VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: XÂY DỰNG VECTOR THÔNG BÁO MANG GEN GFP ĐIỀU KHIỂN BỞI PROMOTER RNR2 ĐỂ PHỤC VỤ CHO VIỆC PHÁT TRIỂN BIOSENSOR PHÁT HIỆN CÁC CHẤT GÂY BIẾN ĐỔI GEN Ngƣời hƣớng dẫn : TS Bùi Văn Ngọc Sinh viên thực : Nguyễn Thị Hƣớng Lớp : 1102 CNSH NĂM – 2015 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: XÂY DỰNG VECTOR THÔNG BÁO MANG GEN GFP ĐIỀU KHIỂN BỞI PROMOTER RNR2 ĐỂ PHỤC VỤ CHO VIỆC PHÁT TRIỂN BIOSENSOR PHÁT HIỆN CÁC CHẤT GÂY BIẾN ĐỔI GEN Ngƣời hƣớng dẫn : TS Bùi Văn Ngọc Sinh viên thực : Nguyễn Thị Hƣớng Lớp : 1102 CNSH NĂM - 2015 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, muốn gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Bùi Văn Ngọc, ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu nhƣ tạo điều kiện tốt cho đƣợc thực tập phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen thuộc Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp hoàn thành khóa luận Tôi xin cảm ơn Ths Nguyễn Thị Thu Huyền, ngƣời cho lời khuyên bổ ích quan tâm động viên thời gian thực đề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc với tập thể cán phòng, ngƣời quan tâm giúp đỡ, bảo, tạo điều kiện cho suốt thời gian nghiên cứu Bên cạnh đó, xin gửi tới thầy cô khoa Công nghệ sinh học, trƣờng Viện Đại Học Mở Hà Nội lời tri ân đặc biệt Cảm ơn thầy cô truyền đạt nhƣ giúp tiếp cận với kiến thức vô bổ ích tạo điều kiện thuận lợi cho toàn trình học tập trƣờng Chúng xin cảm ơn Quỹ phát triển khoa học công nghệ quốc gia (NAFOSTED, mã số 106.16-2012.09) tài trợ cho nghiên cứu Các nguyên liệu để xây dựng thiết kế biosensor nghiên cứu đƣợc cung cấp GS TS Stefan Wölfl, Viện Dƣợc Công nghệ sinh học phân tử (IPMB) – ĐH Heidelberg – Đức Lời cảm ơn cuối cùng, xin dành tặng bạn bè gia đình, ngƣời bên cạnh động viên khích lệ suốt trình học tập nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Nguyễn Thị Hƣớng GVHD: TS Bùi Văn Ngọc i SVTH: Nguyễn Thị Hướng Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC HÌNH ẢNH iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi TÓM TẮT vii Phần I MỞ ĐẦU .1 Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Biosensor .3 2.1.1 Định nghĩa 2.1.2 Ứng dụng 2.1.3 Phân loại 2.2 Biosensor tế bào .7 2.2.1 Cấu tạo nguyên lí hoạt động 2.2.2 Xây dựng biosensor tế bào 2.3 Những nghiên cứu nƣớc biosensor tế bào .17 Phần III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP 19 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 19 3.2 Nội dung nghiên cứu 19 3.3 Vật liệu, trang thiết bị dụng cụ nghiên cứu 19 3.3.1 Vật liệu 19 3.3.2 Các kit 19 3.3.3 Môi trƣờng nuôi cấy 19 3.3.4 Hóa chất 20 3.3.5 Thiết bị, máy móc 21 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu .21 3.4.1 Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số nấm men kit Yeast DNA Extraction Kit, Thermo Scientific 21 3.4.2 Phƣơng pháp PCR 22 3.4.3 Phƣơng pháp tinh sản phẩm PCR kit GenJet Genomic DNA Purification 23 3.4.4 Phƣơng pháp tách dòng vector pJET1.2/blunt 24 GVHD: TS Bùi Văn Ngọc ii SVTH: Nguyễn Thị Hướng Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 3.4.5 Phƣơng pháp xử lí DNA enzym cắt giới hạn 25 3.4.6 Phƣơng pháp nối DNA enzym T4 ligase 25 3.4.7 Biến nạp plasmid DNA vào chủng vi khuẩn E coli DH5α phƣơng pháp sốc nhiệt (Froger, Hall, 2007) .25 3.4.8 Phƣơng pháp tách plasmid kit GenJET plasmid miniprep .26 3.4.9 Phƣơng pháp điện di gel agarose 26 3.4.10 Phƣơng pháp giải trình tự 27 3.4.11 Phƣơng pháp biến nạp plasmid thông báo vào tế bào nấm men phƣơng pháp sốc nhiệt 28 3.4.12 Phƣơng pháp quan sát biểu protein GFP dƣới kính hiển vi huỳnh quang 28 Phần IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 4.1 Nhân dòng vùng promoter gen RNR2 phƣơng pháp PCR 30 4.2 Tách dòng đoạn promoter RNR2 32 4.2.1 Nối đoạn promoter RNR2 vào vector tách dòng pJET2.1/blunt 32 4.2.2 Biến nạp sản phẩm nối vào chủng E coli DH5α 32 4.2.3 Tách plasmid từ thể biến nạp 33 4.2.4 Thu đoạn promoter gen RNR2 .35 4.3 Tạo vector thông báo .35 4.4 Kiểm tra đoạn chèn 36 4.4.1 Biến nạp vector thông báo vào tế bào khả biến E coli DH5 36 4.4.2 Tách tinh plasmid từ thể biến nạp 36 4.4.3 Cắt kiểm tra plasmid enzym cắt giới hạn BamHI PacI 38 4.5 Giải trình tự vùng promoter thu đƣợc 38 4.6 Tạo biosensor tế bào nấm men 39 4.6.1 Biến nạp vector thông báo vào tế bào nấm men .39 4.6.2 Thử nghiệm đánh giá sơ biosensor xử lý với MMS menadione 40 Phần V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 5.1 Kết luận .43 5.2 Kiến nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 GVHD: TS Bùi Văn Ngọc iii SVTH: Nguyễn Thị Hướng Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 3.1 Bản đồ vector pJET2.1/blunt (Thermo Scientific) 24 Hình 4.1 Điện di đồ sản phẩm PCR nhân đoạn promoter RNR2 31 Hình 4.2 Đĩa