VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY CÓ MÚI ĐẶC SẢN TẠI TỈNH HÒA BÌNH Giáo viên hƣớng dẫn : Ts Nguyễn Văn Hiếu Sinh viên thực : Nguyễn Thị Thu Hà Ngành : Công Nghệ Sinh Học HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Hiếu – Phòng Vi sinh vật Đất, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, người hướng dẫn, định hướng nghiên cứu tận tình giúp đỡ em suốt trình học tập nghiên cứu hoàn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn tới TS Phan Thị Hồng Thảo - Trưởng phòng Vi sinh vật Đất, Viện công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi sở, vật chất, thiết bị tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời gian thực tập Nhân dịp này, em xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại học Mở Hà Nội, người trực tiếp giảng dạy, truyền đạt cho em kiến thức bổ ích suốt trình học tập nghiên cứu Em xin cám ơn hỗ trợ kính phí thực từ đề tài “Nghiên cứu đa dạng xạ khuẩn nội sinh có múi đặc sản miền Bắc Việt Nam tiềm sinh tổng hợp chất kháng khuẩn kích thích tăng trưởng thực vật chúng” Mã số đề tài: VAST.ĐLT.12/15-16 thuộc cấp quản lý Viện Hàn lâm KHCNVN điều kiện làm việc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, người động viên giúp đỡ tạo điều kiện giúp em hoàn thành khóa luận Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Sinh Viên DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Tên đủ Chữ viết tắt DNA Deoxyribosenucleoic Acid RNA Ribonucleic acid rDNA Ribosomal Deoxyribosenucleoic Acid rRNA Ribosomal Ribonucleic acid KTCC Khuẩn ty chất KTKK Khuẩn ty khí sinh ISP Internationl Streptomyces Project IAA Indol acetic acid VSV Vi sinh vật HTKS Hoạt tính kháng sinh 10 CFU Đơn vị hình thành khuẩn lạc 11 PCR Polymerase Chain Reaction: Phản ứng khuếch đại gen DANH MỤC CÁC BẢNG STT Bảng 2.1 Bảng 2.2 Trang Vị trí tọa độ mẫu thu thập Danh mục thiết bị sử dụng 25 26 Bảng 2.3 Kết giá trị mật độ quang (OD 530nm) nồng độ IAA khác 32 Bảng 2.4 Trình tự đoạn mồi sử dụng phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rDNA xạ khuẩn 34 Bảng 2.5 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 34 Bảng 3.1 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Bảng 3.4 Bảng 3.5 Bảng 3.6 Bảng 3.7 Bảng 3.8 Bảng 3.9 Bảng 3.10 Bảng 3.11 Bảng 3.12 Số lượng số nhóm VSV mẫu cam thu nhận vùng đất Cao Phong, Hòa Bình Lượng phân bố chủng xạ khuẩn phân lập theo nhóm màu Khả kháng vi sinh vật kiểm định 21 chủng xạ khuẩn Số lượng tỷ lệ chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh với vi sinh vật kiểm định Hoạt tính kháng sinh xạ khuẩn phân bố theo nhóm màu Kết kiểm tra hoạt tính kháng sinh chủng xạ khuẩn lựa chọn nuôi cấy môi trường dịch thể ISP sau ngày Khả sinh IAA chủng xạ khuẩn tuyển chọn môi trường ISP2 Đặc điểm nuôi cấy chủng xạ khuẩn Đặc điểm cáu tạo bào tử chủng xạ khuẩn sau ngày nuôi môi trường thạch đĩa ISP nhiệt độ 28C Khả đồng hóa nguồn cacbon chủng xạ khuẩn tuyển chọn sau 14 ngày nuôi nhiệt độ 28C Ảnh hưởng nồng độ muối môi trường ban đầu đến khả sinh trưởng phát triển chủng xạ khuẩn tuyển chọn Ảnh hưởng pH môi trường ban đầu đến khả sinh trưởng phát triển chủng xạ khuẩn tuyển chọn 37 38 41 42 43 44 46 48 51 52 54 55 Bảng 3.13 Bảng 3.14 Bảng 3.15 Ảnh hưởng nhiệt độ ban đầu đến khả sinh trưởng phát triển chủng xạ khuẩn tuyển chọn Khả sinh tổng hợp enzyme ngoại bào chủng xạ khuẩn sau ngày nuôi cấy Kết so sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA chủng HBC4-2với gen tương ứng chủng xạ khuẩn 55 57 59 đăng ký GenBank Bảng 3.16 So sánh đặc điểm phân loại chủng xạ khuẩn 60 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Trang Hình 2.1 Đồ thị phương trình đường chuẩn 33 Hình 3.1 Kết phân lập chủng xạ khuẩn nội cộng