TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN MÃ NGÀNH: 52620301 TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN CỦA DỊCH CHIẾT RỄ CỎ XƯỚC (Achyranthes aspera L.) VÀ LÁ SẦU ĐÂU (Azadirachta indica A.) LÊN VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophilla Sinh viên thực Nguyễn Thị Hoàng Dung MSSV: 1153040014 Cần Thơ, 2015 i TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN MÃ NGÀNH: 52620301 TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN CỦA DỊCH CHIẾT RỄ CỎ XƯỚC (Achyranthes aspera L.) VÀ LÁ SẦU ĐÂU (Azadirachta indica A.) LÊN VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophilla Cán hướng dẫn Sinh viên thực PGS.TS Nguyễn Văn Bá Nguyễn Thị Hoàng Dung ThS Trần Ngọc Huyền MSSV: 1153040014 Cần Thơ, 2015 ii XÁC NHẬN CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Luận văn: Tác dụng kháng khuẩn dịch chiết rễ cỏ Xước (Achyranthes aspera L.) Sầu đâu (Azadirachta indica A.) lên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophila Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Hoàng Dung Lớp: Nuôi trồng thủy sản K6 Đề tài hoàn thành theo yêu cầu Cán hướng dẫn và góp ý Hội đồng bảo vệ khóa luận tốt nghiệp đại học ngày 15 tháng năm 2015 Cần Thơ, ngày……tháng… năm 2015 Cán hướng dẫn Sinh viên thực (chữ ký) (chữ ký) PGS.Ts Nguyễn Văn Bá Nguyễn Thị Hoàng Dung Cán hướng dẫn (chữ ký) iii Ths Trần Ngọc Huyền iv LỜI CẢM TẠ Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Cô Trần Ngọc Huyền Thầy Nguyễn Văn Bá bảo hướng dẫn tận tình cho em kiến thức kỹ thời gian thực đề tài Em xin cảm ơn tất quý Thầy Cô Khoa Sinh học ứng dụng – Trường Đại học Tây Đô tận tình dạy bảo, truyền đạt kiến thức quý báu cho em suốt thời gian học tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành luận văn này, kiến thức Thầy Cô truyền đạt hành trang giúp em cố gắng thêm tiếp tục phấn đấu để giúp em sống sau Cuối cùng, xin bày tỏ lòng tri ân đến gia đình, bạn bè tập thể lớp Nuôi trồng Thuỷ sản giúp đỡ, động viên suốt trình học tập thực đề tài Xin chân thành cảm ơn v TÓM TẮT Đề tài “Tác dụng kháng khuẩn dịch chiết rễ cỏ Xước (Achyranthes aspera L) Sầu đâu (Azadirachta indica A.) lên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophila” thực nhằm tìm loại thảo dược có tính chất đối kháng với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophila Kiểm tra tính kháng loại thảo dược rễ cỏ Xước Sầu đâu phương pháp đục lỗ thạch với vi khuẩn thị Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophila Kết cho thấy loại dịch chiết thảo dược có tính kháng khuẩn Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophila, thể qua giá trị trung bình đường kính vòng kháng khuẩn Dịch chiết rễ cỏ Xước chiết xuất cách ngâm với cồn 70% tỷ lệ 1:1 có tác dụng kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri với đường kính vòng kháng khuẩn cao 3,3 mm, vi khuẩn Aeromonas hydrophila dịch chiết rễ cỏ Xước tác dụng kháng khuẩn Dịch chiết Sầu đâu ngâm với cồn 70% đun với cồn 70% tỷ lệ 1:1 có tác dụng kháng loại vi khuẩn, dịch chiết ngâm với cồn 70% cho khả kháng cao (Edwardsiella ictaluri mm, Aeromonas hydrophila 13,6 mm) Từ khoá: cỏ Xước, Sầu đâu, đường kính vòng kháng khuẩn, Edwardsiella ictaluri, Aeromonas hydrophila vi MỤC LỤC DANH SÁCH HÌNH ix DANH SÁCH BẢNG .x CHƯƠNG ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu .1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu .1 1.3 Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Cây cỏ Xước (Achyranthes aspera L.) 2.2 Cây Sầu đâu (Azadirachta indica A.) 2.3 Tổng quan vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 2.3.1 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 2.3.2 Điều kiện sống gây bệnh 2.3.3 Dấu hiệu bệnh lý 2.3.4 Sự phân bố, khả gây bệnh lan truyền bệnh Edwardsiella ictaluri cá 2.4 Tổng quan vi khuẩn Aeromonas hydrophila .8 2.4.1 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 2.4.2 Điều kiện sống gây bệnh 2.4.3 Dấu hiệu bệnh lý 2.4.4 Sự phân bố, khả gây bệnh lan truyền bệnh Aeromonas hydrophila 2.4.5 Tình hình nghiên cứu sử dụng loại thảo dược phòng trị bệnh động vật thủy sản .9 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 3.1 Thời gian địa điểm thực đề tài 12 3.1.1 Thời gian 12 3.1.2 Địa điểm 12 vii 3.2 Vật liệu, dụng cụ hóa chất 12 3.2.1 Vật liệu nghiên cứu 12 3.2.2 Dụng cụ, hóa chất 12 3.3 Phương pháp nghiên cứu 12 3.3.1 Phương pháp tiến hành thí nghiệm 12 3.4 Bố trí thí nghiệm 14 3.4.1 Thí nghiệm với rễ cỏ Xước 14 3.4.2 Thí nghiệm với Sầu đâu 14 3.5 Phương pháp xử lý số liệu 15 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 16 4.1 Thí nghiệm với rễ cỏ Xước 16 4.1.1 Khả kháng Edwardsiella ictaluri rễ cỏ Xước 16 4.1.2 Khả kháng Aeromonas hydrophila rễ cỏ Xước 18 4.2 Thí nghiệm với Sầu đâu 19 4.2.1 Khả kháng Edwardsiella ictaluri Sầu đâu 19 4.2.2 Khả kháng Aeromonas hydrophila Sầu đâu 21 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 23 5.1 Kết luận 23 5.2 Đề xuất 23 TÀI LIỆU THAM KHẢO 24 PHỤ LỤC A 27 PHỤ LỤC B 28 PHỤ LỤC C 33 viii DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1 Hình thái bên rễ cỏ Xước……… ………….………………….2 Hình 2.2 Hình thái bên Sầu đâu……… ………….………………… Hình 2.3 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri………………….………………… ……5 Hình 2.4 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila có tiêm mao….………………… Hình 4.1 Vòng kháng khuẩn dịch chiết rễ cỏ Xước vi khuẩn Edwardsiella ictaluri……………………………………………………………….15 Hình 4.2 Vòng kháng khuẩn dịch chiết cỏ Xước vi khuẩn Aeromonas hydrophila………………………………………………………………………….17 Hình 4.3 Vòng kháng khuẩn dịch chiết Sầu đâu vi khuẩn Edwardsiella ictaluri…………………………………….…………………………18 Hình 4.4 Vòng kháng khuẩn dịch chiết Sầu đâu vi khuẩn Aeromonas hydrophila……………………………………………………………………… 20 ix DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1 Thử nghiệm khả kháng Edwardsiella ictaluri cỏ Xước với nước cất cồn 70%……………………………………………………… ……………13 Bảng 3.2 Thử nghiệm khả kháng Aeromonas hydrophila rễ cỏ Xước với nước cất cồn 70%…………………………………………………………… 14 Bảng 3.3 Thử nghiệm khả kháng Edwardsiella ictaluri Sầu đâu với nước cất cồn 70%………………………………………………………… … 14 Bảng 3.4 Thử nghiệm khả kháng Aeromonas hydrophila Sầu đâu với nước cất cồn 70%…………………………………………………………………… 15 Bảng 4.1 Khả kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cỏ Xước với nước cất ngâm, nước cất đun, cồn 70% ngâm, cồn 70% đun………… ………………… 15 Bảng 4.2 Khả kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila cỏ Xước với nước cất ngâm, nước cất đun, cồn 70% ngâm, cồn 70% đun………… ……………….17 Bảng 4.3 Khả kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Sầu