Luận văn Thạc sĩ Thái Bùi Minh MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH VẼ MỞ ĐẦU ………………………………………………………………… Chương - TỔNG QUAN ……………………………………………… 1.1 Giới thiệu chung sulfamit (SAs), metronidazole (MTD)……… 1.1.1 Cấu trúc phân tử ………………………………………………… 1.1.2 Tính chất vật lý hoá học Sulfamit, Metronidazole ………… 1.1.3 Tính chất dược lý phổ tác dụng Sulfamit, Metronidazole 1.1.4 Cơ chế tác dụng kháng khuẩn Sulfamit, Metronidazole 1.1.5 Một số chế phẩm Sulfamit tiêu biểu ……… ……………… 1.2 Phương pháp xác định……………………………………………… 1.2.1 Một số công trình nghiên cứu xác định Sas phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) …………………………………………… 1.2.2 Một số công trình nghiên cứu xác định Metronidazole phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) …………………………………… 1.2.3 Một số công trình nghiên cứu xác định đồng thời sulfamit metronidazole phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC ……… Chương - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …… 2.1 Đối tượng, mục tiêu nhiệm vụ nghiên cứu………………… 2.1.1 Đối tượng mục tiêu nghiên cứu ………………………………… 2.1.2 Nhiệm vụ nghiên cứu …………………………………………… 2.2 Phương pháp nghiên cứu………………………………………… 2.2.1 Nguyên tắc chung trang bị phương pháp HPLC …… 2.2.2 Phân tích định lượng HPLC ………………………… 2.3 2.4 Giới thiệu chung phương pháp chiết pha rắn ….………… Hóa chất dụng cụ…………………………………………… 2.4.1 2.4.2 Hoá chất ………………………………………………… Dụng cụ ……………………………………………………… Chương - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ……………………………… Luận văn Thạc sĩ Thái Bùi Minh 3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký ……………………………………… 3.1.1 Chọn bước sóng detector …………………………………… 3.1.2 Thăm dò khả tách Sulfamit cột RP-C18 ……… 3.2 Chọn pha tĩnh …………………………………………………… 3.3 Tối ưu hóa pha động ………………………………………………… 3.3.1 Nồng độ đệm axetat pha động ……………………………… 3.3.2 Độ pH cho dung dịch đệm axetat ………………………………… 3.3.3 Tỉ lệ thành phần pha động ……………………………………… 3.3.4 Tốc độ pha động 3.4 Đánh giá phương pháp phân tích ………………………………… 3.4.1 Khảo sát lập đường chuẩn khoảng nồng độ 0,05 – 1,000ppm 3.4.2 Giới hạn phát (LOD); Giới hạn định lượng (LOQ) 3.4.3 Độ đúng, độ lặp lại phép đo ………………………………… 3.5 Mẫu thực, quy trình xử lý kết phân tích ………………… 3.5.1 Quy trình xử lý mẫu, xác định hiệu suất thu hồi ………………… 3.5.2 Phân tích mẫu thực ……………………………………………………… KẾT LUẬN ……………………………………………………………… TÀI LIỆU THAM KHẢO Luận văn Thạc sĩ Thái Bùi Minh DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT STT Viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ACN Acetonitrin Axetonitrin Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn BNNPTNT CV Coeficient Variation Hệ số biến thiên HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao RP Reversed phase Hấp phụ pha đảo LOD Limit of Detection Giới hạn phát LOQ Limit of Quantity Giới hạn định lượng TT UV - Vis Thông tư Untraviolet - Visibet Tử ngoại – Khả kiến Luận văn Thạc sĩ Thái Bùi Minh DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3.1: Diện tích pic phụ thuộc vào bước sóng detector………………… 25 Bảng 3.2: Thời gian lưu thứ tự pic chất phân tích……………… 27 Bảng 3.3: Sự phụ thuộc k’ vào nồng độ đệm axetat pha động…………… 29 Bảng 3.4: Hệ số dung tích giá trị pH khác nhau………………………… 31 Bảng 3.5: Hệ số dung tích phụ thuộc vào %ACN pha động…………… 33-34 Bảng 3.6: Diện tích pic chất phân tích phụ thuộc vào tốc độ pha động 36 Bảng 3.7: Diện tích pic sắc ký phụ thuộc vào nồng độ chất phân tích……… 38-39 Bảng 3.8: Bảng giá trị Ftính chất phân tích 42 Bảng 3.9: LOD, LOQ tính theo phương trình hồi quy 43 Bảng 3.10: Khảo sát độ đúng, độ lặp lại phương pháp phân tích (nồng độ 0,08ppm) 45 Bảng 3.11: Khảo sát độ đúng, độ lặp lại phương pháp phân tích (nồng độ 0,4ppm) 46 Bảng 3.12: Khảo sát độ đúng, độ lặp lại phương pháp phân tích (nồng độ 0,8ppm) 47-48 Bảng 3.13: Chiều cao píc sắc ký mẫu tôm nồng độ thêm chuẩn khác 