biến nạp plasmid tái tổ hợp RNR2/pJET 34 Hình 4.3 Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp hai enzym hạn chế BamHI PacI 34 Hình 4.4 Sơ đồ vector thông báo RNR2-GFP-pUMGP5 36 Hình 4.5 Đĩa cấy mẫu biến nạp RNR2-GFP-pUMGP5 37 Hình 4.6 Điện di đồ kiểm tra đoạn chèn RNR2 plasmid 38 Hình 4.7 Đĩa cấy mẫu biến nạp vào tế bào nấm men SD-URA 39 Hình 4.8 Quan sát khả biểu GFP xử lý với 0.2 mM MMS 40 Hình 4.9 Quan sát khả biểu GFP mẫu đối chứng (không xử lý)41 Hình 4.10 Quan sát khả biểu GFP xử lý với 50 µM Menadione 41 GVHD: TS Bùi Văn Ngọc iv SVTH: Nguyễn Thị Hướng Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Tóm lƣợc khả nhận biết chọn lọc hay đáp ứng đặc hiệu promoter gen với tác nhân đối tƣợng cần phân tích (Bui, 2006; Daunert cộng sự, 2000) 12 Bảng 3.1 Danh mục hóa chất sử dụng 20 Bảng 3.2 Danh mục máy móc thiết bị sử dụng 21 Bảng 3.3 Cặp mồi phản ứng PCR nhân dòng vùng promoter RNR2 22 Bảng 3.4 Thành phần phản ứng PCR nhân dòng vùng promoter RNR2 23 GVHD: TS Bùi Văn Ngọc v SVTH: Nguyễn Thị Hướng Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 4-NQO 4-Nitroquinoline 1-oxide Amp Ampicillin bp Base pair CAT Chloramphenicol acetyl transferase DNA Deoxyribonucleic acid E coli Escherichia coli ELISA Enzym-linked immunosorbent assay GC-MS Gas chromatography–mass spectrometry GFP HPLC Green fluorescent protein High-erformance liquid chromatography kb Kilobase LB Luria Bertani LUX Bacterial Luciferase MMS Methyl Methanesulfonate PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic acid β-Gal β-galactosidase YNB Yeast nitrogen base LioAc Lithium acetate DMSO Dimethyl sulfoxide PEG Polyethylene glycol YPD Yeast Peptone Dextrose SD-URA Synthetic Defined Uracil G418 GVHD: TS Bùi Văn Ngọc Geneticin vi SVTH: Nguyễn Thị Hướng Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học TÓM TẮT Biosensor dạng tế bào đƣợc biết đến công cụ phân tích tiềm việc xác định hợp chất gây biến đổi gen, gây độc tế bào độc tính môi trƣờng Một thành phần thiếu biosensor tế bào vector thông báo Vector chứa hai yếu tố quan trọng cấu tạo biosensor yếu tố nhận biết chọn lọc (promoter) yếu tố chuyển đổi tín hiệu (gen thông báo) Trong nghiên cứu này, vector thông báo đƣợc xây dựng cách sử dụng vùng promoter gen RNR2 (1568 bp) gen thông báo GFP gắn plasmid pUMGP5 Vùng promoter gen RNR2 đƣợc nhân đoạn phản ứng PCR đƣợc tách dòng vector pJET1.2/blunt Promoter sau đƣợc xử lý hai enzym cắt giới hạn BamHI PacI đƣợc chèn vào trƣớc gen thông báo GFP vị trí cắt hai enzym plasmid GFP-pUMGP5 để tạo thành vector thông báo RNR2-GFP-pUMGP5 Để chắn đoạn chèn mong muốn đƣợc gắn vị trí, plasmid sau tinh đƣợc xử lý hai enzyme BamHI PacI, điện di gel agarose 1% để kiểm tra có mặt promoter RNR2 Cuối cùng, vùng promoter gen RNR2 đƣợc giải trình tự so sánh với trình tự vùng promoter gen RNR2 ngân hàng gen giới (NCBI) để khẳng định kết Sản phẩm plasmid thông báo RNR2-GFP-pUMGP5 sau đƣợc tách tinh đƣợc biến nạp vào tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae kiểu dại (Y486wt) để tạo biosensor tế bào Sau biosensor đƣợc đánh giá thử nghiệm với số hợp chất nhƣ MMS (gây biến đổi gen) menadione Kết quả, sản phẩm điện di kiểm tra gel agarose cho băng vạch kích thƣớc theo lí thuyết Trình tự vùng promoter gen RNR2 thu đƣợc đƣợc so sánh với trình tự vùng promoter gen RNR2 công bố ngân hàng gen giới (NCBI) cho kết tƣơng đồng 100% Vector thông báo RNR2-GFPpUMGP5 đƣợc biến nạp vào tế bào nấm men tạo biosensor dạng tế bào Biosensor tạo đƣợc thử nghiệm đánh giá với số hợp chất nhƣ MMS, menadione Nhƣ vậy, nghiên cứu thành công với việc tạo vector thông báo RNR2-GFP-pUMGP5 mang gen GFP đƣợc điều khiển promoter RNR2 sở để phát triển biosensor ứng dụng phát chất gây biến đổi gen GVHD: TS Bùi Văn Ngọc vii SVTH: Nguyễn Thị Hướng Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học PHẦN I MỞ ĐẦU Ngày nay, với phát triển xã hội gia tăng nhanh chóng dân số khiến nhu cầu thực phẩm nhƣ mặt hàng tiêu dùng khác ngày tăng Để đáp ứng nhu cầu đó, nhiều nhà máy, khu công nghiệp, sở kinh doanh chế biến thực phẩm đƣợc phát triển, mở rộng qui mô sản xuất Tuy nhiên, vấn đề xử lí nƣớc thải, chất thải từ nhà máy, khu công nghiệp nhƣ vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm nhiều nơi chƣa nhận đƣợc quan tâm mức khiến môi trƣờng ngày bị ô nhiễm nghiêm trọng Điều gây ảnh hƣởng tiêu cực đến đời sống ngƣời nhiều mặt, đặc biệt mặt sức khỏe Một vấn đề đáng lo ngại sức khỏe ngƣời tồn hợp chất có khả gây biến đổi gen, gây ung thƣ nƣớc thải, chất thải nhà máy, khu công nghiệp nhƣ thực phẩm không đƣợc chế biến, bảo quản cách, hợp vệ sinh, ví dụ nhƣ hợp chất chất hydrocarbon thơm đa vòng (Polycyclic aromatic hydrocarbons - PAHs) nhƣ kim loại nặng tồn nƣớc thải từ khu công nghiệp (Ngo cộng sự, 