đâu với nước cất ngâm, nước cất đun, cồn 70% ngâm, cồn 70% đun ………… ……………….18 Bảng 4.2 Khả kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila Sầu đâu với nước cất ngâm, nước cất đun, cồn 70% ngâm, cồn 70% đun………… ……………… 20 x Kết thí nghiệm tách chiết Sầu đâu cồn 70% ngâm cồn 70% đun cho khả kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila Ở cồn 70% ngâm, tỷ lệ 1:1, 1:2 1:3 cho kết vòng kháng khuẩn trung bình 13,6 mm; 11 mm mm cao so với thí nghiệm cồn 70% đun Với tỷ lệ nồng độ thảo dược ly trích nhiều nên khả kháng khuẩn cao hơn, mặt dù đun cồn nhiệt độ cao tách chiết chất kháng khuẩn đồng thời làm cồn bay nhanh nên khả kháng khuẩn giảm dần Kết ngâm dịch chiết Sầu đâu cồn 70% thu vòng kháng khuẩn 13,6 mm đạt mức kháng khuẩn cao X > 10 (Schillinger Luke, 1989), áp dụng phương pháp ly trích thực tiễn Qua kết phân tích vòng kháng khuẩn đun dịch chiết Sầu đâu nước cất tỷ lệ 1:1 10,7 mm khác biệt có ý nghĩa thống kê với tỷ lệ 1:3 (p < 0,05)  So sánh khả kháng vi khuẩn dịch chiết rễ cỏ Xước Sầu đâu Từ kết thí nghiệm với dịch chiết rễ cỏ Xước cho thấy tính kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cho đường kính vòng kháng khuẩn cao tỷ lệ 1:1 3,3 mm Sầu đâu mm thấy khả kháng khuẩn Sầu đâu cao so với dịch chiết rễ cỏ Xước Đối với vi khuẩn Aeromonas hydrophila dịch chiết Sầu đâu phương pháp ngâm cồn 70% ngâm tỷ lệ 1:1 13,6 mm đạt mức kháng khuẩn cao, dịch chiết rễ cỏ Xước tính kháng với vi khuẩn Aeromonas hydrophila Từ kết nghiên cứu thấy dịch chiết từ Sầu đâu có tính kháng khuẩn cao dịch chiết rễ cỏ Xước, thành phần hoá học Sầu đâu có nhiều hoạt chất có tính kháng khuẩn cao so với dịch chiết rễ cỏ Xước 22 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Dịch chiết rễ cỏ Xước (đun nước cất ngâm cồn 70%) có tác dụng kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Dịch chiết Sầu đâu (ngâm cồn 70% đun cồn 70%) có tác dụng kháng loại vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophila Dịch chiết rễ cỏ Xước ngâm cồn 70% có tác dụng kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri với đường kính vòng kháng khuẩn cao tỷ lệ 1:1 3,3 mm, dịch chiết rễ cỏ Xước tác dụng kháng khuẩn vi khuẩn Aeromonas hydrophila Dịch chiết Sầu đâu ngâm đun với cồn 70% có tác dụng kháng loại vi khuẩn, tỷ lệ 1:1 ngâm với cồn 70% cho khả kháng cao (Edwardsiella ictaluri mm, Aeromonas hydrophila 13,6 mm) 5.2 Đề xuất Cần nghiên cứu sâu phân tích thêm thành phần hoá học có dịch chiết rễ Cỏ Xước Sầu đâu để hiểu rõ thêm chế kháng khuẩn 23 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bùi Quang Tề Vũ Thị Tám, 1999 Những bệnh thường gặp tôm cá biện pháp phòng trị, NXB Nông Nghiệp, thành phố Hồ Chí Minh Bùi Quang Tề, Đỗ Thị Hoà, Lê Xuân Thành, 2006 Dự thảo danh mục chất thay hoá chất, kháng sinh chế phẩm sinh học cấm sử dụng nuôi trồng thuỷ sản Bùi Quang Tề, Lê Xuân Thành, 2006 Kết nghiên cứu chế phẩm (VTS1 - C), (VTS1 - T) tách chiết từ thảo dược phòng trị bệnh cho tôm sú cá tra.Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1, Viện hóa học công nghiệp Chu Viết Luân, 2003 Thủy sản Việt nam phát triển hội nhập, NXB Chính trị quốc gia Hà Nội Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng Nguyễn Thị Muội, 2004 Bệnh học thủy sản, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội Huỳnh Kim Diệu, 2011 Khả phòng bệnh xuất huyết gan thận mủ bột Xuân Hoa.Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, tập XVIII số Khuê Lập Trung, 1985 Kỹ thuật phòng trị bệnh tôm, cá nhuyễn thể, NXB Nông thôn Trung Quốc Lê Thị Bé Năm, 2002 Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh đốm trắng nội tạng cá Tra (Pangasius hypophthalmus) LVTN Khoa thủy sản, ĐHCT Lương Trần Thục Đoan 2006 Khảo sát xâm nhập vi khuẩn gây bệnh mủ gan (Edwardsiella ictaluri) quan khác cá Tra (Pangasius hypophthalmus) LVTN Khoa thủy sản, ĐHCT Mai Văn Tài, 2004 Điều tra đánh giá trạng loại thuốc hoá chất dùng nuôi trồng thuỷ sản nhằm đề xuất giải pháp quản lý Nguyễn Ngọc Phước, Nguyễn Anh Tuấn, Nguyễn Quang Linh, Ngô Thị Hương Giang, Nguyễn Nam Quang, 2007 Sử dụng thảo dược chế phẩm từ thảo dược điều trị bệnh vi khuẩn cho động vật thủy sản, Kỷ yếu khoa học công nghệ, 2007 Liên hiệp Khoa học kỹ thuật Việt Nam, Hà Nội Nguyễn Ngọc Phước, Phạm Thị Phương Lan, Nguyễn Quang Linh, Kishio Hatai, 2007 Nghiên cứu khả kháng nấm dịch chiết Trầu (Piper betle L), Tạp chí Thủy Sản số 4/2007 Nguyễn Thành Tâm, 2013 Tình hình nghiên cứu ứng dụng vắc – xin phòng bệnh vi khuẩn Aeromonas hydrophylla 24 Nguyễn Thị Ngọc Thuỳ, 2015 Tác dụng dịch chiết dây Cóc (Tinospora crispa Miers.) dây Thần Thông (Tinospora cordifolia Miers.) lên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophila Nguyễn Thị Vân Thái, 2006 Bàn tiềm phòng chữa bệnh nhiễm khuẩn kháng sinh thảo mộc nuôi trồng thuỷ sản Phạm Quang Trung 2008 Sử dụng chế phẩm cỏ Xước phòng trị bệnh tiêu chảy lợn theo mẹ sau cai sữa Tạp chí Khoa học Trường Đại học Huế, Phạm Thiệp Vũ Ngọc Thuý, 2001 Thuốc biệt dược cách sử dụng, Nhà xuất Y học Phan Xuân Thanh, 2002 Tuyển tập nghề cá đồng sông Cửu Long Tôn Nữ Liên Hương, Nguyễn Minh Hiền, Trần Đình Luận 2011 Nghiên cứu thành phần hóa học thân cỏ Xước (Achyranthes aspera L.) thu Trà Vinh Tạp chí Khoa học Trường ĐHCT, số 19b, 56-61 Trần Anh Dũng 2005 Khảo sát tác nhân gây bệnh nuôi cá tra (Pangasius hypophthalmus) thâm canh tỉnh An Giang LVCH Khoa thủy sản, ĐHCT Từ Thanh Dung, 1997 Tài liệu tập huấn thực hành kí sinh trùng vi khuẩn Võ Văn Chi, 1997 Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội Võ Văn Chi, 2000 Cây thuốc trị bệnh thông dụng, NXB Thanh Hoá Võ Văn Chi, Dương Đức Tiến Phân loại học thực vật bậc cao, 1978 NXB Đại học Trung học chuyên nghiệp Tài liệu tiếng Anh Biswas K.,Chattopadhayay J., Banerjee R.M., Bandyopdyodhyay U 2002 Biological activities and medical properties of neem (Azadirachta indica) Current Science, 82,1336-1345 Dennis D.I.R, 1992 Neem, a tree for solving global problems National Academy Press Washington, D.C, USA, 141 pages Dennis Dearth I.R, 1992 Neem – A tree for solving global problem National Academy Press, Washington D.C, USA 141 pages Esteve, C., E G Biosca and C Amaro 1993 Virulence of Aeromonas hydrophila and some other bacteria isolated from European eels Anguilla anguilla reared in fresh water In Diseases of Aquatic organisms Vol 16: 15-20 25 Ferguson, H.W., J.F Turnbull, A Shinn, K Thomson, T.T Dung and M Crumlish, 2001 Bacillary necrosis in farmed Pangasius hypophthalmus (Sauvage) from the Mekong delta, Vietnam Journal of fish disease 2001, 24, page 509-513 Gunasena H.P.M, Marambe B, 1998 Neem in Sri Lanka – A