ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Phan Lạc Dũng NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS SUBSP PLANTARUM SP 1901 PHÂN LẬP TẠI RỪNG QUỐC GIA HOÀNG LIÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - Năm 2013 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Phan Lạc Dũng NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS SUBSP PLANTARUM SP 1901 PHÂN LẬP TẠI RỪNG QUỐC GIA HOÀNG LIÊN Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS TRỊNH THÀNH TRUNG Hà Nội - Năm 2013 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Trịnh Thành Trung, người dẫn dắt, bảo tạo điều kiện giúp đỡ hoàn thành luận văn cao học Tôi xin chân thành cảm ơn cán bộ, anh chị làm việc Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội giúp đỡ trình hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Bộ môn Vi sinh vật học nói riêng Khoa Sinh học nói chung dạy dỗ trình học tập Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè động viên, giúp đỡ, hỗ trợ để hoàn thành luận văn Hà Nội, tháng năm 2013 Học viên Phan Lạc Dũng MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS 1.1.1 Tổng quan Bacillus amyloliquefaciens 1.1.2 Lịch sử phát 1.1.3 Phân loại 1.1.4 Đặc điểm sinh học phân bố tự nhiên 1.2 ỨNG DỤNG CỦA BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS 1.2.1 Sản xuất enzyme công nghiệp 1.2.2 Sản xuất chất kháng sinh 1.2.3 Sản xuất phân bón vi sinh 1.2.4 Sản xuất chế phẩm probiotics 1.3 MỘT SỐ ENZYME CÔNG NGHIỆP QUAN TRỌNG 1.3.1 Xylanase 1.3.2 α-amylase 10 1.3.3 Protease 13 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 THIẾT BỊ VÀ MÁY MÓC ĐÃ SỬ DỤNG 15 2.2 NGUYÊN LIỆU 15 2.2.1 Chủng vi sinh vật 15 2.2.2 Môi trường 15 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.3.1 Nuôi cấy giống khởi động 16 2.3.2 Phân tích trình tự đa gen 16 2.3.3 Đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn nghiên cứu 18 2.3.4 Lựa chọn môi trường thời gian nuôi cấy thích hợp cho khả sinh enzyme ngoại bào cao 20 2.3.5 Phương pháp xác định protein 21 2.3.6 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme ngoại bào 21 2.3.7 Tách chiết tinh enzyme ngoại bào 25 2.3.8 Xác định đặc tính enzyme ngoại bào 27 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 LỰA CHỌN CHỦNG VI KHUẨN NGHIÊN CỨU 28 28 3.1.1 Tuyển chọn chủng 28 3.1.2 Cây phân loại dựa trình tự 16S rDNA 28 3.1.3 Cây phân loại dựa trình tự đa gen 29 3.2 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG SP 1901 30 3.2.1 Đặc điểm hình thái 30 3.2.2 Đặc điểm sinh học chủng SP 1901 31 3.3 TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH ENZYME NGOẠI BÀO 38 3.3.1 Lựa chọn môi trường thời gian nuôi cấy thích hợp 38 3.3.2 Tinh enzyme ngoại bào phương pháp sắc ký trao đổi ion 41 3.3.3 Tinh enzyme phương pháp sắc ký lọc gel 43 3.3.4 Xác định trọng lượng phân tử xylanase điện di SDS-PAGE 44 3.3.5 Hiệu tinh xylanase từ chủng SP 1901 45 3.4 ĐẶC TÍNH ENZYME 46 3.4.1 Nhiệt độ tối ưu 46 3.4.2 Khả bền nhiệt 47 3.4.3 pH tối ưu 48 3.4.4 Khả bền axít 49 3.4.5 Khả bền ion kim loại hóa chất 50 3.4.6 Sắc ký lớp mỏng 51 KẾT LUẬN 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Khả sinh trưởng chủng SP 1901 nhiệt độ khác 33 Bảng 3.2 Khả đồng hoá loại đường………………………………… 34 Bảng 3.3 Khả lên men loại đường………………………………… 35 Bảng 3.4 Khả sinh enzyme ngoại bào theo phương pháp sử dụng kit API ZYM………………………………….…………………………………… 37 Bảng 3.5 Tỷ lệ hoạt độ xylanase (U/ml) nồng độ protein (mg/ml) chủng SP 1901………………………………….……………………………… 40 Bảng 3.6 Hoạt độ xylanase sau bước tinh sạch……………………… 46 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học xylan vị trí công hệ thống enzyme xylanolytic………………………………….