ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - VŨ XUÂN ĐẠT NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG NẤM LECANICILLIUM KÍ SINH CÔN TRÙNG ĐỂ KIỂM SOÁT RỆP HẠI RAU LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2011 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - VŨ XUÂN ĐẠT NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG NẤM LECANICILLIUM KÍ SINH CÔN TRÙNG ĐỂ KIỂM SOÁT RỆP HẠI RAU Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS QUYỀN ĐÌNH THI LUẬN VĂN ĐƯỢC THỰC HIỆN Ở VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - 2011 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, xin chân thành cảm ơn PGS TS Quyền Đình Thi, Trưởng phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Phó Viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, định hướng nghiên cứu, sửa luận văn tạo điều kiện kinh phí, hóa chất thiết bị Tôi xin chân thành cảm ơn TS Vũ Văn Hạnh hướng dẫn thí nghiệm, trao đổi chuyên môn chỉnh sửa luận văn tập thể Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme giúp đỡ tận tình Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy, cô khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội tạo điều kiện cho trình học tập Tôi xin chân thành cảm ơn Học viện Hậu cần, Bộ Quốc phòng cử đào tạo sau đại học Tôi xin cảm ơn gia đình bạn bè luôn động viên tinh thần để hoàn thành luận văn Hà Nội, tháng 11 năm 2011 Học viên Vũ Xuân Đạt Trường Đại học KHTN i Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Rệp hại trồng 1.1.1 Đặc điểm sinh học 1.1.2 Tình hình rệp hại trồng giới 1.2 Thuốc diệt côn trùng hóa học 1.2.1 Tình hình sản xuất sử dụng 1.2.2 Ưu nhược điểm 1.3 Thuốc diệt côn trùng nguồn gốc sinh học 11 1.3.1 Phân loại 11 1.3.2 Ưu nhược điểm 12 1.3.3 Tình hình nghiên cứu, sản xuất sử dụng 13 1.3.4 Khả kiểm soát rệp hại trồng nấm Lecanicillium 17 1.4 Sản xuất bào tử nấm kí sinh côn trùng 18 1.5 Ảnh hưởng môi trường lên sinh bào tử nấm Lecanicillium .19 1.5.1 Nguồn carbon 19 1.5.2 Nguồn nitơ 20 1.5.3 Nhiệt độ môi trường 21 1.5.4 Độ ẩm không khí độ ẩm chất 21 1.5.5 Một số yếu tố khác 21 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị 23 2.1.1 Chủng giống plasmid 23 2.1.2 Hóa chất 23 2.1.3 Dung dịch đệm 24 2.1.4 Môi trường nuôi cấy 24 Trường Đại học KHTN ii Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt 2.1.5 Thiết bị 24 2.2 Phương pháp nghiên cứu 25 2.2.1 Sàng lọc chủng nấm có độc lực diệt rệp cao 25 2.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử 27 2.2.3 Xác định ảnh hưởng điều kiện môi trường lên sinh bào tử chủng nấm 485 29 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Sàng lọc chủng nấm có độc lực cao 32 3.2 Định tên chủng nấm 485 34 3.3 Ảnh hưởng điều kiện môi trường lên sinh bào tử L lecanii 485 36 3.3.1 Ảnh hưởng nguồn chất 36 3.3.2 Ảnh hưởng tỉ lệ thành phần chất 37 3.3.3 Ảnh hưởng độ dày chất 37 3.3.4 Ảnh hưởng độ ẩm chất 39 3.3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ 40 3.3.6 Ảnh hưởng số nguồn nitơ vô 41 3.3.7 Ảnh hưởng nồng độ (NH4)2SO4 42 3.3.8 Ảnh hưởng nồng độ MgSO4 43 3.3.9 Ảnh hưởng nồng độ KH2PO4 44 3.3.10 Ảnh hưởng thời gian chiếu sáng 45 3.3.11 Ảnh hưởng thời gian lên men 46 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC 60 Trường Đại học KHTN iii Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Thiệt hại số trồng rệp Vương quốc Anh Bảng 2.1 Các dung dịch đệm 24 Bảng 2.2 Các thiết bị 25 Trường Đại học KHTN iv Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Cấu tạo rệp Hình 1.2 Rệp hại trồng Hình 1.3 Vòng đời rệp Hình 2.1 Lá cải có rệp sau phun dịch bào tử nấm 26 Hình 3.1 Kết phun bào tử nấm lên rệp cải 32 Hình 3.2 Độc lực diệt rệp chủng Lecanicillium spp 33 Hình 3.3 Điện di đồ DNA nhân gene 28S rRNA 34 Hình 3.4 Trình tự gene 28S rRNA chủng 485 (A) phân loại (B) 35 Hình 3.5 Ảnh hưởng nguồn chất 36 Hình 3.6 Ảnh hưởng tỉ lệ bột lõi ngô/bột ngô môi trường 37 Hình 3.7 Ảnh hưởng độ dày chất 38 Hình 3.8 Ảnh hưởng độ ẩm chất 39 Hình 3.9 Ảnh hưởng nhiệt độ 40 Hình 3.10 Ảnh hưởng số nguồn nitơ vô 41 Hình 3.11 Ảnh hưởng nồng độ (NH4)2SO4 42 Hình 3.12 Ảnh hưởng nồng độ MgSO4 44 Hình 3.13 Ảnh hưởng nồng độ KH2PO4 45 Hình 3.14 Ảnh hưởng thời gian chiếu sáng 46 Hình 3.15 Ảnh hưởng thời gian lên men 47 Trường Đại học KHTN v Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt BẢNG CHỮ VIẾT TẮT bp DNA dNTP ĐC Base pair Deoxyribonucleic acid 2′-Deoxynucleoside 5′-triphosphate Đối chứng EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid EtBr Ethidium bromide M Marker OD Optical density PCR Polymerase chain reaction RNase Ribonuclease SDS Sodium dodecyl sulfate Taq Thermus aquaticus TE Tris EDTA TBE Tris boric acid EDTA v/v volume/volume w/v weight/volume w/w weight/weight Trường Đại học KHTN vi Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt MỞ ĐẦU Rệp (Aphidoidae) nhóm côn trùng chích hút nhựa phổ biến giới, phân bố rộng rãi vùng ôn đới, cận nhiệt đới nhiệt đới Chúng kí sinh 11000 loài thuộc 243 họ khác nhau, có nhiều trồng quan trọng bông, cải, cải dầu, loại đậu, cà chua, khoai tây, ngũ cốc [39] Rệp không phá hoại trực tiếp cách chích hút nhựa mà truyền virus gây bệnh cho Hàng năm, rệp với côn trùng khác gây thiệt hại 15% sản lượng trồng toàn giới [22] Do tính chất nguy hại rệp, việc sử dụng biện pháp phòng trừ rệp cần thiết Biện pháp phòng trừ rệp phổ biến sử dụng thuốc diệt côn trùng hóa học Mặc dù có ưu điểm phổ tác dụng rộng hiệu tác dụng nhanh, thuốc hóa học ngày bộc lộ rõ nhược điểm nhanh bị kháng côn trùng sau thời gian sử dụng, gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người Với ưu điểm vượt trội độ thân thiện với môi trường, hệ sinh thái sức khỏe người, thuốc diệt côn trùng sinh học coi lựa chọn có tiềm lớn xu hướng phát triển nông nghiệp bền vững Lecanicillium chi nấm có khả kí sinh tự nhiên rệp nhiều loài côn trùng khác Từ năm 1960, giới có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng Lecanicillium để diệt rệp bảo vệ trồng, nhiều sản phẩm sản xuất thương mại hóa Tuy nhiên, kết đạt nghiên cứu sử dụng thuốc diệt côn trùng sinh học hạn chế Năm 2000, giá trị thương mại thuốc diệt côn trùng sinh học sử dụng toàn giới chiếm 1,8% tổng giá trị loại thuốc diệt côn trùng Vì vậy, việc tăng cường nghiên cứu phát triển chế phẩm diệt rệp từ nấm Lecanicillium cần thiết Trong khuôn khổ đề tài hợp tác quốc tế Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, viện Công nghệ Sinh học, viện KH CN Việt Nam năm 2010-2013 Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn làm chủ quản, thực đề tài: "Nghiên cứu sử dụng nấm Lecanicillium kí sinh côn trùng để kiểm soát rệp hại rau" Trường Đại học KHTN Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Rệp hại trồng 1.1.1 Đặc điểm sinh học Rệp (Aphidoidae) họ lớn thuộc lớp côn trùng, động vật không xương sống, thể chia thành ba phần (đầu, ngực, bụng), có ba cặp chân phân đốt, mắt kép cặp râu, thể bao bọc khung kitin, chiều dài từ đến 10 mm (hình 1.1) Khoảng 3700 loài rệp biết đến giới [39] Râu Đầu Ngực Bụng Mắt Mắt kép chân Ống tiết Đuôi chân Vòi chích hút chân Hình 1.1 Cấu tạo rệp Rệp nhóm côn trùng chích hút nhựa phổ biến giới, phân bố tập trung vùng ôn đới [51], rệp phân bố phổ biến vùng nhiệt đới cận nhiệt với độ đa dạng thấp Khoảng 250 loài rệp côn trùng phá hoại nguy hiểm nông, lâm nghiệp cần kiểm soát Tuy nhiên, đứng quan điểm động vật học, rệp nhóm động vật thích nghi tốt với môi trường nhờ khả sinh sản vô tính [67] Phần lớn rệp có thân mềm, màu xanh, đen, nâu, hồng không màu (hình 1.2) Phương thức dinh dưỡng rệp chích hút nhựa miệng có cấu tạo kiểu chích hút Khi chất dinh dưỡng trở nên nghèo nàn mật độ rệp đông, số loài rệp sinh có cánh để phát tán nơi khác Nhiều loài rệp kí sinh loài nhất, số khác chẳng hạn nh Myzus Trường Đại học KHTN Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt pesticide use, and cancer incidence in the agricultural health study cohort”, Cancer Causes Control, 21(11), pp 1759-1775 Angelo I C., Fernandes E K., Bahiense T C., Perinotto W M., Moraes A P., Terra A L., Bittencourt V R (2010), “Efficiency of Lecanicillium lecanii to control the tick Rhipicephalus microplus”, Vet Parasitol, 172(3-4), pp 317-322 10 Arevalo J., Hidalgo-Díaz L., Martins I., Souza J F., Castro J M C., Carneiro R M D G., Tigano M S (2009), “Cultural and morphological characterization of Pochonia chlamydosporia and Lecanicillium psalliotae isolated from Meloidogyne mayaguensis eggs in Brazil”, Trop