nghiệm Để đánh giá mật độ tế bào chủng vi sinh vật có chất mang lựa chọn, kết hỗn hợp chủng mật độ tế bào trước đua vào mơ hình đạt x 1010 Chúng tiến hành đánh giá số lượng vi sinh vật có 1cm3 chất mang loại giá thể phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc CFU (Colony forming unit) tiến hành môi trường thiosulfate thạch mô tả phần 2.2.8 để xác định số lượng tế bào chất mang Xác định số lượng tế bào có chất mang mơ hình chạy 7, 14 21 ngày Kết thể bảng 3.2 Bảng 3.4: Mật độ tế bào loại chất mang Thời gian Loại giá thể CFU/cm3 ngày Xốp mút x 108 Xenllulo 2,4 x 1010 Xốp mút x 107 Xenllulo 6,8 x 109 Xốp mút x 107 Xenllulo x 108 14 ngày 21 ngày Từ bảng 3.4 cho thấy, mật độ tế bào loại chất mang cao chất mang xenllulose có khả oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh mật độ tế bào cm3 chất mang tốt so với xốp mút, nhiên nghiên cứu tiến hành lần tiếp tục nghiên cứu thêm 50 KẾT LUẬN Từ chủng vi khuẩn BNS1, BNS2, BNS3, BNS4, NNS1, NNS5, NNS7 tuyển chọn chủng vi khuẩn BNS3, BNS4, NNS1và NNS7 vừa có khả oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh vừa có khả tạo màng sinh học Đã phân loại chủng BNS3 thuộc chi Paracoccus dựa đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào so sánh trình tự gen 16S rRNA chủng BNS3 với trình tự ngân hàng Gen Quốc tế Bốn chủng vi khuẩn lựa chọn có khả oxy hóa thiosulfate tối ưu 30oC, pH nguồn nitơ NaNO3 Gắn thành công chủng vi khuẩn lựa chọn loại chất mang xốp mút xenllulose quy mơ lít Màng sinh học tạo thành từ chủng vi khuẩn có hoạt tính oxy hóa thiosulfate tốt ổn định sau 21 ngày KIẾN NGHỊ Tiếp tục tiến hành phân loại, định tên chủng vi khuẩn NNS1 NNS7 nhằm sử dụng an tồn mơi trường Tiếp tục chọn lựa nghiên cứu loại chất mang khác nhằm định hướng ứng dụng thực tế 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Cát Lê Văn (chủ biên), Đỗ Thị Hồng Nhung, Ngô Ngọc Cát (2006) Nước nuôi thủy sản chất lượng giải pháp cải thiện chất lượng NXB Khoa học kỹ thuật, tr.102-105, tr.173 Đạt Nguyễn Thành (2004) “Cơ sở Sinh học vi sinh vật”, Nhà xuất giáo dục” & Smith CA, Hussey AM (2005) Gram Stain Protocols American society for microbiology Conference for Undergraduate Educators – American Dũng Nguyễn Lân (11/2005) “Tuần hoàn sinh địa hóa nguyên tố” Vi sinh vật học Hy Lê Gia (2010) “ Giáo trình vi sinh vật học”, NXB Khao Học Công Nghệ Pp.111-136 Lan Khánh (2007) Ơ nhiễm mơi trường cơng nghiệp: Mối đe dọa sức khỏe cộng đồng Báo điện tử Đảng Cộng sản Việt Nam Nghiêm Đặng Xuân (2010) Dịch từ "Melecular bilogy – understanding thegenetic revolution” David D Clark, Đại học Nông Nghiệp Tài liệu tiếng anh Aroca, G.; Urrutia, H.; Nunez, D.; Oyarzuns, P.; Arancibia, A and Guerero K (2007) “Comparison on the removal of hydrogen sulfide in biotrickling filters inoculated with Thionacillus thioparus and Acidithiobaccillus thiooxidans”,Electronic Journal of Biotechnology,vol.10,no.4 Barbosa, V.L.; Atkins, S.D.; Barbosa, V.P.; Burgess, J.E and Stuetz, R.M (2006) “ Characterization of Thiobacillus thioparus isolated from an activated sludge bioreactor used for