………………………… Hình 1.2 Cấu trúc hóa học amylose amylopectin…………………… 11 Hình 1.3 Phản ứng thủy phân liên kết peptide chuỗi polypeptide……… 13 Hình 2.1 Đồ thị đường chuẩn theo thang BSA……………………………… 21 Hình 2.2 Đồ thị đường chuẩn theo thang xylose…………………………… 22 Hình 2.3 Đồ thị đường chuẩn theo thang glucose…………………………… 23 Hình 2.4 Đồ thị đường chuẩn theo thang L-tyrosine………………………… 24 Hình 3.1 Cây phát sinh chủng loại 37 chủng vi khuẩn Bacillus phân lập rừng Quốc gia Hoàng Liên loài thuộc nhóm vi khuẩn B subtilis dựa phân tích trình tự 16S rDNA………………………………….………… 28 Hình 3.2 Cây phát sinh chủng loại loài vi khuẩn thuộc nhóm B subtilis………………………………….…………………………………… 30 Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc chủng SP 1901 (a), hình thái tế bào nhuộm gram (b) soi (c) ………………………………….…………………… 31 Hình 3.4 pH sinh trưởng tối ưu (a) Khả chịu muối NaCl (b) Khả chịu dịch dày (c) Khả chịu muối mật (d) …………………………… 31 Hình 3.5 Khả sinh chất kích thích sinh trưởng IAA chủng SP 1901 sau 24, 48 72 giờ………………………………….……………………… 32 Hình 3.6 Khả sinh IAA làm cho dung dịch chuyển từ màu vàng sang đỏ (a) Ảnh hưởng chủng SP 1901 lên khả sinh trưởng ngô sau 10 ngày trồng (b) ………………………………….………………………… 32 Hình 3.7 Vòng phân giải chất enzyme ngoại bào Amylase (a) Cellulase (b) Phytase (c) Protease (d) Xylanase (e) ……………………… 36 Hình 3.8 Phản ứng thử nghiệm khả sinh enzyme thử API ZYM………………………………….……………………………………… 37 Hình 3.9 Khả sinh kháng sinh chủng SP 1901 theo phương pháp khuếch tán thạch Đĩa thạch cấy sẵn vi khuẩn E coli (a) Vi khuẩn Shigella sp (b) Vi khuẩn S aureus (c) ……………………………………… 38 Hình 3.10 Khả sinh trưởng môi trường khác (a, b) hoạt độ xylanase ngoại bào (c, d) chủng SP 1901 nuôi cấy 10 loại môi trường khác nhau………………………………….……………… 39 Hình 3.11 Hoạt độ xylanase (U/ml) nồng độ protein (mg/ml) nuôi cấy môi trường có bổ sung CMC glucose môi trường NA dịch thể khác nhau………………………………….………………………… 39 Hình 3.12 Hoạt tính amylase protease chủng SP 1901 môi trường có bổ sung CMC glucose môi trường NA dịch thể…………………… 40 Hình 3.13 Hoạt độ xylanase nồng độ protein phân đoạn sắc ký trao đổi ion gel CM Sepharose………………………………….…………… 41 Hình 3.14 Hoạt độ amylase nồng độ protein phân đoạn sắc ký trao đổi ion gel DEAE Sepharose………………………………….………… 42 Hình 3.15 Hoạt độ protease nồng độ protein phân đoạn sắc ký trao đổi ion gel CM Sepharose………………………………….…………… 42 Hình 3.16 Hoạt độ xylanase phân đoạn sắc ký lọc gel………… 43 Hình 3.17 Hoạt độ amylase phân đoạn sắc ký lọc gel………… 44 Hình 3.18 Hoạt độ protease phân đoạn sắc ký lọc gel………… 44 Hình 3.19 Điện di SDS-PAGE mẫu xyl 29 xyl 36…………………… 45 Hình 3.20 Nhiệt độ hoạt động tối ưu xyl 29, xyl 36, amylase protease từ chủng SP 1901…………………………………………………………… 46 Hình 3.21 Khả bền nhiệt xyl 29, xyl 36, amylase protease từ chủng SP 1901……………………………………………………………… 47 Hình 3.22 pH hoạt động tối ưu xyl 29, xyl 36, amylase protease từ chủng SP 1901……………………………………………………………… 48 Hình 3.23 Khả bền axít xyl 29, xyl 36, amylase protease từ chủng SP 1901……………………………………………………………… 49 Hình 3.24 Khả bền ion kim loại hóa chất xyl 29, xyl 36, amylase protease từ chủng SP 1901………………………………………………… 50 Hình 3.25 Bản chạy sắc ký lớp mỏng để phân tích sản phẩm thủy phân từ chất xylan xylanase chủng SP 1901…………………………………… 52 CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT BSA Bovine serum albumin CMC Carboxymethyl cellulose DNA Deoxyribonucleic axít DNS Dinitrosalicylic IAA Indole-3-acetic axít PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis PCR Polymerase chain reaction RNA Ribonucleic axít SDS Sodium dodecyl sulfate ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, việc ứng dụng vi sinh vật