50 Bảng 3.14: Kết xác định hiệu suất thu hồi chất phân tích……………… 51 Bảng 3.15: Kết phân tích chất mẫu tôm rảo…………………… 52 Bảng 3.16: Hàm lượng chất phân tích mẫu tôm rảo………………… 53 Bảng 3.17: Kết phân tích chất mẫu tôm chân trắng…………… 54 Bảng 3.18: Hàm lượng chất phân tích mẫu tôm chân trắng……………… 54 Bảng 3.19: Kết phân tích chất mẫu tôm sú…………………… 55 Bảng 3.20: Hàm lượng chất phân tích mẫu tôm sú…………………… 55 Bảng 3.21: Kết phân tích chất mẫu tôm lớt…………………… 56 Bảng 3.22: Hàm lượng chất phân tích mẫu tôm lớt……………………… 57 Luận văn Thạc sĩ Thái Bùi Minh DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1: Sơ đồ chuyển hoá axít folic thành nucle protein………………… Hình 2.1: Sơ đồ khối hệ thống HPLC đầy đủ……………………………… 19 Hình 3.1: Phổ hấp thụ vùng tử ngoại khả kiến Sas…………… 23-24 Hình 3.2: Diện tích pic phụ thuộc vào bước sóng detector……………… 25 Hình 3.3: Thời gian lưu sulfamit…………………………………… 26-27 Hình 3.4: Sự phụ thuộc k’ vào nồng độ đệm axetat pha động…… 29 Luận văn Thạc sĩ Thái Bùi Minh Hình 3.5: Píc sắc ký giá trị nồng độ đệm khác 29-30 Hình 3.6: Sự phụ thuộc K’ vào pH pha động 31 Hình 3.7: Sắc đồ sắc ký pH khác 32 Hình 3.8: Sự phụ thuộc k’ vào tỉ lệ % ACN pha động 34 Hình 3.9: Sắc đồ píc sắc ký tỉ lệ thành phần pha động khác 34-35 Hình 3.10: Sự phụ thuộc diện tích píc sắc ký vào tốc độ pha động 36 Hình 3.11: Sắc đồ tốc độ khác pha động 37 Hình 3.12: Đường chuẩn chất phân tích khoảng nồng độ 0,05-1,00ppm… 39-40 Hình 3.13: Sắc đồ chất phân tích nồng độ khác bước sóng 270nm… 40 Hình 3.14: Sắc đồ chất phân tích nồng độ khác bước sóng 320nm… 41 Hình 3.15: Sắc đồ chất phân tích với nồng độ 0,01ppm………………… 43 Hình 3.16: Sắc đồ chất phân tích sau lần bơm mẫu nồng độ 0,08ppm … 45 Hình 3.17: Sắc đồ chất phân tích sau lần bơm mẫu nồng độ 0,4ppm …… 47 Hình 3.18: Sắc đồ chất phân tích sau lần bơm mẫu nồng độ 0,8ppm …… 48 Hình 3.19: Sơ đồ xử lý mẫu Tôm 49 Hình 3.20: Sắc đồ hiệu suất thu hồi theo quy trình xử lý mẫu tôm 50 Hình 3.21: Đường chuẩn SGU mẫu tôm rảo phân tích thêm chuẩn… 53 Hình 3.22: Sắc đồ pic sắc ký thêm chuẩn SGU mẫu tôm rảo……… 53 Hình 3.23: Đường chuẩn SGU mẫu tôm chân trắng phân tích thêm chuẩn 54 Hình 3.24: Sắc đồ pic sắc ký thêm chuẩn SGU mẫu tôm chân trắng 54 Hình 3.25: Đường chuẩn SGU, SMP mẫu tôm sú phân tích thêm chuẩn 55 Hình 3.26: Sắc đồ pic sắc ký thêm chuẩn SGU, SMP tôm sú……… 56 Hình 3.27: Đường chuẩn SGU mẫu tôm lớt phân tích thêm chuẩn… 57 Hình 3.28: Sắc đồ pic sắc ký thêm chuẩn SGU tôm lớt…………… 57 Luận văn Thạc sĩ Thái Bùi Minh MỞ ĐẦU Dư lượng kháng sinh thực phẩm vấn đề quan ngại hầu hết quan kiểm soát thực phẩm giới Một số loại kháng sinh thông thường (chloramphenicol, malachite green, metronidazole…) thân gây tác động có hại cho sức khoẻ người tiêu dùng, số loại khác kháng sinh nhóm nitrofurans qua trình trao đổi chất thể động vật sinh hợp chất có độc tính cao thể sống Họ thuốc kháng khuẩn Sulfamit (SAs) nhóm kháng khuẩn có hoạt phổ rộng, sử dụng nhiều trong nuôi trồng, chế biến nông thủy sản, v.v Việc sử dụng chất cách tùy tiện dẫn đến tồn dư lượng lớn giới hạn cho phép thể động vật Khi người tiêu dùng sử dụng thực phẩm có dư lượng lớn sulfamit hay chất kháng sinh thời gian dài gây loạt phản ứng rối loạn đường tiết niệu, rối loạn tạo máu, rối loạn chuyển hóa porphyrin Cho nên việc xác định xác lượng sulfamit, chất kháng sinh thức ăn chăn nuôi lượng tồn dư sản phẩm từ động vật quan trọng Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái Dựa thực tế đó, luận văn này, tiến hành nghiên cứu điều kiện tách xác định đồng thời chất kháng sinh metronidazole sulfamit sulfaguanidine, sulfamethoxazone, sulfamethoxypiridazine, sulfadoxin phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) ghép nối detector UV – Vis, phương pháp có độ chọn lọc, độ nhạy tốt trang bị nhiều sở kiểm nghiệm nước ta, có tính khả thi ứng dụng vào thực tế cao Chương - TỔNG QUAN 1.2 Giới thiệu chung