sinh mẩu 36 rễ, cành cam Cao Phong- Hòa Bình… Hình 3.2 Tỷ lệ chủng xạ khuẩn phân bố theo nhóm màu 39 Hình 3.3 Các chủng xạ khuẩn phân lập 39 Hình 3.4 Hoạt tính kháng sinh chủng xạ khuẩn tuyển trọn 40 Hình 3.5 Tỷ lệ chủng xạ khuẩn có HTKS phân theo nhóm màu 43 Hình 3.6 Hoạt tính kháng sinh dịch lên men chủng xạ khuẩn 45 Hình 3.7 Đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn HBL2-1 nuôi 50 môi trường khác sau ngày nuôi nhiệt độ 28C Hình 3.8 Đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn HBC2-4 nuôi 50 môi trường khác sau ngày nuôi nhiệt độ 28oC Hình 3.9 Cuống sinh bào tử bào tử chủng HBR10-2 51 Hình 3.10 Cuống sinh bào tử bào tử chủng HBC4-2 51 Hình 3.11 Cuống sinh bào tử bào tử chủng HBL2-1 52 Hình 3.12 Khả đồng hóa nguồn cacbon chủng xạ khuẩn 53 Hình 3.13 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến khả phát triển 56 chủng xạ khuẩn nuôi môi trường lỏng Hình 3.14 Khả sinh enzym phân giải chất chủng xạ 57 khuẩn tuyển chọn môi ISP2 Hình 3.15 Điện di đồ DNA tổng số chủng xạ khuẩn HBC4-2 58 gel agarose 1,0 % Hình 3.16 Điện di đồ sản phẩm PCR với cặp mồi sử dụng 27F 58 1492R gel agarose 1,0 % Hình 3.17 Trình tự gen 16S rRNA chủng xạ khuẩn HBC4-2 59 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH PHẦN I TỔNG QUAN……………………………………………………………2 1.1.Giới thiệu có múi .2 1.1.1 Đặc điểm chung 1.1.2 Một số bệnh có múi 1.1.3 Giá trị kinh tế có múi 1.2.Xạ khuẩn 1.2.1 Xạ khuẩn nội cộng sinh thực vật .6 1.2.2 Các phương pháp phân lập xạ khuẩn nội cộng sinh .8 1.2.3 Đặc điểm sinh học xạ khuẩn nội cộng sinh 1.2.4 Sự sinh tổng hợp kháng sinh xạ khuẩn cộng sinh .12 1.2.5 Phân loại xạ khuẩn nội cộng sinh 13 1.2.6 Sự đa dạng xạ khuẩn nội cộng sinh số có múi 14 1.2.7 Vai trò xạ khuẩn có múi đời sống người 15 1.2.7.1 Cơ chế cộng sinh xạ khuẩn có múi 15 1.2.7.2 Vai trò xạ khuẩn với có múi .16 1.2.7.3.Vai trò xạ khuẩn người 18 1.2.7.4 Vai trò xạ khuẩn hệ sinh thái 19 1.3.Tuyển chọn chủng xạ khuẩn nội cộng sinh có múi có hoạt tính kháng sinh .20 1.3.1 Phân lập chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh từ có múi .20 1.3.2 Phân loại định tên xạ khuẩn .20 1.3.2.1 Phương pháp phân loại truyền thống .20 1.3.2.2 Phương pháp phân loại sinh học phân tử 21 1.3.2.3 Phân loại số (Numerical taconomy) 21 1.3.3 Phân loại xạ khuẩn phương pháp truyền thống 22 1.3.3.1 Đặc điểm hình thái tính chất nuôi cấy 22 1.3.3.2 Đặc điểm sinh lí - sinh hóa 23 PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 25 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị 25 2.1.1 Vật liệu .25 2.1.2 Hóa chất 26 2.1.3 Thiết bị .26 2.1.4 Môi trường 27 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .28 2.2.1 Phân lập xạ khuẩn từ cành, lá, rễ có múi 28 2.2.2 Phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc mọc đĩa thạch .28 2.2.3 Phương pháp khiết bảo quản giống 29 2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh 29 2.2.5 Phương pháp lên men xạ khuẩn .30 2.2.6 Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân loại xạ khuẩn .31 2.2.7 Dựng đường chuẩn dựa mối tương quan mật độ quang (OD 530nm) nồng độ IAA .32 2.3 Phân loại xạ khuẩn giải trình tự gen 16S rDNA 33 2.3.1 Tách DNA tổng số xạ khuẩn .33 2.3.2 Khuếch đại gen 16S rDNA .33 PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Phân lập chủng xạ khuẩn từ mẫu cam thu thập vùng Cao Phong -Hòa Bình 36 3.1.1 Phân lâp xạ khuẩn 36 3.1.2 Phân bố xạ khuẩn phân lập theo nhóm màu 38 3.2 Tuyển chọn chủng xạ khuẩn có hoạt tính sinh học .40 3.2.1.Khả sinh kháng sinh chủng xạ khuẩn phân lập 40 3.2.2 Tuyển chọn chủng có hoạt tính kháng sinh cao môi trường lỏng .44 3.2.3 Tuyển chọn chủng xạ khuẩn có hoạt tính sinh IAA 45 3.3 Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn tuyển chọn 47 3.3.1 Đặc điểm nuôi cấy 47 3.3.2 Đặc điểm bào tử 50 3.3.3 Khả sử dụng nguồn cacbon .52 3.3.4 Ảnh hưởng nồng độ muối, pH, nhiệt độ tới khả phát triển xạ khuẩn 54 3.3.5 Hoạt tính enzyme 56 3.4 Kết phân loại xạ khuẩn 58 3.4 Phân tích trình tự gen 16S rDNA 58 3.4.2 Phân loại dựa đặc điểm sinh lý sinh hóa 60 KẾT LUẬN .61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 MỞ ĐẦU Việt Nam nước nông nghiệp nằm vùng nhiệt đới nóng ẩm, điều kiện thuận lợi cho nhiều loại vi sinh vật phát triển từ nhóm vi sinh vật gây bệnh động vật thực vật, đến nhóm vi sinh vật hữu ích có khả ức chế nhóm vi sinh vật ăn quả, rau màu để bảo vệ khỏi công gây hại ví sinh vật việc sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật từ lâu trở nên phổ biến Việt Nam Song việc sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật thường độc hại, sử dụng với liều lượng lớn liên tục tạo nhữngdư đất, nước nông sản ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe người, gây ô nhiễm môi trường cân sinh thái Để giải vấn đề hướng nghiên cứu hàng đầu sử dụng tác nhân sinh học nhóm vi sinh vật hữu ích để hạn chế quần thể vi sinh vật gây bệnh Xạ khuẩn cộng sinh nhóm vi sinh vật có ích có phân lập từ bên phận Xạ khuẩn cộng sinh có nhiều ích lợi, giúp thúc đẩy phát triển trồng lớn cách sinh chất kích thích sinh trưởng, cố định nitơ không khí nguồn tiềm việc sản xuất hợp chất thiên nhiên dùng y học, nông nghiệp công nghiệp Hòa Bình tỉnh giàu tiềm nông nghiệp Trong loại có múi cam, chanh, bưởi… loại phát triển đem lại thu nhập cao giúp ổn định đời sống vật chất tinh thần nhân dân Hòa Bình Do đời sống ngày nâng lên, việc sử dụng sản phẩm hưu trở thành nhu cầu cấp thiết, đòi hỏi sản phẩm phục vụ cho sản xuất nông nghiệp cần thực an toàn hạn chế chất độc hại Việc tìm kiếm chủng xạ khuẩn có khả sinh hợp chất sinh học chống bệnh thực vật có tầm quan trọng đặc biệt góp phần vào công tác bảo vệ có múi xây dựng nông nghiệp hữu Xuất phát từ lí trên, để khai thác nguồn vi sinh vật vô phong phú Việt Nam nói chung tỉnh Hòa Bình nói riêng, thực nghiên cứu đề tài: “ Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn chủng xạ khuẩn nội sinh có múi đặc sản Hòa Bình” Bảng 3.9 Đặc điểm cáu tạo bào tử chủng xạ khuẩn sau ngày nuôi môi trường thạch đĩa ISP nhiệt độ 28C Ký hiệu Đặc điểm bề Hình dạng Hình dạng Số lƣợng bào tử chủng XK mặt bào tử chuỗi bào tử bào tử chuỗi Trơn nhẵn Chuỗi bào tử (Sm) xoắn (S) Hình trụ 10 - 50 Trơn nhẵn Chuỗi bào tử (Sm) xoắn (S) Hình trụ 10 – 50 Trơn nhẵn Chuỗi bào tử (Sm) xoắn (S) Hình cầu 10 - 50 HBR10-2 HBC4-2 HBL2-1 (a) (b) Hình 3.9 Cuống sinh bào tử (a) Bào tử (b) chủng HBR10-2 (a) (b) Hình 3.10 Cuống sinh bào tử (a) bào tử (b) chủng HBC4-2 51 (a) (b) Hình 3.11 Cuống sinh bào tử (a) bào tử (b) chủng HBL2-1 3.3.3 Khả sử dụng nguồn cacbon Việc nghiên cứu khả dùng nguồn cacbon, nito nhằm đánh giá đặc điểm phân loại chủng xạ khuẩn, bên cạnh giúp định hướng tìm nguồn dinh dưỡng thích hợp cho trình lên men Khả đánh giá thông qua phát triển môi trường ISP9, ngồn cacbon thay loại đường quy định khóa phân loại Kết nghiên cứu khả sử dụng nguồn cacbon chủng xạ khuẩn tuyển chọn trình bày bảng 3.10 Bảng 3.10 Khả đồng hóa nguồn cacbon chủng xạ khuẩn tuyển chọn sau 14 ngày nuôi nhiệt độ 28C Nguồn cacbon (1,0 %, w/v) Khả đồng hóa nguồn cacbon chủng xạ khuẩn HBR1-6 HBL2-1 HBC2-1 HBC3-2 HBC4-2 HBR9-5 HBR10-2 D-Glucose ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ L-Arabinose ++ + ++ ++ - ++ ++ D-Sucrose D- Xylose  ++ + ++ + ++ + ++  ++  ++ + + D-Manitolse + + ++ + + + + D- Fructose ++ ++ ++ ++ + ++ ++ D-Cellulose  + ++ ++ + ++ + D-Rafinose  + ++ ++  +  D-Rhamnose        Đối chứng        Ghi chú: ++: sinh trưởng tốt; +: sinh trưởng trung bình; “+”: sinh trưởng yếu;  : không sinh trưởng 52 (1) (4) (2) (3) (5) (6) Hình 3.12 Khả đồng hóa nguồn cacbon chủng xạ khuẩn (1) HBL2-1, (2) HBC2-1, (3) HBR9-5, (4) HBR1-6, (5) HBC4-2, (6) HBC3-2 sau ngày nuôi cấy nhiệt độ 28C Kết bảng 3.8 hình 3.11 cho thấy chủng HBC2-1; HBC3-2 phát triển hầu hết nguồn đường, phát triển tốt nguồn glucoza, Arabinoza, Xylose, Fructose, Cellulose, Rafinose Chủng HBL2-1, HBC4-2 HBR9-5 phát triển tốt nguồn glucoza, Xylose, Fructose Chủng HBR10-2 phát triển tốt nguồn glucoza, Arabinoz, Fructose Việc nghiên cứu khả đồng hóa nguồn đường tiêu quan trọng để tiến hành phân loại xạ khuẩn theo khóa phân loại Nomomura ISP Kết cho thấy chủng sử dụng tất nguồn đường kiểm tra, khuẩn ty phát triển tốt (bằng mạnh ống đối chứng dương) Ngoài ra, việc nghiên cứu khả sử dụng nguồn đường khác nhằm giúp lựa chọn định hướng cho việc tìm nguồn cacbon thích hợp để tạo môi trường lên men thích hợp 53 3.3.4 Ảnh hƣởng nồng độ muối, pH, nhiệt độ tới khả phát triển xạ khuẩn Hoạt động trao đổi chất vi sinh vật coi kết phản ứng hóa học, mà phản ứng phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt độ, pH khả chịu muối tế bào Đối với thể đơn bào xạ khuẩn hay vi khuẩn, nhiệt độ có tác động trực tiếp đến hoạt động sinh lý tế bào.Mặt khác khả chịu nồng độ, pH khoảng nhiệt độ phát triển đặc điểm sinh lí - sinh hóa quan trọng chủng vi sinh vật, cho biết tính thích nghi cao môi trường sống Sinh trưởng chủng xạ khuẩn tuyển chọn môi trường Bennett điều kiện thí nghiệm thay đổi nồng độ muối, pH nhiệt độ thể bảng 3.11, bảng 3.12 bảng 3.13 Bảng 3.11 Ảnh hưởng nồng độ muối môi trường ban đầu đến khả sinh trưởng phát triển chủng xạ khuẩn tuyển chọn Kí hiệu Khả sinh trƣờng chủng môi trƣờng chủng xạ có thay đổi nồng độ muối (%) khuẩn HBR1-6 +++ +++ +++ ++ - - HBL2-1 +++ +++ +++ ++ - - HBC2-1 +++ +++ +++ ++ + - HBC3-2 +++ +++ +++ ++ - - HBC4-2 +++ +++ +++ ++ - - HBR9-5 +++ +++ +++ ++ - - HBR10-2 +++ +++ +++ ++ + - Nhận thấy chủng HBC2-1, HBR10-2 phát triển tốt nồng độ muối từ 0-5(%), chủng lại HBR1-6, HBL2-1, HBC3-2, HBC4-2, HBR9-5 phát triển tốt nồng độ muối 0-3 (%) 54 Bảng 3.12 Ảnh hưởng pH môi trường ban đầu đến khả sinh trưởng phát triển chủng xạ khuẩn tuyển chọn Kí hiệu chủng xạ khuẩn HBR1-6 HBL2-1 HBC2-1 HBC3-2 HBC4-2 HBR9-5 HBR10-2 Khả sinh trƣờng chủng môi trƣờng có thay đổi pH 10 + ++ +++ +++ + + ++ +++ +++ + + ++ +++ +++ + + + ++ +++ +++ + + ++ +++ +++ + + + ++ +++ +++ + + ++ +++ +++ ++ + Nhận thấy chủng HBC3-2 phát triển tốt pH từ 4÷9, Các chủng HBR1-6, HBL2-1, HBC2-1, HBR9-5 phát triển tốt pH từ 5÷9, có chủng HBC4-2 HBR10-2 phát triển tốt pH 5÷10 Bảng 3.13 Ảnh hưởng nhiệt độ ban đầu đến khả sinh trưởng phát triển chủng xạ khuẩn tuyển chọn Kí hiệu Khả sinh trƣờng chủng môi trƣờng có thay chủng xạ đổi nhiệt độ (oC) 20 25 30 37 40 45 HBR1-6 ++ +++ +++ ++ + - HBL2-1 ++ +++ +++ ++ + - HBC2-1 ++ +++ +++ ++ + - HBC3-2 ++ +++ +++ ++ + - HBC4-2 ++ +++ +++ ++ + - HBR9-5 ++ +++ +++ ++ + - HBR10-2 + +++ +++ ++ - - khuẩn Ghi chú: “-” Không sinh trưởng, “+” sinh trưởng bình thường: “++ sinh trưởng tốt”, “+++” sinh trưởng tốt 55 Nhận thấy chủng xạ khuẩn sinh trưởng tốt khoảng nhiệt độ từ 20-40oC, riêng chủng HBR10-2 sinh trưởng khoảng nhiệt độ từ 20-37oC (A) (B) (C) Hình 3.13 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến khả phát triển chủng xạ khuẩn nuôi môi trường GauseII điều kiện lắc 200 vòng/phút Trong đó: (A): Nuôi nhiệt độ 30oC; (B) pH7 (C) nồng độ muối % Các chủng xạ khuẩn nghiên cứu sinh trưởng tốt 25 – 37oC Có thể kết luận chủng thuộc nhóm ưa ấm (mesophilic) Chủng xạ khuẩn phát triển môi trường có dải pH rộng từ pH 4-9, phát triển tốt pH 7-8 Điều phù hợp với nghiên cứu trước cho xạ khuẩn