Plant Pathol, 34(3), pp 158-163 11 Aspelin A L., Grube A H (1999), Pesticides industry sales and usage 1996 and 1997 market estimates, United States EPA 12 Barson G (1976), “Laboratory studies on the fungus Verticillium lecanii, a larval pathogen of the large elm bark beetle (Scolytus scolytus)”, Ann Appl Biol, 83, pp 207-214 13 Baysal Z., Uyar F., Aytekin C (2003), “Solid state fermentation for production of α-amylase by a thermotolerant Bacillus subtilis from hot-spring water”, Process Biochem, 38, pp 1665-1668 14 Blair A., Freeman L B (2009), “Epidemiologic studies of cancer in agricultural populations: observations and future directions”, J Agromed, 14, pp 125-131 15 Brar N S., Bakhetia D R C., Sekhon B S (1987), “Estimation of losses in yield of rapeseed and mustard due to mustard aphid, Lipaphis erysimi (Kalt.)”, J Oilseeds Res, 4(2), pp 261-264 16 Bukhari T., Takken W., Koenraadt C J M (2011), “Development of Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana formulations for control of malaria mosquito larvae”, Parasit Vectors, 4(23), pp 1-14 Trường Đại học KHTN 51 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt 17 Carrasco-Tauber C (1989), Pesticide Productivity Revisited, MA, University of Massachusetts 18 Catangui M A., Beckendorf E A., Riedell W E (2009), “Soybean aphid population dynamics, soybean yield loss, and development of stage-specific economic injury levels”, Agron J, 101(5), pp 1080-1092 19 CEQ (1980), The Global 2000 Report to the President of the US Entering the 21st Century, Pergamon Press, New York 20 Colborn T., Myers J P., Dumanoski D (1996), Our Stolen Future: How We Are Threatening Our Fertility, Intelligence, and Survival: A Scientific Detective Story, Dutton, New York 21 Cuthbertson A G S., Blackburn L F., Northing P., Luo W., Cannon R J C., Walters K F A (2010), “Chemical compatibility testing of the entomopathogenic fungus Lecanicillium muscarium to control Bemisia tabaci in glasshouse environment”, Int J Environ Sci Tech, 7(2), pp 405-409 22 Damalas C A (2009), “Understanding benefits and risks of pesticide use”, Sci Res Essay, 4(10), pp 945-949 23 De Faria M R., Wraight S P (2007), “Mycoinsecticides and Mycoacaricides: A comprehensive list with worldwide coverage and international classification of formulation types”, Biol Control, 43, pp 237-256 24 Diaz B M., Oggerin M., Lopez Lastra C C., Rubio V., Fereres A (2009), “Characterization and virulence of Lecanicillium lecanii against different aphid species”, Bio Control, 54, pp 825–835 25 El-Defrawi G M., El-Harty E H (2009), Injury levels and yield loss model for the cowpea aphid (Aphis craccivora Koch) on Vicia faba L., 6th International Symposium of Mediterranean Group on Pesticide Research, Cairo, Egypt 26 Feng K C., Liu B L., Tzeng Y M (2000), “Verticillium lecanii spore production in solid-state and liquid-state fermentations”, Bioprocess Biosyst Eng, 23, pp 25-29 Trường Đại học KHTN 52 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt 27 Gao L., Liu X Z (2009), “A novel two stage cultivation method to optimize carbon concentration and carbon to nitrogen ratio for sporulation of biocontrol fungi”, Folia Microbiol, 54(2), pp 142-146 28 Gary C J., Liberty P A., Jocelyn B P (2005), “Effect of nitrogen fertilizer on the intrinsic rate of increase of the rusty plum aphid, Hysteroneura setariae (Thomas) (Homoptera: Aphididae) on rice (Oryza sativa L.)”, Environ Entomol, 34(4), pp 938-943 29 Gindin G., Levski S., Glazer I., Soroker V (2006), “Evaluation of the entomopathogenic fungi Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana against the Red Palm Weevil Rhynchophorus ferrugineus”, Phytoparasitica, 34(4), pp 370-379 30 Gopalakrishnan C (1989), “Susceptibility of cabbage diamondback moth Plutella xylostella L to the entomofungal pathogen Verticillium lecanii (Zimmerman)”, Viegas Current Science, 58(22), pp 1256-1257 31 Grube A., Donaldson D., Kiely T., Wu L (2011), Pesticides industry sales and usage, 2006 and 2007 market estimates, United States EPA 32 Guclu S., Ak K., Eken C., Akyol H., Sekban R., Beytut B., Yildirim R (2010), “Pathogenicity of Lecanicillium muscarium against Ricania