hydrogen sulfide treatment” Journal of AppliedMicrobiology, vol 101, no.6, p 1269-1281 Bitton, G (1999) Wastewater microbiology,John Wiley & Sons, New York, USA 10 Bordado J.M.C and Gomes, J.F.P (2001)”Characterisation of non-condensable sulphur containing gases from Kraft pulp mills” Chemosphere, vol.44, no.5, p 1011-1016 11 Dobermann, A.; Fairhurst, T.H (2000) Rice: Nutrient Discorders & Nutrient Management, pp: 126-128 52 12 Dongyou, L (2000) “Indentification, subtyping and virulence determination of Listeria monocytogenes, an important foodborne pathogen” Journal of Medical Microbiology 55: 645-659 13 DS Chaudhary, S Vigneswara, H.-H Ngô, WG Shim H Moon (2003) lọc sinh học xử lý nước nước thải (PDF) Hàn Quốc Tạp chí Chemical Engineering Vol.20 No.6 14 Emky H Valdebenito-Rolack; Tamara C Araya; Leslie E Abarzua; Nathaly M Ruiz-Tagle; Katherine E Sossa; Germans E Aroca and Homero E Urrutia (2011) “ Thiosulfate oxidation by Thiobacillus thioparus and Halothiobacillus nespolitanus strains isolated from the petrochemical industry” Electronic Journal of Biotechnology 15 Hurse, T.J.; Kappler U; Keller, J (2008)”Using anoxygenic phototrophic bacteria for the removal of sulfide from wastewater” In Hell, R.; Dahl, C.; Knaff, D.; Leustek, T (Ed) Sulfur metabolism in phototrophic arganisms Science 16 Jesus, G.M.; Silvia, G.A.; Ana, I A and Francisco, R V (1999) “ Use of 16S – 23S ribosomal genes spacer region in studies of prokaryotic diversity” Journal of Microbiological Methods 36, pp 55-64 17 Joseph S Devinny, Marc A Deshusses Todd S Webster (1999) lọc sinh học để kiểm sốt nhiễm khơng khí Lewis Publishers ISBN 1-56670-289-5 18 Kantachote, D.; Charernjratrakul, W.; Noparatnaraporn, N.; Oda, K (2008) “Selection of sulfur oxidizing bacterium for sulfide ramoval in sulfate rich wastewater to enhance biogas production” Electronic Journal of Biotechnology, vol 11, no 19 Kersters, K and Ley, J.D Genus Alcaligens In: Krieg, N.R ed Bergey’s Manual of Systematic Bacterioloy Baltimore, Wiliams & Wikins, 1984 Vol 1, p 361-373, Moreira, D and Amils, R (1997) “Phylogeny of Thiobacillus cuprinus and other mixotrophic Thiobacilli: proposal for Thiomonas gen nov” International Journal of Systematic Bacteriology, vol 47, no 2, pp 522-528 20 Leng Y, Liu Z, Luo Y, Sun M, Li Z, Christie P (2010) Effect of bioaugmentation by Paracoccus sp.strain HPD-2 on the soil microbial community and removal of polycyclic aromatic hydrocarbons from an aged 53 contaminated soil”, Bioresource Technology (Impact Factor: 4.75), 101(10), pp 3437-3443 21 Lomans, B.P; Van Der Drift, C.; Pol, A and Op Den Camp, H.J (2002) “Microbial cycling of volatile organic sulfur compounds” Cellular and Molecular Life Sciences, vol 59, no.4, pp.575-588 22 Lutz, M and Farmer, G., “Pulling double duty: A Colorado plant’s trickling filters treat odor while reducing wastewater nitrogen content,” Water Environment Federation Operations Forum, 16 (7), pp.10-17 (1999) 23 M F Guo, “Studies on screening and degradation properties of highefficiency bacteria capable of degrading