thuộc nhóm vi sinh vật phát triển tốt môi trường trung tính kiềm Các chủng xạ khuẩn nghiên cứu sinh trưởng tốt nồng độ muối – %, có chủng HBC2-1, HBR10-2 chịu muối đến % 3.3.5 Hoạt tính enzyme Khả sinh enzyme ngoại bào dặc điểm cho biết thích nghi xạ khuẩn môi trường sống Do kiểm tra khả sinh mộ số nhóm enzyme như: carboxyl methyl cellulose (CMC); amylase; protease; chitosanase; catalase chủng xạ khuản tuyển chọn, thể bảng 3.14 56 Bảng 3.14 Khả sinh tổng hợp enzyme ngoại bào chủng xạ khuẩn sau ngày nuôi cấy Cơ chất Đƣờng kính vòng phân giải (D-d mm) đặc hiệu HBR1- HBL2-1 HBC2-1 HBC3-2 HBC4-2 HBR9-5 HBR10-2 Tinh bột + + + + + + + Casein + + + + + + + CMC + + + + + + + Chitin + + + + + + + Hình 3.14 Khả sinh enzym phân giải chất chủng xạ khuẩn tuyển chọn môi ISP2 chủng xạ khuẩn sau thời gian nuôi ngày nhiệt độ 28C Trong hệ sinh thái, vi sinh vật cần nitơ, cacbon trình sống để xây dựng tế bào có số chủng có khả tự cố định nitơ Vì tất môi trường nuôi cấy cần thiết phải có loại hợp chất chứa nitơ, cacbon dạng chuyển hóa, để xạ khuẩn đồng hoá nguồn chất hữu thường chủng xạ khuẩn cần có hệ enzym giúp chúng chuyển hóa phân tử khó tan, cao phân tử thành hợp chất dễ tan, axit amin, đường để sử dụng Nếu chủng dùng lên men quy mô công nghiệp với nguồn 57 chất cao ngô, bột đậu tương, bột lạc, bột ngô loại khô dầu, với hệ enzym protease, amylase xenlulase giúp chúng thích nghi nhanh Nhìn chung chủng xạ khuẩn tuyển chọn có hoạt tính với bố hệ enzyme nói 3.4 Kết phân loại xạ khuẩn 3.4 Phân tích trình tự gen 16S rDNA Trong số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh, chủng HBC4-2 có nhiều đặc điểm nội trội, đồng thời thời gian thực tạp có hạn chế, tiến hành phân loại chủng, kết bước tiến hành phân loại thể mục 3.4.1 Kết kiểm tra DNA tổng số chủng xạ khuẩn gel agarose 1,0 % thể hình 3.14 Hình 3.15 Điện di đồ Hình 3.16 Điện di đồ sản phẩm PCR với cặp mồi sử DNA tổng số chủng xạ dụng 27F 1492R gel agarose 1,0% (Trong khuẩn HBC4-2 gel Lane sản phẩm PCR M: Macker Hyper agarose 1,0 % ladder 1kb (Cat No Bio-33053) Kết hình 3.14 cho thấy, trình tách DNA tổng số cho kết tốt, sản phẩm DNA sử dụng để khuếch đại trình tự gen 16S rDNA Thực kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu 27F 1492R với DNA tổng số thu để khuếch đại gen 16S rDNA chủng HBL2-1và HBC4-2, kết thu thể hình 3.15 58 Kết thu thể hình 3.15 cho thấy, sản phẩm DNA thu sau trình PCR cho băng DNA rõ nét có kích thước khoảng 1400 bp, sản phẩm thu nhận sau kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi thí nghiệm đặc hiệu Sản phẩm sau trình PCR giải trình tự máy đọc trình tự gen tự động (ABI Prism 100 Sequencer) Viện Công nghệ sinh học, kết thể hình 3.16 bảng 3.15 Hình 3.17 Trình từ gen 16S rRNA chủng xạ khuẩn HBC4-2 Bảng 3.15 Kết so sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA chủng HBC4-2với gen tương ứng chủng xạ khuẩn đăng ký GenBank Trình tự gen 16S rDNA chủng vi khuẩn Mã số truy cập Độ tƣơng đƣợc so sánh GenBank đồng (%) Streptomyces costaricanus MJM5482 FJ799179 99 Streptomyces costaricanus WZ162 FJ812352 99 Streptomyces sp MJM3787 FJ799173 99 Streptomyces sp MJM3859 EU603347 99 Streptomyces sp HW 32 KF194346 99 Streptomyces sp GS15 JX679244 99 Kết giải trình tự nucleotide gen 16S rRNA chủng xạ khuẩn HBC4-2 trình bày hình 3.16 Khi so sánh trình tự gen với trình tự 59 tương ứng ngân hàng liệu sở GenBank công cụ BLAST NCBI cho thấy: Gen 16S rRNA chủng xạ khuẩn HBC4-2 có độ tương đồng cao (99 %) so với gen tương ứng loài xạ khuẩn Streptomyces costaricanus MJM5482 3.4.2 Phân loại dựa đặc điểm sinh lý sinh hóa Đối chiếu đặc điểm phân loại chủng nghiên cứu theo khoá định tên loài xạ khuẩn Nomomura 1976, so sánh với đặc điểm phân loại theo