vào đời sống sản xuất trở nên phổ biến Con người khai thác triệt để nguồn tài nguyên vi sinh vật nhiều lĩnh vực khác Trong y học, nhờ có vi sinh vật mà người tổng hợp thành công nhiều loại chế phẩm vacxin, kháng sinh, hormone, vitamin giúp phòng ngừa điều trị nhiều loại bệnh cho người Trong nông nghiệp, nhiều chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ vi sinh vật sản xuất để diệt trừ sâu bệnh hại làm phân bón vi sinh Trong công nghiệp thực phẩm, người ứng dụng vi sinh vật để sản xuất loại protein, enzyme, chế phẩm probiotic loại thực phẩm lên men truyền thống Ngoài ra, vi sinh vật ứng dụng vào xử lý rác thải hữu nước thải sản xuất công nghiệp Với khả chuyển hóa mạnh mẽ sinh sản nhanh chóng, vi sinh vật đóng vai trò to lớn hệ sinh thái tự nhiên hoạt động cải thiện chất lượng sống người Bacillus vi sinh vật phát mô tả giai đoạn đầu tiến trình phát triển ngành vi sinh vật học cuối kỷ 19 Đây chi lớn với gần 200 loài vi khuẩn hiếu khí, hình que có khả sinh nội bào tử Chúng phân bố rộng rãi hệ sinh thái tự nhiên, từ cạn đến nước, từ nước đến nước mặn từ ven bờ đến đáy Đại Dương Ngoài loài vi khuẩn gây bệnh cho người B anthracis B cereus, nhiều loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus đặc biệt nhóm B subtilis có tính ứng dụng cao nhiều lĩnh vực y dược học, nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm xử lý môi trường Do đó, loài thuộc chi Bacillus ngày trở thành vi sinh vật quan trọng hàng đầu mặt ứng dụng Nhằm góp phần tìm hiểu thêm kiến thức chi Bacillus nói chung ứng dụng loài thuộc nhóm B subtilis nói riêng, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đặc tính sinh học tiềm ứng dụng chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum SP 1901 phân lập rừng Quốc gia Hoàng Liên” với mục tiêu sau: (i) Tuyển chọn chủng vi khuẩn thuộc nhóm B subtilis phân lập rừng Quốc gia Hoàng Liên (ii) Sử dụng kỹ thuật phân tích trình tự đa gen để phân loại xác chủng vi khuẩn nghiên cứu đến cấp độ loài loài KẾT LUẬN Từ giống vi khuẩn phân lập rừng Quốc gia Hoàng Liên, chủng SP 1901 thuộc nhóm B subtilis Chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum Chủng SP 1901 sinh trưởng tốt pH 7, 40 oC, đồng hóa 19/49 lên men 24/49 loại đường, sinh amylase, cellulase, xylanase, lipase, protease, phytase 6/20 loại enzyme thử API ZYM, sinh chất kháng khuẩn IAA, môi trường có 1,0-3,0% NaCl, môi trường muối mật có 0,1% Ox-bile tồn sau bị xử lý dịch dày nhân tạo Chủng sinh loại xylanase (40 kDa 15 kDa), loại amylase loại protease Nhiệt độ hoạt động thích hợp loại xylanase 55 oC, amylase 60oC protease 55oC loại xylanase chịu nhiệt tốt 60 oC Cả loại xylanase có pH tối ưu pH 5, amylase pH protease pH loại xylanase amylase bền acid Ion Ca 2+ tăng cường mạnh hoạt động loại xylanase amylase, ion Cu 2+ ức chế mạnh hoạt động loại xylanase, ion Zn2+ Cu2+ ức chế mạnh hoạt động amylase ßmercapto tăng cường ion Fe3+ ức chế mạnh hoạt động protease TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Hoàng Kim Anh (2007), Hóa Học Thực Phẩm, NXB Khoa học - Kỹ thuật Bùi Ái (2008), Công nghệ lên men ứng dụng công nghiệp thực phẩm, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Vũ Ngọc Bội (2005), Nghiên cứu ứng dụng protease từ Bacillus subtilis sản xuất bột đạm thủy phân từ cá mối, Đại học Thủy sản Nha Trang Tô Minh Châu, Vương Thị Việt Hoa, Vũ Thị Lâm An, Lâm Thanh Hiền, Nguyễn Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thúy Hương (2000), Vi Sinh Vật học đại cương, Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến(1998), Công nghệ enzyme, NXB Nông nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh PGS.TS Nguyễn Thùy Châu cộng sự (2006), “Nghiên