CHÀO MỪNG THẦY CÔ VÀ CÁC BẠN THAM DỰ CHUYÊN ĐỀ QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM BỆNH PHẨM ĐỜM TÌM VI KHUẨN M tuberculosis , P aeruginosa, S aureus, Klebsiella pneumoniae Trường ĐH Y- Dược Hải Phòng Lớp: KTHY K5 Nhóm 2: Phạm Quốc Huy Phạm Thị Loan Mai Thị Quỳnh Hải Phòng, ngày 22 tháng năm 2016 Đặt vấn đề • • Đờm chất tiết từ hốc mũi tới phế nang thải miệng Đờm gồm dịch tiết khí phế quản, phế nang, họng, xoang hàm trán, hốc mũi Đờm hậu nhiều nguyên nhân gây bệnh đường hô hấp Trong vi sinh việc xác định nguyên gây bệnh từ bệnh phẩm đờm có ý nghĩa chẩn đoán điều trị lâm sàng I Chỉ định lấy bệnh phẩm đờm • Trong trường hợp viêm đường hô hấp viêm phổi, viêm phế quản cấp, đợt cấp viêm phế quản mạn, người bệnh nghi lao phổi… • Nên cho định lấy mẫu trường hợp bệnh nhân có triệu chứng sau: ho có máu hay ho nhiều, đau ngực, khó thở, có dấu hiệu đặc phổi có ran ẩm rít; giảm tiếng rì rào phế nang; gõ đục khám phổi; phim phổi có thâm nhiễm; có nang; có mủ II Căn nguyên Gặp nhiễm trùng cộng đồng S pneumoniae H influenzae S aureus M tuberculosis K pneumoniae M catarrhalis Nấm: Candida sp Một số virus : Cúm, Á cúm… II Căn nguyên Gặp nhiễm trùng bệnh viện S aureus K pneumoniae P aeruginosa Các Enterobacteriaceae Các trực khuẩn gram(-) dễ mọc khác III Quy trình xét nghiệm 1.Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất 1.1 Dụng cụ III Quy trình xét nghiệm 1.Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất 1.2 Hóa chất, sinh phẩm III Quy trình xét nghiệm Lấy bệnh phẩm đờm 2.1 Nguyên tắc - Vô trùng - Lấy sớm tốt - Lấy trước dùng kháng sinh - Gửi bệnh phẩm sớm tốt III Quy trình xét nghiệm 2.2 Lấy bệnh phẩm Yêu cầu bệnh nhân súc miệng nước muối sinh lý đánh trước lấy bệnh phẩm (không dùng chất có tính sát trùng) -Ghi đầy đủ thông tin người bệnh, ngày lấy mẫu -Hướng dẫn bệnh nhân cách khạc đờm •Với bệnh phẩm tìm AFB: Lấy đờm tốt vào buổi sáng sớm ngủ dậy người bệnh đến khám: mẫu lấy cùn ngày ( mẫu cách mẫu giờ) III Quy trình xét nghiệm 2.2 Lấy bệnh phẩm Trường hợp bệnh nhân không khạc đờm ( trẻ em) bệnh phẩm cần lấy là: dịch hút từ dày hút đờm khí quản qua đường mũi 2.3 Tiêu chuẩn chấp nhận từ chối mẫu • Tiêu chuẩn chấp nhận: - Lọ bệnh phẩm phải có dán nhãn, đủ thông tin người bệnh, ngày lấy mẫu, người lấy mẫu gửi kèm phiếu yêu cầu xét nghiệm - Mẫu đờm có nhày mủ nước bọt, đủ số lượng từ -3 ml Trực khuẩn mủ xanh (P aeruginosa) • Hình thể, tính chất bắt màu: Trực khuẩn bắt màu Gram âm, mảnh, thẳng cong, hai đầu tròn, không sinh nha bào • Nuôi cấy: -Trên thạch thường: Sinh sắc tố, có mùi thơm -Trên thạch máu: Khuẩn lạc dạng S, M, R tùy chủng mức độ độc lực vi khuẩn Trực