VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH TỪ TRẦM TÍCH BIỂN THU THẬP Ở CÔ TÔ – THANH LÂN Giáo viên hướng dẫn : TS Lê Thị Hồng Minh Giáo viên hướng dẫn : NCS Vũ Thị Quyên Sinh viên thực : Âu Hoài Thương Lớp : 11-01 Hà Nội – 2015 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lời cám ơn tới toàn ban giám hiệu Viện Đại học Mở Hà Nội, đặc biệt thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học dạy dỗ em suốt năm học trường, trang bị cho em tảng kiến thức khoa học tạo điều kiện tốt cho em làm báo cáo tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến TS Lê Thị Hồng Minh, Phó Trưởng phòng Công nghệ sinh học – Viện Hoá sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam NCS Vũ Thị Quyên, người truyền cho em phương pháp học tập nghiên cứu khoa học, tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ em suốt trình nghiên cứu vừa qua Đồng thời, em gửi lời cám ơn tới cô chú, anh chị, bạn Phòng Công nghệ sinh học – Viện Hoá sinh biển giúp đỡ em nhiều thời gian thực tập Cuối cùng, em xin gửi tới gia đình, người thân, bạn bè lời cám ơn sâu sắc giúp đỡ, động viên em suốt thời gian học tập Sinh viên Âu Hoài Thương MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Ý nghĩa đề tài PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Xạ khuẩn (Actinomycetes) 2.1.1 Vị trí xạ khuẩn vi sinh vật 2.1.2 Cấu tạo xạ khuẩn 2.1.3 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn 2.1.4 Sự hình thành bào tử xạ khuẩn 2.2 Chất kháng sinh 2.2.1 Lịch sử nghiên cứu chất kháng sinh 2.2.3 Sự hình thành chất kháng sinh xạ khuẩn 2.2.4 Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn 10 2.2.5 Tình hình nghiên cứu nước 12 2.2.6 Xạ khuẩn biển hợp chất thứ cấp chúng 13 2.2.6.1 Streptomycetaceae 13 2.2.6.2 Micromonosporaceae 16 2.2.6.3 Các họ khác Actinobacteria 20 PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 Vật liệu hóa chất 21 3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 21 3.1.2 Hóa chất, dụng cụ thiết bị 21 3.1.2.1 Hóa chất 21 3.2 Phương pháp nghiên cứu 23 3.2.1 Thu thập mẫu trầm tích biển [35] 23 3.2.2 Phương pháp phân lập xạ khuẩn [2] [16] [31] 23 3.2.3 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định [47] 23 3.2.4 Xác định khả sinh enzyme chủng nghiên cứu [15] 24 3.2.5 Phương pháp xác định hình thái chụp SEM [48] 25 3.2.6: Phương phân loại xạ khuẩn kỹ thuật sinh học phân tử 27 3.2.6.1 Phương pháp tách chiết AND tổng số từ xạ khuẩn biển 27 3.2.6.2: Phương pháp PCR [42] 27 3.2.6.3: Giải trình tự [43] 27 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1 Kết thu thập mẫu 28 4.2 Phân lập xạ khuẩn từ trầm tích 29 4.3 Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định chủng nghiên cứu 31 4.4 Khả sinh enzyme chủng nghiên cứu 33 4.4.1 Khả thủy phân tinh bột tan 33 4.4.3 Khả thủy phân CMC 35 4.5 Xác định hình thái chủng xạ khuẩn môi trường thạch quan sát kính hiển vi điện tử SEM 36 4.6 Định danh xạ khuẩn sinh học phân tử 37 4.6.1 Tách ADN genom từ xạ khuẩn 37 4.6.2 Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR 38 4.6.3 Nhân gen 16S ADN riboxom 38 4.6.4 Kết giải trình tự gene 16S ba chủng xạ khuẩn 39 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 5.1: Kết luận 42 5.2: Kiến nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 LỜI CAM ĐOAN 48 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chú thích ADN Axit deoxyribonucleotit Agar Agarose ARN Axit ribonucleotit BLAST Basic Local Alignment Search Tool CKS Chất kháng sinh CMC Carboxymethyl cellulose EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid G(-) Gram âm G(+) Gram dương HTKS Hoạt tính kháng sinh KS Kháng sinh LB Lauria Betani PCR Polymerase Chain Reaction SDS Sodium dodecyl sulfate SEM Scanning Electron Microscope UV Ultraviolet VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật VSVKĐ Vi sinh vật kiểm định XK Xạ khuẩn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Một số hình ảnh xạ khuẩn Hình 2.2 Một số hình ảnh khuẩn lạc xạ khuẩn [41] Hình 2.3 Alexander Fleming [46] Hình 2.4 Cấu trúc chất trao đổi thứ cấp từ Streptomyces 14 Hình 2.5 Các chất trao đổi thứ cấp từ Marinispora 16 Hình 2.6 Các chất trao đổi thứ cấp Salinispora 18 Hình 2.7 Các chất chuyển hóa thứ cấp từ Micromonosporaceae 19 Hình 2.8 Các chất chuyển hóa thứ cấp từ họ khác Actinobacteria 20 Hình 4.1: Một số hình ảnh nơi lấy mẫu mẫu thu 29 Hình 4.2 Một số hình ảnh phân lập xạ khuẩn 29 Hình 4.3 Một số hình ảnh làm chủng xạ khuẩn 31 Hình 4.4: Một số hình ảnh thử hoạt tính kháng VSVKĐ 33 Hình 4.5 Khả thủy phân tinh bột tan 34 Hình 4.6 Khả phân giải casein XK14 XK16 (A); XK13 (B) 34 Hình 4.7 Khả phân giải cellulose 35 Hình 4.8: Hình ảnh khuẩn lạc chủng XK13(A1), XK14(A2), XK16(A3) Hình ảnh chụp kính hiển vi điện tử quét SEM tương ứng B1, B2 B3 36 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1.Các chất kháng sinh phát qua năm Bảng 4.1 Danh sách mẫu trầm tích thu thập Cô Tô – Thanh Lân 28 Bảng 4.2 Danh sách 20 chủng xạ khuẩn phân lập 30 Bảng 4.3 Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định chủng xạ khuẩn 32 Bảng 4.4: Trình tự thông số cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR 38 TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1.Tên đề tài Phân lập định danh số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định từ trầm tích biển thu thập Cô Tô – Thanh Lân Đối tượng Chủng xạ khuẩn phân lập từ trầm tích biển thuộc khu vực biển Cô Tô – Thanh Lân dùng để tuyển chọn nghiên cứu hoạt tính sinh học Mục tiêu Tuyển chọn nghiên cứu số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Kết Phân lập làm chủng xạ khuẩn từ mẫu trầm tích Kiểm tra hoạt tính kháng sinh chủng xạ khuẩn với vi sinh vật kiểm định Tuyển chọn 2-3 chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao, có khả kháng vi sinh vật kiểm định Kiểm tra hoạt tính sinh enzyme: amylase, protease cellulase chủng xạ khuẩn tuyển chọn Định danh chủng tuyển chọn PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Từ xa xưa, bệnh nhiễm khuẩn nỗi lo đáng ngại người Chính điều thúc nhà khoa học giới phải tìm chất có khả phòng chống điều trị bệnh nhiễm khuẩn Năm 1928, A.Pleming phát penicillin-CKS có nguồn gốc từ nấm Penicillium phải 10 năm sau, năm 1941 penicillin thức sử dụng y học cứu sống bệnh nhân nhiễm trùng máu đầu tiên, từ kỷ nguyên CKS bắt đầu Đây thành tựu vĩ đại nhân loại kỷ XX Tuy nhiên, việc sử dụng CKS không hợp lý làm cho tượng kháng kháng sinh xuất hiện, phát triển ngày lan rộng Việc sử dụng số chất đặc hiệu để chữa trị số loại bệnh không mang lại hiệu mong muốn Số lượng vi khuẩn đề kháng với kháng sinh ngày gia tăng Chính việc tìm kiếm CKS thu hút quan tâm nhiều nhà khoa học Cho đến nay, người phát khoảng 17.000 CKS có nguồn gốc VSV, 3.000 CKS bán tổng hợp năm có khoảng vài trăm CKS phát Trong số VSV sinh CKS xạ khuẩn đóng vai trò quan trọng hàng đầu, chiếm 80% chất kháng sinh mô tả, chủ yếu thuộc chi Streptomyces [4][6] Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn đó, tiến hành thực đề tài: Phân lập định danh số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định từ trầm tích biển thu thập Cô Tô – Thanh Lân 1.2 Mục tiêu đề tài - Phân lập làm xạ khuẩn từ mẫu trầm tích - Nghiên cứu tuyển chọn số chủng xạ khuẩn có khả kháng vi sinh vật kiểm định - Kiểm tra khả sinh enzym ngoại bào để chọn chủng có hoạt tính enzyme cao - Định danh tên khoa học số chủng xạ khuẩn có hoạt tính cao 1.3 Ý nghĩa đề tài Tiến hành nghiên cứu hệ xạ khuẩn từ trầm tích biển, từ tiến tới khai thác nguồn dược liệu từ vi sinh vật biển nói chung xạ khuẩn từ trầm tích biển nói riêng Hình 4.5 Khả thủy phân tinh bột tan Kết thí nghiệm cho thấy chủng xạ khuẩn nghiên cứu XK13, XK14 XK16 có khả sinh enzyme amylase Môi trường xung quanh chủng xạ khuẩn không màu, suốt, bên có màu xanh tím, đường kính vòng phân giải 5mm, 11mm 20,5mm Từ kết trên, ta thấy chủng chủng XK16 có vòng phân giải rộng rõ (20,5mm), điều chứng tỏ khả sinh enzyme amylase chủng XK16 tốt (hình 4.5) 4.4.2 Khả thủy phân protein (casein) Nuôi cấy xạ khuẩn môi trường có 1-3% casein Sau 1-2 ngày nuôi cấy điều kiện thích hợp lấy nhỏ 1-2ml dung dịch lugol để thử Nếu xạ khuẩn có enzyme có khả phân hủy casein chúng tạo vòng phân giải xung quanh vị trí xạ khuẩn phát triển, vòng phân giải có màu trong, bên có màu nâu đỏ A B Hình 4.6 Khả phân giải casein XK14 XK16 (A); XK13 (B) 34 Kết cho thấy ba chủng xạ khuẩn nghiên cứu có phản ứng dương tính: môi trường xung quanh nấm không màu, suốt