khoá phân loại Gause 1983 Bergey 1989, bước đầu nhận thấy chủng xạ khuẩn nghiên cứu thuộc chi Streptomyces Riêng chủng HBC4-2 có nhiều đặc điểm phân loại tường đồng với loài gần là: - Chủng HBC4-2 có đặc điểm giống loài Streptomyces costaricanus Bảng 3.16 So sánh đặc điểm phân loại chủng xạ khuẩn Các đặc điểm Cuống sinh bào tử Bề mặt bào tử Số bào tử/chuỗi Màu khuẩn ti khí sinh Màu khuẩn ti chất Sắc tố tan Sắc tố Melanin Sử dụng nguồn đường Glucoza Fructoza L-arabinoza D-mannitol Saccaroza Xyloza Rhamnoza Raffinoza HBC4-2 Xoắn Trơn 10-50 Xám-Vàng ISP2, ISP3, ISP4 ISP5 Vàng nâu ISP2, ISP3, ISP4 ISP5 Vàng ISP2 ISP5 - Streptomyces costaricanus Xoắn Trơn 10-50 Xám-Vàng ISP2, ISP3, ISP4 ISP5 Vàng nâu ISP2, ISP3, ISP4 ISP5 Vàng ISP2 ISP5 - + + + + - + + + + - 60 KẾT LUẬN Từ 12 mẫu rễ, cành cam thu thập Cao Phong- Hòa Bình, phân lập 30 chủng xạ khuẩn, nhóm xám chiếm 30,0%, tiếp nhóm đỏ chiếm 26,7%, nhóm vàng chiếm 20,0%, nhóm trắng chiếm 16,7% nhóm cam chiếm 6,6% Trong số 30 chủng phân lập có: Số chủng xạ khuẩn có khả ức chế Bacillus subtilis chiếm tỷ lệ cao (có 16 chủng - chiếm 76,2%), (có chủng có khả ức chế Staphylococcus aureus – chiếm 42,8 %) thấp (chỉ có chủng có khả ức chế Fusarium xylarioides – chiếm 14,3%) Tổng số có 21 30 chủng xạ khuẩn phân lập chủng có hoạt tính kháng sinh, chiếm tỷ lệ 70 % Đã lựa chọn chủng có hoạt tính kháng khuẩn cao, chủng có kí hiệu HBR1-6, HBL2-1, HBC2-1, HBC3-2, HBC4-2, HBR9-5, HBR10-2 để nghiên cứu đặc điểm sinh học phân loại cho kết tất chủng thuộc chi Streptomyces Riêng chủng HBC4-2 so sánh kết hợp giữa: Kỹ thuật phân tử sử dụng trình từ 16S rRNA mức độ tương đồng lên 99% phân loại truyền thống cho kết tương tự với độ tương đồng gần với loài Streptomyces costaricanus 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Ngô Đình Quang Bính (2005), Vi sinh vật học công nghiệp, NXB Trung tâm Khoa học tự nhiên Công nghệ quốc gia, Hà Nội, Tr 53 – 71 Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men chất kháng sinh, NXB Khoa học Kĩ thuật Hà Nội Nguyễn Văn Cách, Lê Văn Nhương (2009), Cơ sở công nghệ sinh học- Công nghệ vi sinh, NXB Giáo dục, T4 Vi Thị Đoan Chính (2000), Nghiên cứu khả nâng cao hoạt tính kháng sinh chủng Streptomyces rimosus R77 Streptomyces hygroscopicus 5820 kỹ thuật dung hợp tế bào trần, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ sinh học Nguyễn Lân Dũng (dịch) (1976), Thực tập vi sinh vật học, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, Tr 73 - 81 Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, T3 Nguyễn Lân Dũng, Đào Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, NXB Khoa học Kĩ thuật, Hà Nội, T1 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2002), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, Hà Nội Nguyễn Thành Đạt (2007), Cơ sở sinh học vi sinh vật, NXB Đại học sư Phạm Hà Nội 10 Nguyễn Thành Đạt (2000), Sinh học vi sinh vật, NXB Giáo dục Hà Nội 11 Bùi Thị Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Hà Nội 12 Đỗ Thu Hà (2004), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Quảng Nam - Đà Nẵng, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Hà Nội 62 13 Lê Mai Hương (1993), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh phân lập Hà Nội vùng lân cận, Luận án Phó tiến sĩ Sinh học, Hà Nội 14 Lê Gia Hy (2010), Cơ sở công nghệ vi sinh vật ứng dụng, NXB Giáo dục Việt Nam 15 Lê Gia Hy (1994), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn thối cổ rễ phân lập Việt Nam, Luận án Phó tiến sĩ khoa học Sinh học, Hà Nội 16 Nguyễn Khang (20050, Kháng sinh học ứng dụng, NXB Y học, Hà Nội, Tr 21 Tiếng Anh 17 Akhter MS, Islam MS, Lee MW (2009), Identification of the Fungal Pathogen that Causes Strawberry