2012; Rodriguez-Mozaz cộng sự, 2005) aflatoxin B1 có số ngũ cốc mốc, sữa (Dinckaya cộng sự, 2011), sterigmatocystin thực phẩm, sản phẩm sữa hƣ hỏng (Yao cộng sự, 2006), đất trồng nhiễm dioxin (Tuyet-Hanh cộng sự, 2010), thịt chứa kháng sinh (Duong cộng sự, 2006)… Việc phát hiện, đánh giá hợp chất môi trƣờng nhƣ thực phẩm đòi hỏi thiết yếu Đã có nhiều phƣơng pháp đƣợc áp dụng để phát hợp chất có khả gây biến đổi gen Có thể kể đến phƣơng pháp hóa lí nhƣ sắc kí lỏng cao áp (HPLC), sắc ký khí khối phổ (GC-MS) (McCoy cộng sự, 2008; Rodriguez Velasco cộng sự, 2003) phƣơng pháp hóa sinh nhƣ dạng test ELISA (Gundinc, Filazi, 2009; Kolosova cộng sự, 2006), gần cảm biến sinh học (biosensor) đƣợc phát triển từ DNA, enzym, protein, plasmid Tuy nhiên, phƣơng pháp HPLC, GC-MS, nhƣ biosensor chế tạo từ DNA, enzym, protein…chỉ phù hợp cho việc phát hiện, định tính, định lƣợng hợp chất không đánh giá đƣợc ảnh hƣởng mặt sinh học nhƣ độc tính tế bào, độc tính gen hợp chất Để giải vấn đề này, ngƣời ta sử dụng tế GVHD: TS Bùi Văn Ngọc SVTH: Nguyễn Thị Hướng Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học Hình 4.6 Điện di đồ kiểm tra đoạn chèn RNR2 plasmid 1: thang DNA chuẩn (1 kb, Thermo Scientific) 2, 3: plasmid sau đƣợc xử lí hai enzym BamHI PacI 4, 5: plasmid trƣớc đƣợc xử lí hai enzym BamHI PacI 4.4.3 Cắt kiểm tra plasmid enzym cắt giới hạn BamHI PacI Để kiểm tra plasmid có chứa promoter RNR2 vị trí tính toán hay không, tiến hành xử lí plasmid thu đƣợc hai enzym cắt giới hạn BamHI PacI, sau điện di kiểm tra gel agarose 1% (hình 4.6) Kết thể hình 4.6, giếng cho thấy xuất hai băng vạch có kích thƣớc tƣơng ứng với vùng promoter RNR2 (1568 bp) plasmid GFP-pUMGP5 (10349 bp) Điều chứng tỏ vùng promoter RNR2 đƣợc chèn vào vị trí hai enzym BamHI PacI plasmid GFP-pUMGP5 4.5 Giải trình tự vùng promoter thu đƣợc Plasmid RNR2-GFP-pUMGP5 sau tách chiết tiến hành tinh đƣợc xác định trình tự tự động Để khẳng định ghép nối thành công promotor RNR2 vào vector GFPpUMGP5), so sánh trình tự với trình tự vùng promoter RNR2 theo ngân hàng gen giới (NCBI) Kết cho thấy trình tự thu đƣợc tƣơng đồng 100% với trình tự vùng promoter gen RNR2 ngân hàng gen NCBI, với chiều dài 1568 nucleotide GVHD: TS Bùi Văn Ngọc 38 SVTH: Nguyễn Thị Hướng Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học Nhƣ vậy, tạo thành công dòng biến nạp E coli DH5 mang plasmid RNR2-GFP-pUMGP5 có gắn đoạn promoter gen RNR2 vị trí mong muốn Plasmid tiếp tục đƣợc sử dụng làm vector thông báo để tạo biosensor tế bào 4.6 Tạo biosensor tế bào nấm men 4.6.1 Biến nạp vector thông báo vào tế bào nấm men Plasmid RNR2-GFP-pUMGP5 đƣợc biến nạp vào chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae kiểu dại theo phƣơng pháp sốc nhiệt Khi tiến hành biến nạp, hỗn hợp plasmid tế bào nấm men đƣợc đem nuôi tĩnh 30oC 20 phút thêm 300µl dịch PEG 3350 (40%) nuôi tĩnh 30oC 20 phút Sau đó, cho 35,5µl dịch DMSO 100% đƣợc sốc nhiệt 42 oC 15 phút đƣợc chuyển lại vào đá phút Sự chênh lệch nhiệt độ tác động đến cấu trúc thành màng tế bào khiến plasmid vào tế bào chất Sau trình sốc nhiệt, tế bào khả biến đƣợc ổn định tạo điều kiện sinh trƣởng cách bổ sung môi trƣờng YPD lỏng lắc nhiệt độ 30 oC với tốc độ 850 vòng/phút Sau đó, hỗn hợp phản ứng đƣợc cấy trang môi trƣờng SD-URA Nuôi tĩnh qua đêm nhiệt độ 30 oC Kết cho thấy có xuất khuẩn lạc mọc bề mặt thạch Theo lí thuyết, tế bào nấm men bình thƣờng phát triển đĩa môi trƣờng SDURA Do đó, khuẩn lạc xuất khuẩn lạc có chứa plasmid RNR2-GFP-pUMGP5, mang gen có khả tổng hợp uracil Hình 4.7 Đĩa cấy mẫu biến nạp vào tế bào nấm men SD-URA GVHD: TS Bùi Văn Ngọc 39 SVTH: Nguyễn Thị Hướng Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 4.6.2 Thử nghiệm đánh giá sơ biosensor xử lý với MMS menadione Theo sơ đồ cấu tạo nguyên lý hoạt động chung biosensor (Hình 1.1) kết tạo đƣợc vector thông báo RNR2-GFP-pUMGP5 (Hình 4.4) Khi có mặt hợp chất gây đột biến gen, yếu tố nhận biết promoter RNR2 bị kích thích hoạt động điều khiển phiên mã gen thông báo GFP dẫn đến trình trình chuyển đổi tín hiệu thông qua biểu protein thông báo GFP Tín hiệu huỳnh quang GFP phát đƣợc ghi lại máy đo huỳnh quang đƣợc kích thích bƣớc sóng 485 nm phát xạ 535 nm Cƣờng độ tín hiệu GFP đo đƣợc tỷ lệ thuận với nồng độ chất môi trƣờng cần phân tích Trƣớc phát triển biosensor ứng dụng việc phát sàng lọc hợp chất gây biến đổi gengen Trong nghiên cứu này, bƣớc đầu thử nghiệm đánh giá sơ biosensor tạo từ tế bào nấm men cách quan sát khả biểu protein GFP đƣợc điều khiển promoter RNR2 xử lý với MMS, hợp chất thuộc nhóm alkyl hóa DNA, menadione hợp chất tiền vitamin K Nhƣ vậy, theo kết trình bày Hình 4.4–4.6 biến nạp thành công plasmid RNR2-GFP-pUMGP5 vào tế bào nấm men Để kiểm tra kết tạo biosensor, tiến hành chọn ngẫu nhiên số khuẩn