monograph A Publication of the university of Peradeniya – Oxford Forestry Insitute, UK Forsetry Research Link, 62 pages Gunasena H.P.M Marambe B, 1998 Neem in Sri Lanca, a monograph The University of Peradeniya – Oxford Foresty Institute (UK) Forestry Research Link, 62 pages Hutchinson J., 1975 Những họ thực vật có hoa, tập I Nguyễn Thạch Bích, Vũ Văn Chuyên, Vũ Văn Dũng, Lê Văn Quỳ, Trịnh Văn Thanh dịch Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, trang 368 – 369 Inglis, V., R.J Roberts and Niall R Bromage, 1994 Enteric septicaemia of catfish Bacterial Diseases of Fish, page 67-79 312pp Rahman, M.H., S Suzuki and K Kawai 2000 The effect of temperature on Aeromonas hydrophila infection in goldfish, Carassius auratus 26 PHỤ LỤC A Phụ lục A.1 Bảng thành phần môi trường Tên môi trường BHI_Broth (Brain Heart Infusion Broth), 1.000ml NB (Nutrient Broth), 1.000ml Thành phần Khối lượng (g) Beef heart infusion 250,0 Calf brain infusion 200,0 Proteose peptone 10,00 NaCl 5,00 Na2HPO4.12H2O 2,50 Glucose 2,00 pH (250C) 7,4 ± 0,2 Peptic digest of animal tissue 5.00 Beef extract 3.00 pH 6.9 ± 0.2 at 250C Distilled water Ltr 27 PHỤ LỤC B * Phương pháp nuôi tăng sinh vi khuẩn Theo De Man et al., (1960) vi khuẩn phân lập môi trường BHI agar NA sau ủ 320C 48 – 72h để khuẩn lạc phát triển Sau lấy khuẩn lạc rời rạc vi khuẩn Aeromonas hydrophila vi khuẩn Edwardsiella ictaluri đem nuôi tăng sinh môi trường NB ủ 320C 24h Mẫu vi khuẩn Trữ ml mẫu ống fancol, giữ lạnh Nuôi tăng sinh môi trường NB ủ 24h, to 320C Cấy lên đĩa thạch BHI agar NA VK phân lập ủ 24h, to 320C Hút ml vi khuẩn tăng sinh sang thưa để thử với dịch chiết thảo dược Lấy khuẩn lạc riêng lẽ nuôi tăng sinh ống nghiệm NB 10 ml Hình 3.2: Quy trình nuôi tăng sinh mẫu vi khuẩn Hình 3.3: Mẫu vi khuẩn gốc (a) vi khuẩn Aeromonas hydrophila (b) vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 28 Hình 3.4: Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophila nuôi tăng sinh * Phương pháp cấy ria đĩa thạch vô trùng Chuẩn bị Giống vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophila Đĩa thạch Que cấy Đèn cồn Vệ sinh cồn 70% khắp mặt bên tủ cấy Thao tác Rửa tay cồn Lắc ống huyền phù Hơ que cấy lửa đèn cồn đến đầu que cấy nóng đỏ, làm nguội que cấy không khí khoảng 15 giây Mở nắp dụng cụ chứa vi khuẩn cần cấy, đưa nhẹ qua lửa đèn cồn Cho que cấy vào ống huyền phù tế bào, chạm đầu que cấy vào thành ống để làm nguội tiếp Nhúng đầu que cấy vào dịch huyền phù Tay trái mở nắp đĩa thạch Đặt đầu que cấy vào góc đĩa thạch chấm nhẹ để loại bớt tế bào lần Từ điểm đẩy nhẹ đầu que cấy lướt nhanh mặt thạch theo đường zích zắc dày Đậy nắp đĩa 29 Khử trùng đầu que cấy đèn cồn làm nguội đầu que cấy Hé mở nắp đĩa, đặt đầu que cấy lên phần thạch chưa ria cấy để làm nguội tiếp Bắt đầu từ cạnh đường zích zắc thứ nhất, ria đường zích zắc thứ hai có chiều khác với đường ban đầu Đậy nắp đĩa lại Khử trùng que cấy, làm nguội, cạnh đường zích zắc thứ hai, ria cấy đường zích zắc thứ ba có chiều khác với đường thứ thứ hai khoảng trống lại Đậy nắp đĩa, khử trùng que cấy trước cắm vào giá Ngoài kiểu ria cấy tạo thành ba đường zích zắc (hay gọi ria cấy ba pha) ria cấy bốn đường zích zắc (bốn pha) để thu nhận khuẩn lạc Hình 2: Các cách cấy ria Hình 3: Các thao tác cấy truyền 30 Phụ lục B.2 Phương