Phía bên có màu nâu đỏ Ba chủng có khả sinh enzyme protease với đường kính vòng phân giải là: 5mm (XK13), 9,5 mm (XK14) 26,3mm (XK16) Trong chủng chủng XK16 có vòng phân giải 26,3mm rộng rõ nhất, điều chứng tỏ khả sinh enzyme protease chủng XK16 tốt (Hình 4.6) 4.4.3 Khả thủy phân CMC Nuôi cấy xạ khuẩn môi trường có 1-3% CMC Sau 2-3 ngày nuôi cấy điều kiện thích hợp lấy nhỏ 1-2ml dung dịch lugol để thử Nếu xạ khuẩn có enzyme có khả phân hủy CMC chúng tạo vòng phân giải xung quanh vị trí xạ khuẩn phát triển, vòng phân giải có màu trong, bên có màu nâu đỏ A B Hình 4.7 Khả phân giải cellulose Kết thí nghiệm cho thấy chủng xạ khuẩn nghiên cứu có khả sinh enzyme cellulase: môi trường xung quanh xạ khuẩn không màu, bên màu nâu đỏ Đường kính vòng phân giải chủng XK13, XK14, XK16 4,5mm (A), 19mm (B) 12mm (A) Trong chủng chủng XK14 có vòng phân giải rộng rõ nhất, điều chứng tỏ khả sinh enzyme cellulose chủng XK14 tốt (Hình 4.7) 35 4.5 Xác định nh hình thái chủng xạ khuẩn môi trường thạch ch quan sát kính hiển vi điện n tử t SEM A1 A2 B2 B1 A3 B3 Hình 4.8: Hình ảnh nh khuẩn khu lạc chủng XK13(A1), 13(A1), XK14(A2), XK16(A3) Hình ảnh chụp p kính hiển hi vi điện tử quét SEM tương ứng ng B1, B2 B3 Kết nghiên cứuu hình 4.8 cho thấy: Chủng XK13 rên môi tr trường A1, khuẩn lạc nhô cao, nhăn ăn tâm, dạng phấn Đường kính khuẩnn lạc l 6-12mm Màu sắc khuẩn ty khí sinh trắắng đục Màu sắc khuẩn ty chất nâu xám Quan sát kính hiển vi ta thấyy chuỗi bào tử dạng xoắn Chủng XK14 rên môi trường tr A1, khuẩn lạc nhô cao, bào tử khí sinh phát triển tốt Đường kính khuẩn khu lạc 4-11mm Màu sắc khuẩnn ty khí sinh trắng Màu sắc khuẩn ty chất nâu sẫm s Quan sát kính hiển vi ta thấyy chu chuỗi bào tử dạng thẳng, hệ sợii phân nhánh Chủng XK16 rên môi trường tr A1, khuẩn lạc phẳng, u Đư Đường kính khuẩn lạc 5-9mm Màu ssắc khuẩn ty khí sinh trắng Màu sắc khuẩnn ty ccơ chất nâu nhạt Quan sát dướii kính hiển hi vi ta thấy chuỗi bào tử dạng thẳng, ng, bào ttử có hình bầu dục, xếp p thành chuỗi chu dài Các khuẩn lạc củaa chủng ch có khác biệt mặt kích thướ ớc, kích thước khuẩn lạc phụ thuộcc vào ch chủng độ tuổi dao động từ vài mm mm, bề mặt 36 khuẩn lạc (mềm, cứng, nhăn nheo, cấu trúc hạt), độ dày (phồng hay phẳng) Các khuẩn lạc tạo thành hệ sợi chất sợi khí sinh với loại màu khác trắng nâu vàng… Đặc điểm bào tử chuỗi bào tử quan sát kính hiển vi điện tử SEM, chuỗi bào tử chủng chia thành hai loại: Dạng thẳng có chuỗi bào tử thẳng ngoằn ngoèo, hệ sợi khí sinh phân nhánh màu trắng Hoặc dạng xoắn có hệ sợi khí sinh tạo thành sợi mang bào tử phân nhánh có hình móc, vòng mở, bào tử có hình bầu dục hình xoắn, xếp thành chuỗi dài Các đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn môi trường thạch quan sát kính hiển vi điện tử SEM cho thấy chủng XK13, XK14, XK16 mang đầy đủ đặc điểm chung chi xạ khuẩn Streptomyces theo khóa phân loại Bergey (1963) Để khẳng định xác việc định danh đến chi chủng nghiên cứu, tiến hành giải trình tự gen 16S ARN riboxom XK13, XK14, XK16 so sánh chúng với Ngân hàng gen Quốc tế 4.6 Định danh xạ khuẩn sinh học phân tử 4.6.1 Tách ADN genom từ xạ khuẩn Từ 1,5ml dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn chọn, qua nhiều bước xử lý thu ADN genom Độ tinh sản phẩm kiểm tra phổ hấp thụ tử ngoại điện di gel agaroza 1% Hình ảnh điện di (Hình 4.9) cho thấy mẫu ADN sạch, bị đứt gẫy, sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR Hình 4.9: Kết điện di đồ AND tổng số ba chủng xạ khuẩn Đường chạy số AND tổng số chủng XK13 Đường chạy số AND tổng số chủng XK14 Đường chạy số AND tổng số chủng XK16 37 4.6.2 Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR Mồi PCR thiết kế sở chọn vùng có tính bảo thủ cao Để thực điều này, tra cứu Ngân hàng gen quốc tế dựa sở số trình tự gen 16S ARN riboxom, sử dụng số phần mềm để trợ giúp tính toán thiết kế mồi Thông số cặp mồi lựa chọn trình bày bảng 4.4, kích thước đoạn gen thu theo tính toán lý thuyết khoảng 1500bp Bảng 4.4: Trình tự thông số cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR Tm(0C) %GC AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 52 45 TAC GGC TAC CTT GTT AGC ACTT 58 55,5 Mã hiệu Trình tự mồi cho 16S rARN 16SF 16SR 4.6.3 Nhân gen 16S ADN riboxom