lạc đĩa thạch SD-URA nuôi môi trƣờng SD-URA dạng dịch qua đêm tủ lắc 300 C, 250 rpm Tiếp theo, bổ sung 0.2 mM MMS 50 µM menadione Sau 16 tiến hành quan sát dƣới kính hiển vi huỳnh quang để kiểm tra kết theo phƣơng pháp đƣợc trình bày phần 3.4.12 Hình 4.8 Quan sát khả biểu GFP xử lý với 0.2 mM MMS GVHD: TS Bùi Văn Ngọc 40 SVTH: Nguyễn Thị Hướng Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học Hình 4.9 Quan sát khả biểu GFP mẫu đối chứng (không xử lý) Hình 4.10 Quan sát khả biểu GFP xử lý với 50 µM Menadione GVHD: TS Bùi Văn Ngọc 41 SVTH: Nguyễn Thị Hướng Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học Kết qủa cho thấy, có mặt MMS kích thích promoter RNR2 hoạt động dẫn đến trình phiên mã, biểu phát tín hiệu huỳnh quang GFP (Hình 4.8) Bởi lẽ, MMS tác nhân alkyl hóa cách gắn nhóm methyl lên vị trí N7-deoxyguanine N3-deoxyadenine phân tử DNA, đồng thời tác nhân ngăn chặn chạc ba tái bản, dẫn đến đột biến gen gây ung thƣ ( Lundin cộng sự, 2005) Vì thế, MMS thƣờng đƣợc dùng nhƣ chất chuẩn nghiên cứu đột biến gen chất đối chứng việc xác định hợp chất có khả gây đột biến gen gây ung thƣ tiềm tàng (Huang cộng sự, 2013; Piening cộng sự, 2013) Trái ngƣợc với kết xử lý với MMS, mẫu không xử lý (đôí chứng) mẫu xử lý với menadione tín hiệu huỳnh quang không đƣợc quan sát thấy, điều có nghĩa promoter RNR2 không đƣợc kích thích gây cảm ứng hoạt động dẫn đến trình biểu phát huỳnh quang GFP (Hình 4.9 - 4.10) Menadione đƣợc biết đến tiền vitamin K thƣờng đƣợc sử dụng làm thành phần dinh dƣỡng bổ sung, tính chất gần giống vitamin K Chỉ xử lý với nồng độ cao (khoảng 0.5 mM, gấp 10 lần so với nghiên cứu này), menadione gây độc tế bào (cytotoxicity) nấm men Saccharomyces cerevisiae (Castro cộng sự, 2008) Ngoài ra, menadione thƣờng đƣợc khuyến cáo không sử dụng cho ngƣời, mà chủ yếu cho gia gia súc với nồng độ thấp Bởi lẽ, việc sử dụng menadione liều cao gây thiếu máu, tổn thƣơng não… (theo Cục quản lý Dƣợc phẩm Thực phẩm Mỹ, FDA) Mặc dù nghiên cứu thử nghiệm với hai hợp chất: gây biến đổi gen MMS hợp chất tiền vitamin K menadione Tuy nhiên, sở để xây dựng, phát triển ứng dụng biosensor việc phân tích sàng lọc hợp chất có tính chất hoá học tƣơng tự MMS, thuộc nhóm alkyl hóa DNA nhƣ mitomycin C, Nnitroso-N-methylurea, chlorambucil Hơn nữa, từ kết ngƣời ta xây dựng nhiều loại vector thông báo khác để phát triển nhiều loại biosensor khác nhau, tùy vào mục đích sử dụng yêu cầu phát hiện, thông qua việc thay promoter thích hợp việc nhận biết hợp chất Ví dụ sử dụng promoter ARS gen arsR để nhận biết Asen, promoter PBR gen pbrR nhận biết chì, promoter MER gen merR nhận biết thủy ngân… (DAUNERT, 2000) GVHD: TS Bùi Văn Ngọc 42 SVTH: Nguyễn Thị Hướng Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Đã khuếch đại thành công vùng promoter gen RNR2 có kích thƣớc 1568 bp từ chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae kiểu dại, ký hiệu Y486wt Đã tách dòng thành công vùng promoter gen RNR2 vector pJET1.2/blunt Đã xây dựng thành công vector thông báo mang gen GFP đƣợc điều khiển promoter RNR2 để ứng dụng việc chế tạo biosensor dạng tế bào với mục đích phát hợp chất gây biến đổi gen gây ung thƣ Đã biến nạp thành công vector thông báo mang gen GFP đƣợc điều khiển promoter RNR2 vào tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae Đã tạo thành công biosensor dạng tế bào để đánh giá thử nghiệm hợp chất gây biến đổi gen MMS 5.2 Kiến nghị Trong nghiên cứu tiếp theo: Tối ƣu hoá phản ứng thử nghiệm biosensor phân tích đánh giá hợp chất gây biến đổi gen khác khảo sát dải nồng độ rộng để xác định tính đặc hiệu độ nhạy Biosensor Tối ƣu môi trƣờng nuôi cấy để tăng độ nhạy Biosensor GVHD: TS Bùi Văn Ngọc 43 SVTH: Nguyễn Thị Hướng Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tài liệu tham khảo tiếng Việt BÙI VĂN NGỌC, NGUYỄN HỮU ĐỨC, NGUYỄN ĐỨC THẮNG, NGUYỄN CÔNG HIẾU (2013) Xây dựng phát triển biosensor từ tế bào nấm men ứng dụng phát hợp chất gây đột biến gen Tạp chí Khoa học phát triển số 6, tập 11: 840-849 ĐỖ BIÊN CƢƠNG ĐẶNG THỊ THU (2009) Phƣơng pháp chế tạo kít acetylcholinesterase huyết lợn phát nhanh dƣ lƣợng thuốc trừ sâu Bằng độc quyền Giải pháp hữu ích số 771 Cục Sở hữu trí tuệ cấp ngày 1.6.2009 PHAN HỮU TÔN (2010) Giáo trình sinh học phân tử Nhà xuất Nông nghiệp 179 trang  Tài liệu tham khảo tiếng Anh ABID, M R., LI, Y., ANTHONY, C DE BENEDETTI, A (1999) Translational regulation of ribonucleotide reductase by eukaryotic initiation factor 4E links protein synthesis to the control of DNA replication J Biol Chem 274: 35991-8 AFANASSIEV, V., SEFTON, M., ANANTACHAIYONG, T., BARKER, G., WALMSLEY, R WOLFL, S (2000) Application of yeast cells transformed with GFP expression constructs containing the RAD54 or RNR2 promoter as a test for the genotoxic