simulans”, Bull Insectol, 63(2), pp 243-246 33 Hall R A (1981), “A new insecticide against greenhouse aphids and whitefly: the fungus Verticillium lecanii”, Ohio Florists’ Assoc Bull, 626, pp 3-4 34 Hart K., Pimentel D (2002), “Public health and costs of pesticides”, Encyclopedia of Pest Management, Marcel Dekker, New York, pp 677-679 35 Heathcote G D (1962), “The suitability of some plant hosts for the development of the peach-potato aphid, Myzus persicae (Sulzer)”, Entomol Exp Appl, 5(2), pp 114-118 36 Henry G S (1997), “Aphid”, McGraw-Hill Encyclopedia of Science and Technology, McGraw-Hill, New York Trường Đại học KHTN 53 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt 37 Ho Q T., Tran T P., Nguyen T., Tran V H., Trinh T X., Bui X H., Dang T C., Tran T B (2010), Rearing Metarhizium anisopliae fungi at the household level for management of brown planthoppers in rice fields, 28th International Rice Research Conference, Hanoi, Vietnam 38 Hohenadel K., Harris S A., Mclaughlin J R., Spinelli J J., Pahwa P., Dosman J A., Demers P A., Blair A (2011), “Exposure to multiple pesticides and risk of non-Hodgkin lymphoma in men from six Canadian provinces”, Int J Environ Res Public Health, 8, pp 2320-2330 39 Holman J (2009), Host Plant Catalog of Aphids: Palaearctic Region, Springer Verlag, Berlin, Germany 40 Hossain A., Ferdous J., Salim M M R (2006), “Relative abundance and yield loss assessment of Lentil aphid, Aphis craccivora Koch in relation to different sowing dates”, J Agric Rural Dev, 4, pp 101-106 41 Howard T D., Hsu F C., Grzywacz J G., Chen H., Quandt S A., Vallejos Q M., Whalley L E., Cui W., Padilla S., Arcury T A (2010), “Evaluation of candidate genes for cholinesterase activity in farmworkers exposed to organophosphorus pesticides: Association of single nucleotide polymorphisms in BCHE”, Environ Health Perspect, 118(10), pp 1395-1399 42 Jenkins N E., Heviefo G., Langewald J., Cherry A J., Lomer C J (1998), “Development of mass production technology for aerial conidia for use mycopesticides”, Biocontrol News Inf, 19(1), pp 21-31 43 Johnson D L., Huang H C., Harper A M (1988), “Mortality of grasshoppers (Orthoptera: Acrididae) inoculated with a Canadian isolate of the fungus Verticillium lecanii”, J Invertebr Pathol, 52, pp 335-342 44 Kaiser W J., Danesh D (1971), “Biology of four viruses affecting Cicer arietinzrm in Iran”, Phytopathology, 61, pp 372-375 45 Kiely T., Donaldson D., Grube A (2004), Pesticides industry sales and usage, 2000 and 2001 market estimates, United States EPA Trường Đại học KHTN 54 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt 46 Kim H Y., Lee H B., Kim U C., Kim I S (2008), “Laboratory and field evaluations of entomopathogenic Lecanicillium attenuatum CNU-23 for control of green peach aphid (Myzus persicae)”, J Microbiol Biotechnol, 18(12), pp 1915-1918 47 Kim J J., Lee M H., Yoon C S., Kim H S., Yoo J K., Kim K C (2001), “Control of cotton aphid and greenhouse whitefly with a fungal pathogen”, Biological Control of Greenhouse Pests, Food & Fertilizer Technology Center, Taipei, Taiwan, pp 8-15 48 Kleespies R G., Zimmermann G (1992), “Production of blastospores by three strains of Metarhizium anisopliae (Metch.) Sorok In submerged culture”, Biocontrol Sci Technol, 2, pp 127-135 49 Kope H H., Alfaro R I., Lavallée R (2008), “Effects of temperature and water activity on Lecanicillium spp conidia germination and growth, and mycosis of Pissodes strobi”, BioControl, 53, pp 489-500 50 Le V V., Nguyen D D., Le K A., Pham K S., Tetsu A (2011), “Sex pheromone components and control of the citrus pock caterpillar, Prays endocarpa, found in the Mekong Delta of Vietnam”, J Chem Ecol, 37(1), pp 134-140 51 Mcgavin G C., Preston-Mafham K (1993), Bugs of the World, Of the World Series, Facts on File, New York 52 Miller G T (2002), Living in the Environment: Principles, Connections, and Solutions (12th Ed.), Wadsworth/Thomson Learning, Belmont, Califorlia 53 Milner R J (1997), “Prospects for biopesticides for aphid control”, Biocontrol, 42(1-2), pp 227-239 54 Moazami N (2002), “Biopesticides production”, Encyclopedia of Biological physiological and Health Sciences, Encyclopedia Of