LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Bùi Thị Việt Hà, chủ nhiệm môn Vi sinh vật học, trường ĐH Khoa học Tự Nhiên- ĐH Quốc gia Hà Nội Người tận tình bảo, hướng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ suốt trình học tập làm luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể cán môn Vi sinh vật học, trường ĐH Khoa học Tự Nhiên- ĐH Quốc gia Hà Nội Trong trình làm luận văn, nhận bảo trực tiếp tạo điều kiện thuận lợi Đồng thời, chân thành cảm ơn thầy giáo, cô giáo khoa Sinh học nói chung môn Vi sinh vật học, trường ĐH Khoa học Tự Nhiên- ĐH Quốc gia Hà Nội nói riêng tận tình dạy dỗ trình học tập Cuối xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân toàn thể bạn nhóm Những người bên cạnh động viên, giúp đỡ thời gian học tập Hà Nội, ngày 20 tháng 06 năm 2012 Học viên Nguyễn Thị Minh Thư MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 BỆNH NHIỄM KHUẨN HÔ HẤP Ở NGƯỜI 3 1.2 Moraxella catarrhalis VÀ BỆNH VIÊM ĐƯỜNG HÔ HẤP TRÊN 1.2.1 Đặc điểm hình thái nuôi cấy 1.2.2 Vai trò M.catarrhalis bệnh nhiễm khuẩn hô hấp 1.2.3 Tính kháng kháng sinh M catarrhalis 1.3 CHẤT KHÁNG SINH 10 1.3.1 Khái niệm 1.3.2 Chất kháng sinh có nguồn gốc từ vi khuẩn 1.3.3 Chất kháng khuẩn thực vật 1.3.4 Cơ chế kháng khuẩn 10 11 14 15 1.4 CÂY TÁO MÈO VÀ DỊCH CHIẾT TỪ QUẢ TÁO MÈO 16 1.4.1 Đặc điểm thực vật học 16 1.4.2 Sự phân bố 1.4.3 Tác dụng dược lý 17 17 14.4 Thành phần hóa học 18 1.4.5 Tình hình nghiên cứu táo mèo 18 Chương NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 NGUYÊN LIỆU 2.1.1 Nguồn giống 2.1.2 Hóa chất thiết bị 2.2 PHƯƠNG PHÁP 2.2.1 Phương pháp lên men táo mèo 2.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn 2.2.3 Xác định hoạt tính kháng sinh enzym 2.2.4 Bảo quản giống 2.2.5 Xác định sinh khối phương pháp đo mật độ quang học-OD 2.2.6 Xác định yếu tố ảnh hưởng tới khả sinh trưởng hoạt tính kháng khuẩn vi khuẩn 2.2.7 Tách chiết hợp chất dịch lên men vi khuẩn giấm táo mèo 2.2.8 Khảo sát sơ thành phần hóa học dịch chiết táo mèo phân 19 19 19 19 19 19 19 20 21 21 21 22 25 đoạn kháng khuẩn Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 HOẠT TÍNH KHÁNG Moraxella catarrhalis CỦA DỊCH LÊN MEN QUẢ TÁO MÈO 3.2 TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT 3.2.1 Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật kháng Moraxella catarrhalis 3.2.2 Phân loại chủng vi khuẩn tuyển chọn 3.3 ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY THÍCH HỢP CHO SINH TRƯỞNG VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN 3.3.1 Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp 3.3.2 Nguồn cacbon thích hợp 3.3.3 Nguồn nitơ thích hợp 3.3.4 Lựa chọn pH nuôi cấy thích hợp 3.3.5 Lựa chọn nhiệt độ thích hợp 3.3.6 Lựa chọn thời gian nuôi cấy thích hợp 3.3.7 Khả sinh enzym ngoại bào TM5.2 3.4 TÁCH CHIẾT CHẤT KHÁNG KHUẨN TỪ DỊCH CHIẾT TÁO MÈO VÀ DỊCH LÊN MEN VI KHUẨN 3.4.1 Khảo sát hệ dung môi rửa giải pha rắn hấp phụ 3.4.2 Tách chiết phân đoạn chất kháng khuẩn dịch lên men vi khuẩn 3.4.3 Tách chiết phân đoạn chất kháng khuẩn từ dịch chiết táo mèo 3.4.4 Sắc ký mỏng phân đoạn kháng khuẩn dịch lên men chủng TM5.2 dịch chiết táo mèo 3.5 NGHIÊN CỨU SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CAO DỊCH LÊN MEN, DỊCH CHIẾT TÁO MÈO VÀ CÁC PHÂN ĐOẠN 3.5.1 Sơ thành phần hóa học cao dịch chiết táo mèo phân đoạn KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 28 28 29 29 30 32 32 33 34 36 37 38 39 39 40 40 41 42 42 42 45 BẢNG MỘT SỐ KÝ HIỆU VIẾT TẮT CKS CMC DMSO HTKK LB PĐ TCA VSV Chất