cứu áp dụng công nghệ vi sinh hiện đại để sản xuất axít amin enzyme từ nguồn thứ phẩm nông nghiệp hải sản ở quy mô bán công nghiệp”, Báo cáo tổng kết đề tài Khoa học - Công nghệ cấp Nhà nước, Viện Nông nghiệp Công nghệ sau thu hoạch, Hà Nội Trương Thị Hòa (1994), Nghiên cứu ứng dụng protease sản xuất bia, viện Công nghệ Thực phẩm Lê Thị Loan (2002), Một số đặc tính sinh hóa, miễn dịch sinh học phân tử chủng Bacillus Du NT sản xuất sinh phẩm, Viện Vacxin sở Đà Lạt Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Quyền Đình Thi (2009), “Nhân dòng phân tích trình tự gen mã hóa xylanase từ A niger DSM195”, Báo cáo Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, NXB Đại học Thái Nguyên, 6, tr 701704 10 Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm (2004), Công nghệ Enzyme, NXB Khoa học Kỹ thuật 11 Vũ Thị Thứ (1996), Nghiên cứu đặc điểm sinh học khả ứng dụng của số chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus, Luận án tiến sỹ Khoa học Sinh học, Hà Nội 12 Trịnh Thành Trung, Nguyễn Thị Thu Thủy, Nguyễn Mạnh Hùng, Đào Thị Lương Dương Văn Hợp (2011), “so sánh đa dạng vi khuẩn hiếu khí sinh nội bào tử rừng Quốc gia Hoàng Liên vùng đất canh tác nông nghiệp lân cận”, Hội nghị Khoa học toàn Quốc Sinh thái Tài nguyên Vi sinh vật, 4, pp 996-1003 13 Ngô Văn Thu (2011), Bài Giảng Dược Liệu, 1, Đại học Dược Hà Nội 14 Nguyễn Đình Thương (2005), Công nghệ sản xuất kiểm tra cồn ethylen, NXB Khoa học Kỹ thuật 15 Nguyễn Thị Thảo, Quyền Đình Thi (2006), “Ảnh hưởng yếu tố môi trường lên trình sinh trưởng sinh tổng hợp Protease chủng Serratia sp DT3”, Tạp chí Sinh học, 2, NXB Khoa học Tự nhiên Công nghê Tiếng Anh 16 17 18 Alvarez F, Castro M, Principe A, Borioli G, Fischer S, Mori G & Jofre E (2012), “The plant-associated Bacillus amyloliquefaciens strains MEP2 18 and ARP2 capable of producing the cyclic lipopeptides iturin or surfactin and fengycin are effective in biocontrol of sclerotinia stem rot disease”, Journal of Applied Microbiology, 112, pp 159-174 Arguelles Arias A, Ongena M, Halimi B, Lara Y, Brans A, Joris B & Fickers P (2009), “Bacillus amyloliquefaciens GA1 as a source of potent antibiotics and other secondary metabolites for biocontrol of plant pathogens”, Microbial Cell Factories, 8, pp 63 Aris Tri Wahyudi et al (2011), “Characterization of Bacillus sp strains isolated from zhizosphere of soybean plants for their use as potentoal plant growth for promoting Rhizobacteria”, Jounal of Microbiology and Antimicrobials, 3, pp 34-40 19 Bailey, M.J., Biely, P., and Poutanen, K (1992), “Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity”, Journal of Biotechnology, 23, pp 257-270 20 Barredo JL (2005), “Microbial enzymes and biotransformations”, Humana Press Inc., pp 151-180 21 Benitez LB, Velho RV, de Souza da Motta A, Segalin J & Brandelli A (2012), “Antimicrobial factor from Bacillus amyloliquefaciens inhibits Paenibacillus larvae, the causative agent of American foulbrood”, 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Archives of Microbiology, 194, pp 177-185 Borriss R, Chen XH, Rueckert C, et al (2011), “Relationship of Bacillus amyloliquefaciens clades associated with strains DSM 7T and FZB42T: a proposal for Bacillus amyloliquefaciens subsp amyloliquefaciens subsp nov and Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum subsp nov based on complete genome sequence comparisons”, International Journal Systematic Evolutionary Microbiology, 61, pp 1786-1801 Buchanan, J.R and N.E Gibbons (1974), “Bergey’s manual of determinative bacteriology”, The Williams and Wilkins Company, 8, Baltimore Chun J & Bae KS (2000), “Phylogenetic analysis of Bacillus