sulfamit (SAs), metronidazole(MTD) 1.1.1 Cấu trúc phân tử [3,6] Họ SAs có cấu trúc phân tử tổng quát: R2 N SO2 NH R1 Khi thay nhóm R1, R2 gốc khác nhau, có SAs khác nhau.Vì có họ SAs Khi R2 = H sulfamit có hoạt tính kháng khuẩn Khi R # H, chất tiền thuốc R1 mạch thẳng, dị vòng Tuy nhiên R dị vòng hiệu lực kháng khuẩn mạnh hơn, thông thường dị vòng 2-3 dị tố Cấu trúc Metronidazole(MTD): Luận văn Thạc sĩ Thái Bùi Minh Là thuốc kháng sinh thuộc họ nitroimidazole sử dụng đặc biệt vi khuẩn kỵ khí động vật nguyên sinh MTD thành phần có mặt thức ăn chăn nuôi, thuốc kháng sinh nuôi trồng thủy sản (với tên thương mại Enro DC) 1.1.3 Tính chất vật lý hoá học Sulfamit, Metronidazole [3] 1.1.2.1 Tính chất vật lý SAs dạng tinh thể màu trắng vàng nhạt, không mùi, thường tan nước, tan dung dịch axít, tan dung dịch kiềm (trừ sulfagu-anidin) MTD tinh thể bột kết tinh, vàng, không mùi, bền không khí, sẫm màu dần tiếp xúc với ánh sáng Nóng chảy khoảng 159 oC – 163oC Metronidazol khó tan nước, aceton 1.1.2.2 Tính chất hoá học - SAs có tính chất lưỡng tính: • Có tính kiềm có nhóm amin thơm tự do, nên tan dung dịch axít Ví dụ: cho kết tủa muối picrat dung dịch HCl loãng • Có tính axít có nguyên tử H N-amit linh động, nên dễ tan dung dịch kiềm tạo muối natri tan để pha thuốc tiêm (trừ Sulfaguanidin): Luận văn Thạc sĩ Thái Bùi Minh R H2N SO2 R N H2N H SO2 N H H2N SO2 N R Na - SAs tạo muối phức kết tủa với ion Ag +, tạo phức màu kết tủa với ion Cu 2+, Co2+, … - Ở nhóm amin bậc SAs có đôi điện tử tự do, giúp SAs thực phản ứng tạo phức chuyển điện tích với phenosafranine (PSF) cho phức màu tím có bước sóng hấp thụ cực đại 270-273 nm - Nhóm amin thơm tự cho phản ứng diazo hoá, ngưng tụ với naphtol cho sản phẩm azoic màu đỏ cam hấp thụ bước sóng 460nm Ar-NH2 + NaNO2 + 2HCl = [Ar-N+ ≡N]Cl- + NaCl + 2H2O Muối diazoni Ở đây, Ar – thành phần -C6H5-SO2NH-R1 phân tử SAs Nhờ mà việc định lượng SAs theo hai phương pháp diễn dễ dàng 1.1.6 Tính chất dược lý phổ tác dụng Sulfamit, Metronidazole [3,6,9] Với liều điều trị, SAs không diệt vi khuẩn, làm vi khuẩn yếu đi, không phát triển sinh sản được, dễ bị bạch cầu tiêu diệt SAs có phổ tác dụng hoạt phổ rộng: tác dụng lên nhiều vi khuẩn than, vi khuẩn tả, Shigella, E.coli, trực khuẩn Hansen Ít không tác dụng số vi khuẩn: liên cầu khuẩn yếm khí, trực khuẩn lao, Ricketchia Không có tác dụng virut (trừ virut gây đau mắt nhạy cảm với sulfacylum) Nhưng lại có tác dụng lên số ký sinh trùng, đặc biệt ký sinh trùng sốt rét 10 Luận văn Thạc sĩ Thái Bùi Minh SMP 25742 50795 SDO 23144 49734 SMX 21975 48753 Từ kết trên, hiệu suất thu hồi chất nồng độ bảng 3.13 Hiệu suất thu hồi xác định sau: H = (Cx/Ct)* 100% Trong đó: Ct - lượng chất biết trước thêm vào Cx - lượng chất xác định phương pháp thêm Với Cx = (S x − So ) − A B Sx – Diện tích pic thêm lượng Cx vào mẫu So – Diện tích pic thêm mẫu chưa thêm chất phân tích A, B - hệ số phương trình đường chuẩn chất phân tích Bảng 3.14: Kết xác định hiệu suất thu hồi chất phân tích Các Sas SGU MTD SMP SDO SMX Ct (ppm) Cx(ppm) H% 0,200 0,165 82,50 0,400 0,200 0,400 0,349 0,151 0,31 87,3 75,5 77,7 0,200 0,167 83,5 0,400 0,361 90,3 0,200 0,146 72,9 0,400 0,343 85,8 0,200 0,142 71,0 0,400 0,352 88,1 Như khoảng nồng độ 0,2 – 0,4ppm, hiệu suất thu hồi metronidazole chất kháng khuẩn SAs đạt từ 71 – 90 %, hiệu suất thu hồi đạt yêu cầu 3.5.2 Phân tích mẫu thực 58 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái Các mẫu tôm (bỏ đầu, vỏ, chân, đuôi) lấy phần thịt, sau đông khô xử lý theo sơ đồ 3.19 Sau dung dịch cuối tiến hành phân tích theo phương pháp thêm chuẩn Xây dựng đồ thị biểu diễn diện tích pic theo nồng độ chất thêm • Nồng độ chất phân tích mẫu Cx tính theo công thức: Cx = A/B (với A, B - hệ số phương trình hồi quy đồ thị thêm chuẩn) • Khoảng tin cậy nồng độ chất phân tích mẫu là: S S Sx = ( a )2 + ( b )2 Cx a b Trong đó: Cx : Nồng độ chất