Từ ADN genom chủng nghiên cứu, sử dụng cặp mồi 16SF,16SR, tiến hành PCR nhân đoạn gen 16S với chu trình nhiệt nêu phần phương pháp Với cặp mồi thiết kế dựa trình tự bảo thủ gen 16S ARN riboxom xạ khuẩn khuôn ADN genom theo lý thuyết sản phẩm PCR có độ dài xấp xỉ 1500 bp Kết điện di đồ sản phẩm PCR (hình 4.10) cho thấy sản phẩm PCR chủng xuất băng có kích thước khoảng 1500bp Như chu trình phản ứng PCR thiết lập hoàn toàn phù hợp với mục đích nhân dòng đoạn gen 16S chủng nghiên cứu Hình 4.10: Điện di đồ sản phẩm PCR gen 16S ADN riboxom chủng XK13, XK14 XK16 1500bp Giếng 1,2,3: sản phẩm PCR chủng xạ khuẩn XK13, XK14 XK16 Giếng : thang ADN chuẩn 38 Như vậy, khuyếch đai đoạn gen 16S ARN riboxom chủng xạ khuẩn có hoạt tính cao Trên sở tiến hành tinh lượng lớn sản phẩm PCR để tiến hành đọc trình tự nucleotit 4.6.4 Kết giải trình tự gene 16S ba chủng xạ khuẩn Trình tự gen xác định theo phương pháp Sanger&đtg Sau xử lý liệu thu qua chương trình GENE DOC, nhận trình tự hoàn chỉnh gen 16S ARN riboxom chủng • Kết trình tự đoạn gen 16S ARN riboxom chủng XK13 có độ dài 1522 bp AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG GACGAACGCT GGCGGCGTGC TTAACACATG CAAGTCGAAC GATGAAGCCG CTTCGGTGGT GGATTAGTGG CGAACGGGTG AGTAACACGT GGGCAATCTG CCCTGCACTC TGGGACAAGC CCTGGAAACG GGGTCTAATA CCGGATACGA CACAGGAAGG CATCTTCTCT GTGTGGAAAG CTCCGGCGGT GCAGGATGAG CCCGCGGCCT ATCAGCTTGT TGGTGGGGTG ATGGCCTACC AAGGCGACGA CGGGTAGCCG GCCTGAGAGG GCGACCGGCC ACACTGGGAC TGAGACACGG CCCAGACTCC TACGGGAGGC AGCAGTGGGG AATATTGCAC AATGGGCGCA AGCCTGATGC AGCGACGCCG CGTGAGGGAT GACGGCCTTC GGGTTGTAAA CCTCTTTCAG CAGGGAAGAA GCGCAAGTGA CGGTACCTGC AGAAGAAGCA CCGGCTAACT ACGTGCCAGC AGCCGCGGTA ATACGTAGGG TGCGAGCGTT GTCCGGAATT ATTGGGCGTA AAGAGCTCGT AGGCGGCTTG TCACGTCGGA TGTGAAAGCC CGGGGCTTAA CCCCGGGTCT GCATTCGATA CGGGCAGGCT AGAGTTCGGT AGGGGAGATC GGAATTCCTG GTGTAGCGGT GAAATGCGCA GATATCAGGA GGAACACCGG TGGCGAAGGC GGATCTCTGG GCCGATACTG ACGCTGAGGA GCGAAAGCGT GGGGAGCGAA CAGGATTAGA TACCCTGGTA GTCCACGCCG TAAACGTTGG GAACTAGGTG TGGGCGACAT TCCACGTCGT CCGTGCCGCA GCTAACGCAT TAAGTTCCCC GCCTGGGGAG TACGGCCGCA AGGCTAAAAC TCAAAGGAAT TGACGGGGGC CCGCACAAGC GGCGGAGCAT GTGGCTTAAT TCGACGCAAC GCGAAGAACC TTACCAAGGC TTGACATACA TCGGAAAGCC GTAGAGATAC GGCCCCCCTT GTGGTCGGTG TACAGGTGGT GCATGGCTGT CGTCAGCTCG TGTCGTGAGA TGTTGGGTTA AGTCCCGCAA CGAGCGCAAC CCTTGTTCTG TGTTGCCAGC ATGCCTTTCG GGGTGATGGG GACTCACAGG AGACTGCCGG GGTCAACTCG GAGGAAGGTG GGGACGACGT CAAGTCATCA TGCCCCTTAT GTCTTGGGCT GCACACGTGC TACAATGGCC GGTACAATGA GTTGCGATGC CGTGAGGTGG AGCGAATCTC AAAAAGCCGG TCTCAGTTCG GATTGGGGTC TGCAACTCGA CCCCATGAAG TCGGAGTCGC TAGTAATCGC AGATCAGCAT TGCTGCGGTG AATACGTTCC CGGGCCTTGT ACACACCGCC CGTCACGTCA CGAAAGTCGG TAACACCCGA AGCCGGTGGC CTAACCCCCT TGTGGGGAGG GAATCGTCGA AGGTGGGACT GGCGATTGGG GACGAAGTCG TAACAAGGTA GCCGTACCGG AAGGGTGCGG CTGGATCACC CT Chúng sử dụng chương trình BLAST để so sánh trình tự đoạn gen chủng XK13 với trình tự gen 16S ARN riboxom xạ khuẩn khác đăng ký Ngân hàng gen quốc tế Kết cho thấy đoạn gen có độ tương đồng cao (100%) so với gen 16S ARN riboxom chủng Streptomyces sp VITTK3 mã số GU808333 phân lập từ mẫu trầm tích biển Ấn Độ 39 • Kết trình tự đoạn gen 16S ARN riboxom chủng XK14 có độ dài 1495 bp GAGTTTGATC CTGGCTCAGG ACGAACGCTG GCGGCGTGCT TAACACATGC AAGTCGAACG ATGAAGCCGC TTCGGTGGTG GATTAGTGGC GAACGGGTGA GTAACACGTG GGCAATCTGC CCTGCACTCT GGGACAAGCC CTGGAAACGG GGTCTAATAC CGGATATGAC ACAGGAAGGC ATCTTCTCTG TGTGGAAAGC TCCGGCGGTG CAGGATGAGC CCGCGGCCTA TCAGCTTGTT GGTGGGGTGA TGGCCTACCA AGGCGACGAC GGGTAGCCGG CCTGAGAGGG CGACCGGCCA CACTGGGACT GAGACACGGC CCAGACTCCT ACGGGAGGCA GCAGTGGGGA ATATTGCACA ATGGGCGGAA GCCTGATGCA GCGACGCCGC GTGAGGGATG ACGGCCTTCG GGTTGTAAAC CTCTTTCAGC AGGGAAGAAG CGCAAGTGAC GGTACCTGCA GAAGAAGCAC CGGCTAACTA CGTGCCAGCA GCCGCGGTAA TACGTAGGGT GCGAGCGTTG TCCGGAATTA TTGGGCGTAA AGAGCTCGTA GGCGGCTTGT CACGTCGGAT GTGAAAGCCC GGGGCTTAAC CCCGGGTCTG CATTCGATAC GGGCAGGCTA GAGTTCGGTA GGGGAGATCG GAATTCCTGG TGTAGCGGTG AAATGCGCAG ATATCAGGAG GAACACCGGT GGCGAAGGCG GATCTCTGGG CCGATACTGA CGCTGAGGAG CGAAAGCGTG GGGAGCGAAC AGGATTAGAT ACCCTGGTAG TCCACGCCGT AAACGTTGGG AACTAGGTGT GGGCGACATT CCACGTCGTC CGTGCCGCAG CTAACGCATT AAGTTCCCCG CCTGGGGAGT ACGGCCGCAA GGCTAAAACT CAAAGGAATT GACGGGGGCC CGCACAAGCG GCGGAGCATG TGGCTTAATT