kháng sinh Carboxymethylcellulose Dimethyl sulfoxide Hoạt tính kháng khuẩn Môi trường Luria Bertani Phân đoạn Tricloacetic Vi sinh vật DANH SÁCH BẢNG BIỂU, BIỂU ĐỒ Bảng 1.1: Tỷ lệ vi khuẩn gây bệnh viêm họng mạn tính Bảng 1.2: Tỷ lệ kháng kháng sinh M.catarrhalis Bảng 1.3:Tỷ lệ loài có khả sinh CKS 10 Bảng 1.4: So sánh bacteriocin chất kháng sinh 13 Bảng 2.1: Thông số thiết kế cột nhồi 23 Bảng 3.1: Hoạt tính kháng M.catarrhalis dịch lên men táo mèo 28 Bảng 3.2: Hoạt tính kháng M.catarrhalis chủng vi khuẩn 29 Bảng 3.3: Hoạt tính kháng khuẩn chủng TM5.2 lên chủng vi khuẩn kiểm định Hình 3.1: Vị trí phân loại chủng TM5.2 với loài quan hệ họ hàng gần 29 Bảng 3.4: Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả sinh trưởng hoạt tính kháng khuẩn chủng TM5.2 33 Hình 3.2: Hoạt tính kháng khuẩn TM5.2 môi trường 33 Bảng 3.5: Ảnh hưởng nguồn cacbon đến khả sinh trưởng hoạt tính kháng khuẩn TM5.2 Hình 3.3: Ảnh hưởng nguồn cacbon lên khả sinh trưởng hoạt tính kháng khuẩn TM5.2 Bảng 3.6: Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh trưởng hoạt tính kháng khuẩn TM5.2 34 Hình 3.4: Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh trưởng hoạt tính kháng khuẩn TM5.2 35 32 34 35 Bảng 3.7: Ảnh hưởng pH ban đầu đến sinh trưởng, hoạt tính kháng khuẩn TM5.2 Hình 3.5: Ảnh hưởng pH ban đầu đến sinh trưởng HTKK TM5.2 Bảng 3.8: Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng hoạt tính kháng khuẩn TM5.2 Hình 3.6: Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng hoạt tính kháng khuẩn TM5.2 Bảng 3.9: Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh trưởng hoạt tính kháng khuẩn TM5.2 Hình 3.7: Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh trưởng hoạt tính kháng khuẩn TM5.2 Bảng 3.10: Khả sinh enzym ngoại bào 36 Bảng 3.11: Kết thử hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn tách từ dịch chiết lên men Bảng 3.12: Kết thử hoạt tính kháng khuẩn M.catarrhalis cao dịch chiết táo mèo nồng độ khác Bảng 3.13: Kết thử hoạt tính kháng khuẩn M.catarrhalis phân đoạn từ dịch chiết táo mèo Bảng 3.14: Kết thử định tính nhóm hợp chất dịch chiết táo mèo phân đoạn 40 36 37 37 38 39 39 41 42 43 MỞ ĐẦU Nhiễm khuẩn đường hô hấp cấp bệnh lý có tỷ lệ tử vong đứng đầu số 10 bệnh lý nhiễm khuẩn nước có thu nhập thấp Chương trình toàn cầu phòng chống nhiễm khuẩn hô hấp cấp WHO phát động, Việt Nam chương trình triển khai từ năm 1984 Kiểm soát phòng chống bệnh ưu tiên hàng đầu nước phát triển có Việt Nam, chịu tác động bất lợi phát triển lan truyền tình trạng kháng kháng sinh vi khuẩn gây bệnh Bệnh nhiễm khuẩn đường hô hấp cấp gồm nhiễm khuẩn đường hô hấp nhiễm khuẩn đường hô hấp Tỷ lệ mắc bệnh nhiễm khuẩn đường hô hấp chiếm phần lớn so với bệnh hô hấp khác, bệnh thường gặp, mắc hàng năm, theo mùa gây nhiều biến chứng nặng viêm tai giữa, viêm màng não, áp xe não, áp xe sau thành họng Khi mắc viêm đường hô hấp lây nhiễm xuống đường hô hấp gây viêm khí, phế quản viêm phổi nặng Có thể thấy bệnh gây ảnh hưởng đáng kể đến sức khỏe đặc biệt với trẻ em, người già gây thiệt hại kinh tế Moraxella catarrhalis nguyên gây phần lớn trường hợp mắc bệnh nhiễm khuẩn hô hấp, đặc biệt coi tác nhân gây bệnh viêm tai phổ biến thứ ba sau Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae Trong M catarrhalis kháng lại hầu hết chất kháng sinh thuộc nhóm beta-lactam, nhạy cảm với cephalosporin hệ 2, ciprofloxacin thuộc họ quinolon Thực trạng kháng kháng sinh M catarrhalis nói riêng, vi khuẩn gây bệnh truyền nhiễm nói chung đem đến gánh nặng kinh tế, xã