Life Support Systems, pp 1-52 55 Moo Y., Moreira M A R., Tengerdy R P (1983), “Principles of solid substrate fermentation”, Fungal Technology, Edward Arnold, London, pp 117-144 Trường Đại học KHTN 55 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt 56 Mussen E (1990), “California crop pollination”, Gleanings in Bee Culture, 118, pp 646-647 57 Nault L R (1997), “Arthropod transmission of plant viruses: a new synthesis”, Ann Entomol Soc Amer, 90, pp 521-541 58 Nene Y L., Reddy M V (1976), “Preliminary information on chickpea stunt”, Tropical Grain Legume Bulletin, 5, pp 31-32 59 Nevo E., Coll M ( 2001), “Effect of nitrogen fertilization on Aphis gossypii (Homoptera: Aphididae): variation in size, color, and reproduction”, J Econ Entomol, 94(1), pp 27-32 60 Ofuya T T (1997), “Control of cowpea aphid, Aphis craccivora Koch (Homoptera: Aphididae), in cowpea, Vigna unguiculata (L.) Walp.” Integr Pest Manag Rev, 2(4), pp 199-207 61 Patel S R., Awasthi A K., Tomar R K S (2004), “Assessment of yield losses in mustard (Brassica juncea L.) due to mustard aphid (Lipaphis erysimi Kalt.) under differrent thermal environments in Eastern Central India”, Appl Eco Environ Res, 2(1), pp 1-15 62 Pham T A., Kim J J., Kim K (2010), “Optimization of solid-state fermentation for improved conidia production of Beauveria bassiana as a mycoinsecticide”, Mycobiology, 38(2), pp 137-143 63 Pimentel D (1997), “Pest management in agriculture”, Techniques for Reducing Pesticide Use: Environmental and Economic Benefits, John Wiley & Sons, Chichester, UK, pp 1-11 64 Pimentel D (2005), “Enviromental and economic costs of the application of pesticides primarily in the United States”, Environ Dev Sustain, 7, pp 229252 65 Pimentel D., Acquay H., Biltonen M., Rice P., Silva M., Nelson J., Lipner V., Giordana S., Horowitz A., D’amore M (1993), “Assessment of environmental and economic impacts of pesticide use”, The Pesticide Trường Đại học KHTN 56 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt Question: Environment, Economics and Ethics, Chapman & Hall, New York, pp 47-84 66 Pimentel D., Stachow U., Takacs D A., Brubaker H W., Dumas A R., Meaney J J., O’neil J A S., Onsi D E., Corzilius D B (1992), “Conserving biological diversity in agricultural/forestry systems”, Bioscience, 42, pp 354-362 67 Piper R., Shanahan M (2007), Extraordinary Animals: An Encyclopedia of Curious and Unusual Animals, Greenwood Press, United States 68 Raimbault M (1998), “General and microbiological aspects of solid substrate fermentation”, Electron J Biotechnol, 1(3), pp 1-15 69 Razaq M., Mehmood A., Aslam M., Ismail M., Afzal M., Ali-Shad S (2011), “Losses in yield and yield components caused by aphids to late sown Brassica napus L., Brassica juncea L and Brassica carrinata A at Multan, Punjab (Pakistan)”, Pak J Bot, 43(1), pp 319-324 70 Richter E D (2002), “Acute human pesticide poisonings”, Encyclopedia of Pest Management, Dekker, New York, pp 3-6 71 Ridgway R L., Tinney J C., Macgregor J T., Starlert N J (1978), “Pesticide use in agriculture”, Environ Health Perspect, 27, pp 103-112 72 Riedell W E., Catangui M A., Beckendorf E A (2009), “Nitrogen, fixation, ureide, and nitrate accumulation responses to soybean aphid injury in Glycine max”, J Plant Nutr, 32(10), pp 1674-1686 73 Rombach M C (1989), “Production of Beauveria bassiana [Deuteromycotina: Hyphomycetes] sympoduloconidia in submerged culture”, Entomophaga, 34, pp 45-52 74 Shi Y., Xu X., Zhu Y (2009), “Optimization of Verticillium lecanii spore production in solid-state fermentation on sugarcane bagasse”, App Microbiol Biotechnol, 82, pp 921-927 Trường Đại học KHTN 57 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt 75 Shingleton A W., Sisk G C., Stern D L (2003), “Diapause in the pea aphid (Acyrthosiphon pisum) is a slowing but not a cessation of development”, BMC Dev Biol, 3(7), pp 1-12 76 Singh C P., Sachan G C (1994), “Assessment of yield losses in yellow sarson due to mustard aphid, Lipaphis erysimi (Kalt)”, J Oilseeds Res, 11(2), pp 179-184 77 Sylvester E S (1980), “Circulative and propagative virus transmission by aphids”, Ann Rev Entomol, 25, pp 257-286 78 Tatchell G M (1989), “An