CGACGCAACG CGAAGAACCT TACCAAGGCT TGACATACAT CGGAAAGCCG TAGAGATACG GCCCCCCTTG TGGTCGGTGT ACAGGTGGTG CATGGCTGTC GTCAGCTCGT GTCGTGAGAT GTTGGGTTAA GTCCCGCAAC GAGCGCAACC CTTATTCTGT GTTGCCAGCA TGCCTTTCGG GGTGATGGGG ACTCACAGGA GACTGCCGGG GTCAACTCGG AGGAAGGTGG GGACGACGTC AAGTCATCAT GCCCCTTATG TCTTGGGCTG CACACGTGCT ACAATGGCCG GTACAATGAG TTGCGATACC GTGAGGTGGA GCGAATCTCA AAAAGCCGGT CTCAGTTCGG ATTGGGGTCT GCAACTCGAC CCCATGAAGT CGGAGTCGCT AGTAATCGCA GATCAGCATT GCTGCGGTGA ATACGTTCCC GGGCCTTGTA CACACCGCCC GTCACGTCAC GAAAGTCGGT AACACCCGAA GCCGGTGGCC TAACCCCCTT GTGGGGAGGG AATCGTCGAA GGTGGGACTG GCGATTGGGA CGAAGTCGTA ACAAGGTAGC CGTAA Kết so sánh trình tự đoạn gen chủng XK14 với trình tự gen 16S ARN riboxom xạ khuẩn khác đăng ký Ngân hàng gen quốc tế cho thấy, đoạn gen có độ tương đồng cao (100%) so với gen 16S ARN riboxom chủng Streptomyces sp CNP-942- SD01 mã số EU214914 phân lập từ mẫu trầm tích biển Mỹ • Kết trình tự đoạn gen 16S ARN riboxom chủng XK16 có độ dài 1421 bp GGCTTACCAT GCAGTCGAAC GATGAAGCCG CTTCGGTGGT GGATTAGTGG CGAACGGGTG AGTAACACGT GGGCAATCTG CCCTGCACTC TGGGACAAGC CCTGGAAACG GGGTCTAATA CCGGATACGA CACAGGAAGG CATCTTCTCT GTGTGGAAAG CTCCGGCGGT GCAGGATGAG CCCGCGGCCT ATCAGCTTGT TGGTGGGGTG ATGGCCTACC AAGGCGACGA CGGGTAGCCG GCCTGAGAGG GCGACCGGCC ACACTGGGAC TGAGACACGG CCCAGACTCC TACGGGAGGC AGCAGTGGGG AATATTGCAC AATGGGCGCA AGCCTGATGC AGCGACGCCG CGTGAGGGAT GACGGCCTTC GGGTTGTAAA CCTCTTTCAG CAGGGAAGAA GCGCAAGTGA CGGTACCTGC AGAAGAAGCA CCGGCTAACT ACGTGCCAGC AGCCGCGGTA ATACGTAGGG TGCGAGCGTT GTCCGGAATT ATTGGGCGTA AAGAGCTCGT AGGCGGCTTG TCACGTCGGA TGTGAAAGCC CGGGGCTTAA CCCCGGGTCT GCATTCGATA CGGGCAGGCT AGAGTTCGGT AGGGGAGATC GGAATTCCTG GTGTAGCGGT GAAATGCGCA 40 GATATCAGGA GGAACACCGG TGGCGAAGGC GGATCTCTGG GCCGATACTG ACGCTGAGGA GCGAAAGCGT GGGGAGCGAA CAGGATTAGA TACCCTGGTA GTCCACGCCG TAAACGTTGG GAACTAGGTG TGGGCGACAT TCCACGTCGT CCGTGCCGCA GCTAACGCAT TAAGTTCCCC GCCTGGGGAG TACGGCCGCA AGGCTAAAAC TCAAAGGAAT TGACGGGGGC CCGCACAAGC GGCGGAGCAT GTGGCTTAAT TCGACGCAAC GCGAAGAACC TTACCAAGGC TTGACATACA TCGGAAAGCC GTAGAGATAC GGCCCCCCTT GTGGTCGGTG TACAGGTGGT GCATGGCTGT CGTCAGCTCG TGTCGTGAGA TGTTGGGTTA AGTCCCGCAA CGAGCGCAAC CCTTGTTCTG TGTTGCCAGC ATGCCTTTCG GGGTGATGGG GACTCACAGG AGACTGCCGG GGTCAACTCG GAGGAAGGTG GGGACGACGT CAAGTCATCA TGCCCCTTAT GTCTTGGGCT GCACACGTGC TACAATGGCC GGTACAATGA GTTGCGATGC CGTGAGGTGG AGCGAATCTC AAAAAGCCGG TCTCAGTTCG GATTGGGGTC TGCAACTCGA CCCCATGAAG TCGGAGTCGC TAGTAATCGC AGATCAGCAT TGCTGCGGTG AATACGTTCC CGGGCCTTGT ACACACCGCC CGTCACGTCA CGAAAGTCGG TAACACCCGA AGCCGGTGGC CTAACCCCCT TGTGGGGAGG GAATCGTCGA AGGTGGACCG G Kết so sánh trình tự đoạn gen chủng XK16 với trình tự gen 16S ARN riboxom xạ khuẩn khác đăng ký Ngân hàng gen quốc tế cho thấy, đoạn gen có độ tương đồng cao (100%) so với gen 16S ARN riboxom chủng Streptomyces sp 133VN28 mã số KJ434942 phân lập vùng biển phía Nam Hàn Quốc Từ số đặc điểm hình thái so sánh trình tự gene 16S ARN riboxom chủng phân lập Chúng kết luận chủng nghiên cứu XK13, XK14, XK16 thuộc chi Streptomyces spp Streptomyces chi lớn ngành Actinobacteria chi thuộc nhánh Streptomycetaceae Chủng vi sinh sản xuất nửa số thuốc kháng sinh giới sản phẩm có giá trị lớn lĩnh vực y tế Streptomyces họ hàng trở nên phổ biến nhờ vào khả sản xuất chế phẩm như: Thuốc kháng sinh: streptomycin, erythromycin, tetracyclin, neomycin, chloramphenicol, vancomycin, gentamicin; thuốc kháng nấm: nystatin, amphotericin; thuốc chống ung thư: doxorubicin, bleomycin, mitomycin; Ức chế miễn dịch: rapamycin; thuốc diệt cỏ: bialaphos… 41 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1: Kết luận - Từ mẫu trầm tích thu Đảo Cô Tô – Thanh Lân tuyển chọn 20 chủng xạ khuẩn thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định - Đã chọn chủng có khả kháng vi sinh vật kiểm định cao Chủng XK13 có đường kính kháng E.faecalis 20,33mm, kháng S.aureus 23,67mm, kháng C.albican 21mm Chủng XK14 có đường kính kháng B.cereus 24,03mm, S.aureus 23mm, C.albican 18,67mm Chủng XK16 có đường kính kháng E.faecalis 20,67mm, B.cereus 22mm, S.aureus 21mm C.albican 24,03mm - Cả ba chủng có khả sinh enzyme với độ mạnh yếu khác nhau, chủng XK16 có khả sinh amylase cao với vòng phân giải 20,5mm, chủng XK16 có khả sinh protease cao với vòng phân giải 26,3mm chủng