subtilis and related taxa based on partial gyrA gene sequences”, Antonie Van Leeuwenhoek, 78, pp 123-127 Cao H, He S, Wei R, Diong M & Lu L (2011) “Bacillus amyloliquefaciens G1: A potential antagonistic bacterium against eelPathogenic aeromonas hydrophila”, Evid Based Complementary Alternative Medicine Degefu Y (2003), Cloning and characterization of xylanase gene from phytopathogenetic fungi with a special reference to Helminthosporium turcicum, the cause of the northern leaf blight of maize, University of Helsinki, Poland Fan B, Borriss R, Bleiss W & Wu X (2012), “Gram-positive rhizobacterium Bacillus amyloliquefaciens FZB42 colonizes three types of plants in different patterns”, Journal of Microbiology, 50, pp 38-44 Fu S, Sun J, Qian L & Li Z (2008), “Bacillus phytases: present scenario and future perspectives”, Applied Biochemistry and Biotechnology, 151, pp 1-8 Gutierrez C K et al (2009), “Production of the phytohormone Indole-3acetic axít by estuarine species of the genus vibrio”, Applied and Environmental Microbiology, pp 2253-2258 Idris E E et al (2007), “Tryptophan-dependent production of indole-3acetic axít (IAA) affects level of plant growth promotion by Bacillus amyloliquefaciens FZB42”, Molecular Plant-Microbe Interactions, 20, pp 619-626 31 Jamaly et al (2011), British Micobiology Research Journal, 1, 4, pp 7994 32 Jorquera et al (2010), “identification of β-propeller phytase-encoding genes in culturable Paenibacillus and Bacillus spp from the zhizosphere of pasture plants on volcanic soils”, Federation of European Microbiological societies, 75, pp 163-172 Julio P., Andrew P M (2007), Industrial enzymes: structure, function and applications , University of Helsinki, Poland 33 34 Ken K Y W., Larry U L T, and John N.S (1988), “Multiplicity of β1,4-xylanase in microorganisms: Functions and application”, Microbiological reviews, pp 305-317 35 Kurtzman, C P., and C J Robnett (1997), “Identification of clinically important ascomycetous yeasts based on nucleotide divergence in the 5′ end of the large-subunit (26S) ribosomal DNA gene”, Journal of Clinical Microbiology, 35, pp 1216-1223 Lazim et al (2009), Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 36, pp 531-537 36 37 38 Lee H & Kim HY (2011), “Lantibiotics, class I bacteriocins from the genus Bacillus”, Journal of Microbiology and Biotechnology, 21, pp 229-235 Lee Y E., Pyung O L (2004), “Purification and characterization of two thermostable xylanases from Paenibacillus sp DG-22”, Journal of Microbiology and Biotechnology, 14, 5, pp 1014 – 1021 39 Miller G.L (1959), “Use of dinitrosalicylic axít reagent for determination of reducing sugar”, Analytical Chemistry, 31, 3, pp 426428 40 Mishra S and Behara N., (2008), “Amylase activity of a starch degrading bacteria isolated from soil receiving kitchen wastes”, African Journal of Biotechnology Vol 7, 18, pp 3326-3331 41 Nakamura LK, Roberts MS & Cohan FM (1999), “Relationship of Bacillus subtilis clades associated with strains 168 and W23: a proposal for Bacillus subtilis subsp subtilis subsp nov and Bacillus subtilis subsp spizizenii subsp nov.”, International Journal of Systematic 42 43 44 45 46 47 Bacteriology, 49 (3), pp 1211-1215 Priest FG, Goodfellow M, Shute LA & Berkeley RCW (1987), “Bacillus amyloliquefaciens sp nov norn rev.” International Journal of Systematic Bacteriology, 37, pp 69-71 Richard R.B., Murray P.D., (2009) Methods in enzymology, guide to protein purification, London NW1 7BY, UK Rooney AP, Price NP, Ehrhardt C, Swezey JL & Bannan JD (2009), “Phylogeny and molecular taxonomy of the Bacillus subtilis species complex and description of Bacillus