khuẩn mủ xanh (P aeruginosa) • Tính chất sinh vật hóa học P aeruginosa G L H2S Hơi DĐ Citrat Ure Indol RM VP Oxidase - - - - + + - - - - + Klebsiella pneumoniae Thường gây bội nhiễm đường hô hấp Hình thể: trực khuẩn ngắn, gram âm, bắt màu đậm hai cực, vi khuẩn có nhiều hình thể, có cầu khuẩn, có lại hình dài, có vỏ, không di động, không sinh nha bào Nuôi cấy -Thạch máu: khuẩn lạc dạng M, nhầy, quánh, dai -MC, DC: Lên men lactose, khuẩn lạc dạng M, bò lan , nhầy • • Klebsiella pneumoniae • Tính chất sinh vật hóa học G L H2S Hơi DĐ Citrat Ure Indol RM VP Manit oxidase + +/_ - +/_ - + -/+ - - + + - Trực khuẩn lao(M tuberculosis) Trực khuẩn lao sống tháng đờm ẩm, sữa chúng sống nhiều tuần Với kháng sinh hóa trị liệu, chúng ngày kháng lại streptomycin, ethambutol, rifampimicin Việt Nam nước có tỷ lệ lao kháng thuốc ban đầu mức cao Trực khuẩn lao(M tuberculosis) 4.1Nhuộm soi trực tiếp • Nhuộm Ziehl – Neelsel: Hình thể: -AFB có hình que mảnh, cong, bắt màu đỏ vi trường màu xanh -Đếm số lượng AFB ghi kết bảng sau: Số lượng AFB Kết Phân loại AFB/300 vi trường Âm tính 1-9 AFB/100 vi trường Dương tính Ghi số lượng AFB cụ thể 10-99 AFB/100 vi trường Dương tính + 1-10AFB/1 vi trường Dương tính ++ Dương tính +++ Soi 50 vi trường >10AFB/10 vi trường Soi 20 trường Trực khuẩn lao(M tuberculosis) 4.1Nhuộm soi trực tiếp • Nhuộm Ziehl – Neelsel: Tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán AFB Trực khuẩn lao(M tuberculosis) 4.1 Nhuộm soi trực tiếp • Nhuộm huỳnh quang: Hình thể trực khuẩn mảnh, màu vàng phát quang tối, đứng riêng rẽ thành đám Kỹ thuật có độ nhạy cao so với nhuộm Ziehl-Neelsen mẫu bệnh phẩm vi khuẩn số lượng vi trường nhiều 4.2 Nuôi cấy •Trên môi trường đặc: Lowein stein: Tạo khuẩn lạc dạng R, màu vàng màu kem bờ không đều, khuẩn lạc khó tan nước (xù xì súp lơ) • Trên môi trường lỏng Souton: tạo váng, nhăn nheo, khó tan nước, lắng cặn 4.2 Nuôi cấy  Trực khuẩn lao phát triển chậm, thường 1-2 tháng tạo khuẩn lạc môi trường, dùng nghiên cứu chủ yếu, dùng định danh • Tính chất sinh vật hóa học: + Phản ứng catalase dương tính + Phản ứng Niacin dương tính Ống bên phải có catalase dương tính mạnh với cột bọt khí cao 45mm 4.3 Kỹ thuật sinh học phân tử 4.3.1 Kỹ thuật PCR(Polymerase Chain Reaction) Nguyên lý: kỹ thuật khuyếch đại ADN cách tạo hàng triệu từ chuỗi đích acid nucleic ADN polymerase enzym chép ADN, tái chép nhiều lần đoạn ADN kích thích đặc hiệu Xác định có mặt BK thông qua khuếch đại đoạn gen ADN đặc hiệu 4.3 Kỹ thuật sinh học phân tử 4.3.1 Kỹ thuật PCR(Polymerase Chain Reaction) Thuần mẫu đờm • Khử nhiễm thểmix tích NaOH 1M (40gr NaOH/lit) + thể tích Natri Chuẩn bị PCR Citrat 