hydrogen sulfide,” Master degree thesis in Xi'an University of Architecture and Technology, Xi'an June 2008(Ch)] 24 Mandavia, S.Toxicity.Hydrogen sulfide 2009 25 O’Toole G A and Kolter R (1998) Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signaling pathways: a genetic analysis Molecular Microbiology 28: 449-46]; Morikawa cộng (2006) [Morikawa M (2006)] Beneficial biofilm formation by industrial bacteria Bacillus subtilis and related species Journal of Bioscience and Bioengineering 101(1): 1-8 26 Okabe, S.; Odagiri, M.; Ito, T and Satoh, H (2007) “Succession of sulfur – oxidizing bacteria in the microbial community on corroding concrete in sewer systems” Applied and Environmental Microbiology, vol 73, no 3, pp 971-980 27 Oyarzuns, P.; Arancibia, F.; Canales, C and Aroca, G.E (2003) “Biofiltration of high concentration of hydrogen sulfide using Thiobacillus thioparus” Process Biochemistry, vol 39, pp 165-170 28 Potivichayanon, S.; Pokethitiyook, P and Kruatrachue, M “Hydrogen sulfide removal by a novel fixed-film bioscrubber system” Process Biochemistry, 2006, vol.41, no 3, pp.708-715 29 PW Westerman, JR Bicudo A Kantardjieff (1998) Aerobic cố định phương tiện truyền thông xử lý lọc sinh học phân heo đỏ ửng ASAE Hội nghị thường niên quốc tế - Florida 30 Rattanapan, C.; Kantachote, D.; Yan, R and Boonsawang, P (2010) International Biodeterioration & Biodegradation 64, pp 383-387 54 31 Robertson, L A & Kuenen, J G (2006) The Genus Thiobacillus In: TheProkaryotes, pp 812-827 Edited by M Bworkin, S Falkow, E Rosenberg, K H Sehleifer & Stackebrandt Berlin: Springer, Sorokin, D.Y.; Robertson, L.A.; and Kuenen, J.G (2000) Isolation and characterization of alkaliphilic, chemolithoautotrophic, sulfur – oxidizing bacteria Antonie van Leeuvenhoek 77, pp 251-262 32 Smith CA, Hussey AM (2005) Gram Stain Protocols American society for microbiology Conference for Undergraduate Educators – American 33 Tchobanoglous, G.; Burton, F.I and Stensel, H.D (Eds) (2003) Wastewater Engineering: Treatment, Disposal and Reuse 4th end New York: McGraw-Hill 34 Truong, H.; Eghbal, M.A.; Hindmarsh, W.; Roth, S.H and O”bbrien, P.J (2006) “Molecular machanisms of hydrogen sulfide toxicity” Drug Metabolism Reviews, vol 38, no 4, pp 733-744 35 Vishniac, W and Santer, M (1957) “The Thiobacilli” Bacterial rev 21, pp 195-213 36 Waksman, Selman A.and J.S.Joffe (1992) “Microorganisms concerned in the oxidizing organism isolated from the soil: II Thiobacillus thiooxidans oxidizing organism isolated from the soil.” Journal of bacteriology (2), pp.239-256 37 Widdel, F.; Bak, F (2000) Gram-negative mesophilic sulfate-reducing bacteria In Balows, A.; Trueper, G.H.; Dworkin, M.; Hander, W.; Schleifer, K.H; Eds The Prokaryotes: an Evolving electronic resource for the microbiological community Springer-Verlag, New York 38 Zhou J, Bruns MA, Tiedje JM (1996) DNA Recovery from soils of diverse composition Applied and Environmental Microbiology 62(2): 316-322 Tài liệu lấy từ internet 39 http://ngoclan.org/xu-ly-khi-thai-bang-cong-nghe-biofilter/ 55