hội việc thay kháng sinh hệ cũ kháng sinh hệ đắt tiền Với phát triển ngành công nghệ sinh học đại đem lại triển vọng lớn cho Y học tìm kiếm thêm hợp chất tự nhiên hỗ trợ cho việc phòng điều trị bệnh Các hợp chất góp phần giảm tác dụng phụ không mong muốn hợp chất tổng hợp, giảm gánh nặng mặt kinh tế cho người bệnh xã hội Từ ngàn xưa, ông cha ta lưu truyền nhiều thuốc dân gian từ cây, cỏ chữa bệnh đường hô hấp nhiều bệnh khác Hiện táo mèo sản phẩm chế biến từ táo mèo đặc biệt giấm táo mèo lan truyền rộng rãi cộng đồng thuốc chống béo phì, tăng cường miễn dịch, kháng khuẩn, giảm chứng suy hô hấp Trên giới táo mèo phân bố Trung Quốc, Ấn Độ, Myanma, Việt Nam tập trung tỉnh Yên Bái, Sơn La, Lào Cai, Lai Châu Lâm Đồng Năm 2010 có nghiên cứu sơ với kết khả quan tác dụng kháng khuẩn, có M catarrhalis gây bệnh hô hấp dịch lên men táo mèo mở hướng nghiên cứu định hướng ứng dụng dịch lên men táo mèo việc hỗ trợ nâng cao thể trạng cho người Với mục tiêu góp phần chứng minh làm sáng tỏ vai trò chủ đạo tác nhân có dịch lên men táo mèo theo kinh nghiệm dân gian, đặc biệt công dụng kháng vi khuẩn gây viêm đường hô hấp kháng kháng sinh thông dụng, tiến hành thực đề tài: “ Nghiên cứu tác dụng chống lại vi khuẩn kháng kháng sinh (Moraxella catarrhalis) gây nhiễm đường hô hấp người dịch lên men táo mèo (Docynia indica)” Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 BỆNH NHIỄM KHUẨN HÔ HẤP Ở NGƯỜI Nhiễm khuẩn hô hấp tình trạng phận thuộc máy hô hấp bị viêm nhiễm vi khuẩn virut gây Về phương diện lâm sàng, nhiễm khuẩn hô hấp gồm hai loại: nhiễm khuẩn hô hấp nhiễm khuẩn hô hấp Nhiễm khuẩn hô hấp bệnh lý riêng biệt mà gồm nhiều bệnh lý (các bệnh tai mũi họng) như: + Viêm mũi + Viêm họng + Viêm amidan + Viêm tai + Viêm xoang Bệnh nhiễm khuẩn hô hấp coi bệnh cảnh nặng thực tế bệnh chiếm tỷ lệ thấp không dễ mắc Trong nhiễm khuẩn hô hấp chứng bệnh thường gặp hàng năm, mắc tái diễn theo mùa, tái mắc nhiều lần năm, dễ gây biến chứng nặng nề chiếm tỷ lệ lớn so với bệnh hô hấp khác Theo thống kê tổ chức y tế Hoa Kỳ, trung bình người trưởng thành bị viêm đường hô hấp khoảng – lần năm số cao nhiều trẻ em, trẻ nhiễm đến 10 lần Mỗi năm Hoa Kỳ, nhiễm khuẩn hô hấp gây giảm khả làm việc 170 triệu ngày, 23 triệu ngày trẻ phải nghỉ học, 18 triệu ngày phải nghỉ làm Điều cho thấy dù loại bệnh cho tự khỏi chúng gây thiệt hại đáng kể không sức khỏe mà kinh tế xã hội Đối tượng mắc bệnh chủ yếu trẻ em Ước tính toàn cầu năm có khoảng tỷ lượt trẻ bị bệnh nhiễm khuẩn hô hấp cấp, chiếm 15 -20% số tử vong độ tuổi Tại khu vực Đông Nam Á, có Việt Nam bệnh nguyên nhân cao (25%) gây tử vong trẻ, tiêu chảy sơ sinh kết hợp với bệnh khác, lại nguyên nhân khác [22] Ở trẻ em bệnh nhiễm khuẩn hô hấp gây biến chứng nặng viêm tai (29 – 50%), viêm xoang (5 – 10%) [38] Vi sinh vật gây bệnh thường gặp virut (chiếm 80%) vi khuẩn (20%), cụ thể sau: - Tác nhân virut gây bệnh gồm có: +) Rhinovirus picornavirut, phân lập 110 serotyp- thường gặp (khoảng 50%) +) Coronavirus: 20-25% +) Orthomyxovirus: gây bệnh cúm +) Paramyxovirus : virut hợp bào, quai bị +) Adenovirus, thường typ 1, 2, 3, 5, - Tác nhân vi khuẩn thường gặp Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae Moraxella catarrhalis [24, 33,37] Ngoài vi khuẩn có vi khuẩn không điển Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae Legionella pneumophila Bệnh nhiễm khuẩn hô hấp gia tăng gặp yếu tố thuận lợi như: + Theo lứa tuổi: chủ yếu trẻ em người già + Sức đề kháng yếu người: sinh non, suy dinh dưỡng, + Điều kiện khí hậu, thời