có khả sinh cellulase cao XK14với vòng phân giải 19mm - Đã xác định đặc điểm hình thái chủng nghiên cứu quan sát chúng môi trường thạch nuôi cấy kính hiển vi điện tử SEM, kết hợp với giải trình tự 16S ARN riboxom chủng, kết cho thấy chủng thuộc chi Streptomyces spp 5.2: Kiến nghị - Tối ưu hóa điều kiện trình lên men, tách chiết chất từ dịch lên men nghiên cứu cấu trúc hoạt chất ba chủng: XK13, XK14 XK16 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Đỗ Thu Hà, Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, 2006 Đỗ Thu Hà, Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập đất Quảng Nam – Đà Nẵng, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, 2004 Lê Gia Hy, Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh cống nấm gây bệnh đạo ôn thối cổ rễ phân lập Việt Nam, Luận án Phó tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, 1994 Lê Mai Hương, Nguyên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh phân lập Hà Nội vùng phụ cận, Luận văn phó tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, 1993 Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượn, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty, Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập 1, NXBKHKT Hà Nội, 1972 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, 2007 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Vi sinh vật học, tập II, Nhà xuất Đại học Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội, 1977 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, 2007 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Vi sinh vật học, tập II, Nhà xuất Đại học Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội, 1977 10 Nguyễn Lân Dũng, Thực tập vi sinh vật học, NXB Đại học Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội, 1993 11 Nguyễn Thành Đạt, K.A Vinogradva V.A.Poltorac, Tinh biến dị bề mặt bào tử xạ khuẩn sinh choromomycin, Act.A buraviensis, microbiologia, TXL III, N5, NXB Academia cccp, 1974 12 Nguyễn Văn Cách, Công nghệ lên men chất kháng sinh, NXB Khoa học Kĩ thuật, tr.17, 2004 43 13 Phan Quốc Kinh, Công nghiệp hóa chất, Thông tin Kinh tế Công nghệ, số 1, 2004 14 Phan Quốc Kinh, Công nghiệp hóa chất, Thông tin Kinh tế Công nghệ, số 1, 2004 15 Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, Thực phẩm Mỹ phẩm, NXB Giáo dục 16 Trịnh Ngọc Hoàng, Nghiên cứu tính đối kháng xạ khuẩn với số VSV gây nhiễm trùng bệnh viện, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, 2009 17 Vi Thị Đoan Chính, Nghiên cứu khả nâng cao hoạt tính kháng sinh chủng Streptomyces rimosus R77 Streptomyces hygroscopicus 5820 kỹ thuật dung hợp tế bào trần, Luận án TS Sinh học, Viện công nghệ sinh học, HÀ Nội, 2000 18 Vi Thị Đoan Chính, Tuyển chọn nghiên cứu xạ khuẩn có khả đối kháng với số chủng vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện, Báo cáo tổng kết đề tài khoa học công nghệ cấp Bộ Mã số B2009 – TN07 – 02 Tài liệu Tiếng Anh 19 Canedo, L M., Fernandez-Puentes, J L & Baz, J P., IB-96212, a novel cytotoxic macrolide produced by a marine Micromonospora II Physicochemicalproperties and structure determination, Journal of Antibiotics, 2000 20 Chen M., Xiao X., Wang P., Zeng X., Wang F, Arthrobacter ardleyensis sp nov isolated from Antarctic lake sediment and deep-sea sediment, Arch Microbiol, 183, pp 301-305, 2008 21 Erba, E., Bergamaschi, D., Ronzoni, S., Faretta, M., Taverna, S., Bonfanti, M., Catapano, C V., Faircloth, G., Jimeno, J & D'incalci, M., Mode of action of thiocoraline, a natural marine compound with anti-tumour activity, British Journal of Cancer, 1999 22 Fred C Tenover, Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria, Amer.J Med, 119, pp.3-10, 2006 44 23 Gontang, E A., Fenical, W & Jensen, P R., Phylogenetic diversity of Grampositive bacteria cultured from marine sediments, Applied and Environmental Microbiology, 2007 24 Hernandez, D., Altuna, M., Cuevas, C., Aligue, R., Albericio, F & Alvarez, M., Synthesis and antitumor activity of mechercharmycin A analogues, Journal of Medicinal Chemistry, 2008 25 Hozzein W.N., Li W.J., Ali M.I.A, Hammouda O., Mousa A.S., Xu L.H., Jiang C L., Nocardiopsis alkliphila sp nov., a novel alkaliphilic actinomycete