phân tích có dung dịch bơm vào cột tách a,b hệ số phương trình hồi qui Sa, Sb : sai số hệ số phương trình hồi qui Sx sai số nồng độ xác định theo phương pháp thêm chuẩn Khối lượng chất phân tích có a(g) mẫu cân đông khô ban đầu : mcpt = V*Cx*F*10-3(mg) Trong mcpt : Khối lượng chất phân tích a (g) mẫu (mg) V : Thể tích dung dịch pha từ a(g) (ml) F : Hệ số pha loãng Cx : Nồng độ chất phân tích xác định từ phương trình hồi quy 10-3 : Hế số chuyển từ µg sang mg 3.5.2.1 Mẫu tôm rảo Khối lượng mẫu thịt tôm tươi : 142,8g Khối lượng mẫu sau đông khô : 32,9g Lượng nước có mẫu : 77% 59 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái Với mẫu xử lý ba lần, phân tích lặp lại ba lần lấy giá trị trung bình Kết phân tích sau: Bảng 3.15: Kết phân tích chất mẫu tôm rảo Chất phân tích SGU Diện tích píc sắc ký (mAu.s) Mẫu thêm chuẩn Mẫu thêm chuẩn 0,1ppm chất phân tích 0,2ppm chất phân tích 45766 75734 Mẫu tôm Rảo 22151 Ta có phương trình hồi quy: 80000 Spic(mAu.s) 70000 60000 50000 40000 Y=A+B*X He so Gia tri Sai so -A 21092.16667 2367.62331 B 267915 18339.5313 30000 20000 R SD N P -0.99767 2593.60139 0.04351 10000 -0,15 -0,10 -0,05 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 CSGU(ppm) Hình 3.21: Đường chuẩn SGU mẫu tôm rảo phân tích thêm chuẩn Bảng 3.16: Hàm lượng chất phân tích mẫu tôm rảo Chất phân tích CSAs từ đường chuẩn (ppm) Hàm lượng chất mẫu đông khô (ppm) Hàm lượng chất mẫu tươi (ppm) SGU 0,079 ± 0,010 0,53 ± 0,07 0,12 ± 0,02 60 Luận văn Thạc sĩ Thái Bùi Minh mV 7.0 Detector A Ch1:270nm mV 7.0 Detector A Ch1:270nm 6.0 6.0 5.0 5.0 4.0 4.0 3.0 3.0 2.0 2.0 mV Detector A Ch1:270nm 7.0 6.0 1/3.407 5.0 1/3.363 4.0 1/3.441 3.0 2.0 1.0 1.0 1.0 0.0 0.0 0.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 Mẫu chưa thêm 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 Mẫu thêm chuẩn 0,1ppm 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 Mẫu thêm chuẩn 0,2ppm Hình 3.22: Sắc đồ pic sắc ký thêm chuẩn SGU mẫu tôm rảo 3.5.2.2 Mẫu tôm chân trắng Khối lượng mẫu thịt tươi : 150,1g Khối lượng mẫu sau đông khô : 30,5g Lượng nước có mẫu :79,7% Bảng 3.17: Kết phân tích chất mẫu tôm chân trắng Chất phân tích SGU Mẫu tôm Diện tích píc sắc ký (mAu.s) Mẫu thêm chuẩn Mẫu thêm chuẩn 0,2ppm chân trắng 0,1ppm chất phân tích chất phân tích 30407 59365 74137 Ta có phương trình hồi quy: 61 Luận văn Thạc sĩ Thái Bùi Minh 90000 6000 Spic(mAu.s) 80000 5000 70000 4000 60000 50000 3000 40000 Y=A+B*X 20000 10000 -0.20 -0.15 -0.10 -0.05 2000 He so Gia tri Sai so -A 31104.66667 1560.03009 B 268650 12083.94113 30000 0.00 1000 R SD N P -0.99899 1708.92734 0.02862 0.05 0.10 0.15 0.20 0.0 CSGU(ppm) 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 Hình 3.23: Đường chuẩn SGU mẫu Hình 3.24: Sắc đồ pic sắc ký thêm tôm chân trắng phân tích thêm chuẩn SGU mẫu tôm chân trắng chuẩn Bảng 3.18: Hàm lượng chất phân tích mẫu tôm chân trắng Chất phân tích CSAs từ đường chuẩn (ppm) SGU 0,115 ± 0,008 Hàm lượng chất Hàm lượng chất mẫu đông khô(ppm) mẫu tươi(ppm) 0,77 ± 0,05 3.5.2.3 Mẫu tôm Sú Khối lượng mẫu thịt tôm tươi 0,16 ± 0,01 : 123,6g Khối lượng mẫu sau đông khô: 37,4g Lượng nước có mẫu : 69,7% Với mẫu xử lý ba lần, phân tích lặp lại ba lần lấy giá trị trung bình Kết phân tích sau: Bảng 3.19: Kết phân tích chất mẫu tôm sú Chất phân tích Mẫu tôm sú SGU 18451 Diện tích píc sắc ký (mAu.s) Mẫu thêm chuẩn Mẫu thêm chuẩn 0,1ppm chất phân tích 0,2ppm chất phân tích 30532 45849 62 Luận văn Thạc sĩ Thái Bùi Minh SMP 7010 20175 35745 Ta có phương trình hồi quy: 40000 50000 45000 Spic(mAu.s) 35000 40000 Spic(mAu.s) 30000 35000 25000 30000 20000 25000 Y=A+B*X 20000 15000 10000 -0,15 -0,10 -0,05 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 C He so Gia tri Sai so -A 6609.16667 896.29058 B 143675 6942.63699 10000 R SD N P -0.99768 1321.09147 0.04334 5000 -0,20 Y=A+B*X 15000 He so Gia tri Sai so -A 17911.66667 1205.986 