estimate of the potential economic losses to some crops due to aphids in Britain”, Crop Prot, 8, pp 25-29 79 Thackray D J., Diggle A J., Berlandier F A., Jones R A (2004), “Forecasting aphid outbreaks and epidemics of Cucumber mosaic virus in lupin crops in a Mediterranean-type environment”, Virus Res, 100(1), pp 67-82 80 Vu V H., Hong S I., Kim K (2007), “Selection of entomopathogenic fungi for aphid control”, J Biosci Bioeng, 104(6), pp 498-505 81 Vu V H., Hong S I., Kim K (2008), “Production of aerial conidia of Lecanicillium lecanii 41185 by solid-state fermentation for use as mycoinsecticide”, Mycobiology, 36(3), pp 183-189 82 Weiner B P., Worth R M (1972), “Insecticides: household use and respiratory impairment”, Adverse Effects of Common Environmental Pollutants, MSS Information Corporation, New York, pp 149-151 83 Xia J (1997), Biological control of cotton aphid (Aphis gossypii Glover) in cotton (inter) cropping systems in China: a simulation study, S.L Xia, Florida 84 Xu X., Yu Y., Shi Y (2011), “Evaluation of inert and organic carriers for Verticillium lecanii spore production in solid-state fermentation”, Biotechnol Lett, 33, pp 763-768 85 Zare R., Gams W (2001), “A revision of Verticillium sect Prostrata III Generic classification”, Nova Hedwigia, 72, pp 329-337 Trường Đại học KHTN 58 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt 86 Zhang M., Tang Q., Chen Z., Liu J., Cui H., Q S., Xia Y., Altosaar I (2009), “Genetic transformation of Bt gene into sorghum (Sorghum bicolor L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens”, Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao, 25(3), pp 418-423 87 Zhou P., Zhao Y., Li J., Wu G., Zhang L., Liu Q., Fan S., Yang X., Li X., Wu Y (2011), “Dietary exposure to persistent organochlorine pesticides in 2007 Chinese total diet study”, Environ Int, Epub ahead of print, available at http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0160412011001632 Trường Đại học KHTN 59 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt PHỤ LỤC Bảng 4.1 Độc lực diệt rệp cải chủng nấm Lecanicillium spp Tỉ lệ rệp chết (%) Thời gian sau phun (ngày) Đối chứng 0 L18 2,3 L43 2,6 L85 1,7 85k 12,9 485 9,2 8514 5,2 L1185 0 0 ± 4,0 1,1 ± 2,0 2,9 ± 5,1 5,1 ± 8,9 10,3 ± 17,8 17,9 ± 31,1 17,3 ± 30,0 ± 5,2 16,7 ± 19,0 29,2 ± 18,7 35,9 ± 19,4 41,0 ± 18,1 47,6 ± 19,3 46,2 ± 20,9 ±3,4 2,6 ± 1,7 11,3 ± 10,3 11,0 ± 7,4 17,1 ± 14,4 24,7 ± 30,5 24,8 ± 32,3 ±11,4 29,7 ± 28,8 47,4 ± 17,8 47,2 ± 20,1 50,5 ± 18,5 52,8 ± 22,3 56,6 ± 15,5 ± 13,1 21,5 ± 8,6 31,3 ± 21,3 51,3 ± 18,6 61,7 ± 14,6 60,8 ± 16,3 67,4 ± 7,4 ± 6,6 6,3 ± 6,1 17,8 ± 21,5 20,7 ± 24,7 32,2 ± 29,7 39,0 ± 31,8 37,5 ± 31,4 ± 4,9 7,0 ± 7,5 25,7 ± 11,2 27,3 ± 13,1 39,3 ± 10,9 49,4 ± 15,4 47,2 ± 14,3 3,4 Ghi chú: nhiệt độ 21-25°C, độ ẩm không khí 75-80% Bảng 4.2 Ảnh hưởng nguồn chất lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 TT Số lượng bào tử/g chất (x109) hiệu Lần Lần Lần Trung bình Gạo G 0,19 0,28 1,19 0,55 ± 0,55 Bột gạo BG 0,84 0,32 1,30 0,82 ± 0,49 Cám gạo CG 2,67 1,37 1,13 1,72 ± 0,83 Bột ngô BN 2,25 2,75 3,73 2,96 ± 0,76 Bột lõi ngô + bột gạo (1:1, w/w) LG 4,90 4,87 3,57 4,44 ± 0,76 Bột lõi ngô + bột ngô (1:1, w/w) LN 4,83 5,33 4,93 5,03 ± 0,26 Bột bã mía + bột gạo (1:1, w/w) MG 2,08 1,82 3,07 2,32 ± 0,66 Bột bã mía + bột ngô (1:1, w/w) MN 4,10 4,53 2,97 3,87 ± 0,81 Nguồn chất Kí Ghi chú: F = 18,57; P < 0,001 Trường Đại học KHTN 60 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt Bảng 4.3 Ảnh hưởng tỉ lệ bột lõi ngô/bột ngô môi trường lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 TT Số lượng bào tử/g chất (x109) Bột lõi ngô: bột ngô (w/w) Lần Lần Lần Trung bình 8:2 0,00 0,00 0,00 0,00 ± 0,00 7:3 0,36 0,39 0,49 0,41 ± 0,07 6:4 3,10 3,90 6,13 4,38 ± 1,57 5:5 4,40 5,40 6,30 5,37 ± 0,95 4:6 4,60 4,20 3,97 4,26 ± 0,32 3:7 3,50 3,90 3,83 3,74 ± 0,21 2:8 3,33 3,67 3,77 3,59 ± 0,23 Ghi chú: F = 25,06; P < 0,001 Bảng 4.4 Ảnh hưởng độ dày chất lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 Số lượng bào tử/g chất (x109) TT Độ dày chất (mm) Lần Lần Lần Lần Lần Lần Trung bình 6,90 6,37 5,43 6,23 ± 0,74 11 6,20 5,67 5,77 5,88 ± 0,28 13 5,40 6,27 7,17 6,28 ± 0,88 15 4,93 5,37 8,23 6,18 ± 1,79 17.5 7,30 8,03 7,07 7,47 ± 0,50 20 8,37 7,73 7,57 22,5 7,87 8,00 9,20 10,53 25 8,33 11,07 9,57 10,63 27,5 10,67 10,07 10,17 10,32 ± 0,32 10 30 9,20 10,40 9,79 ± 0,60 6,93 8,33 9,60 9,04 ± 1,12 9,90 ± 1,22 9,77 Ghi chú: F = 11,50; P < 0,001 Trường Đại học KHTN 8,57 7,92 ± 0,62 61 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt Bảng 4.5 Ảnh hưởng độ ẩm lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 TT Số lượng bào tử/g chất (x109) Lượng nước bổ sung (% so với chất) Lần Lần Lần Trung bình 40 2,00 2,37 1,97 2,11 ± 0,22 50 3,57 2,40 2,83 2,93 ± 0,59 60 4,20 4,83 5,07 4,70 ± 0,45 70 4,37 6,53 5,40 5,43 ± 1,08 80 5,03 5,50 4,57 5,04 ± 0,47 90 5,20 4,60 5,40 5,07 ± 0,42 100 4,30 3,73 4,07 4,03 ± 0,28 110 3,27 3,37 3,43 3,36 ± 0,08 Ghi chú: F = 14,96; P < 0,001 Bảng 4.6 Ảnh hưởng nhiệt độ lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 TT Số lượng bào tử/g chất (x109) Nhiệt độ (°C) Lần Lần Lần Trung bình 25 4,30 3,20 3,13 3,54 ± 0,66 28 4,00 4,70 4,93 4,54 ± 0,49 30 8,60 7,63 7,40 7,88 ± 0,64 37 0,00 0,00 0,00 0,00 ± 0,00 Ghi chú: F = 117,78; P < 0,001 Bảng 4.7 Ảnh hưởng số nguồn nitơ vô lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 TT Số lượng bào tử/g chất (x109) Nguồn nitơ Không bổ sung Lần 4,37 6,53 Lần Lần Trung bình 5,40 5,43 ± 1,08 NaNO3 2,90 3,47 3,77 3,38 ± 0,44 KNO3 5,63 5,00 5,13 5,26 ± 0,33 NH4NO3 6,90 7,93 (NH4)2SO4 11,73 11,03 12,00 11,59 ± 0,50 (NH4)2HPO4 10,80 11,83 10,33 10,99 ± 0,77 Ghi chú: F = 69,36; P < 0,001 Trường Đại học KHTN 62 6,50 7,11 ± 0,74 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt Bảng 4.8 Ảnh hưởng nồng độ (NH4)2SO4 lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 TT Số lượng bào tử/g chất (x109) Nồng độ (NH4)2SO4 (mol N/1000g chất) Lần 7,03 Lần 6,90 Lần Trung bình 7,07 7,00 ± 0,09 0,02 7,00 9,50 8,73 8,41 ± 1,28 0,05 8,17 9,57 9,67 9,13 ± 0,84 0,1 10,57 11,03 10,53 10,71 ± 0,28 0,2 1,60 1,53 1,43 1,52 ± 0,08 0,5 0,03 0,01 0,02 0,02 ± 0,01 Ghi chú: F = 139,79; P < 0,001 Bảng 4.9 Ảnh hưởng nồng độ MgSO4 lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 TT Số lượng bào tử/g chất (x109) Nồng độ MgSO4 (% so với khối lượng chất) Lần Lần Lần Trung bình 0,000 11,23 10,80 9,93 10,66 ± 0,66 0,020 9,13 0,030 11,53 10,70 10,17 10,80 ± 0,69 0,035 12,87 13,23 13,03 13,04 ± 0,18 0,040 11,63 11,33 11,43 11,47 ± 0,15 0,050 10,50 11,73 11,03 11,09 ± 0,62 9,83 9,57 9,51 ± 0,35 Ghi chú: F = 16,40; P < 0,001 Bảng 4.10 Ảnh hưởng nồng độ KH2PO4 lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 TT Nồng độ KH2PO4 (% so với khối lượng chất) Số lượng bào tử/g chất (x109) Lần Lần Lần Trung bình 0,00 11,23 10,80 0,10 12,03 11,20 11,43 11,56 ± 0,43 0,15 11,30 11,50 11,47 11,42 ± 0,11 0,20 11,20 11,27 11,37 11,28 ± 0,08 0,25 11,63 11,63 11,50 11,59 ± 0,08 0,30 11,87 10,57 11,27 11,23 ± 0,65 Ghi chú: F = 1,96; P > 0,1 Trường Đại học KHTN 63 9,93 10,66 ± 0,66 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt Bảng 4.11 Ảnh hưởng thời gian chiếu sáng lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 TT Số lượng bào tử/g chất (x109) Giờ/ngày Lần Lần Lần Trung bình 12,97 13,23 12,67 12,96 ± 0,28 12 13,73 12,73 13,30 13,26 ± 0,50 24 11,83 11,77 12,13 11,91 ± 0,20 Ghi chú: F = 12,12; P < 0,01 Bảng 4.12 Ảnh hưởng thời gian lên men lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 TT Thời gian lên men (ngày) Số lượng bào tử/g chất (x109) Lần Lần Lần Trung bình 12,90 12,23 12,57 12,57 ± 0,33 13,70 13,33 13,57 13,53 ± 0,19 10 13,73 12,73 13,30 13,26 ± 0,50 12 13,43 13,60 12,87 13,30 ± 0,38 14 13,23 13,17 13,40 13,27 ± 0,12 Ghi chú: F = 3,54; P < 0,05 Trường Đại học KHTN 64 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ Vu Van Hanh, Le Thi Thuy Duong, Nguyen Huu Quan, Vu Xuan Dat, Quyen Dinh Thi, Kim Keun (2011), Improvement of Virulence of Entomopathogenic fungus Lecanicillium sp L43 towords Aphids, 2011 International Symposium & Annual Meeting, Translational research in Microbiology and Biotechnology, Korea Vu Van Hanh, Quyen Dinh Thi, Vu Xuan Dat, Nguyen Huu Quan, Kim Keun (2011), Virulence of Entomopathogenic Fungus Lecanicillium sp Le85 towards Cotton Aphids, 2011 International Symposium & Annual Meeting, Translational research in Microbiology and Biotechnology, Korea Trường Đại học KHTN 65 [...]