isolated from desert soil in Egypt, Int J Syst Evol Microbial, 54, pp.247-252, 2004 26 Imada, C., Okami, Y & Hotta, K., Production of selenohomocystine as anantibiotic by a marine Bacillussp No 14 with selenomethionine resistance, Journal of Antibiotics, 2002 27 Kanoh, K., Matsuo, Y., Adachi, K., Imagawa, H., Nishizawa,M & Shizuri, Y., Mechercharmycins A and B, cytotoxic substances from marine-derived Thermoactinomycessp YM3-251, Journal of Antibiotics, 2005 28 MA Elberson, F Malekzadeh, M.T Yazdi, N Kameranpour, M.R Noori – Daloii, M H Matte, M Shahamat, R.R Colwell, K.R Sower, Cellulomonas persica sp nov and Cellulomonas iranensis sp nov., mesophilic cellulose – degrading bacteria isolated from forest soils, J Syst Evol Microbiol 50, p.993, 2000 29 Negri, A., Marco, E., Garcia-Hernandez, V., Domingo, A., Llamas-Saiz, A L., Porto-Sanda, S., Riguera, R., Laine, W.,David-Cordonnier, M H., Bailly, C., Garcia-Fernandez, L F., Vaquero, J J & Gago, Antitumor activity, x-ray crystal structure, and DNA binding properties of thiocoraline A, a natural bisintercalating thiodepsipeptide, Journal of Medicinal Chemistry, 2007 30 Pasti M B., Pometto A P., Nuti M P., Crawford D L., Ligninsolubilizing ability of actinomycetes isolated from termite (Termitidae) gutt, Appl Environ Microbiol, pp.2213-2218, 1990 45 31 R Gupta, O.K Beg, P Lorenz, Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and industrial application, Appl Microbiol Biotrechol 59 (1), p.15, 2002 32 Riedlinger, J., Reicke, A., Zahner, H., Krismer, B., Bull, A T., Maldonado, L A., Ward, A C., Goodfellow, M., Bister, B., Bischoff, D., Sussmuth, R D & Fiedler, H P., Abyssomicins, inhibitors of the para-aminobenzoic acid pathway produced by the marine Verrucosisporastrain AB-18-032, Journal of Antibiotics, 2004 33 Saga T., Yamaguchi K, History of antimicrobial agents and resistant bacteria, J Japan Med Assoc, 137, pp.513-517, 2008 34 Seong C N., Kim Y S., Baik K S., Lee S D., Hah Y C., Kim S B., Goodfellow M, Mycolic acid-containing actinomycetes associated with activated sludge foam, J Microbiol, 37, pp.66-72, 1999 35 Sherif S Ebada and Peter Proksch (2012), The Chemistry of Marine Sponges Handbook of Marine Natural Products (190-294) 36 Sitachitta, N., Gadepalli, M & Davidson, B S., New α-pyrone-containing metabolites from a marine-derived actinomycete, Tetrahedron , 1996 37 Steger K, PhD Thesis: Composition of microbial communities in composts A tool to assess process development and quality of the final product Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala, 2006 38 Suzumura, K., Yokoi, T., Funatsu, M., Nagai, K., Tanaka, K., Zhang, H & Suzuki, K., YM-266183 and YM-266184, novel thiopeptide antibiotics produced by Bacillus cereus isolated from a marine sponge II Structure elucidation, Journal of Antibiotics, 2003 39 Teasdale, M E., Liu, J., Wallace, J., Akhlaghi, F & Rowley, D C., Secondary metabolites produced by the marine bacterium Halobacillus salinusthat inhibit quorum sensing-controlled phenotypes in gram-negative bacteria, Applied and Environmental Microbiology, 2009 40 Zhang JF, Liu JJ, Lu MQ, Cai Cj, Yang Y, Li H, Xu C, Chen GH, Rapamycin in hibits cell growth by induction of apoptosis on hepatocellular carcinomacells in vitro, Transpl Immunol, 2007 46 Các trang web tham khảo 41 http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phanloaixakhuan01.htm 42 http://vi.wikipedia.org/wiki/PCR 43 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST 44 http://doc.edu.vn/tai-lieu/luan-van-nghien-cuu-xa-khuan-thuoc-chistreptomyces-sinh-chat-khang-sinh-chong-nam-gay-benh-tren-cay-che-othai-nguyen-1761/ 45 http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phanloaixakhuan01.htm 46 http://www.slideshare.net/phongphunguyen16/khng-sinh 47 http://www.vnua.edu.vn:85/tc_khktnn/Upload%5C2102014tc%20so%205%204.pdf 48 http://vi.wikipedia.org/wiki/K%C3%ADnh_hi%E1%BB%83n_vi_%C4%91i %E1%BB%87n_t%E1%BB%AD_qu%C3%A9t 47 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết số liệu nghiên cứu trình bày luận văn trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ việc thực luận văn cảm ơn, thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Sinh viên Âu Hoài Thương 48 [...]