B 136990 9341.52736 5000 -0.10 (ppm) 0.00 -0.05 R SD N P -0.99883 981.83714 0.03074 0.05 0.10 0.15 0.20 CSMP(ppm) SGU Hình 3.25: Đường chuẩn SGU, SMP mẫu tôm sú phân tích thêm chuẩn Bảng 3.20: Hàm lượng chất phân tích mẫu tôm sú Chất phân CSAs từ đường Hàm lượng chất Hàm lượng chất tích chuẩn (ppm) mẫu đông khô (ppm) mẫu tươi (ppm) SGU 0,130 ± 0,012 0,87 ± 0,08 SMP 0,046 ± 0,007 0,30 ± 0,04 0,26 ± 0,02 0,09 ± 0,01 mV 5.0 Detector A Ch1:270nm mV 5.0 Detector A Ch1:270nm mV 5.0 Detector A Ch1:270nm 4.0 4.0 1/3.340 4.0 3.0 3.0 1/3.358 3.0 2.0 2/4.476 2/4.675 2/4.877 1.0 1.0 1.0 0.0 0.0 0.0 2.0 1/3.308 2.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 63 5.0 6.0 7.0 8.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 Luận văn Thạc sĩ Thái Bùi Minh Mẫu chưa thêm Mẫu thêm chuẩn 0,1ppm Mẫu thêm chuẩn 0,2ppm Hình 3.26: Sắc đồ pic sắc ký thêm chuẩn SGU, SMP tôm sú 3.5.2.4 Mẫu tôm lớt Khối lượng mẫu tôm tươi : 132,5g Khối lượng mẫu sau đông khô: 28,4g Lượng nước có mẫu : 78,6% Với mẫu xử lý ba lần, phân tích lặp lại ba lần lấy giá trị trung bình Kết phân tích sau: Bảng 3.21: Kết phân tích chất mẫu tôm lớt Diện tích píc sắc ký (mAu.s) Chất phân tích SGU Mẫu tôm lớt Mẫu thêm chuẩn Mẫu thêm chuẩn 0,2ppm 0,1ppm chất phân tích chất phân tích 26845 40548 60849 Ta có phương trình hồi quy: 65000 60000 Spic(mAu.s) 55000 50000 45000 40000 35000 30000 Y=A+B*X 25000 He so Gia tri Sai so -A 25745.3333 2458.929 B 170020 19046.78538 20000 15000 10000 5000 -0,20 -0,15 -0,10 -0,05 0,00 R SD N P -0.99883 2693.62222 0.07102 0,05 0,10 0,15 0,20C SGU (ppm) Hình 3.27: Đường chuẩn SGU mẫu tôm lớt phân tích thêm chuẩn 64 Luận văn Thạc sĩ Thái Bùi Minh Bảng 3.22: Hàm lượng chất phân tích mẫu tôm lớt Chất phân CSAs từ đường tích chuẩn (ppm) SGU 0,151 ± 0,022 Hàm lượng chất mẫu đông khô(ppm) Hàm lượng chất mẫu tươi(ppm) 1,00 ± 0,15 0,21 ± 0,03 9.0 9.0 9.0 8.0 8.0 8.0 7.0 7.0 7.0 6.0 6.0 6.0 5.0 5.0 5.0 4.0 4.0 4.0 3.0 3.0 3.0 2.0 2.0 1.0 1.0 1.0 0.0 0.0 0.0 2.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 Mẫu chưa thêm 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 Mẫu thêm chuẩn 0,1ppm 0.0 1/3.485 mV 10.0 Detector A Ch1:270nm 1/3.395 mV 10.0 Detector A Ch1:270nm 1/3.427 mV 10.0 Detector A Ch1:270nm 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 Mẫu thêm chuẩn 0,2ppm Hình 3.28: Sắc đồ pic sắc ký thêm chuẩn SGU tôm lớt Nhận xét: Với kết xác định cho thấy mẫu tôm xuất chất dư lượng kháng khuẩn SGU Với giới hạn dư lượng sulfamit thịt thủy sản cho phép 0,1ppm( theo thông tư số:29/2010/TT-BNNPTNT) mẫu tôm mà phân tích vượt mức giới hạn Với mẫu tôm sú, tôm lớt dư lượng gấp lần lượng cho phép Không SMP( trừ tôm sú) mẫu tôm 65 phát thấy MTD, SMX, SDO, Luận văn Thạc sĩ Thái Bùi Minh KẾT LUẬN Trên sở nghiên cứu điều kiện thực nghiệm, nhằm ứng dụng kỹ thuật phân tích HPLC – UV-Vis để tách, xác định đồng thời metronidazole số sulfamit (SGU, SMP, SDO, SMX) số loại tôm, thu số kết sau đây: Đã chọn điều kiện tối ưu cho trình sắc ký: • Cột tách RP - C18: 25 cm × 4,6 mm; 5m • Detector UV-VIS: kênh  = 270 nm;  =320nm.Rise time = 0,1 s; Range = 0,01 AUFS 66 Luận văn Thạc sĩ Thái Bùi Minh • Máy ghi: tốc độ giấy = mm/phút; ghi = 10 mV • Thành phần pha động: dung dịch đệm axetat (pH = 4,5) 10mM /acetonitril: 80/20 (v/v) • Tốc độ pha động: ml/phút Đã đánh giá phương pháp phân tích: • Khoảng tuyến tính sulfamit: 0,05 – 1,00ppm • Giới hạn phát hiện: 0,012 – 0,029 ppm • Giới hạn định lượng: 0,040 - 0,096 ppm • Hệ số biến thiên: 0,2% – 5% khoảng nồng độ 0,08- 0,8ppm Khảo sát mẫu thực • Chọn quy trình xử lý mẫu thích hợp, hiệu suất thu hồi chất phân tích mẫu tôm đạt từ 71 -90% • Xác định dư lượng SGU mẫu tôm chân trắng: 0,16 ± 0,01ppm, tôm lớt: 0,21±0,03ppm, tôm rảo:0,12±0,02ppm, tôm sú :0,26±0,02ppm, dư lượng SMP tôm sú 0,09 ± 0,01ppm • Không phát thấy MTD, SDO, SMX, SMP( trừ tôm sú) mẫu tôm Từ kết thu được, thấy