TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN MÃ SỐ: D620301 Tác dụng dịch chiết dây Cóc (Tinospora crispa Miers.) dây Thần thông (Tinospora cordifolia Miers.) lên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophila Sinh viên thực Nguyễn Thị Ngọc Thùy Lớp: NTTS6 MSSV: 1153040045 Cần Thơ, 2015 TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN MÃ SỐ: D620301 Tác dụng dịch chiết dây Cóc (Tinospora crispa Miers.) dây Thần thông (Tinospora cordifolia Miers.) lên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophila Cán hướng dẫn Sinh viên thực PGs.Ts Nguyễn Văn Bá Nguyễn Thị Ngọc Thùy Lớp: NTTS6 MSSV: 1153040045 ThS Trần Ngọc Huyền Cần Thơ, 2015 TỪ VIẾT TẮT NA: Môi trường Nutrient agar NB: Môi trường Nutrient Broth BHI: Môi trường Brain Heart Infusion ĐC: Đối chứng i MỤC LỤC DANH SÁCH BẢNG iv DANH SÁCH HÌNH v CHƯƠNG ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm phân loại hình thái thảo dược 2.1.1 Tổng quan dây Cóc 2.1.2 Tổng quan dây Thần thông 2.2 Tổng quan vi khuẩn 2.2.1 Tổng quan vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 2.2.2 Tổng quan vi khuẩn Aeromonas hydrophila 2.3 Sơ lược tình hình sử dụng dịch chiết từ thảo dược 2.3.1 Trên giới .9 2.3.2 Trong nước 13 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1 Thời gian địa điểm thực đề tài 16 3.2 Vật liệu, dụng cụ hóa chất 16 3.2.1 Vật liệu nghiên cứu 16 3.2.2 Dụng cụ, hóa chất 16 3.3 Phương pháp nghiên cứu 16 3.3.1 Phương pháp ly trích thảo dược 16 3.3.2 Bố trí thí nghiệm 17 3.3.3 Phương pháp lập đĩa thảo dược 17 3.4 Nuôi tăng sinh mẫu vi khuẩn Error! Bookmark not defined 3.5 Phương pháp xử lý số liệu 19 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 ii 4.1 Khả kháng loại vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophila dịch chiết từ dây Cóc 21 4.2 Khả kháng loại vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophila dịch chiết từ dây Thần thông 25 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 31 5.1 KẾT LUẬN 31 5.2 ĐỀ XUẤT 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 331 PHỤ LỤC 32 iii DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1: Thử nghiệm khả kháng Edwardsiella ictaluri dịch chiết dây Cóc với nước cất đun sôi, cồn 700, cồn 900 17 Bảng 3.2: Thử nghiệm khả kháng Aeromonas hydrophila dịch chiết dây Cóc với nước cất đun sôi, cồn 700, cồn 900 17 Bảng 3.3: Thử nghiệm khả kháng Edwardsiella ictaluri dịch chiết dây Thần thông với nước cất đun sôi, cồn 700, cồn 900 17 Bảng 3.4: Thử nghiệm khả kháng Aeromonas hydrophila dịch chiết dây Thần thông với nước cất đun sôi, cồn 700, cồn 900.Error! Bookmark not defined Bảng 4.1: Đường kính vòng kháng khuẩn trung bình dịch chiết từ dây Cóc với nước cất đun sôi 22 Bảng 4.2: Đường kính vòng kháng khuẩn trung bình dịch chiết từ dây Cóc ngâm với cồn 700 23 Bảng 4.3: Đường kính vòng kháng khuẩn trung bình dịch chiết từ dây Cóc đun với cồn 900 24 Bảng 4.4: Đường kính vòng kháng khuẩn trung bình dịch chiết từ dây Thần thông với nước cất đun sôi 25 Bảng 4.5: Đường kính vòng kháng khuẩn trung bình dịch chiết từ dây Thần thông ngâm với cồn 700 26 Bảng 4.6: Đường kính vòng kháng khuẩn trung bình dịch chiết từ dây Thần thông đun với cồn 900 27 iv DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1: Hình thái bên dây Cóc Hình 2.2: Hình thái bên dây Thần thông Hình 2.3: Hình dạng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Hình 2.4: Hình dạng vi khuẩn Aeromonas hydrophila Hình 