0,1M (29,4gr Na-citrat.2H2O/lit) 30mM N-acetyl-L-cystein Cài đặt chu trình nhiệt: Gồm giai đoạn: (NALC) (15mg/100ml), lắc cho đờm loãng 15 phút, ly tâm Phá vỡ màng tế bào giải phóng DNA cặnOnhư dịch _GĐ 1: Biến tínhtách (94-95 C)/30-60s Biến tính protein • Tách chiết thu nhận DNA • • • • Tiến hành phản ứng PCR O _GĐ 2: Bắt cặp (40-60 C)/30-60s Tủa DNA Tinh bảo quản O _GĐ 3: Kéo dài chuỗi (72 C)/2p Chu trình lặp lại từ 30-40 chu kỳ •Xếp ống XN vào máy chạy ống chuẩn Điện di • Định tính: xác định có hay không sản phẩm đích trình PCR • Định lượng: xác định độ đài đoạn gen khuếch đại Trả kết 4.3 Kỹ thuật sinh học phân tử 4.3.2 Kỹ thuật Real Time – PCR Nguyên lý: Dựa kỹ thuật PCR cổ điển xảy giai đoạn: biến tính gắn mồi kéo dài Điểm mấu chốt kỹ thuật sử dụng chất có khả phát huỳnh quang có mặt sản phẩm khuếch đại từ trình tự DNA đích tác dụng ánh sáng kích thích 4.3 Kỹ thuật sinh học phân tử 4.3.2 Kỹ thuật Real Time – PCR Kỹ thuật cho phép tính toán hàm lượng DNA đích khuôn ban đầu Tóm lại: Kỹ thuật sinh học phân tử có độ đặc hiệu độ nhạy cao cho phép phát trực khuẩn lao với hàm lượng thấp mà nhuộm soi không tìm thấy hình ảnh vi khuẩn Cảm ơn thầy cô bạn ý lắng nghe [...]...III Quy trình xét nghiệm 2.2 Tiêu chuẩn chấp nhận và từ chối • Tiêu chuẩn từ chối: - Không đủ thông tin trên nhãn và phiếu xét nghiệm - Số lượng và chất lượng đờm không đạt yêu cầu - Lọ đựng bệnh phẩm bị rò rỉ, vỡ, không có bệnh phẩm - Bệnh phẩm lấy trên 4h 3 Quy trình xét nghiệm Bệnh phẩm đờm Quan sát đại thể PCR (nếu có điều kiện) Quan sát vi thể Ngày 1 Nhuộm gram Nhuộm xanh methylen Soi kính hiển vi. .. hơi cong, bắt màu đỏ trên nền vi trường màu xanh -Đếm số lượng AFB và ghi kết quả như bảng sau: Số lượng AFB Kết quả Phân loại 0 AFB/300 vi trường Âm tính 1-9 AFB/100 vi trường Dương tính Ghi số lượng AFB cụ thể 10-99 AFB/100 vi trường Dương tính + 1-10AFB/1 vi trường Dương tính ++ Dương tính +++ Soi ít nhất 50 vi trường >10AFB/10 vi trường Soi ít nhất 20 trường 4 Trực khuẩn lao(M tuberculosis) 4.1Nhuộm... để chẩn đoán AFB 4 Trực khuẩn lao(M tuberculosis) 4.1 Nhuộm soi trực tiếp • Nhuộm huỳnh quang: Hình thể trực khuẩn mảnh, màu vàng phát quang trên nền tối, đứng riêng rẽ hoặc thành từng đám Kỹ thuật này có độ nhạy cao hơn so với nhuộm Ziehl-Neelsen đối với những mẫu bệnh phẩm ít vi khuẩn vì số lượng vi trường được nhiều hơn 4.2 Nuôi cấy •Trên môi trường đặc: Lowein stein: Tạo khuẩn lạc dạng R, màu vàng... vi thể Ngày 1 Nhuộm gram Nhuộm xanh methylen Soi kính hiển vi Soi kính hiển vi Nuôi cấy tìm VSV Không nuôi cấy/ lấy lại bệnh phẩm gây bệnh Thạch máu Ngày 2 Thạch Chocolate Ngày 4 Trả kết quả AFB Thạch Mac-Conkey