tiết: Việt Nam có khí hậu nóng ẩm tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật gây bệnh đường hô hấp nói riêng bệnh nhiễm khuẩn nói chung phát triển Việt Nam coi quốc gia có tỷ lệ bệnh nhiễm khuẩn cao nên việc điều trị phòng bệnh trở nên cần thiết + Do ô nhiễm môi trường sống, đời sống kinh tế xã hội 1.2 Moraxella catarrhalis VÀ BỆNH VIÊM ĐƯỜNG HÔ HẤP TRÊN 1.2.1 Đặc điểm hình thái nuôi cấy 10 Bảng 3.13: Kết thử hoạt tính kháng khuẩn M catarrhalis phân đoạn từ dịch chiết táo mèo Mẫu thử HTKS ( D – d, mm) PĐ1 27,5 PĐ2 26,1 PĐ3 18,0 3.4.4 Sắc ký mỏng phân đoạn kháng khuẩn dịch lên men chủng TM5.2 dịch chiết táo mèo Sau tiến hành triển khai sắc ký mỏng phân đoạn có tính kháng khuẩn thu từ dịch lên men chủng TM5.2 hệ dung môi triển khai khác Nhận thấy: • Hệ triển khai tương đối tốt phân đoạn gồm có: - Toluen- Etyl acetat- Aceton- Axit formic = 15: 2: 2: - TEAF - Tuluen: Ethylacetae: Acetone: Acid Focmic = 5:3:1:1 - Toluen: Ethylaxetat: axit focmic = 5:4:1 • Dịch lên men chủng TM5.2: Phân đoạn tách vết , phân đoạn tách vết • Dịch chiết táo mèo: Phân đoạn tách vết, phân đoạn có vết, phân đoạn có vết Từ kết thu bước đầu kết luận sơ phân đoạn kháng khuẩn thu chứa nhiều chất khác 3.5 NGHIÊN CỨU SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CAO DỊCH CHIẾT TÁO MÈO VÀ CÁC PHÂN ĐOẠN 3.5.1 Sơ thành phần hóa học cao dịch chiết táo mèo phân đoạn Tiến hành thử định tính nhóm chất phản ứng đặc trưng trình bày chi tiết phần phương pháp, bước đầu kết bảng sau: 47 Bảng 3.14: Kết thử định tính nhóm hợp chất dịch chiết táo mèo phân đoạn Nhóm chất Flavonoit Kết Thuốc thử Cao cồn PĐ1 PĐ2 PĐ3 Shinoda ++ ++ + + Diazo - + - - NaOH 10% ++ +++ ++ ++ H2SO4 ++ ++ + + - + - - Acetat chì ++ ++ + + Dragendorf ++ +++ + + +++ + + ++ Galatin/ Tannin Ankaloit Glycozit NaCl KellerKillian Ghi chú: + : Phản ứng dương tính - : Phản ứng âm tính Kết cho thấy dịch chiết táo mèo phân đoạn có nhóm chất: flavonoit, tannin, ankaloit, glycozit với hàm lượng khác Với thuốc thử (phương pháp định tính) khác kết thu khác nhau, ví dụ việc định tính nhóm flavonoit, dùng thuốc thử diazo NaOH 10% kết khác độ nhạy thuốc thử với nhóm chất khác 48 Kết định tính cho thấy phân đoạn 1(PĐ1) giàu nhóm flavonnoit ankaloit phân đoạn hai ba (PĐ2, PĐ3); phân đoạn lại giàu nhóm glycozit phân đoạn Kết thử hoạt tính kháng M catarrhalis (bảng 3.13) lại cho thấy HTKK phân đoạn cao Như hoạt tính kháng khuẩn chủng M catarrhalis liên quan đến hàm lượng có mặt số chất thuộc nhóm flavonoit ankaloit 49 KẾT LUẬN Sau tiến hành nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn Moraxella catarrhalis kháng kháng sinh gây viêm đường hô hấp dịch lên men táo mèo, thu số kết sau: Dịch lên men táo mèo có khả kháng M catarrhalis kháng kháng sinh pH nồng độ chất dịch ảnh hưởng đến hoạt tính kháng M catarrhalis Phân lập, tuyển chọn chủng TM5.2 từ dịch lên men táo mèo có hoạt tính kháng khuẩn M catarrhalis mạnh ổn định Chủng TM5.2 thuộc loài Bacillus subtilis, chi Bacillus, có khả sinh trưởng tốt môi trường LB, nguồn cacbon tinh bột, nguồn nitơ cao nấm men, pH 7, nhiệt độ 300C, thời gian lên men thích hợp 48- 72 Tách chiết phân đoạn có hoạt tính kháng M catarrhalis từ dịch lên men chủng TM5.2 Từ dịch chiết táo mèo tách chiết phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn M catarrhalis Các phân đoạn có hoạt tính kháng M catarrhalis từ dịch lên men chủng TM5.2 dịch chiết táo mèo chứa nhiều chất khác Quả táo mèo, phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết táo mèo có đầy đủ nhóm