3.1: Vòng kháng khuẩn đĩa petri 20 Hình 3.2: Quy trình nuôi tăng sinh mẫu vi khuẩn 21 Hình 3.3: Mẫu vi khuẩn gốc 21 Hình 3.4: Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophila sang thưa 20 Hình 4.1: Vòng kháng khuẩn dịch chiết mẫu vi khuẩn gốc 22 Hình 4.2: Vòng kháng khuẩn dịch chiết mẫu vi khuẩn sang thưa lần 22 Hình 4.3: Vòng kháng khuẩn dịch chiết dây Cóc với nước cất 23 Hình 4.4: Vòng kháng khuẩn dịch chiết dây Cóc với dung môi cồn 700 24 Hình 4.5: Vòng kháng khuẩn dịch chiết dây Cóc với dung môi cồn 900 24 Hình 4.6: Vòng kháng khuẩn dịch chiết dây Thần thông với dung môi cồn 700 26 Hình 4.7: Vòng kháng khuẩn dịch chiết dây Thần thông với dung môi cồn 900 28 v CHƯƠNG ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Trong thập kỷ qua, nhu cầu sử dụng thực phẩm có nguồn gốc động vật, đặc biệt sản phẩm thủy sản ngày tăng cao Nghề nuôi thủy sản phát triển mạnh, việc tăng suất, sản lượng nuôi trồng thủy sản cách nhanh chóng khiến tình hình dịch bệnh ngày diễn biến nghiêm trọng Để xử lý vấn đề này, loại hóa chất kháng sinh xem biện pháp người sử dụng để xử lý cho loại thủy sản Tuy nhiên, việc sử dụng hóa chất kháng sinh không quy định liều lượng gây nên kháng thuốc vi sinh vật đồng thời làm suy thoái môi trường, ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe người (Nguyễn Đức Hiền, 2008) Chính cần có biện pháp thiết yếu tìm phương pháp phù hợp Việt Nam nước nằm khu vực nhiệt đới gió mùa nên hệ thực vật phong phú, từ thời xa xưa nhân dân ta biết dùng loại thảo dược, vị thuốc nam để phòng, trị bệnh cho gia súc, gia cầm người Từ đó, xây dựng học thuyết tích lũy kinh nghiệm quý báu phương pháp chuẩn trị đông y Những năm gần xu hướng dùng thảo dược chữa trị bệnh động vật thủy sản ngày phổ biến biên độ an toàn cao (Phạm Thiệp Vũ Ngọc Thúy, 2001), có nhiều nghiên cứu sử dụng chiết xuất từ thảo dược phòng bệnh nhiễm khuẩn cá tra thực Bùi Quang Tề (2006), phối hợp dịch chiết từ Tỏi (Allium sativum) Sài đất (Weledia calendulacea) để tăng cường hệ miễn dịch cho cá tra chống mầm bệnh xuất huyết vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây Huỳnh Kim Diệu (2011) sử dụng bột Hoàng ngọc (Pseuderanthemum palatiferum) để tăng sức đề kháng giúp cá tăng trọng tốt hơn, dịch chiết từ Hoàng kỳ thử nghiệm để tăng cường hoạt động hệ miễn dịch cá tra (Đặng Thị Hoàng Oanh Trần Thị Yến Nhi, 2011) Việc phòng bệnh cho động vật thủy sản dịch chiết từ thảo dược vào thức ăn để tăng cường hoạt động hệ miễn dịch cá hướng tích cực quản lý sức khỏe thủy sản nuôi theo hướng an toàn bền vững Vì vậy, đề tài ”Tác dụng dịch chiết dây Cóc (Tinospora crispa Miers.) dây Thần thông (Tinospora cordifolia Miers.) lên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophila” thực 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Nhằm đánh giá khả kháng số vi khuẩn gây bệnh cá dịch chiết dây Cóc dây Thần thông 1.3 Nội dung nghiên cứu Xác định so sánh khả kháng khuẩn dịch chiết dây Cóc dây Thần thông vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophila gây bệnh cá phòng thí nghiệm CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 KẾT LUẬN Dịch chiết dây Cóc (đun với cồn 900) dịch chiết dây Thần thông (ngâm với cồn 700 đun với cồn 900) có tác dụng kháng loại vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophila Dịch chiết từ dây Thần thông cho khả kháng loại vi khuẩn cao dịch chiết dây Cóc Dịch chiết dây Cóc chiết xuất đun với cồn 900 có tác dụng kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri với đường kính vòng kháng khuẩn cao tỷ lệ 1:3 11 mm, vi khuẩn Aeromonas hydrophila tỷ lệ 1:3 7,3 mm Dịch chiết dây Thần thông ngâm với cồn 700 đun với cồn 900 có tác dụng kháng loại vi khuẩn, tỷ lệ 1:3 dịch chiết đun với cồn 900 cho khả kháng cao (Edwardsiella ictaluri 16 mm, Aeromonas hydrophila 14 mm) 5.2 ĐỀ XUẤT Cần nghiên cứu sâu phân tích thêm thành phần hoá học có dịch chiết dây Cóc, dây Thần thông Nghiên cứu chế miễn dịch thể động vật thuỷ sản điều trị dịch chiết dây Cóc dây Thần thông với phương pháp tách chiết khác 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bộ môn Công nghiệp Dược, 2001 Kỹ thuật sản xuất dược phẩm, tập I, trường ĐH Dược Hà Nội Bùi Quang Tề, Lê Xuân Thành, 2006 Kết nghiên cứu chế phẩm (VTS1 - C), (VTS1 - T) tách chiết từ thảo dược phòng trị bệnh cho tôm sú cá tra.Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1, Viện hóa học công nghiệp Đặng Thụy Mai Thy, Trần Thị Thủy Cúc, Nguyễn Châu Phương Lam, Nguyễn Đức Hiền Đặng Thị Hoàng Oanh, 2012 Đặc điểm mô bệnh học cá Rô (Anabas testudineus) nhiễm vi khuẩn Aeromonas hydrophila Streptococcus sp điều kiện thực nghiệm Tạp chí Khoa học, 22c 183 – 193 Trường Đại học Cần Thơ Đỗ Tất Lợi, 1968.Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng Nguyễn Thị Muội, 2004 Bệnh học thủy sản, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội Đỗ Tiến Hảo, 2009.Tình hình xuất bệnh mủ gan cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi thâm canh số tỉnh đồng sông Cửu Long Khóa luận tốt nghiệp Đại học, trường Đại Học Cần Thơ Hà Ký, 1995 Phòng trị bệnh cho tôm cá.Báo cáo tổng kết cấp Nhà nước mã số KN-04-12, Hà Nội Huỳnh Kim Diệu, 2011 Khả phòng bệnh xuất huyết gan thận mủ bột Xuân Hoa.Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, tập XVIII số Nguyễn Chính, 2005 Đánh giá tình hình sử dụng thuốc thú y thủy sản nuôi cá Tra thâm canh An Giang Cần Thơ Khóa luận tốt nghiệp cao học trường Đại học Cần Thơ Nguyễn Chung, 2008 Kỹ thuật sinh sản nuôi cá Tra, Nhà xuất Nông Nghiệp Nguyễn Gia Hoàng Diễm, 2012 Khảo sát kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri dịch chiết từ thảo dược Khóa luận tốt nghiệp Đại học, trường Đại Học Tây Đô Nguyễn Hoàng Minh, 2013 Phối hợp dịch chiết Diệp hạ châu đỏ kháng sinh điều trị vi khuẩn Aeromonas hydrophila Khóa luận tốt nghiệp Đại học, trường Đại Học Tây Đô 31 Nguyễn Liêm, Phạm Gia Khôi, Vũ Văn Chuyên, 1975: Phát nguồn berberin số thuốc nam Thông báo dược liệu Bộ y tế (BYT) số 47 Nguyễn Ngọc Phước, 2007 Nghiên cứu khả kháng nấm dịch chiết trầu (Piper betel L.) Kỷ yếu Hội thảo quốc tế KHCN phục vụ ngành thủy sản, Nha Trang, tháng 11/2006, 2006 Nguyễn Văn Toại, Lê Thị Oanh, Nguyễn Xuân Huyên (2001) Kết nghiên cứu tính kháng khuẩn Helicobacter pylori hoạt chất toàn phần chiết xuất từ Trầu không ống nghiệm,Y học thực hành Quách Đỉnh, Nguyễn Văn Tiếp, Nguyễn Văn Thoa, 2008 Bài giảng Công nghệ chế biến rau (Fruits and Vegetables Processing) Đại học Công nghiệp TPHCM Trần Hạnh Triết, Vũ Thị Thanh Hương, Bùi Thị Thanh Tịnh, Lê Văn Hậu, Trần Thanh Tiếng, Nguyễn Quốc Bình, 2014 So sánh khả xâm nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophila cá tra (Pangasius hypophthalmus) Tạp chí sinh học 2014 Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh, Trần Thị Tuyết Hoa, 2005 Giáo trình bệnh học thủy sản Khoa Thủy sản Đại học Cần Thơ Võ Văn Chi, 1997 Từ điển thuốc Việt Nam, NXB y học Vũ Xuân Quang (1993) Những thuốc nam chữa số bệnh viêm nhiễm NXB Y học 32 Tài liệu tiếng Anh Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (9th Edition), Vol.I Williams and Wilkins, Baltimore (1984), pp 261–267 Bertani S, Bourdy G, Landau I, Robinson JC, Esterre P, Deharo E, 2005 Evaluation of French Guiana traditional antimalarial remedies J Ethnopharmacol; 98: 45−54 Chintalwar G, Jain A, Sipahimalani A, 1999 An immunologically active arabinogalactan from Tinospora cordifolia Phytochemistry; 52 (6): 10891093 Chopra RN, 1982 Chopra's Indigenous Drugs of India 2nd ed Calcutta, India: Academic Publishers; 426-428 De Man, J.C., M Rogosa and M.E Sharpe, 1960 A medium for the cultivation of lactobacilli J Applied Bacteriol, 23: 130-135 Gupta SS, Verma SC, Garg VP, Rai M, 1967 Anti-diabetic effects of Tinospora cordifolia Effect on fasting blood sugar level, glucose tolerance and adrenaline induced hyperglycaemia Indian J Med Res; 55(7): 733-745 Kapur P, Pereira BM, Wuttke W, Jarry H, 2009 Androgenic action of Tinospora cordifolia ethanolic extract in prostate cancer call line LNCaP Phytomedicine; 16(6-7): 679-682 Leyon PV, Kuttan G, 2004 Inhibitory effect of a polysaccharide from Tinospora cordifolia on experimental metastasis J Ethnopharmacol; 90(2-3): 233-237 Mahesh, B., Satish S (2008) Antimicrobial activity of some important medicinal plant against plant and human pathogens Nguyen Thanh Tam, Dang Thi Thu Thao and Nguyen Van Ba, 2011 Evaluated inhibition of Edwardsiella ictaluri by lactic acid bacteria Vietfish International Noor H, Ashcroft SJ, 1998 Pharmacological characterisation of the antihyperglycaemic properties of Tinospora crispa extract J Ethnopharmacol; 62: 7–13 Palaksha, M Mansoor N., A., Sanjoy D (2010) Antibacterial activity of garlic extract on streptomycin-resistant Staphylococcus aureus and Escherichia coli solely and in synergism with streptomycin Panchabhai TS, Ambarkhane SV, Joshi AS, Samant BD, Rege NN, 2008 Protective effect of Tinospora cordifolia, Phyllanthus emblica and their combination 33 against antitubercular drugs induced hepatic damage: an experimental study Phytother Res; 22(5): 646-650 Panchabhai TS, Kulkarni UP, Rege NN, 2008 Validation of therapeutic claims of Tinospora cordifolia: a review Phytother Res; 22(4): 425-441 Rahman, M Fazlic M., V and Saad N W (2012) Antioxidant properties of raw garlic (Allium sativum) extract International Food Research Journal Rastogi, Mehrotra, 1990 African Journal of Biotechnology Vol.1 (2), ISSN 1684– 5315 Academic Journals Roman RR, Aharcon AF, Lara LA, Flores SJL (1992) Hypoglycemic effect of plants used in Mexico as antidiabetics Arch Med Res 23(1): 59-64 Sana, M and Ifra G (2012) Antibacterial activity of aqueous and ethanolic extracts of garlic, cinnamon and turmeric against Escherichia coli ATCC 25922 and Bacillus subtilis DMS 3256 International Journal of Applied Biology and Pharmaceutical Schillinger V and K.K Luke, 1989 Antibacterial activity of Lactobacillus sake isolated from meat Appl.Environ Microbiol., 55: 1091-1096 Seyyedneiad, Motamedi S.M., H (2010) A review on Native medicinal Plant in Khuzestan, Iran with Antibacterial properties International journal of Pharmacology Siddiqi MA, Nasir E, Ali SI, 1974 Flora of West Pakistan Issues 56-75 Karachi, Feroz Sons, pp 74-75 Solanki, R (2010) Some medicinal plants with antibacterial activity Pharmacies Globate (IJCP), 