... chứa cả nấm kí sinh côn trùng và vi khuẩn, tác dụng lên các côn trùng chích hút, sâu đục thân và côn trùng thân cứng Biomite: chứa hỗn hợp của V lecanii và một số sinh vật kí sinh khác, tác dụng lên ve bét phá hoại mùa màng Cơ chế diệt côn trùng của các chế phẩm này: Nấm tiết ra enzyme phân giải biểu bì côn trùng, sợi nấm đâm vào cơ thể côn trùng, kí sinh, hình thành bào tử và giết chết côn trùng sau... giết bởi nấm Beauveria bassiana Đó chính là cơ sở khoa học vững chắc cho việc nghiên cứu sản xuất các chế phẩm sinh học diệt côn trùng A Thế giới Sự đóng góp đặt nền móng cho xu hướng kiểm soát côn trùng bằng vi sinh vật là của Mechnikoff (1879) và Krassilnikow (1888), khi lần đầu tiên trình bày các nghiên cứu về khả năng sử dụng nấm kí sinh côn trùng Metarrhizium anisopliae để diệt côn trùng gây hại ngũ... Khả năng kiểm soát rệp hại cây trồng của nấm Lecanicillium Lecanicillium là chi nấm kí sinh côn trùng thuộc ngành nấm túi Ascomycota, lớp Sordariomycetes, bộ Hypocreales, họ Clavicipitaceae Lecanicillium trước đây được gọi là Verticillium lecanii [85] Cùng trong họ Clavicipitaceae với chi nấm Lecanicillium còn có một chi nấm kí sinh côn trùng khác là Metarhizium Lecanicillium có khả năng kí sinh tự... sợi nấm tiết các enzyme (proteinase, lipase, chitinase) thủy phân các mô, tiết các độc tố nấm gây độc thần kinh cho côn trùng Kết quả là côn trùng bị tổn thương, bị đa nhiễm bởi Lecanicillium và các vi sinh vật gây bệnh khác Sau khi côn trùng chết, nấm tiếp tục phát triển và sinh bào tử bên ngoài cơ thể côn trùng và có thể lây truyền bệnh cho côn trùng khác [54] Vu và cộng sự (2007) đã nghiên cứu sử dụng. .. lượng các loại thuốc diệt côn trùng Do vậy, việc tăng cường nghiên cứu phát triển chế phẩm diệt côn trùng từ nấm Lecanicillium là cần thiết 1.4 Sản xuất bào tử nấm kí sinh côn trùng Để sản xuất chế phẩm diệt côn trùng trước tiên phải có bào tử nấm kí sinh côn trùng Việc lựa chọn phương pháp lên men và tối ưu các điều kiện lên men là cần thiết để sản xuất được nhiều bào tử với hiệu quả kinh tế cao Hiện... Tech là chế phẩm chiết từ hạt neem, tác dụng lên hơn 400 loài côn Trường Đại học KHTN 13 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt trùng khác nhau nhưng không ảnh hưởng đến côn trùng có lợi Các chất này kiểm soát sự sinh trưởng và do đó kiểm soát số lượng côn trùng Bacillus thuringensis là một trong những vi khuẩn được sử dụng để kiểm soát côn trùng sớm nhất Năm 1901, Ishiwatari phát hiện ra một loại vi... diệt côn trùng hóa học, xu hướng chung trên thế giới hiện nay là không sử dụng thuốc diệt côn trùng hoặc sử dụng thuốc có nguồn gốc sinh học để thay thế dần nhằm phát triển nền nông nghiệp bền vững 1.3 Thuốc diệt côn trùng nguồn gốc sinh học 1.3.1 Phân loại Thuốc diệt côn trùng, thuốc diệt cỏ, thuốc trừ bệnh được gọi chung là thuốc diệt hại Thuốc diệt hại sinh học là các chế phẩm có nguồn gốc sinh. .. 24,4% so với sử dụng hóa chất tổng hợp [37] Phạm Thị Thùy và cộng sự (2005) đã nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu vi nấm sử dụng Beauveria và Metarhizium để phòng trừ sâu hại đậu tương và đậu xanh [3], Nguyễn Dương Khuê (2005) đã sử dụng M anisopliae để phòng trừ mối nhà [1] Mặc dù đã được nghiên cứu từ gần 100 năm qua, nhưng việc ứng dụng các chế phẩm diệt côn trùng sinh học trong... cây trồng của nấm Lecanicillium rất lớn, nhưng việc nghiên cứu ứng dụng Lecanicillium để bảo vệ cây trồng cũng như kết quả đạt được còn hạn chế, nhất là ở Việt Nam Hiệu quả diệt côn trùng của chế phẩm Lecanicillium cũng như các chế phẩm sinh học khác còn kém, khối lượng chế phẩm diệt côn trùng sinh học được sử dụng mới chỉ chiếm tỉ trọng thấp trong tổng khối lượng các loại thuốc diệt côn trùng Do vậy,... Trường Đại học KHTN 7 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt Như vậy, với nguy cơ làm giảm năng suất cây trồng của rệp, yêu cầu phải có biện pháp kiểm soát rệp để bảo vệ mùa màng là cấp thiết Biện pháp kiểm soát rệp và các loại côn trùng khác được áp dụng chủ yếu trong nhiều thập kỷ qua là sử dụng hóa chất diệt côn trùng tổng hợp Cho đến nay, đây vẫn là biện pháp được sử dụng chủ yếu, đặc biệt là ở các nước