potential of chemical substances Mutat Res 464: 297-308 BASSO, T S., PUNGARTNIK, C BRENDEL, M (2008) Low productivity of ribonucleotide reductase in Saccharomyces cerevisiae increases sensitivity to stannous chloride Genet Mol Res 7: 1-6 BENTON, M G., GLASSER, N R PALECEK, S P (2007) The utilization of a Saccharomyces cerevisiae HUG1P-GFP promoter-reporter construct for the selective detection of DNA damage Mutat Res 633: 21-34 BERG, J., HUNG, Y P YELLEN, G (2009) A genetically encoded fluorescent reporter of ATP:ADP ratio Nat Methods 6: 161-6 BLUM, J L COULET, P R (1989) Biosensor: Principle and Application, NY Oxford Univ Press GVHD: TS Bùi Văn Ngọc 44 SVTH: Nguyễn Thị Hướng Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học BUI, V N (2006) Development of novel yeast - based biosensor for cytotoxicity, genotoxicity, and environmental monitoring University of Heidelberg - Germany BUI VN, NGUYEN TT, BETTAREL Y, NGUYEN TH, PHAM TL, HOANG TY, NGUYEN VT, NGHIEM NM, WÖLFL S (2015) Genotoxicity of Chemical Compounds - Identification and Assessment by Yeast Cells Transformed With GFP Reporter Constructs Regulated by the PLM2 or DIN7 Promoter Int J Toxicol 34(1):31-43 CAHILL, P A., KNIGHT, A W., BILLINTON, N., BARKER, M G., WALSH, L., KEENAN, P O., WILLIAMS, C V., TWEATS, D J WALMSLEY, R M (2004) The GreenScreen genotoxicity assay: a screening validation programme Mutagenesis 19: 105-19 10 CASTRO FA, MARIANI D, PANEK AD, ELEUTHERIO EC, PEREIRA MD (2008) Cytotoxicity mechanism of two naphthoquinones (menadione and plumbagin) in Saccharomyces cerevisiae PloS one 3(12): e3999 11 CHABES, A., DOMKIN, V., LARSSON, G., LIU, A., GRASLUND, A., WIJMENGA, S THELANDER, L (2000) Yeast ribonucleotide reductase has a heterodimeric iron-radical-containing subunit Proc Natl Acad Sci U S A 97: 2474-9 12 CLARK, L C LYONS, C (1962) Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery Ann NY Acad Sci 102: 29-45 13 DAUNERT, S., BARRETT, G., FELICIANO, J S., SHETTY, R S., SHRESTHA, S SMITH-SPENCER, W (2000) Genetically engineered wholecell sensing systems: coupling biological recognition with reporter genes Chem Rev 100: 2705-38 14 DINCKAYA, E., KINIK, O., SEZGINTURK, M K., ALTUG, C AKKOCA, A (2011) Development of an impedimetric aflatoxin M1 biosensor based on a DNA probe and gold nanoparticles Biosens Bioelectron 15 DOMKIN, V., THELANDER, L CHABES, A (2002) Yeast DNA damage-inducible Rnr3 has a very low catalytic activity strongly stimulated after the formation of a cross-talking Rnr1/Rnr3 complex J Biol Chem 277: 18574-8 GVHD: TS Bùi Văn Ngọc 45 SVTH: Nguyễn Thị Hướng Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 16 DUDAS, A CHOVANEC, M (2004) DNA double-strand break repair by homologous recombination Mutat Res 566: 131-67 17 DUONG VN, PAULSEN P, SURIYASATHAPORN W, SMULDERS FJ, KYULE MN, BAUMANN MP, ZESSIN KH, PHAM HN (2006) Preliminary analysis of tetracycline residues in marketed pork in Hanoi, Vietnam Ann N Y Acad Sci 1081: 534-542 18 EISEN, J A., SWEDER, K S HANAWALT, P C (1995) Evolution of the SNF2 family of proteins: subfamilies with distinct sequences and functions Nucleic Acids Res 23: 2715-23 19 ELLEDGE, S J DAVIS, R W (1990) Two genes differentially regulated in the cell cycle and by DNA-damaging agents encode alternative regulatory subunits of ribonucleotide reductase Genes Dev 4: 740-51 20 FROGER, A HALL, J E (2007) Transformation of plasmid DNA into E coli using the heat shock method Journal of Visualized Experiments 6: doi: 10.3791/253 21 GAME, J C MORTIMER, R K (1974) A genetic study of x-ray sensitive mutants in yeast Mutat Res 24: 281-92 22 GARCIA-ALONSO, J., FAKHRULLIN, R F PAUNOV, V N (2010) Rapid and direct magnetization of GFP-reporter yeast for micro-screening systems Biosens Bioelectron 25: 1816-9 23 GE, J., PERLSTEIN, D L., NGUYEN, H H., BAR, G., GRIFFIN, R G STUBBE, J (2001) Why multiple small subunits (Y2 and Y4) for yeast ribonucleotide reductase? Toward understanding the role of Y4 Proc Natl Acad Sci U S A 98: 10067-72 24 GU, M B., MITCHELL, R J KIM, B C (2004) Whole-cell-based biosensors for environmental biomonitoring and application Adv Biochem Eng Biotechnol 87: 269-305 25 GUNDINC, U FILAZI, A (2009) Detection of aflatoxin M1 concentrations in UHT milk consumed in Turkey markets by ELISA Pak J Biol Sci 12: 653-6 GVHD: TS Bùi Văn Ngọc 46 SVTH: Nguyễn Thị Hướng Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 26 HINGORANI, M M O'DONNELL, M (2000) Sliding clamps: a (tail)ored fit Curr Biol 10: R25-9 27 HOEGE, C., PFANDER, B., MOLDOVAN, G L., PYROWOLAKIS, G JENTSCH, S (2002) RAD6-dependent DNA repair is linked to modification of PCNA by ubiquitin and SUMO Nature 419: 135-41 28 HUANG D, PIENING BD, PAULOVICH AG (2013) The