4(10) Srinivasan, D., Sangeetha S., Lakshmanaperumalsamy P (2009) In vitro Antibacterial Activity and Stability of Garlic Extract at Different pH and Temperature Electronic Journal of Biology 34 PHỤ LỤC A Bảng A1: Thành phần môi trường Tên môi trường BHI_Broth (Brain Heart Infusion Broth), 1.000ml NB (Nutrient Broth), 1.000ml Thành phần Beef heart infusion Calf brain infusion Proteose peptone NaCl Na2HPO4.12H2O Glucose pH (250C) Peptic digest of animal tissue Beef extract pH Distilled water 35 Khối lượng (g) 250,0 200,0 10,00 5,00 2,50 2,00 7,4 ± 0,2 5.00 3.00 6.9 ± 0.2 at 250C Ltr PHỤ LỤC B *Phương pháp nhuộm Gram mô tả hình thái vi khuẩn Cho giọt nước muối sinh lý lên lam Dùng que cấy tiệt trùng lấy 2-3 khuẩn lạc trải lên lam, để lam khô tự nhiên Hơ lướt lam lên lửa đèn cồn, cố định vi khuẩn sau để nguội - Nhuộm crystal violet khoảng phút, rửa lam nước, thấm khô - Nhuộm iodine khoảng phút, rửa lam nước, thấm khô - Rửa lame dung dịch alcohol/acetone khoảng 2-3 giây, rửa lam nước - Nhuộm safranin khoảng phút, rửa lam nước, thấm khô Quan sát lam kính hiển vi quang học (40X 100X) Vi khuẩn Gram (+): bắt màu tím Vi khuẩn Gram (-): bắt màu hồng * Đặc điểm sinh hoá vi khuẩn Ewardsiella sp Aeromonas sp STT Chỉ tiêu Ewardsiella sp Aeromonas sp Nhuộm Gram - - Di động + + Oxydase - + Catalase + + O/F +/+ +/+ 0/129 Kháng Ghi chú: (+): dương; (-): âm * Cách làm đĩa thạch vô trùng - Pha môi trường BHI (0,52g/ml), NB (0,08g/ml), NA (0,2g/ml) - Chuẩn bị đĩa petri - Hấp tiệt trùng dụng cụ chứa môi trường đĩa petri 121 oC 20 phút - Lau cồn quanh mặt tủ cấy vô trùng - Thắp đèn cồn để tránh nhiễm vi khuẩn vào đĩa môi trường 36 - Đợi nhiệt bình môi trường nguội đến 60 oC cho vào tủ cấy vô trùng với đĩa petri để chuẩn bị đổ đĩa Không đổ đĩa môi trường nóng 60oC để tránh nước đọng nắp đĩa mặt thạch - Sát trùng tay cồn 70% trước đổ đĩa - Quay tròn bình để trộn môi trường, tránh lắc mạnh sinh bọt khí -Đổ khoảng ml – 10 ml môi trường vào đĩa pertri - Nếu thấy có bọt khí mặt thạch dùng que cấy nung đỏ lửa đèn cồn châm vỡ bọt khí Thao tác cần thực thạch nóng, chưa đông - Để yên cho thạch đông, tránh làm rung đĩa petri để bề mặt thạch phẳng, đồng - Để cho đĩa thạch đông đĩa nguội đến nhiệt độ phòng - Gói giấy báo, ghi tên môi trường ngày đổ đĩa bên cho vào tủ lạnh dùng để cấy vi khuẩn * Phương pháp cấy ria đĩa thạch vô trùng Chuẩn bị  Vi khuẩn E ictaluri A hydrophila  Đĩa thạch  Que cấy  Đèn cồn  Vệ sinh cồn 70% khắp mặt bên tủ cấy Thao tác  Rửa tay cồn  Lắc ống huyền phù  Hơ que cấy lửa đèn cồn đến đầu que cấy nóng đỏ, làm nguội que cấy không khí khoảng 15 giây  Mở nắp dụng cụ chứa vi khuẩn cần cấy, đưa nhẹ qua lửa đèn cồn  Cho que cấy vào ống huyền phù tế bào, chạm đầu que cấy vào thành ống để làm nguội tiếp  Nhúng đầu que cấy vào dịch huyền phù  Tay trái mở nắp đĩa thạch Đặt đầu que cấy vào góc đĩa thạch chấm nhẹ để loại bớt tế bào lần Từ điểm đẩy nhẹ đầu que cấy lướt nhanh mặt thạch theo đường zích zắc dày Đậy nắp đĩa  Khử trùng đầu que cấy đèn cồn làm nguội đầu que cấy Hé mở nắp đĩa, đặt đầu que cấy lên phần thạch chưa ria cấy để làm nguội tiếp Bắt đầu từ cạnh đường zích zắc thứ nhất, ria đường zích zắc thứ hai có chiều khác với đường ban đầu Đậy nắp đĩa lại 37  Khử trùng que cấy, làm nguội, cạnh đường zích zắc thứ hai, ria cấy đường zích zắc thứ ba có chiều khác với đường thứ thứ hai khoảng trống lại Đậy nắp đĩa, khử trùng que cấy trước cắm vào giá  Ngoài kiểu ria cấy tạo thành ba đường zích zắc (hay gọi ria cấy ba pha) ria cấy bốn đường zích zắc (bốn pha) để thu nhận khuẩn lạc Hình 5.1: Các cách cấy ria Hình 5.2: Các thao tác cấy truyền *Phương pháp cấy vi khuẩn ống nghiệm Vệ sinh cồn khắp mặt tủ cấy, cho dụng cụ vào bên tủ cấy, rửa tay cồn 700C Lắc bình chứa mẫu cần pha loãng máy khuấy ống nghiệm phút Mở nút bình chứa mẫu, hơ nhanh miệng bình pha loãng lửa đèn cồn Dùng Micropipet hút ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa ml nước muối sinh lý, hơ nhanh miệng ống nghiệm lửa đèn cồn, đậy nút lại *Phương pháp pha loãng Chuẩn bị  Ống nghiệm chứa mẫu cần pha loãng Ống nghiệm chứa ml nước muối sinh lý hấp tiệt trùng Máy khuấy ống nghiệm  Đèn cồn Micropipet, hộp đầu tuýp hấp tiệt trùng, bút Tiến hành: Vệ sinh khắp mặt tủ cấy cồn Cho dụng cụ vào bên tủ cấy 38  Rửa tay cồn  Lắc bình chứa mẫu cần pha loãng máy khuấy ống nghiệm phút Mở nút nhựa bình chứa mẫu, hơ nhanh miệng ống nghiệm lửa đèn cồn  Dùng micropipet hút ml  Mở nút nhựa ống nghiệm chứa ml nước muối sinh lý, hơ nhanh miệng ống nghiệm lửa đèn cồn, cho ml mẫu vào Hơ nhanh miệng ống nghiệm lửa đèn cồn, đậy nhanh nút nhựa lại *Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn Dựa theo phương pháp pha loãng nối tiếp Joseph Lister (1878), phương pháp xác định mật độ vi khuẩn tiến hành sau: 1ml 9ml Dung dịch gốc 1ml 1ml 9ml 10-1 1ml 1ml 9ml 9ml 10-2 … 10-(n-1) 9ml 10-n Hình 5.3: Sơ đồ pha loãng xác định mật độ vi khuẩn Hình 5.4: Cách cấy mẫu vào môi trường 39 * Mật độ vi khuẩn tính theo công thức: M= A.D (cfu/ml) V Trong đó: M: mật độ vi khuẩn (cfu/ ml) A: Số lượng khuẩn lạc trung bình/ đĩa (KL/ đĩa) D: độ pha loãng (ml) V: thể tích dung dịch cho vào đĩa (ml) * Đếm khuẩn lạc Các đĩa thạch sau tráng vi khuẩn giữ tủ ấm 32oC sau 48h đem đếm Cách đếm: dùng bút chia khuẩn lạc thành phần, phần Đếm số khuẩn lạc có phần sau cộng lại (Chú ý: không bỏ sót khuẩn lạc) Trong trình đếm khuẩn lạc cần ghi lại hình dạng chủng vi khuẩn, vi khuẩn môi trường nuôi cấy khác cho hình dạng khuẩn lạc khác (Nguyễn Đức Lợi, 2013) 40 PHỤ LỤC C Bảng C1 Kích thước đường kính vòng kháng khuẩn dịch chiết dây Cóc Dung môi Nước cất Cồn 700 Cồn 900 Edwardseilla ictaluri Aeromonas hydrophila 3 1:1 0 0 0 1:2 0 0 0 1:3 0 0 0 1:1 0 0 0 1:2 0 0 0 1:3 0 0 0 1:1 2 1:2 10 4 1:3 13 11 7 Tỷ lệ Bảng C2 Kích thước đường kính vòng kháng khuẩn dịch chiết dây Thần thông Edwardseilla ictaluri Dung môi Nước cất Cồn 700 Cồn 900 Aeromonas hydrophila Tỷ lệ 3 1:1 0 0 0 1:2 0 0 0 1:3 0 0 0 1:1 10 12 1:2 12 11 13 1:3 13 12 15 1:1 8 10 12 1:2 12 11 12 13 16 15 1:3 13 14 15 14 16 18 41 Bảng C3 Kết phân tích Post Hoc đường kính vòng kháng khuẩn dịch chiết từ dây Cóc với cồn 900 với vi khuẩn Aeromonas hydrophila Vi khuẩn Aeromonas hydrophila (I) (J) Mean Std NT NT Difference Error Sig (I-J) TL1 LSD TL2 TL3 95% Confidence Interval Lower Upper Bound Bound TL2 -3.00000* 66667 004 -4.6313 -1.3687 TL3 -6.00000* 66667 000 -7.6313 -4.3687 TL1 3.00000* 66667 004 1.3687 4.6313 TL3 -3.00000* 66667 004 -4.6313 -1.3687 TL1 6.00000* 66667 000 4.3687 7.6313 TL2 3.00000* 66667 004 1.3687 4.6313 * The mean difference is significant at the 0.05 level Bảng C4 Kết phân tích Post Hoc đường kính vòng kháng khuẩn dịch chiết từ dây Cóc với cồn 900 với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Vi khuẩn Edwardseilla ictaluri (I) (J) Mean Std NT NT Difference Error Sig (I-J) TL1 LSD TL2 TL3 95% Confidence Interval Lower Upper Bound Bound TL2 -3.33333 2.03670 153 -8.3170 1.6503 TL3 -6.66667* 2.03670 017 -11.6503 -1.6830 TL1 3.33333 2.03670 153 -1.6503 8.3170 TL3 -3.33333 2.03670 153 -8.3170 1.6503 TL1 6.66667* 2.03670 017 1.6830 11.6503 TL2 3.33333 2.03670 153 -1.6503 8.3170 * The mean difference is significant at the 0.05 level 42 Bảng C5 Kết phân tích Post Hoc đường kính vòng kháng khuẩn dịch chiết từ dây Thần thông với cồn 700 với vi khuẩn Aeromonas hydrophila Vi khuẩn Aeromonas hydrophyla (I) (J) Mean Std NT NT Difference Error Sig (I-J) TL1 LSD TL2 TL3 95% Confidence Interval Lower Upper Bound Bound TL2 -2.33333 1.27657 117 -5.4570 7903 TL3 -5.33333* 1.27657 006 -8.4570 -2.2097 TL1 2.33333 1.27657 117 -.7903 5.4570 TL3 -3.00000 1.27657 057 -6.1237 1237 TL1 5.33333* 1.27657 006 2.2097 8.4570 TL2 3.00000 1.27657 057 -.1237 6.1237 * The mean difference is significant at the 0.05 level Bảng C6 Kết phân tích Post Hoc đường kính vòng kháng khuẩn dịch chiết từ dây Thần thông với cồn 700 với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Vi khuẩn Edwardseilla ictaluri (I) (J) Mean Std NT NT Difference Error Sig (I-J) TL1 LSD TL2 TL3 95% Confidence Interval Lower Upper Bound Bound TL2 -1.66667 1.12217 188 -4.4125 1.0792 TL3 -3.00000* 1.12217 037 -5.7458 -.2542 TL1 1.66667 1.12217 188 -1.0792 4.4125 TL3 -1.33333 1.12217 280 -4.0792 1.4125 TL1 3.00000* 1.12217 037 2542 5.7458 TL2 1.33333 1.12217 280 -1.4125 4.0792 * The mean difference is significant at the 0.05 level 43 Bảng C7 Kết phân tích Post Hoc đường kính vòng kháng khuẩn dịch chiết từ dây Thần thông với cồn 900 với vi khuẩn Aeromonas hydrophila Vi khuẩn Aeromonas hydrophyla (I) (J) Mean Std Sig 95% Confidence Interval NT NT Difference Error Lower Upper (I-J) Bound Bound * TL2 -5.00000 90267 001 -7.2088 -2.7912 TL1 * TL3 -7.33333 90267 000 -9.5421 -5.1246 * TL1 5.00000 90267 001 2.7912 7.2088 LSD TL2 TL3 -2.33333* 90267 041 -4.5421 -.1246 * TL1 7.33333 90267 000 5.1246 9.5421 TL3 * TL2 2.33333 90267 041 1246 4.5421 * The mean difference is significant at the 0.05 level Bảng C8 Kết phân tích Post Hoc đường kính vòng kháng khuẩn dịch chiết từ dây Thần thông với cồn 900 với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Vi khuẩn Edwardseilla ictaluri (I) (J) Mean NT NT Difference Std Sig Error (I-J) TL1 LSD TL2 TL3 95% Confidence Interval Lower Upper Bound Bound TL2 -4.66667* 1.51535 022 -8.3746 -.9587 TL3 -6.00000* 1.51535 007 -9.7079 -2.2921 TL1 4.66667* 1.51535 022 9587 8.3746 TL3 -1.33333 1.51535 413 -5.0413 2.3746 TL1 6.00000* 1.51535 007 2.2921 9.7079 TL2 1.33333 1.51535 413 -2.3746 5.0413 * The mean difference is significant at the 0.05 level 44 [...]... dã E ictaluri (Trần Hạnh Triết và ctv., 201 4) 4.3 Khả năng kháng 2 loại vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila (mật độ 106 CFU/ml) của dịch chiết từ dây Thần thông Thông qua phương pháp đục lỗ thạch (Sarkar et al., 199 6) để xác định khả năng kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila của dịch chiết từ dây Thần thông Đường kính vòng kháng khuẩn trung bình của dịch chiết. .. thống kê (p < 0,0 5) Kết quả đã trừ ra 9mm đường kính giếng (a) (b) Hình 4.6: Vòng kháng khuẩn dịch chiết dây Thần thông ngâm với cồn 700 (a) vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (b) vi khuẩn Aeromonas hydrophila Ở dung môi là cồn 700 và dịch chiết là dây Thần thông đều cho kết quả kháng khuẩn với cả 2 loại vi khuẩn Với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cho đường kính trung 26 bình vòng kháng khuẩn có tính kháng... 