Nhuộm gram,Cấy định danh Đọc kết quả định danh Ngày 3 Nhuộm Ziehl-Neelsen Làm kháng sinh đồ Trả kết quả: tên vi khuẩn và kháng sinh đồ Thạch Sabourau IV Tiêu chuẩn chẩn đoán P aeruginosa, S.aureus,... Klebsiella pneumoniae Thường gây ra các bội nhiễm ở đường hô hấp Hình thể: trực khuẩn ngắn, gram âm, bắt màu đậm ở hai cực, vi khuẩn này có nhiều hình thể, có khi như cầu khuẩn, có khi lại hình dài, có vỏ, không di động, không sinh nha bào Nuôi cấy -Thạch máu: khuẩn lạc dạng M, nhầy, quánh, dai -MC, DC: Lên men lactose, khuẩn lạc dạng M, bò lan , nhầy • • 3 Klebsiella pneumoniae • Tính chất sinh vật... mặt sản phẩm khuếch đại từ trình tự DNA đích dưới tác dụng của ánh sáng kích thích 4.3 Kỹ thuật sinh học phân tử 4.3.2 Kỹ thuật Real Time – PCR Kỹ thuật này cho phép chúng ta tính toán được hàm lượng DNA đích trong khuôn ban đầu Tóm lại: Kỹ thuật sinh học phân tử có độ đặc hiệu và độ nhạy cao cho phép phát hiện trực khuẩn lao với hàm lượng thấp mà nhuộm soi không tìm thấy hình ảnh của vi khuẩn Cảm... Indol RM VP Manit oxidase + +/_ - +/_ - + -/+ - - + + - 4 Trực khuẩn lao(M tuberculosis) Trực khuẩn lao có thể sống 1 tháng trong đờm ẩm, trong sữa chúng sống được nhiều tuần Với kháng sinh và hóa trị liệu, chúng ngày càng kháng lại streptomycin, ethambutol, rifampimicin Vi t Nam là nước có tỷ lệ lao kháng thuốc ban đầu vẫn ở mức cao 4 Trực khuẩn lao(M tuberculosis) 4.1Nhuộm soi trực tiếp • Nhuộm Ziehl... Manit (+) 2 Trực khuẩn mủ xanh (P aeruginosa) • Hình thể, tính chất bắt màu: Trực khuẩn bắt màu Gram âm, mảnh, thẳng hoặc hơi cong, hai đầu tròn, không sinh nha bào • Nuôi cấy: -Trên thạch thường: Sinh sắc tố, có mùi thơm -Trên thạch máu: Khuẩn lạc có thể dạng S, M, R tùy từng chủng và mức độ độc lực của vi khuẩn 2 Trực khuẩn mủ xanh (P aeruginosa) • Tính chất sinh vật hóa học P aeruginosa G L H2S Hơi... chất bắt màu: Cầu khuẩn xếp đám hình chùm nho, nhỏ đều bắt màu gram (+) • Nuôi cấy -Trên thạch thường: khuẩn lạc dạng S sắc tố màu vàng chanh -Trên thạch máu: Tạo khuẩn lạc dạng S có tan máu β IV Tiêu chuẩn chẩn đoán P aeruginosa, S.aureus, M tuberculosis, K pneumoniae 1 Tụ cầu vàng (S aureus) • Tính chất sinh vật hóa học Catalase (+) Coagulase tự do (+) Chapman : Manit (+) 2 Trực khuẩn mủ xanh (P... Kỹ thuật sinh học phân tử 4.3.1 Kỹ thuật PCR(Polymerase Chain Reaction) Thuần nhất mẫu đờm • Khử nhiễm bằng 1 thểmix tích NaOH 1M (40gr NaOH/lit) + 1 thể tích Natri Chuẩn bị PCR Citrat 0,1M (29,4gr Na-citrat.2H2O/lit) và 30mM N-acetyl-L-cystein Cài đặt chu trình nhiệt: Gồm 3 giai đoạn: (NALC) (15mg/100ml), lắc cho đờm loãng đều trong 15 phút, ly tâm Phá vỡ màng tế bào giải phóng DNA cặnOnhư đối với