Preference for Error-Free or Error-Prone Postreplication Repair in Saccharomyces cerevisiae Exposed to Low-Dose Methyl Methanesulfonate Is Cell Cycle Dependent Molecular and cellular biology 33(8): 1515-1527 29 INTERTHAL, H HEYER, W D (2000) MUS81 encodes a novel helixhairpin-helix protein involved in the response to UV- and methylation-induced DNA damage in Saccharomyces cerevisiae Mol Gen Genet 263: 812-27 30 JAYARAMAN, M., RADHIKA, V., BAMNE, M N., RAMOS, R., BRIGGS, R DHANASEKARAN, D N (2005) Engineered Saccharomyces cerevisiae strain BioS-OS1/2, for the detection of oxidative stress Biotechnol Prog 21: 1373-9 31 JOHNSTON, L H JOHNSON, A L (1995) The DNA repair genes RAD54 and UNG1 are cell cycle regulated in budding yeast but MCB promoter elements have no essential role in the DNA damage response Nucleic Acids Res 23: 2147-52 32 KANOJIA, D VAIDYA, M M (2006) 4-nitroquinoline-1-oxide induced experimental oral carcinogenesis Oral Oncol 42: 655-67 33 KENDALL, J M BADMINTON, M N (1998) Aequorea victoria bioluminescence moves into an exciting new era Trends Biotechnol 16: 216-24 34 KOLOSOVA, A Y., SHIM, W B., YANG, Z Y., EREMIN, S A CHUNG, D H (2006) Direct competitive ELISA based on a monoclonal antibody for detection of aflatoxin B1 Stabilization of ELISA kit components and application to grain samples Anal Bioanal Chem 384: 286-94 35 KUMAR, D., VIBERG, J., NILSSON, A K CHABES, A (2010) Highly mutagenic and severely imbalanced dNTP pools can escape detection by the S-phase checkpoint Nucleic Acids Res 38: 3975-83 GVHD: TS Bùi Văn Ngọc 47 SVTH: Nguyễn Thị Hướng Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 36 LAVRINENKO, I A., LAVRINENKO, V A., RYABCHENKO, A V BEKLEMISHEV, A B (2006) Development of a biosensor test system with GFP reporter protein for detection of DNA damages Bull Exp Biol Med 141: 33-5 37 LEFEVRE, C K., SINGER, V L., KANG, H C HAUGLAND, R P (1995) Quantitative nonradioactive CAT assays using fluorescent BODIPY 1deoxychloramphenicol substrates Biotechniques 19: 488-93 38 LEWIS, J C DAUNERT, S (1999) Dual detection of peptides in a fluorescence binding assay by employing genetically fused GFP and BFP mutants Anal Chem 71: 4321-7 39 LEWIS, J C., FELTUS, A., ENSOR, C M., RAMANATHAN, S DAUNERT, S (1998) Applications of reporter genes Anal Chem 70: 579A585A 40 LIU, H S., JAN, M S., CHOU, C K., CHEN, P H KE, N J (1999) Is green fluorescent protein toxic to the living cells? Biochem Biophys Res Commun 260: 712-7 41 LUNDIN C, NORTH M, ERIXON K, WALTERS K, JENSSEN D, GOLDMAN AS, et al (2005) Methyl methanesulfonate (MMS) produces heatlabile DNA damage but no detectable in vivo DNA double-strand breaks Nucleic acids research 33(12): 3799-3811 42 LUMJIAKTASE, P., AGUILAR, C., BATTIN, T., RIEDEL, K EBERL, L (2010) Construction of self-transmissible green fluorescent protein-based biosensor plasmids and their use for identification of N-acyl homoserine-producing bacteria in lake sediments Appl Environ Microbiol 76: 6119-27 43 MAGA, G HUBSCHER, U (2003) Proliferating cell nuclear antigen (PCNA): a dancer with many partners J Cell Sci 116: 3051-60 44 MARTINEAU, R L., STOUT, V TOWE, B C (2009) Whole cell biosensing via recA::mCherry and LED-based flow-through fluorometry Biosens Bioelectron 25: 759-66 45 MATUNIS, M J (2002) On the road to repair: PCNA encounters SUMO and ubiquitin modifications Mol Cell 10: 441-2 GVHD: TS Bùi Văn Ngọc 48 SVTH: Nguyễn Thị Hướng Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 46 MAZIN, A V., BORNARTH, C J., SOLINGER, J A., HEYER, W D KOWALCZYKOWSKI, S C (2000) Rad54 protein is targeted to pairing loci by the Rad51 nucleoprotein filament Mol Cell 6: 583-92 47 MCCOY, L F., SCHOLL, P F., SUTCLIFFE, A E., KIESZAK, S M., POWERS, C D., ROGERS, H S., GONG, Y Y., GROOPMAN, J D., WILD, C P SCHLEICHER, R L (2008) Human aflatoxin albumin adducts quantitatively compared by ELISA, HPLC with fluorescence detection, and HPLC with isotope dilution mass spectrometry Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 17: 1653-7 48 MITCHELL, R J GU, M B (2004) An Escherichia coli biosensor capable of detecting both genotoxic and oxidative damage Appl Microbiol Biotechnol 64: 46-52 49 MOLDOVAN, G L., PFANDER, B JENTSCH, S (2006) PCNA controls establishment of sister chromatid cohesion during S phase Mol Cell 23: 723-32 50 MULLIS, K., FALOONA, F., SCHARF, S., SAIKI, R., HORN, G ERLICH, H (1986) Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction Cold Spring Harb Symp Quant Biol 51 Pt 1: 263-73 51 MURIS, D F., VREEKEN, K., CARR, A M., MURRAY, J M., SMIT, C., LOHMAN, P H PASTINK, A (1996) Isolation of the Schizosaccharomyces pombe RAD54 homologue, rhp54+, a gene involved in the repair of radiation damage and