chất flavonoit, tannin, ankaloit, glycozit Hoạt tính kháng khuẩn chủng M catarrhalis phân đoạn kháng khuẩn thu từ dịch chiết táo mèo liên quan đến hàm lượng có mặt số chất thuộc nhóm nhóm flavonoit ankaloit KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn khác dịch lên men táo mèo có khả kháng M catarrhalis kháng kháng sinh Nghiên cứu chất hóa học chất kháng M catarrhalis kháng kháng sinh thu từ dịch lên men chủng TM5.2 từ dịch chiết táo mèo 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO I TÀI LIỆU VIỆT NAM 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Nguyễn Văn Bản (1996), Phân tích sàng lọc hóa thực vật, Tập II, tr 132169 Nguyễn Đình Bảng (1992), “Vấn đề kháng sinh Tai Mũi Họng” , Chuyên đề Tai Mũi Họng, tr 20-24 Nguyễn Thị Ngọc Bích (2007), Nghiên cứu giá trị phương pháp cấy đờm tìm vi khuẩn chẩn đoán nguyên nhân nhiễm khuẩn hô hấp, Luận văn tốt nghiệp bác sỹ chuyên khoa II, Học viên Quân y Phạm Văn Ca (2005), “Tần suất bắt gặp Moraxella catarrhalis vi khuẩn gây bệnh mức độ kháng thuốc Việt Nam”, Tạp chí Y học dự phòng, 15(1), tr 55 – 59 Đinh Thị Kim Chung (2007), “Ảnh hưởng số yếu tố tới trình lên men vang tóa mèo (Docynia indica)”, Tạp chí KH&CN, 45(2), tr 87 – 92 Danh lục loài Thực vật (2006), Tập II Bùi Xuân Đồng (2000), Vi nấm dùng công nghệ sinh học, Nxb Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Đào Đình Đức, Lê Đăng Hà, Phạm Văn Ca (1996), Tình hình nhiễm khuẩn kháng kháng sinh số vi khuẩn gây bệnh bệnh viện Bạch Mai năm (1990-1994), Một số công trình nghiên cứu độ nhạy cảm vi khuẩn với thuốc khánh sinh (1994-1995), tr 30-32 Bùi Thị Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam, Luận án Tiến sỹ sinh học Nguyễn Minh Hải, Nguyễn Tiền (2007), “ Nghiên cứu nguyên vi khuẩn đờm tính nhạy cảm kháng sinh chúng đợt bùng phát COPD”, Tạp chí y học lâm sàng, 108 Trần Thị Thu Hằng (2009), Thuốc sử dụng hóa trị liệu, Dược lực học, Nxb Phương Đông, tr 681 – 685 Phạm Thị Hóa, Lê Kim Phụng, Lương Lệ Nhi (2010), Hợp chất thiên nhiên thuốc y học cổ truyền, Dược học cổ truyền, Bộ môn dược học cổ truyền, tr 11 – 24 Nguyễn Hồng Lâm, (2009), Nghiên cứu tình hình kháng kháng sinh vi khuẩn Moraxella catarrhalis khả măng gây bệnh chúng bệnh viện Tai Mũi Họng Trung Ương từ tháng năm 2007 đến tháng năm 2008, Khóa luận tốt nghiệp, trường Đại hoc Khoa Học Tự nhiên Phạm Thùy Linh (2010), Nghiên cứu công nghệ sản xuất sử dụng chất diệt khuẩn sinh học (nicin enterocin) dùng bảo quản nông sản thực phẩm, Luận án tiến sỹ sinh học, Viện công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Nguyễn Thị Thanh Loan cộng (2011), “ Tác dụng chống béo phì giảm trọng lượng dịch chiết táo mèo Docynia indica (Wall.) Decne mô hình chuột béo phì thực nghiệm”, Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội, 27, tr 125 – 133 Đỗ Tất Lợi (2001), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học Vũ Văn Ngũ (1987), Các tác nhân gây viêm cấp tính đường hô hấp trẻ em tuổi, Nxb Y học, tr 3-7 Nguyễn Phi Kim Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Nxb ĐH Quốc gia TP Hồ Chí Minh Đỗ Quyết (2010), “Nguyên nhân vi khuẩn giai đoạn đầu sau đợt bùng phát bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính”, Tạp chí y – dược học quân sự, Vũ Thị Hạnh Tâm (2011), Nghiên cứu tác dụng hạ lipid đường huyết dịch chiết táo mèo (Docynia indica (Wall.) Dene) mô hình chuột thực nghiệm, Luận văn tốt nghiệp, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội II 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 TÀI LIỆU