phương pháp HPLC – Detector UVVis có độ nhạy cao, thích hợp cho phân tích đồng thời metronidazole chất kháng khuẩn SGU, SMP, SDO SMX tôm Chúng hy vọng nghiên cứu góp phần vào việc ứng dụng kỹ thuật HPLC – UV-Vis nói riêng kỹ thuật HPLC nói chung để xác định metronidazole hợp chất thuộc họ sulfamit thực phẩm, nhằm phục vụ đắc lực cho ngành khoa học đặc biệt lĩnh vực vệ sinh an toàn thực phẩm, giúp bảo vệ sức khoẻ cho người 67 Luận văn Thạc sĩ Thái Bùi Minh TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Chu Đình Bính, Phạm Luận, Nguyễn Thị Ánh Nguyệt, Nguyễn Phương Thanh (2007), “Xác định dư lượng chất kháng khuẩn họ sulfamit thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu nâng cao”, Tạp chí Khoa học Công nghệ, 45(1B), tr 33 – 41 Nguyễn Thị Kim Dung (2004), Xác định sulfonamide thuốc phương pháp hấp thụ nguyên tử, Luận văn Thạc sĩ khoa học, Đại học Quốc gia Hà Nội 68 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái Trần Đức Hậu, Nguyễn Đình Hiển, Thái Duy Thìn, Huỳnh Kim Thoa, Nguyễn Văn Thục (2006), Hoá dược tập 2, Bộ môn hoá dược, Đại học Dược, Hà Nội Nguyễn Thị Phương Linh (2006), Xác định gián tiếp hàm lượng sulfamethoxazole thuốc phép đo F-AAS, Luận văn thạc sĩ khoa học, Đại học Quốc gia Hà Nội Phạm Luận (1998), Cơ sở lý thuyết phân tích sắc ký lỏng hiệu nâng cao, Đại học Quốc gia Hà Nội Nguyễn Thị Ánh Nguyệt (2007), Nghiên cứu tách xác định đồng thời số sulfamit thức ăn chăn nuôi thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu nâng cao (HPLC), Luận văn thạc sĩ khoa học, Đại học Quốc gia Hà Nội Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung, Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi(2003), Hóa học phân tích- Phần 2(Các phương pháp phân tích công cụ), Đại học Quốc Gia Hà Nội Tạ Thị Thảo (2005), Thống kê hoá phân tích, Đại học Quốc gia Hà Nội Tiêu chuẩn ngành (2004), Sulfonamit sản phẩm thuỷ sản-Phương pháp định lượng sắc ký lỏng hiệu cao, 28 TCN 196:2004 10 Vũ Cẩm Tú (2009), Xác định sulfamit mẫu Dược phẩm thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao(HPLC), Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Khoa học Tự nhiên Tiếng Anh 11 A V Pereira, Q B Cass(2005), “High- performance liquid chromatography method for the simultaneous determination of sulfamethoxazole and trimethoprim in bovine milk using an on-line clean-up column”, Journal of chromatography B, 826, pp 139- 146 12 Cheong, C.K., Hajeb, P.Jinap, S and Ismail-Fitry, M.R(2010), “Sulfonamides determination in chicken meat products from Malaysia’’, International Food Research Journal,17, pp 885-892 13 Craig D.C Salisbury, Jason C Sweet, Roger Munro(2004), “ Determination of sulfonamide residues in the Tissues of food animals using 69 Luận văn Thạc sĩ Thái automated Bùi Minh precolumn derivatization and liquid chromatography with fluorescence detection”, Journal of AOAC international, 87( 5), pp.12641268 14 D.G Kennedy, R.J.McCracken, A.Cannavan, S.A.Hewitt (1998),“Use of liquid chromatography-mass spectrometry in the analysis of residues of antibiotics on meat and milk” Journal of chromatography A, 812, pp.77-98 15 Gertraud Suhren and W Heeschen(1993) “Detection of eight sulphonamides and dapsone in milk by a liquid chromatographic method”, Analytica Chimica Acta, 275, pp 329-333 16 Hadir M Maher, Rasha M Youssef, Riad H Khalil and Sabry M ElBahr(2008), “ Simultaneous multiresidue determination of metronidazole and spiramycin in fish muscle using high performance liquid chromatography with UV detection ’’, Journal of Chromatography B, 17 876(2), pp.175-181 Han-Wen Sun, Feng-Chi Wang and Lian-Feng Ai(2007), “ Simultaneous determination of seven nitroimidazole residues in meat by using HPLC-UV detection with solid-phase extraction”, Journal of Chromatography B, 857(2), pp 296-300 18 Ivan Pecorelli, Rita Bibi, Laura Fioroni, Roberta Galarini (2004) ,“Validation