pháp nhuộm Gram vi khuẩn Nhuộm Gram theo bước sau:  Cho giọt nước muối sinh lý lên kính mang vật  Dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc trãi lên kính mang vật, để kính mang vật khô tự nhiên  Hơ lướt kính mang vật lửa đèn cồn, cố định vi khuẩn sau để nguội  Nhuộm crytal violet (dung dịch 1) khoảng phút, rửa kính mang vật nước  Nhuộm iodine (dung dịch 2) phút, rửa kính mang vật nước  Rửa kính mang vật dung dịch alcohol/acetone (dung dịch 3) từ – giây  Rửa kính mang vật lại nước  Nhuộm safranin (dung dịch 4) khoảng phút, rửa lại nước để khô Quan sát kính mang vật kính hiển vi quang học (40X 100X)  Vi khuẩn gram (+): xanh tím  Vi khuẩn gram (-): màu hồng Phụ lục B.3 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn Chuẩn bị số ống nghiệm vô trùng, ống chứa 9ml nước muối sinh lý Lấy 1ml mẫu nước cần nghiên cứu, đưa sang ống nghiêm thứ làm đồng ta độ pha loãng 10 lần (10-1) Lấy 1ml nước ống nghiệm 10-1 cho vào ống nghiệm thứ 2, ta độ pha loãng 100 lần (10-2) Cứ làm ta độ pha loãng tiếp theo: 10-3, 10-4,…,10-n Lấy 0,1ml nước nghiên cứu – độ pha loãng khác nhau, nuôi cấy đĩa thạch chứa môi trường cần thiết que gạt Mỗi độ pha loãng nuôi cấy từ – đĩa Nuôi cấy nhiệt độ 300C, sau 24 giờ, đem đếm số khuẩn lạc mọc đĩa thạch, lấy giá trị trung bình đĩa lồng có nồng độ pha loãng 31 Mật độ vi khuẩn tính theo công thức: A (cfu/ml) X= V.K Trong đó: X: mật độ vi khuẩn A: Số lượng khuẩn lạc trung bình độ pha loãng V: Thể nước đưa vào nuôi cấy K: Hệ số pha loãng Phương pháp so màu: Dùng dung dịch Macphalan để so màu xác định nồng độ vi khuẩn 1ml 1ml 1ml Dd gốc 10-1 10-2 1ml 1ml 10-(n-1) 10-n Sơ đồ 3.2 Sơ đồ xác định mật độ vi khuẩn 32 PHỤ LỤC C Bảng C1 Kích thước đường kính vòng kháng khuẩn dịch chiết cỏ Xước Dung môi Nước cất ngâm Nước cất đun Cồn 70 ngâm Edwardseilla ictaluri Aeromonas hydrophila 3 1:1 0 0 0 1:2 0 0 0 1:3 0 0 0 1:1 0 1:2 1 0 1:3 0 0 0 1:1 0 1:2 2 0 1:3 0 0 0 1:1 0 0 0 1:2 0 0 0 1:3 0 0 0 Tỷ lệ Cồn 700 đun 33 Bảng C2 Kích thước đường kính vòng kháng khuẩn dịch chiết Sầu đâu Dung môi Nước cất ngâm Nước cất đun Cồn 70 ngâm Edwardseilla ictaluri Aeromonas hydrophila 3 1:1 0 0 0 1:2 0 0 0 1:3 0 0 0 1:1 0 12 11 1:2 0 10 1:3 0 1:1 7 10 14 17 1:2 5 13 12 1:3 11 1:1 12 12 10 1:2 10 12 1:3 11 Tỷ lệ Cồn 700 đun Bảng C3 Kết phân tích Post Hoc đường kính vòng kháng khuẩn dịch chiết với nước cất đun từ rễ cỏ Xước vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (I) NT (J) NT Mean Std Sig 95% Confidence Interval Difference Error Lower Upper (I-J) Bound Bound * TL2 1.000 385 041 06 1.94 TL1 * TL3 2.333 385 001 1.39 3.28 * TL1 -1.000 385 041 -1.94 -.06 LSD TL2 TL3 1.333* 385 013 39 2.28 TL1 -2.333* 385 001 -3.28 -1.39 TL3 * TL2 -1.333 385 013 -2.28 -.39 * The mean difference is significant at the 0.05 level 34 Bảng C4 Kết phân tích Post Hoc đường kính vòng kháng khuẩn dịch chiết với cồn 700 ngâm từ rễ cỏ Xước vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (I) NT (J) NT Mean Std Sig 95% Confidence Interval Difference Error Lower Upper (I-J) Bound Bound * TL2 1.667 385 005 72 2.61 TL1 * TL3 3.333 385 000 2.39 4.28 TL1 -1.667* 385 005 -2.61 -.72 LSD TL2 * TL3 1.667 385 005 72 2.61 * TL1 -3.333 385 000 -4.28 -2.39 TL3 * TL2 -1.667 385 005 -2.61 -.72 * The mean difference is significant at the 0.05 level Bảng