replication fidelity J Cell Sci 109 ( Pt 1): 73-81 52 NGO, D M., HOUGH, R L., LE, T T., NYBERG, Y., LE, B M., NGUYEN, C V., NGUYEN, M K OBORN, I (2012) Assessing dietary exposure to cadmium in a metal recycling community in Vietnam: age and gender aspects Sci Total Environ 416: 164-71 53 PANCRAZIO, J J., WHELAN, J P., BORKHOLDER, D A., MA, W STENGER, D A (1999) Development and application of cell-based biosensors Ann Biomed Eng 27: 697-711 54 PAZOS, E., VAZQUEZ, O., MASCARENAS, J L VAZQUEZ, M E (2009) Peptide-based fluorescent biosensors Chem Soc Rev 38: 3348-59 GVHD: TS Bùi Văn Ngọc 49 SVTH: Nguyễn Thị Hướng Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 55 PETRANOVIC, D., TYO, K., VEMURI, G N NIELSEN, J (2010) Prospects of yeast systems biology for human health: integrating lipid, protein and energy metabolism FEMS Yeast Res 10: 1046-59 56 PHILLIPS, G N., JR (1997) Structure and dynamics of green fluorescent protein Curr Opin Struct Biol 7: 821-7 57 PIENING BD, HUANG D, PAULOVICH AG (2013) Novel Connections Between DNA Replication, Telomere Homeostasis, and the DNA Damage Response Revealed by a Genome-Wide Screen for TEL1/ATM Interactions in Saccharomyces cerevisiae Genetics 193(4): 1117-1133 58 RITTBERG, D A WRIGHT, J A (1989) Relationships between sensitivity to hydroxyurea and 4-methyl-5-amino-1-formylisoquinoline thiosemicarbazone (MAIO) and ribonucleotide reductase RNR2 mRNA levels in strains of Saccharomyces cerevisiae Biochem Cell Biol 67: 352-7 59 RODRIGUEZ-MOZAZ, S., ALDA, M J., MARCO, M P BARCELO, D (2005) Biosensors for environmental monitoring A global perspective Talanta 65: 291-7 60 RODRIGUEZ VELASCO, M L., CALONGE DELSO, M M ORDONEZ ESCUDERO, D (2003) ELISA and HPLC determination of the occurrence of aflatoxin M(1) in raw cow's milk Food Addit Contam 20: 276-80 61 SHAW, W V (1983) Chloramphenicol acetyltransferase: enzymology and molecular biology CRC Crit Rev Biochem 14: 1-46 62 SHEN, C., LANCASTER, C S., SHI, B., GUO, H., THIMMAIAH, P BJORNSTI, M A (2007) TOR signaling is a determinant of cell survival in response to DNA damage Mol Cell Biol 27: 7007-17 63 SMIRNOVA, M., VAN KOMEN, S., SUNG, P KLEIN, H L (2004) Effects of tumor-associated mutations on Rad54 functions J Biol Chem 279: 24081-8 64 STOCKER, J., BALLUCH, D., GSELL, M., HARMS, H., FELICIANO, J., DAUNERT, S., MALIK, K A VAN DER MEER, J R (2003) Development of a set of simple bacterial biosensors for quantitative and rapid measurements of arsenite and arsenate in potable water Environ Sci Technol 37: 4743-50 GVHD: TS Bùi Văn Ngọc 50 SVTH: Nguyễn Thị Hướng Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 65 SUZUKI, Y OKAMOTO, S (1967) The enzymatic acetylation of chloramphenicol by the multiple drug-resistant Escherichia coli carrying R factor J Biol Chem 242: 4722-30 66 SYMINGTON, L S (2002) Role of RAD52 epistasis group genes in homologous recombination and double-strand break repair Microbiol Mol Biol Rev 66: 630-70, table of contents 67 TAK, Y K., NAOGHARE, P K., LEE, K H., PARK, S S SONG, J M (2008) Green fluorescent protein (GFP) as a direct biosensor for mutation detection: elimination of false-negative errors in target gene expression Anal Biochem 380: 91-8 68 TANIGUCHI, A (2010) Live cell-based sensor cells Biomaterials 31: 5911-5 VASTARELLA, W (2001) Enzyme modified electrodes in amperometric biosensors Doctor, Università Degli Studi di Bari - Italy 69 TUYET-HANH TT, VU-ANH L, NGOC-BICH N, TENKATE T (2010) Enviroment health risk assessment of dioxin exposure throught foods in a dioxin hot spot-Bien Hoa City, Vietnam Int J Environ Res Public Health 7: (5) 2395-2406 70 WADA, K., TANIGUCHI, A., KOBAYASHI, J., YAMATO, M OKANO, T (2008) Live cells-based cytotoxic sensorchip fabricated in a microfluidic system Biotechnol Bioeng 99: 1513-7 71 WALSH, L., SCHMUCKLI-MAURER, J., BILLINTON, N., BARKER, M G., HEYER, W D WALMSLEY, R M (2002) DNA-damage induction of RAD54 can be regulated independently of the RAD9- and DDC1-dependent checkpoints that regulate RNR2 Curr Genet 41: 232-40 72 WANG, H., NAKATA, E HAMACHI, I (2009) Recent progress in strategies for the creation of protein-based fluorescent biosensors Chembiochem 10: 2560-77 73 WATTS, F Z (2006) Sumoylation of PCNA: Wrestling with recombination at stalled replication forks DNA Repair (Amst) 5: 399-403 74 WOLNER, B PETERSON, C L (2005) ATP-dependent and ATPindependent roles for the Rad54 chromatin remodeling enzyme during recombinational repair of a DNA double strand break J Biol Chem 280: 10855-60 GVHD: TS Bùi Văn Ngọc 51 SVTH: Nguyễn Thị Hướng Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 75 WOOD, K V (1995) Marker proteins for gene expression Curr Opin Biotechnol 6: 50-8 76 WU, C H., LE, D., MULCHANDANI, A CHEN, W (2009) Optimization of a whole-cell cadmium sensor with a toggle gene circuit Biotechnol Prog 25: 898-903 77 YAO, D S., CAO, H., WEN, S., LIU, D L., BAI, Y ZHENG, W J (2006) A novel biosensor for sterigmatocystin constructed by multi-walled carbon nanotubes (MWNT) modified with aflatoxin-detoxifizyme (ADTZ) Bioelectrochemistry 68: 126-33 78 YAO, R., ZHANG, Z., AN, X., BUCCI, B., PERLSTEIN, D L., STUBBE, J HUANG, M (2003) Subcellular localization of yeast ribonucleotide reductase regulated by the DNA replication and damage checkpoint pathways Proc Natl Acad Sci U S A 100: 6628-33 GVHD: TS Bùi Văn Ngọc 52 SVTH: Nguyễn Thị Hướng [...]