of a confirmatory method for the determination of sulphonamides in muscle according to the European Union regulation 2002/657/EC”, Journal of chromatography A, 1032(1-2),pp 23-29 19 M Brandtner, W Hela, R Widek, R Suhuh (2003), “Determination of sulfonamides in animal tissues using cation exchange reversed phase sorbent for sample cleanup and HPLC-DAD for detection”, Food Chemistry, 83, pp 601-608 20 Naser Tavakoli, Jaleh Varshosaz, Farid Dorkoosh and Mohammad R Zargarzadeh (2007), “Development and validation of a simple HPLC method for simultaneous in vitro determination of amoxicillin and metronidazole at single wavelength’’, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 43(1), pp.325- 329 70 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái 21 Naoto Furusawa(2000), “Simplified determining procedure for routine residue monitoring of sulphamethazine and sulphadimethoxine in milk” Journal of chromatography A, 898, pp.185 – 191 22 PVinas, C.Lopez Erroz,N.Campillo, M.Hernandez(1996), “ Determination of sulphonamides in foods by liquid chromatography with postcolumn fluorescence derivatization”, Journal of Chromatography A, 726(1-2), pp.125-131 23 Qiong-Hui Zou, Xiang-Feng Wang,Yuan Liu, Jin Wang, Jia Song, Hui Gao, Jie Han(2007), “ Determination of sulphonamides in animal tissues by high performance liquid chromatography with pre-column derivatization of 9fluorenylmethyl chloroformate”, Journal of Separation Science ,30(16), pp 2647–2655 24 Richard Lindberg, Per-Åke Jarnheimer, Björn Olsen, Magnus Johansson and Mats Tysklind (2004), “Determination of antibiotic substances in hospital sewage water using solid phase extraction and liquid chromatography/mass spectrometry and group analogue internal standards”, Chemosphere, 57(10) ,pp.1479 -1488 25 Rodrigo H.M.M Granja, Alfredo M Montes Niño, Fernanda Rabone and Alessandro Gonzalez Salerno(2008), “A reliable high-performance liquid chromatograph with ultraviolet detection for the determination of 26 sulfonamides in honey” , Analytica Chimica Acta , 613(1), pp 116-119 Ticiano Gomes Nascimento, Eduardo de Jesus Oliveira and Rui Oliveira Macêdo(2005),’’ metronidazole Simultaneous in human determination plasma using high of ranitidine performance and liquid chromatography with diode array detection’’, Journal of Pharmaceutical 27 and Biomedical Analysis, 37( 4), pp 777-783 Theresa A Gehring, Bill Griffinb, Rod Williams , Charles Geiseker ,Larry G Rushing , Paul H Siitonen(2006), “ Multiresidue determination of sulfonamides in edible catfish, shrimp and salmon tissues by highperformance liquid chromatography with postcolumn derivatization and fluorescence detection”, Journal of Chromatography B, 840,pp.132–138 71 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái 28 W.M.A Niessen(1998), “Analysis of antibiotics by liquid chromatography – mass spectrometry” Journal of chromatography A, 812, pp 53 – 75 29 W Hela, , M Brandtner, R Widek and R Schuh(2003), “ Determination of sulfonamides in animal tissues using cation exchange reversed phase sorbent for sample cleanup and HPLC–DAD for detection”, Food Chemistry,83(4), pp.601-608 30 Xiaojia Huang, Dongxing Yuan, Benli Huang (2007) ,“Simple and rapid determination of sulfonamides in milk using Ether- type column liquid chromatography”, Talanta ,72 ,pp.1298 -1301 31 Wang P, Li J, Zheng H.(2007), “ Simultaneous determination of seven sulfonamides and metronidazole and chloramphenicol in cosmetics by high performance liquid chromatography’’, Chineses journal of chromatography, 25(5), pp.743-746 32 Wikipedia, “the free encyclopedia (2005), sulfonamide (medicine)” Http://en.wikipedia.org/wiki/Sulfonamide (medicin) 33 Http://www.uptodate.com/contents/metronidazole-an-overview 72 [...]