... tính kháng thu c kháng sinh và phát hiện các kháng sinh mới có cơ chế hoạt động khác nhau [22] 2.2.3 Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn Một trong những đặc điểm quan trọng của xạ khuẩn là khả năng hình thành chất kháng sinh Đa số các chất kháng sinh dùng trong y học hiện nay có nguồn gốc từ xạ khuẩn, trong khoảng 5500 chất kháng sinh đã biết đến hiện nay có khoảng 4000 chất kháng sinh từ xạ khuẩn. .. 2.1 Xạ khuẩn (Actinomycetes) Xạ khuẩn có danh pháp khoa học là Actinobacteria, tiếng Anh: Actinomycetes, là một nhóm vi khuẩn thật phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên Streptomyces Norcadia Hình 2.1 Một số hình ảnh về xạ khuẩn 2.1.1 Vị trí của xạ khuẩn trong vi sinh vật Xạ khuẩn thu c nhóm vi khuẩn Gram dương, hiếu khí, hoại sinh và có cấu tạo dạng sợi phân nhánh Trong số khoảng 1000 chi và 5000 loài sinh. .. số các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn đều có phổ kháng sinh rộng, kìm hãm hoặc ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nhiều loại VSV khác nhau 9 Ngày nay, người ta đã biết chất kháng sinh là sản phẩm trao đổi thứ cấp của vi sinh vật Dẫu vậy vẫn còn nhiều giả thuyết khác nhau về vai trò của chất kháng sinh đối với xạ khuẩn Một số cho rằng, sự hình thành chất kháng sinh là cơ chế giúp xạ khuẩn. .. loài vi khuẩn thu c chi Lactobacillus và Corynebacterium - Xạ khuẩn giống vi khuẩn ở chỗ không có nhân thật, chúng chỉ chứa nhiễm sắc chất phân bố dọc theo các sợi hoặc các tế bào - Đường kính của sợi xạ khuẩn và bào tử giống với ở vi khuẩn Đồng thời sợi xạ khuẩn thường không chứa vách ngăn - Xạ khuẩn là đích tấn công của các thực khuẩn thể giống như vi khuẩn, trong khi đó, nấm không bị tấn công bởi... không bị tấn công bởi thực khuẩn thể - Xạ khuẩn thường nhạy cảm với các kháng sinh có tác dụng lên vi khuẩn, nhưng lại thường kháng với những kháng sinh tác dụng lên nấm như các polyen - Xạ khuẩn không chứa chitin, chất có mặt trong sợi và bào tử của nhiều nấm, mà không có ở vi khuẩn Đồng thời giống như phần lớn vi khuẩn, xạ khuẩn không chứa cellulose - Tương tự với vi khuẩn, xạ khuẩn nhạy cảm với phản... sinh vật nhân sơ đã công bố có khoảng 100 chi và 1000 loài xạ khuẩn Xạ khuẩn phân bố chủ yếu trong đất và đóng vai trò rất quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất trong tự nhiên Chúng sử dụng acid humic và các chất hữu cơ khó phân giải khác trong đất Mặc dù xạ khuẩn thu c nhóm sinh vật nhân sơ nhưng chúng thường sinh trưởng dưới dạng sợi và thường tạo nhiều bào tử Thậm chí một số loại xạ khuẩn. .. tính kháng khuẩn chống lại nhiều chủng Gram dương và Gram âm Chất chuyển hóa phức tạp này đã đưa ra giả thuyết là nucleophin của trioxacarcin A tấn công ADN của vi khuẩn dẫn đến vi c phân cắt sợi, do đó dẫn tới khả năng gây độc tế bào mạnh của nó Cấu trúc bổ sung mới được tìm thấy từ một chủng Streptomyces được phân lập từ trầm tích thu thập ở Biển Cortez, Baja California, Mexico Vi c nuôi cấy xạ khuẩn. .. chọn lọc đối với các dòng tế bào u ác tính trong 8 tế bào NCI 60 bảng điều khiển dòng và cũng hiển thị hoạt tính kháng khuẩn mạnh mẽ hướng tới một vài mầm bệnh vi khuẩn kháng thu c [23] Tương tự như vậy, một nghiên cứu của một chủng Marinispora thu thập từ trầm tích ngoài khơi bờ biển La Jolla, California sinh marinisporolides Đây là ví dụ duy nhất được phân lập từ thiên nhiên Giống như các marinomycins,... đi nuôi ấm ở 37⁰C Đọc kết quả sau 24 giờ ở 37⁰C Hoạt tính kháng sinh ( HTKS) được xác định theo kích thước vòng kháng khuẩn của xạ khuẩn Hoạt tính kháng sinh của mỗi chủng xạ khuẩn được xác định theo kích thước vòng vô khuẩn: D - d (mm), trong đó D là đường kính vòng vô khuẩn, d là đường kính của lỗ thạch 3.2.4 Xác định khả năng sinh enzyme của các chủng nghiên cứu [15] • Khả năng thủy phân tinh bột... xạ ngược có thể dùng để ghi nhận ảnh nhiễu xạ điện tử tán xạ ngược, giúp cho vi c phân tích cấu trúc tinh thể (chế độ phân cực điện tử) Ngoài ra, điện tử tán xạ ngược phụ thu c vào các liên kết điện tại bề mặt mẫu nên có thể đem lại thông tin về các đômen sắt điện 26 3.2.6: Phương phân loại xạ khuẩn bằng kỹ thu t sinh học phân tử 3.2.6.1 Phương pháp tách chiết AND tổng số từ xạ khuẩn biển Nuôi xạ khuẩn