subtilis subsp inaquosorum subsp nov.” International Journal of Systematic Bacteriology, 59, pp 24292436 Sakiyama, Y., Nguyen, K N T., Nguyen, M G., Miyadoh, S., Duong, V H & Ando, K (2009), “Kineosporia babensis sp nov., isolated from plant litter in Vietnam”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 59, pp 550-554 Sansinenea E & Ortiz A (2011), “Secondary metabolites of soil Bacillus spp.”, Biotechnol Lett, 33, pp 1523-1538 Sanders ME (2008), “Probiotics: definition, sources, selection, and uses”, Clinical Infectious Diseases, 46, Suppl 2, S58-61, discussion S144-151 48 Saxelin M (2008), “Probiotic formulations and applications, the current probiotics market, and changes in the marketplace: a European perspective”, Clinical Infectious Diseases, 46, Suppl 2, S76-79, discussion S144-151 49 Sapre M.P., Jha H and Patil M.B (2005), “Purification and characterization of a thermoalkalophilic xylanase from Bacillus sp.”, World Journal of Microbiology & Biotechnology, 21, pp 649 - 654 50 Sharmin S., Hossain M T and Anwar M N.,(2005), "Isolation and characterization of a protease producing bacteria Bacillus amovivorus and optimization of some factor of culture conditions for protease production", Journal of biological sciences 5, 3, pp 358-362 51 Subramaniyan (2012), “Isolation, purification and characterisation of low molecular weight xylanase from Bacillus pumilus SSP-34”, Applied Biochemistry and Biotechnology, 166, pp 1831-1842 52 53 Sutyak KE, Wirawan RE, Aroutcheva AA & Chikindas ML (2008), “Isolation of the Bacillus subtilis antimicrobial peptide subtilosin from the dairy product-derived Bacillus amyloliquefaciens”, Journal of Applied Microbiology, 104, pp 1067-1074 Tseng MJ et al (2004), “Cloning and characterization of two thermostable xylanases from an alkaliphilic Bacillus firmus”, Biochemistry and Biophysical Research Communications, 319, 3, pp 1017-1025 54 Ufuk B., Sebnem Y., Ferda G., Aysegul E (2001), “An endo-1,4xylanase from Rhizopus oryzae: production, partial purification and biochemical characterization”, Journal of Applied Sciences Research, 6, 9, pp 1373-1378 55 Yao AV, Bochow H, Karimov S, Boturov U, Sanginboy S & Sharipov K (2006), “Effect of FZB42 Bacillus subtilis as a biofertilizer on cotton yields in field tests”, Archives of Phytopathology and Plant Protection, 39, pp 323–328 Yin et al., Agric J (2010), Food Chemistry, Institute of Food Technologists, 58, pp 557–562 56 PHỤ LỤC A HÓA CHẤT DÙNG TRONG CÁC THÍ NGHIỆM Thuốc thử DNS Dinitrosalicylic axít - 1%; phenol - 0,2%; sodium sulfite - 0,05%; sodium hydroxide - 1%; sodium tartrate - 20% Casein 2% Casein pha NaOH 0,2 M, sau dùng HCl 1M để đưa pH thêm H2O để nồng độ casein 2% Copper sulfate reagent 100 mg CuSO4 5H2O + 200 mg C4H4NaKO6 + 10 g Na2CO3 + 100 ml H2O Hỗn hợp WS1 WS1 = 100 ml Copper sulfate reagent + 100 ml SDS 5% + 200 ml NaOH 3,2% Hỗn hợp WS2 WS2 = 10 ml Folin-Ciocalteu’s Phenol reagent + 40 ml H2O Đệm chạy sắc ký trao đổi ion gel CM Sepharose Đệm acetate 50 mM pH 5,78 Đệm chạy sắc ký trao đổi ion gel DEAE Sepharose Đệm Tris-HCl 0,02 M pH Thành phần gel chạy điện di SDS-PAGE • Resolving gel: 3,35 ml H2O + 2,5 ml Tris-HCl 1,5M pH 8,8 + 0,1 ml SDS 10% + ml acrylamide + 50 µl ammonium persulfate 10% + 5µl TEMED • Stacking gel: 3,05 ml H2O + 1,25 ml Tris-HCl 0,5 M pH 6,8 + 0,65 ml acrylamide + 50 µl SDS 10% + 25 µl APS 10% + µl TEMED Stock sample buffer 4,8 ml H2O + 1,2 ml Tris-HCl 0,5 M pH 6,8 + ml SDS 10% + ml glycerol + 0,5 ml bromophenol 0,5% SDS reducing buffer 950 µl Stock sample buffer + 50 µl 2-mercaptoethanol Dung dịch Coomassie Brilliant Blue R-250 0,5 g Coomassie Brilliant Blue R-250 + 