TIẾNG ANH Akinjogunla, O.J and Eghafona, N.O (2011), “Prevalence, Haemolytic activities and flouroquinolones susceptibility profiles of Moraxella catarrhalis, Streptococcus pneumoniae associated with acut otitis media”, Nature and Science, 9(6), pp 85 – 92 Austria R (1981), “Pneumococcus: The first one hundred years”, Rev Infect, 3, pp – 183 Borris, R.P (1996), “ Natural products research: perspective from a major pharmaceutical company”, J Ethnopharmacol, 51, pp 29 – 38 Catlin BW (1990), “Branhamella catarrhalis: an organism gaining respect as a pathogen”, Clinical Microbiology Reviews, 3, pp 293 – 320 Cees M Verduin, Cees Hol, Andre Fleer, Hans van Dijk, and Alexvan Belkum (2002), “ Moraxella catarrhalis: from Emerging to Established pathogen”, Clinical Microbiology Reviews, 15(1), pp 125 – 144 Chen H., Hoover D.G (2003), “Bacteriocins and their food application”, Compre Rev in Foood Scien Food Safety, 2(3), pp 82-100 Cleveland J., Montville T J., Nes I F., Chikindas M L (2001), “Bacteriocins: Safe, natural antimicrobials for food preservation”, Int J Food Microbiol, 71, pp 1-20 Critchley et al (2002), “Antimicrobial resistance among respiratory pathogens collected in Thailand during 1999- 2000”, J Chemother, 14, pp 147- 154 Dask., R.K.S Tiwari and D.K.Shrivastava (2010), “ Techniques for evaluation of medicinal plant products as antimicrobial agent: Curent methods and future trends”, Journal of Medicinal Plants Research, (2), pp 104-111 Ejlertsen T, Thisted E, Ebbesen F, Olesen B, Renneberg J (1994), “ Branhamella catarrhalis in children and adults A study of prevalence, time of coloisation, and association with upper and lower respiratory tract infections”, J Infect, 29, pp 23- 31 Fang G., Fine M., Orloff J., et al (1990), “New and emerging etilogies for community – acquired pneumonia with implications for therapy”, Medicine, 69, pp 307 – 316 FAO yearbook (2008), pp 35 – 37 Frances M.Boyle, Paul R Georghiou, martyn H Tilse & Joseph G McCormack (1991), " Branhamella (Moraxella) catarrhalis: pathogenic significance in respiratory infection", The Medical Journal of Australia, 154, pp 592-596 Hongli Qiu, Wakako Kumita, Kenya Sato , Shinichi Nakajima, Hiroyuki 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 Nishiyama , Ryoichi Saito, Etsuko Sawabe, Emi Ono, Toshio Chida and Noboru Okamura (2009), “uspA1 of Moraxella catarrhalis Clinical Isolates in Japan and its Relationship with Adherence to HEp-2 Cells”, Med Dent Sci, 56, pp 61-67 Jacobs MR (1996), “ Increaing importance f antibiotic – resistant Streptococcus pneumoniae in acute otitis media”, Pediatric Infect Dis J 15, pp 940 – 943 Karalus, R., and A.Campagnan (2000), “Moraxella catarrhalis, a review of an important human mucosal pathogen”, Microbes Infect, 2, pp 547 – 559 Klaenhammer T.R (1993), “Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria”, FEMS Microbiol Rev, 12, pp 39-85 Krystal, Reval, LauraA.Dobbs, Sungeeta Narr, Janak A.Patel, Jame J.Grady, Tasnee Chonmaitree (2007), “Incidence of Acute Otiris Media and Sinusitis complicating Upper Respiratory Tract Infection: The effect of age”, Pediatric, 119(6), pp 1408- 1412 M.C.Enright, H.Mc Kenzie (1997), “Moraxella (Branhamella) catarrhalis – clinical and molecular aspects of a redicovered pathogen”, J.Med Microbiol, 46, pp 360- 371 Marjorie Murphy Cowan (1999), “ Plant products as antimicrobial agents”, Clinical Microbiology Reviews, 12(4), pp 564- 582 Meyer GA, Shope TR, Waecker NJ, Lanningham FH (1995), “ Moraxella (Branhamella) catarrhalis bacteremia in children A report of two patients and review of literature”, Clin Pediatr, 34, pp 146- 150 Moerman, D.E (1996), “ An analysis of the food plants and drug plants of native North America”, I.Ethopharmacol, 58, pp 85- 88 Riley M.A., Wertz J.E (2002), “Bacteriocins: evolution, ecology, and application”, Annual Review of Microbiology, 56, pp 117-137 Rohani et al (1999), “Antimicrobial resistance among respiratory pathogens collected in Malaysia”, Int Med Res J, 3, pp 57 Timothy F Murphy, G Iyer Parameswaran, (2009), “Moraxella catarrhalis, a Human Respiratory Tract Pathogen”, Clinical Infectious Diseases, 49, pp 124–31 Vaneechoutte M, Verschraegen G, Clayeys G, Weise B, Van den Abeele (1990), “Respiratory tract carrier rates of Moraxella (Branhamella) catarrhalis in adults and children and interpretation of the isolation of M.catarrhalis from sputum”, J Clin Microbiol, 28, pp 2674 – 2680 Vu Thi Hue, Bui Thi Viet Ha (2010), “ Study on antibacterial activity toward bacteria causing upper respiratory (Moraxella catarrhalis) of Bacillus sp TM1.2 isolated from vinegar Docynia fruit (Docynia indica (Wall.) Decne)”, J Scien anh Technol, 26(4), pp 537-542 CÁC WEBSITE 50 http://www.duoclieu.org PHỤ LỤC Phụ lục 01 Thành phần môi trường nuôi cấy VSV sử dụng nghiên cứu Môi trường thạch thường Peptone 10g Nước mắm 20ml Thạch 16g Nước cất 1000ml pH Môi trường LB Peptone 10g Cao nấm men 5g NaCl 5g Nước cất 1000ml pH Môi trường giá đỗ Giá đỗ Glucoza 100g 10g Nước cất 1000ml pH 6,8 Phụ lục 02: Một số hình ảnh liên quan đến luận văn Hình 1: Khuẩn lạc chủng TM5.2 Hình 3: Khuẩn lạc M.catarrhalis Hình 2: Tế bào chủng TM5.2 (x 10.000) Hình 4: Tế bào M.catarrhalis Hình 5: Quả táo mèo Hình 6: Dịch lên men táo mèo Hình 7: Hoạt tính kháng M.catarrhalis dịch lên men táo mèo 1: Dịch lên men táo mèo nguyên chất (pH 4,3) 2: Dịch lên men táo mèo nguyên chất (pH 7) 3: Đối chứng Hình 8: Hoạt tính kháng M.catarrhalis dịch lên men táo mèo với tỷ lệ pha khác với nước cất 1: Dịch lên men táo mèo nguyên chất 2: Tỷ lệ 1:1 3: Tỷ lệ 1:2 4: Tỷ lệ 1:3 5: Tỷ lệ 1:4 6: Đối chứng Hình 9: Hoạt tính kháng M.catarrhalis chủng TM5.2 1: Dịch lên men TM5.2 2: Đối chứng Hình 10: Hoạt tính kháng M.catarrhalis phân đoạn tách chiết từ dịch lên men TM5.2 1: PĐ - 4: Đối chứng Hình 11: Hoạt tính kháng khuẩn M.catarrhalis cao dịch chiết táo mèo nồng độ khác 1: Nồng độ cao 50mg/ml 2: Nồng độ cao 100mg/ml 3: Đối chứng 3: PĐ Hình 12: Hoạt tính kháng khuẩn M.catarrhalis phân đoạn tách chiết từ táo mèo 1: PĐ 2: PĐ 3: PĐ 4: Đối chứng PĐ PĐ Hình 13: Sắc ký mỏng phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn dịch lên men chủng TM5.2 PĐ PĐ PĐ Hình 14: Sắc ký mỏng phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết táo mèo [...]... hoạt tính kháng M catarrhalis của dịch lên men quả táo mèo chịu tác động của pH, nồng độ các chất trong dịch Từ dịch lên men quả táo mèo tiến hành phân lập, tuyển chọn vi khuẩn có khả năng kháng M catarrhalis kháng kháng sinh 3.2 TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT 3.2.1 Phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật kháng Moraxella catarrhalis 35 Tiến hành phân lập vi khuẩn từ mẫu dịch lên men quả táo mèo trên môi... dụng kháng khuẩn rất có hiệu quả Giấm táo chứa axit malic, axit acetic, hàm lượng enzym cao rất tốt cho tiêu hóa 1.4.5 Tình hình nghiên cứu táo mèo tại Vi t Nam Hiện nay trên thế giới chưa có nhiều nghiên cứu về cây táo mèo Docynia indica, đặc biệt là về tác dụng kháng khuẩn