C5 Kết phân tích Post Hoc đường kính vòng kháng khuẩn dịch chiết với cồn 700 ngâm từ Sầu đâu vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (I) NT (J) NT Mean Std Sig 95% Confidence Interval Difference Error Lower Upper (I-J) Bound Bound TL2 1.333 609 071 -.16 2.82 TL1 TL3 2.667* 609 005 1.18 4.16 TL1 -1.333 609 071 -2.82 16 LSD TL2 TL3 1.333 609 071 -.16 2.82 * TL1 -2.667 609 005 -4.16 -1.18 TL3 TL2 -1.333 609 071 -2.82 16 * The mean difference is significant at the 0.05 level Bảng C6 Kết phân tích Post Hoc đường kính vòng kháng khuẩn dịch chiết với cồn 700 đun từ Sầu đâu vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (I) NT TL1 LSD TL2 TL3 (J) NT TL2 TL3 TL1 TL3 TL1 TL2 Mean Difference (I-J) 1.333 2.000 -1.333 667 -2.000 -.667 Std Error 1.656 1.656 1.656 1.656 1.656 1.656 35 Sig .451 272 451 701 272 701 95% Confidence Interval Lower Upper Bound Bound -2.72 5.38 -2.05 6.05 -5.38 2.72 -3.38 4.72 -6.05 2.05 -4.72 3.38 Bảng C7 Kết phân tích Post Hoc đường kính vòng kháng khuẩn dịch chiết với nước cất đun từ Sầu đâu vi khuẩn Aeromonas hydrophila (I) NT (J) NT Mean Std Sig 95% Confidence Interval Difference Error Lower Upper (I-J) Bound Bound TL2 2.000 1.018 097 -.49 4.49 TL1 * TL3 2.667 1.018 040 17 5.16 TL1 -2.000 1.018 097 -4.49 49 LSD TL2 TL3 667 1.018 537 -1.83 3.16 * TL1 -2.667 1.018 040 -5.16 -.17 TL3 TL2 -.667 1.018 537 -3.16 1.83 * The mean difference is significant at the 0.05 level Bảng C8 Kết phân tích Post Hoc đường kính vòng kháng khuẩn dịch chiết từ Sầu đâu với cồn 700 ngâm vi khuẩn Aeromonas hydrophila (I) NT (J) NT Mean Std Sig 95% Confidence Interval Difference Error Lower Upper (I-J) Bound Bound TL2 2.667 2.277 286 -2.91 8.24 TL1 TL3 4.667 2.277 086 -.91 10.24 TL1 -2.667 2.277 286 -8.24 2.91 LSD TL2 TL3 2.000 2.277 414 -3.57 7.57 TL1 -4.667 2.277 086 -10.24 91 TL3 TL2 -2.000 2.277 414 -7.57 3.57 * The mean difference is significant at the 0.05 level Bảng C9 Kết phân tích Post Hoc đường kính vòng kháng khuẩn dịch chiết với cồn 700 đun từ Sầu đâu vi khuẩn Aeromonas hydrophila (I) NT (J) NT Mean Std Sig 95% Confidence Interval Difference Error Lower Upper (I-J) Bound Bound TL2 1.667 1.633 347 -2.33 5.66 TL1 TL3 2.667 1.633 154 -1.33 6.66 TL1 -1.667 1.633 347 -5.66 2.33 LSD TL2 TL3 1.000 1.633 563 -3.00 5.00 TL1 -2.667 1.633 154 -6.66 1.33 TL3 TL2 -1.000 1.633 563 -5.00 3.00 * The mean difference is significant at the 0.05 level 36 [...]... quan tâm nghiên cứu ứng dụng thảo dược vào trong l nh vực nuôi trồng thuỷ sản Từ đó, đề tài Tác dụng kháng khuẩn c a dịch chiết rễ cỏ Xước (Achyranthes aspera L. ) và l Sầu đâu (Azadirachta indica A .) l n vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila được thưc hiện 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Nhằm đánh giá khả năng kháng vi khuẩn c a dịch chiết rễ cỏ Xước và l Sầu đâu l n 2 loại vi khuẩn Edwardsiella. .. 