0,0 5) Kết quả đã trừ ra 9mm đường kính giếng (a) (b) Hình 4.5: Vòng kháng khuẩn của dịch chiết dây Cóc đun với cồn 900 (b) vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (b) vi khuẩn Aeromonas hydrophila Qua Bảng 4.5 cho thấy sau 3 lần lặp lại ở cả 3 tỉ lệ ly trích dịch chiết dây Cóc với dung môi cồn 900 đều cho tính kháng với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila (theo tiêu chuẩn Buaer- Kirty, 199 7). .. mật độ vi khuẩn được sang thưa 3 lần để có được mật độ vi khuẩn 106CFU/ml tương đối phù hợp với thí nghiệm 4.2 Khả năng kháng 2 loại vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila ở mật độ 106 CFU/ml của dịch chiết từ dây Cóc Thông qua phương pháp đục lỗ thạch (Sarkar et al., 199 6) để xác định khả năng kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila của dịch chiết từ dây Cóc Đường... với dây Cóc Bảng 3.1: Thử nghiệm khả năng kháng Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila của dịch chiết dây Cóc với nước cất đun sôi, cồn 700, cồn 900 Nghiệm thức Thể tích dịch chiết Số lần lặp lại (µl) Mật độ vi khuẩn (cfu/ml) 1:1 100 3 106 1:2 100 3 106 1:3 100 3 106 Đối chứng 100 3 106 * Thí nghiệm với dây Thần thông Bảng 3.2: Thử nghiệm khả năng kháng Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila. .. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1 Trong quá trình thực hiện thí nghiệm đã thử nghiệm tác dụng của dịch chiết với vi khuẩn ở 3 mật độ sang thưa khác nhau Ở mẫu vi khuẩn gốc, do mật độ dày đặc dịch chiết không có tác dụng, không xuất hiện đường kính vòng kháng khuẩn Mật độ vi khuẩn ở đĩa này là 108 - 109CFU/ml Hình 4.1: Vòng kháng khuẩn của dịch chiết ở mẫu vi khuẩn gốc Ở mẫu vi khuẩn khi được sang... không có tính kháng với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila (theo tiêu chuẩn Buaer- Kirty, 199 7) Mặc dù trong thành phần dây Cóc có hoạt chất kháng khuẩn palmatin hàm lượng 0,1% trọng lượng khô, có tác dụng ức chế đối với tụ cầu khuẩn (Staphylococcus) và liên cầu khuẩn (Streptococcus), tuy 22 nhiên tác dụng ức chế vi khuẩn của palmatin kém hơn các loại kháng sinh thông thường Ngoài ra,... 1959, Horak and Santavi đã chiết suất từ Cần sa (Cannabis sativa) được chất cannabiriolic, dung dịch 10 - 15μg/ml có tác dụng với vi khuẩn lao ở người và một số vi khuẩn Gram ( +), đặc biệt là vi khuẩn kháng lại Penicilline Tại Liên Xô (c ) thường dùng “imalin” tách chiết từ cây Cỏ Ban (Hypericum pesoratum), dung dịch 1/1.000.000 đã có thể diệt được tụ cầu vàng, vi khuẩn bạch cầu, vi khuẩn hoại thư sinh... riêng lẽ nuôi tăng sinh trong ống nghiệm NB 10 ml Hình 3.2: Quy trình nuôi tăng sinh mẫu vi khuẩn (a) (b) Hình 3.3: Mẫu vi khuẩn gốc (a) vi khuẩn Aeromonas hydrophila (b) vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 19 Hình 3.4: Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila được sang thưa 3.5 Phương pháp xử lý số liệu Sử dụng phần mềm Microsoft Office Word 2007 để soạn thảo văn bản Sau đó số liệu được xử lý... Đường kính vòng kháng khuẩn trung bình của dịch chiết của được thể hiện qua bảng sau: Bảng 4.1: Đường kính vòng kháng khuẩn trung bình của dịch chiết từ dây Cóc với nước cất đun sôi Đường kính trung bình vòng kháng khuẩn (mm) Tỷ lệ ly trích (thảo dược :nước cất) Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophila 1:1 0 0 1:2 0 0 1:3 0 0 ĐC 0 0 Hình 4.3: Vòng kháng khuẩn của dịch chiết dây Cóc với nước cất đun