200 ml methanol + 50 ml acetic axít + 250 ml H2O Dung môi chạy sắc ký lớp mỏng n-butanol : H2O : pyridine : toluene = 10 : : : Dung dịch nhuộm sắc ký lớp mỏng ml n-butanol + ml H2O + 0,325 g phthalic axít + 0,2 ml aniline Dung dịch Salkowski R1 FeCl3-12; H2SO4-429 (g ml/l) B CÁC LOẠI MỒI DÙNG TRONG LUẬN VĂN Cặp mồi dùng phản ứng khuếch đại đoạn 16S rDNA 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 1525R: 5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3' Các mồi dùng phản ứng cho đọc trình tự đoạn 16S rDNA 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 1525R: 5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3' 780F: 5'-GAATTGATACCCTGGTAG-3 350R: 5'-CTGCTGCCTCCCGTAG-3' 1100F: 5'-GCAACGAGCGCAACCC-3' 920R: 5'-GTCAATTCCTTTGAGTTT-3' Các mồi dùng phương pháp phân tích trình tự đa gen gyrA - 42F: 5'-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3' gyrA - 1066R: 5'-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3' rpoB - 2292F: 5'-GACGTGGGATGGCTACAACT-3' rpoB - 3354R: 5'-ATTGTCGCCTTTAACGATGG-3' purH - 70F: 5'-ACAGAGCTTGGCGTTGAAGT-3' purH - 1013R: 5'-GCTTCTTGGCTGAATGAAGG-3' polC - 1505F: 5'-TTGTCGCTCAYAATGCAAGC-3' polC - 2337R: 5'-YTCAAGCATTTCRTCTGTCG-3' groEL - 550F: 5'-GAGCTTGAAGTKGTTGAAGG-3' groEL - 1497R: 5'-TGAGCGTGTWACTTTTGTWG-3' C DANH SÁCH BẢNG Bảng Các enzyme ngoại bào, môi trường khuếch tán thuốc thử tương ứng Enzyme Môi trường Thuốc thử Amylase NA + 0,1% tinh bột tan Lugo CMCase NA + 0,1% CMC Lugo Xylanase NA + 0,1% xylan Đỏ Congo Lipase NA + 0,1% tributyrin Không cần thuốc thử Protease NA + 0,1% casein Axít acetic 2% Phytase NA + 0,1% natri phytate Jorquera cộng (2010) Bảng Các loại môi trường dùng nghiên cứu Stt Loại môi trường Môi trường khoáng + 0.5% D-glucose + 0.5% chất tinh bột tan Môi trường khoáng + 0.5% D-glucose + 0.5% chất casein Môi trường khoáng + 0.5% D-glucose + 0.5% chất CMC Môi trường khoáng + 0.5% D-glucose + 0.5% chất xylan Môi trường khoáng + 0.5% D-glucose + 0.5% chất chitin Môi trường khoáng + 0.5% D-glucose + 0.5% chất tributyrin Môi trường khoáng + 0.5% D-glucose + 0.5% chất pectin Môi trường khoáng + 0.5% D-glucose + 0.5% chất tổng hợp Môi trường NA dịch thể 10 Môi trường khoáng + 1% D-glucose Bảng Nồng độ bão hòa ammonim sulfate [44] Bảng Các loại đệm dùng thí nghiệm xác định đặc tính enzyme Đệm citrate phosphate Dung dịch A: Citrate axít 0,1 M Dung dịch B: Sodium phosphate 0,2 M A (ml) B (ml) Nước (ml) pH 3,98 1,02 3,07 1,93 2,43 2,57 5 1,79 3,21 0,65 4,36 Đệm Tris-HCl Dung dịch C: Tris-HCl 0,2 M Dung dịch D: HCl 0,2 M C (ml) D (ml) Nước (ml) pH 2,5 1,34 6,16 2,5 0,25 7,25 Bảng Các ion kim loại hóa chất dùng thí nghiệm xác định đặc tính enzyme Stt Ion kim loại Hóa chất KLPT mg/10 ml (200 mM) Na+ NaCl 58,5 117 K+ KCl 74,5 149 Mg2+ MgCl2 95 190 Mn2+ MnSO4.H2O 169 338 Ca2+ CaCl2 111 222 Cu2+ CuSO4 160 320 Fe2+ FeSO4.7H2O 278 556 Fe3+ FeCl3.6H2O 270 540 Zn2+ ZnSO4.7H2O 287,5 575 10 EDTA 292 584 11 SDS 288 576 12 ß-mecaptoethanol 78 156 [...]...(iii) Tìm hiểu các đặc tính sinh học quý của chủng vi khuẩn được lựa chọn (iv) Tách chiết, tinh sạch và đánh giá sơ bộ đặc tính các enzyme ngoại của chủng vi khuẩn nghiên cứu CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS 1 Tổng quan về Bacillus amyloliquefaciens Bacillus amyloliquefaciens là một loài vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus subtilis [45] B subtilis được... phương pháp phân tích trình tự đa gen và xây dựng cây phát sinh chủng loại, nhiều loài trong nhóm này đã được phân tách thành các loài phụ như B subtilis được phân thành B subtilis subsp subtilis, B subtilis subsp spizizenii và B subtilis subsp inaquosorum; B amyloliquefaciens được