... vật được chiết bằng acetonitrile và tinh chế bằng cách chiết pha rắn với C18 Phương pháp này có độ nhạy cao và lặp lại tốt và hiệu suất thu hồi trung bình trên 70% Các giới hạn phát hiện cho hầu hết các sulfamit có thể đạt 3-5 μg/kg 1.2.2 Một số công trình nghiên cứu xác định Metronidazole bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) HPLC là phương pháp mới được ứng dụng để xác định Metronidazole. .. 2.6.1 Nguyên tắc chung và trang bị của phương pháp HPLC [4 ; 8] Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật tách chất trong đó xảy ra quá trình các chất tan chuyển dịch trong cột tách có chứa các chất nhồi kích thước nhỏ, chất tan chuyển dịch với vận tốc khác nhau phụ thuộc vào hệ số phân bố của nó Các chất nhồi cột có kích thước đủ nhỏ để đáp ứng hiệu quả tách sắc ký tốt Thành phần pha... những tương đồng trong việc xác định SAs và MTD, rất nhiều công trình đã xác định được đồng thời MTD và các SAs trong các đối tượng khác nhau Năm 2002, Richard Lindberg và cộng sự[24] đã xác định đồng thời các chất kháng sinh thuộc các họ sau: fluoroquinolones, sulfamit, trimethoprim,-β lactam (penicillin và cephalosporines), nitroimidazoles và tetracycline trong nước thải bệnh viện Phương pháp phân... 1.2 Phương pháp xác định 1.2.1 Một số công trình nghiên cứu xác định Sas bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất là các lĩnh vực của hoá dược, sinh hoá, hoá thực phẩm, nông hoá, hoá dầu, hoá học hợp chất thiên nhiên, các loại chất có tác... tích môi trường đặc biệt là tách và phân tích lượng vết các chất Phương pháp HPLC được sử dụng rộng rãi để xác định các kháng khuẩn SAs trong các loại mẫu khác nhau, khá ưu thế so với các phương pháp khác khi xác định dư lượng các kháng khuẩn trong mẫu thực phẩm vì có độ chính xác, độ nhạy và độ lặp lại cao Detector ghép nối trong máy HPLC cho phép phát hiện sự xuất hiện chất sau khi rửa giải Ngày... khác nhau Do các ưu điểm như xác định được nhiều loại chất, hiệu quả tách tốt, dung môi ít tốn kém hơn NP – HPLC nên ngày nay sắc ký lỏng hiệu năng cao theo cơ chế hấp phụ pha ngược được sử dụng nhiều hơn Sơ đồ tổng quát của một hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao được tóm tắt như sau: 25 Luận văn Thạc sĩ Thái Bùi Minh Hình 2.1: Sơ đồ khối hệ thống HPLC đầy đủ 2.6.2 Phân tích định lượng bằng HPLC Trong... đại Thời gian lưu phụ thuộc vào: • Pha tĩnh (loại, cỡ hạt, độ xốp, cấu trúc xốp ) • Pha động chạy sắc ký( loại dung môi, thành phần, tốc độ…) • Bản chất và cấu trúc phân tử của các chất phân tích • Môi trường pH của pha động Muốn tách và xác định đồng thời các chất phân tích, chúng ta phải biết thứ tự xuất hiện pic của các chất Vì vậy, việc khảo sát thời gian lưu là cần thiết và được thực hiện như. .. chọn, đại lượng đặc trưng cho một chất là thời gian lưu tRi của chất đó trên cột tách Chúng ta có thể dựa vào thời gian lưu này để định tính được chất đó thông qua mẫu chuẩn Sau đó dựa vào các tín hiệu phân tích thu được (chiều cao pic hoặc diện tích pic) để định lượng các chất Thông thường trong phương pháp HPLC người ta biểu diễn quan hệ nồng độ chất phụ thuộc vào chiều cao pic hoặc diện tích H = k.Cb... sắc ký: cột tách C18 Sep-Pak, pha động: rửa giải gradient 0,05M đệm phosphate (pH =2,4)-ACN, tốc độ dòng 1ml/phút Khoảng tuyến tính của metronidazole: 0,005-1,000mg/g, LOD:0,002mg/g, LOQ:0,005mg/g Khoảng tuyến tính của piamycin: 0,025 -1,000mg/g, LOD: 0,005mg/g, LOQ: 0,025mg/g 1.2.3 Một số công trình nghiên cứu xác định đồng thời các sulfamit và metronidazole bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. .. giàu cao Cơ sở chính của phưong pháp này về căn bản rất giống với sắc ký lỏng (đã được giới thiệu ở trên), chỉ khác ở chỗ: HPLC tách các hợp chất trong một hệ có pha động chảy liên tục, trong khi chiết pha rắn giữ chất phân tích ở chất hấp phụ, các tạp chất bị loại vào pha động và chất phân tích được rửa giải vào dung môi thích hợp sau đó Chiết pha rắn là một dạng HPLC đặc biệt, chỉ giữ chất này và không