... của gen RNR2 và thực hiện đề tài: Xây dựng vector thông báo mang gen GFP điều khiển bởi promoter RNR2 để phục vụ cho việc phát triển biosensor phát hiện các chất gây biến đổi gen Mục tiêu nghiên cứu: Tạo ra đƣợc vector thông báo có gắn gen GFP điều khiển bởi promoter RNR2 để phục vụ cho việc phát triển biosensor từ tế bào nấm men và sử dụng biosensor trong việc phát hiện và đánh giá các hợp chất gây. .. xuất hiện hợp chất gây đột biến gen (www.yeastgenome.org) Nhờ đặc tính này, mà ngƣời ta đã sử dụng tổ hợp promoter của một trong các gen kể trên kết hợp với một gen mã hóa cho protein thông báo GFP (green fluorescent protein) để tạo ra plasmid thông báo hay vector thông báo Plasmid này là một thành phần quan trọng, quyết định hoạt động của biosensor Xuất phát từ lí do trên, chúng tôi đã lựa chọn vùng promoter. .. (promoter) và yếu tố chuyển đổi tín hiệu (gen thông báo) Tùy vào đối tƣợng, tác nhân phân tích cũng nhƣ điều kiện trang thiết bị nghiên cứu, GVHD: TS Bùi Văn Ngọc 8 SVTH: Nguyễn Thị Hướng Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học ngƣời ta có thể lựa chọn các promoter và gen thông báo khác nhau để xây dựng vector thông báo 2.2.2 Xây dựng biosensor tế bào 2.2.2.1 Một số protein thông báo Protein thông. .. dụng promoter RAD54 tạo biosensor phát hiện chất gây biến đổi gen 4-NQO 4 Afanassiev (Afanassiev và cộng sự, 2000), Billinton (Billinton và cộng sự, 1998), Cahill (Cahil và cộng sự, 2004) sử dụng promoter RNR2 tạo biosensor phát hiện chất gây biến đổi gen MMS và phân tích các hợp chất khác thuộc nhóm alkyl hóa DNA nhƣ mitomycin C, N-nitrosoN-methylurea, chlorambucil Đã có những nghiên cứu sử dụng promoter. .. với các loại biosensor khác nhƣ giá thành rẻ, thao tác đơn giản, bền trong môi trƣờng trong khi vẫn đảm bảo khả năng đánh giá đƣợc các ảnh hƣởng sinh học 2.2 Biosensor tế bào 2.2.1 Cấu tạo và nguyên lí hoạt động Nhìn chung biosensor tế bào chứa yếu tố nhận biết chọn lọc là các promoter gắn trƣớc một gen báo cáo hay gen thông báo (reporter gene) để điều khiển hoạt động của gen này Sau đó, promoter và gen. .. khiển sự phiên mã của gen thông báo (ví dụ gen mã hoá GFP) dẫn đến quá trình biểu hiện protein thông báo GFP Cƣờng độ hoặc tín hiệu của protein thông báo đo đƣợc sẽ tƣơng ứng với nồng độ chất gây cảm ứng có trong môi trƣờng cần phân tích Có thể thấy trong hoạt động của biosensor tế bào, vector thông báo đóng vai trò thiết yếu Vector này chứa hai yếu tố quan trọng trong cấu tạo biosensor đó là yếu tố... chlorambucil Đã có những nghiên cứu sử dụng promoter RNR2 để tạo biosensor phát hiện chất gây biến đổi gen Tuy nhiên, biosensor đƣợc tạo ra từ các nghiên cứu này có độ nhạy chƣa cao Hơn thế nữa, các nghiên cứu này chƣa đánh giá đầy đủ tính gây độc gen của các hợp chất khảo sát Chính vì vậy, trong nƣớc ta hiện nay có công trình nghiên cứu của TS Bùi Văn Ngọc về biosensor tế bào: 1 Bui (Bui và cộng sự, 2013),... có nhiệm vụ nhận biết và liên kết chọn lọc với hợp chất cần phát hiện Tín hiệu đƣợc hình thành thông qua quá trình tƣơng tác giữa yếu tố nhận biết và hợp chất cần phát hiện Các tƣơng tác này sẽ tạo ra sự thay đổi về phổ hấp thụ, phổ phát xạ, cƣờng độ dòng điện, điện thế, điện trở… hoặc thông qua khả năng gây kích thích của hợp chất cần phát hiện đến sự hoạt động của một gen dẫn tới sự biểu hiện của... thực hiện từ tháng 5 năm 2014 đến tháng 5 năm 2015 tại phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam, số 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội 3.2 Nội dung nghiên cứu 1 Thiết kế và xây dựng plasmid thông báo  Tách dòng vùng promoter của gen RNR2  Nối vùng promoter RNR2 vào phía trƣớc gen thông báo GFP trên plasmid pUMGP5 để tạo vector thông. .. các hợp chất độc hại cho sức khỏe con ngƣời, hợp chất có khả năng gây biến đổi gen và ung thƣ khác nhƣ aflatoxin, sterigmatocystin… hoặc các hợp chất chƣa đƣợc biết đến và chƣa đƣợc xác định nhƣng có tính chất hóa học tƣơng tự MMS 2 Bui VN ( Bui và cộng sự, 2015 ), mục tiêu của nghiên cứu này là sử dụng promoter PLM2, DIN7 làm nguyên liệu để phát triển biosensor nhằm xác định và đánh giá khả năng gây