phân thành B amyloliquefaciens subsp amyloliquefaciens và B amyloliquefaciens subsp plantarum [42] Phân loại các loài trong... xylanolytic Tất cả các enzyme trong hệ thống này tác động tương hỗ với nhau để phân giải xylan thành các phân tử đường [34] 1.3.1.2 Nguồn sản sinh xylanase Xylanase được sinh tổng hợp bởi nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn và động vật nguyên sinh Trong các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp xylanase, nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn là các nhóm quan trọng nhất [57] Các loại xylanase được sinh ra bởi vi khuẩn và nấm sợi... Cây phát sinh được xây dựng theo Kimura (1980) sử dụng phương pháp của Saitou và Nei (1987) 5 Đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn nghiên cứu 2.3.3.1 Nhiệt độ sinh trưởng thích hợp Chủng vi khuẩn được cấy zíc zắc vào các ống nghiệm có chứa môi trường NA thạch nghiêng, sau đó đặt các ống nghiệm này vào các máy ổn nhiệt ở dải nhiệt độ từ 15-70oC Quan sát khả năng mọc sau 24 và 48 giờ 2.3.3.2 pH sinh trưởng... Bacillus amyloliquefaciens Đặc điểm sinh học và phân bố trong tự nhiên B amyloliquefaciens thường có mặt trong các mẫu đất tự nhiên Đây là loài vi khuẩn hiếu khí, hình que, Gram dương, sinh nội bào tử, có khả năng di động và kích thước tế bào 3,0-4,0 × 0,7-1,5 µm Đặc biệt, có một số chủng vi khuẩn B amyloliquefaciens có khả năng sống nội cộng sinh rễ cây thực vật [23] 2 ỨNG DỤNG CỦA BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS. .. dạng khuẩn lạc, hình thái tế bào và bào tử cũng như các đặc điểm sinh hóa không có khả năng phân tách các loài này Vì vậy, 9 loài vi khuẩn trên thường được gọi theo một thuật ngữ chung là nhóm vi khuẩn B subtilis [45] Gần đây, bên cạnh vi c phân tích trình tự gen 16S rRNA các nhà khoa học đã sử dụng phương pháp phân tích trình tự đa gen trong vi c phân loại vi khuẩn đến cấp độ loài và dưới loài [25] Đặc. .. enzyme từ vi sinh vật đang dần thay thế enzyme từ động vật và thực vật bởi: tốc độ sinh sản của vi sinh vật nhanh, enzyme được tách chiết từ vi sinh vật có hoạt tính cao và vi sinh vật là giới sinh vật phù hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp Các đối tượng vi sinh vật thường được dùng để tách chiết protease là nấm mốc, vi khuẩn và xạ khuẩn 1.3.3.2 Phân loại protease Protease được xếp vào nhóm enzyme... trọng lượng tươi của bèo tấm khi thu hoạch có sự gia tăng đáng kể so với đối chứng Loài vi khuẩn B amyloliquefaciens đã được chứng minh có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất phân bón vi sinh nhờ khả năng sinh các chất kháng nấm và chất kích thích sinh trưởng thực vật [31] 8 Sản xuất chế phẩm probiotics B amyloliquefaciens là những vi sinh vật an toàn (Generally recognized as safe; GRAS) và có thể dùng... da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo nhất định Ngoài ra, protease còn được phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp enzyme được bổ sung vào thức ăn gia súc làm tăng khả năng tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trong chăn nuôi gia súc và gia cầm CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 THIẾT BỊ VÀ MÁY MÓC ĐÃ SỬ DỤNG Các thiết bị và máy móc của bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật, Vi n Vi Sinh. .. nhóm các enzyme có khả năng phân giải các liên kết peptide trong phân tử protein tạo thành các đơn vị nhỏ như các đoạn peptide hay các phân tử amino axít [5] Hình 1.3 Phản ứng thủy phân liên kết peptide của chuỗi polypeptide [34] 1.3.3.1 Nguồn sản sinh protease Protease được sản xuất chủ yếu từ 3 nguồn chính là động vật, thực vật và vi sinh vật Trong đó, nguồn enzyme từ vi sinh vật là phong phú nhất và