Anthracnose in Bangladesh and Evaluation of In Vitro Fungicide Activity, Mycobiology 37(2):77-81 18 Bacon CW, White JF (2000), Microbial endophytes Marcel Dekker, New York: 237-261 19 Cao LX, Qiu ZQ, You JL, Tan HM, Zhou S (2005), Isolation and characterization of endophytic Streptomycete antagonists of Fusarium with phathogen from surface-sterilized banana roots FEMS Microbiol Lett 247: 147152 20 Gangwar M, Dogra S, UP Gupta, RN Kharwar (2014), Diversity and Biopotential of endophytic actinomycetes from three medicinal plants in India, African J Microbiol Research 8(2): 184-191 21 Gangwar M, S Dogra, N Sharam (2011), Antagonistic Bioactivity of Endophytic Actinomycetes Isolated from Medicinal Plans, J Advanced Lab Research in Biology 2(4): 154-157 22 Geschva, A Shurk, W Romer (1979), Phosphate inhibition of secondary metabolism in Streptomyces hygroscopicus and its reversal by cyclic AMP, Arch Microbiol 121: 91 - 96 63 23 Hong YZ, Quan HX, Ming T, Guang HS (2013), Effect of actinomycetes on ginseng growth and production of ginsenosides, J Food Agr Environ 11(1): 557-559 24 Hopwood DA, MJ Merrick (1997), Genetics of antibiotic production, J Bacteriol: 596-636 25 Iso N, Henrietta O (2010), Assessment of antibiotic production by some marine Streptomyces isolated from the Nahoon beach, Department Biochemis Hare, Alice, South Africa 26 Kumar, A Singh, TS Kumar (2011), Isolation and screening of endophytic actinomycetes from different parts of Emblica officinalis, Annals Biological Research 2(4) : 423-434 27 Ramasamy V, Chinnasamy M, Nooruddin T, Nnamalai P, Rengasamy S (2007), Studies on the diversity of actinomycetes in the Palk Strait region of Bay of Bengal, India, Actinomycetologica 21: 59 - 65 28 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, 2nded, Cold Spring Habor laboratory Cold Spring Habor laboratory Press, New York 29 Shirling EB, D Gottlieb (1966), Methods for characterization of Streptomyces species, Int J Sys Bacteriol, 16: 313-340 30 Smith GE (1957), Inhibition of Fusarium oxysporum f sp Lycopersici by a species of Micromonospora isolated from tomato Phytopathology 47:429-432 31 Strobel G, Daisy B, Castillo U, Harper J (2004), Natural products from endophytic microgranisms, J Nat Prod 67 : 257-268 32 Trerner HD, Buckus EJ (1963), System of color wheels for Streptomycete taxonomy, Appl Microbiol 11: 335 - 338 33 Waksman SA (1961) The Actinomycetes Classification, identification and descriptions of genera and species, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, USA 34 William ST, Davies FL (1965), Use of antibiotics for selective isolation and enumeration of actinomycetes in soil, J Gen Microbiol 38: 251 - 261 64 35 Zhang JF, Liu JJ, Lu MQ, Cai C, Yang Y, Li H, Xu C, Chen GH, (2007) Rapamycin in hibits cell growth by induction of apoptosis on hepatocellular carcinoma cells in vitro, Transpl Immunol 17 (3): 162 - 170 36 http://www.News.Bacsi.com/y dược 37 http://www.cuctrongtrot.gov.vn/ 38 http://xttm.mard.gov.vn/ 39 http://www.hoabinh.gov.vn/ 40 http://hoithaoktxh.hagiang.gov.vn 41 http://www.nhandan.com.vn 65 [...]... các hạt đất với nhau tạo nên cấu trúc đất Ngoài ra, các enzym thủy phân này còn giúp phân hủy phế thải chứa các nguồn tinh bột, xenluloza, protein, góp phần xử lý và tái chế rác, khép kín vòng tuần hoàn vật chất tự nhiên 1.3 .Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây có múi có hoạt tính kháng sinh 1.3.1 Phân lập các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh từ cây có múi Xạ khuẩn cộng sinh là xạ. .. có nguồn gốc từ thực vât nhờ quá trình nuôi cấy VSV Ví dụ như chất kháng ung thư paclitaxel phổ biến trên cây thông đỏđược tách chiết từ xạ khuẩn Kitasatopora sp và một số nấm cộng sinh khác Một số nghiên cứ gần đây cho thấy, tỷ lệ phát hiện ra các kháng sinh mới trên xạ khuẩn nội cộng sinh có tỷ lệ khá cao so với xạ khuẩn phân lập từ đất mới trên xạ khuẩn nội cộng sinh có tỷ lệ khá cao so với xạ khuẩn. .. thực vật Chúng có khả năng cố định đạm không khí, giúp cây trồng sinh trưởng và phát triển tốt trên các vùng đất nghèo chất dinh dưỡng như các vùng đất cát ven biển nước ta Một số dạng cộng sinh giữa xạ khuẩn và cây có múi: - Nội cộng sinh: Là dạng xạ khuẩn sống cộng sinh bên trong các bộ phận của cây như rễ, thân, cành, lá - Ngoại cộng sinh: Xạ khuẩn phát triển trên bề mặt các bộ phận của cây 1.2.7.2... phong phú của xạ khuẩn nội cộng sinh và các hợp chất có hoạt tính sinh học Xạ khuẩn nội cộng sinh đã và đang được các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu về tiềm năng ứng dụng trong lính vực y học, nông nghiệp và công nghiệp [31] Hiện nay, xạ khuẩn nội cộng sinh được phân lập từ nhiều loài cây trồng như lúa mì, gạo, khoai tây, cà rốt, cà chua, cây gỗ, nho, rêu và dương xỉ… Cũng như xạ khuẩn phân lập từ... chưa có một nghiên cứu nào được chính thức công khai về số lượng xạ khuẩn ở các loại cây như cam, chanh, bưởi… 1.2.7 Vai trò của xạ khuẩn đối với cây có múi và trong đời sống con ngƣời 1.2.7.1 Cơ chế cộng sinh giữa xạ khuẩn và cây có múi Quan hệ cộng sinh là quan hệ hợp tác chặt chẽ giữa hai hay nhiều loài trong đó tất cả các loài đều có lợi Trong cộng sinh, mỗi loài chỉ có thể sống, phát triển, sinh sản ... Nhóm xạ khuẩn có các bào tử nang Đặc trưng là khuẩn ty phân chia theo các hướng vuông góc với nhau, tạo ra các cấu trúc tương tự nang bào tử - Nhóm xạ khuẩn dạng Nocardia sinh sản bằng cách phân đốt khuẩn ty Hầu hết các chi xạ khuẩn được mô tả hiện nay được phân chia tuỳ theo sự khác nhau về đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy: như màu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất, sắc tố hoà tan; sự có. .. số (dựa trên sự đánh giá về số lượng mức độ giống nhau giữa các vi sinh 13 vật theo một độ lớn các đặc điểm, chủ yếu là các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa Để so sánh các chủng với nhau từng đôi một) 1.2.6 Sự đa dạng xạ khuẩn nội cộng sinh trên một số cây có múi Xạ khuẩn sống trong các cơ quan khác nhau (rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt) của cây chủ và chủ yếu cứ trú trong khoảng không giữa các mô... tỷ lệ xạ khuẩn nội cộng sinh thuộc chi Streptomyces chiếm hơn 50%, tiếp theo là các chi Microbispora, Micromonospora, Nocardioide, Nocardia và Streptosporangium Các nghiên cứu về đa dạng xạ khuẩn nội cộng sinh được phân bố bởi các nhóm nghiên cứu khác nhau từ Trung Quốc, Thái Lan, Ấn Độ… Tan và cộng sự (2006) đã phân lập được 619 chủng xạ khuẩn từ các loại cây cà chua khác nhau và tất cả các chủng. .. các cây chủ và các sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh học được sinh ra bởi xạ khuẩn nội công sinh giúp tìm ra các loại thuốc đặc hiệu có tiềm năng ứng dụng trong bảo vệ và tăng năng xuất cây trồng Ngoài khả năng tiết CKS, xạ khuẩn còn có thể giúp cây trồng tăng khả năng sinh các enzyme có lợi, kích thích cây trồng sinh trưởng, tăng cường sự hấp thu chất dinh dưỡng Giúp kiểm soát bệnh do nấm và vi khuẩn. .. trao đổi chất, kích thích sinh trưởng, miễn dịch cho vật chủ bằng cách tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất… [18, 21, 31] Trong số các VSV nội cộng sinh, xạ khuẩn được chú ý bởi hơn 70 % các chủng xạ khuẩn đã biết có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh có thể ức chế nhiều nhóm VSV gây bệnh Cho tới nay hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì có tới 80 % là do xạ khuẩn sinh ra [1,2,3,8,9,15,33]