của quả táo mèo Tại Vi t Nam, nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Loan [15] cho thấy tác dụng chống béo phì và giảm trọng luợng của. .. tính kháng kháng với kích thước vòng kháng 20mm Dùng nước cất pha loãng dịch lên men táo mèo theo các tỷ lệ thể tích (ml) khác nhau: V 1: V2= 1: 1, 1:2, 1:3, 1:4 Trong đó V 1 là thể tích dịch lên men quả táo mèo, V 2 là thể tích nước cất Sau đó đem kiểm tra hoạt tính kháng M catarrhalis Kết quả như sau: Bảng 3.1 Hoạt tính kháng M catarrhalis của dịch lên men quả táo mèo V1 : V2 (ml: ml) Dịch lên men quả. .. có nhiều nghiên cứu chỉ ra M catarrhalis là nguyên nhân phổ biến gây bệnh vi m đường hô hấp M catarrhalis là vi khuẩn cộng sinh phổ biến ở vòm họng của trẻ em [41], một nghiên cứu trên 120 trẻ sơ sinh đã cho thấy 66% trẻ một tuổi mang vi khuẩn, tăng lên đến 77,5% ở trẻ hai năm tuổi, điều này cho thấy trẻ em có nguy cơ cao bị các bệnh đường hô hấp, đặc biệt là hô hấp trên [20] Những nghiên cứu khác... Dịch lên men quả táo mèo Dịch lên men quả táo mèo 1:1 1:2 1:3 1:4 HTKK (D-d,mm) 13 20 16 10 3 0 pH sau pha 7 4,3 4,8 5,1 5,3 5,5 Cho thấy dịch lên men quả táo mèo nguyên chất có hoạt tính kháng M catarrhalis mạnh nhất, hoạt tính kháng giảm dần theo tỷ lệ pha loãng và tại tỷ lệ pha 1: 4 dịch không còn hoạt tính Dịch lên men quả táo mèo khi đưa về pH trung tính có hoạt tính kháng khuẩn thấp hơn so với... khô, hệ thống chiết pha rắn, cột sắc ký… 2.2 PHƯƠNG PHÁP 2.2.1 Phương pháp lên men quả táo mèo Sử dụng 1kg quả táo mèo tươi, rửa sạch, cắt thành các phần nhỏ, để nguyên hạt, cho vào bình thủy tinh Bổ sung 3 lít nước đun sôi ấm (khoảng 40 0C), 300 g đường, 30 g muối , đậy kín bình bằng vải màn Sau một tháng thu dịch lên men quả táo mèo – giấm táo mèo 2.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn Dịch lên men quả. .. của dịch chiết quả Táo mèo Docynia indica (Wall.) Decne trên mô hình chuột béo phì thực nghiệm Theo Vũ Thị Hạnh Tâm [20] nghiên cứu và ghi nhận vai trò hạ lipit và đường huyết của dịch chiết quả táo mèo trên chuột Hoàng Thị Minh Tân [21] quả và lá táo mèo có khả năng chống 23 rối loạn trao đổi gluxit và lipit Vũ Thị Huê, Bùi Thị Vi t Hà [49] đã có những nghiên cứu sơ bộ ghi nhận về tác dụng kháng khuẩn. .. cao nấm men, peptone Các bước tiếp theo tiến hành tương tự như trên • Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy Vi khuẩn được nuôi cấy lắc trên môi trường với nguồn cacbon, nitơ, pH thích hợp, cứ sau 24h lại lấy mẫu để xác định OD, pH, hoạt tính enzym, hoạt tính kháng khuẩn 2.2.7 Tách chiết các hợp chất trong dịch lên men vi khuẩn và dịch lên men quả táo mèo [18] 2.2.7.1 Phương pháp đông khô Đông khô là quá... triển trong đó có Vi t Nam với gánh nặng của các bệnh nhiễm khuẩn và những chi phí bắt buộc cho vi c thay thế các kháng sinh cũ bằng kháng sinh mới đắt tiền Cùng với bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa, bệnh lây nhiễm qua đường tình dục và nhiễm khuẩn bệnh vi n, bệnh nhiễm khuẩn đường hô hấp là một trong những nguyên nhân hàng đầu có tỷ lệ mắc và tử vong cao ở các nước đang phát triển Thực tế vi c kiểm soát... nguy hiểm của chúng đối với sức khỏe con người, đặc biệt là với trẻ em, người già Một vấn đề rất được quan tâm và chú trọng nghiên cứu hiện nay chính là tính kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn gây bệnh hô hấp, trong đó đặc biệt là của M catarrhalis 1.2.3 Tính kháng kháng sinh của Moraxella catarrhalis 13 Vấn đề về thực trạng kháng kháng sinh đã mang tính toàn cầu và đặc biệt nổi trội ở các nước