70 %) có tác dụng kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Dịch chiết l Sầu đâu (ngâm trong cồn 70% và đun trong cồn 70 %) có tác dụng kháng 2 loại vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila Dịch chiết rễ cỏ Xước ngâm trong cồn 70% có tác dụng kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri với đường kính vòng kháng khuẩn cao nhất ở tỷ l 1:1 l 3,3 mm, dịch chiết rễ cỏ Xước không có tác dụng kháng khuẩn. .. QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thí nghiệm với dịch chiết cỏ Xước 4.1.1 Khả năng kháng Edwardsiella ictaluri c a dịch chiết cỏ Xước Thông qua phương pháp đục l thạch (Sarkar et al., 199 6) để xác định khả năng kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri c a dịch chiết từ rễ cỏ Xước Đường kính vòng kháng khuẩn trung bình c a dịch chiết c a được thể hiện như sau: Bảng 4.1 Khả năng kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri c a. .. Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila 1 1.3 Nội dung nghiên cứu Tách chiết dịch chiết rễ cỏ Xước và l Sầu đâu với dung môi với tỷ l khác nhau và theo 2 phương pháp ngâm hoặc đun Kiểm tra tính kháng c a 2 loại thảo dược rễ cỏ Xước và l Sầu đâu bằng phương pháp đục l thạch với vi khuẩn chỉ thị l Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila 2 CHƯƠNG 2 L ỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Cây cỏ Xước Đặc... do vi khuẩn và nấm gây ra 2.3 Tổng quan về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Giống: Edwardsiella Loài: Edwardsiella ictaluri Hình 2.3 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri nhuộm Gram (Nguồn: tự chụp) 2.3.1 Đặc điểm sinh l , sinh h a Vi khuẩn Edwardstella ictaluri l loài vi khuẩn Gram âm, hình que mảnh, kích thước 1 x 2 – 3µm, không sinh bào tử, l vi khuẩn yếm khí... nghiệm với dịch chiết rễ cỏ Xước cho thấy tính kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cho đường kính vòng kháng khuẩn cao nhất ở tỷ l 1:1 l 3,3 mm nhưng ở l Sầu đâu l 6 mm thấy được khả năng kháng khuẩn c a l Sầu đâu cao hơn so với dịch chiết rễ cỏ Xước Đối với vi khuẩn Aeromonas hydrophila dịch chiết l Sầu đâu ở phương pháp ngâm trong cồn 70% ngâm được tỷ l 1:1 l 13,6 mm đạt mức kháng khuẩn cao, còn... nghể (Polygonum hydropiper), rau sam (Portulaca cleracea), cây cỏ s a l to (Euphorbia hirta), cỏ s a l nhỏ (Euphorbia thymifolis), sài đất (Wedelia calendu lacae), nhọ nồi (Eclipta alba), bồ công anh (Lactuca indica) , cây vòi voi (Heliotropium indicum) và cây chó đẻ răng c a (Phyllanthus urinaria) có thể sử dụng trong phòng trị bệnh đốm đỏ ở cá trắm cỏ (Hà Ký và ctv., 199 5) Năm 2000, Nguyễn Ngọc Hạnh... vòng kháng khuẩn cao nhất l 3,3 mm ≤ 5 mm (Schillinger và Luke, 198 9) ch a thể áp dụng vào thực tiễn Còn đối với vi khuẩn Aeromonas hydrophila không có tính kháng X = 0 18 4.2 Thí nghiệm với dịch chiết l Sầu đâu 4.2.1 Khả năng kháng Edwardsiella ictaluri c a dịch chiết l Sầu đâu Đường kính vòng kháng khuẩn trung bình c a dịch chiết c a được thể hiện như sau: Bảng 4.3 Khả năng kháng vi khuẩn Edwardsiella. .. vi khuẩn Aeromonas hydrophila Dịch chiết l Sầu đâu ngâm và đun với cồn 70% đều có tác dụng kháng 2 loại vi khuẩn, tỷ l 1:1 ngâm với cồn 70% cho khả năng kháng cao hơn (Edwardsiella ictaluri l 6 mm, Aeromonas hydrophila l 13,6 mm) 5.2 Đề xuất Cần nghiên cứu sâu và phân tích thêm thành phần hoá học có trong dịch chiết rễ Cỏ Xước và l Sầu đâu để hiểu rõ thêm về cơ chế kháng khuẩn 23 TÀI LIỆU THAM... Virulence of Aeromonas hydrophila and some other bacteria isolated from European eels Anguilla anguilla reared in fresh water In Diseases of Aquatic organisms Vol 16: 15-20 25 Ferguson, H.W., J.F Turnbull, A Shinn, K Thomson, T.T Dung and M Crumlish, 2001 Bacillary necrosis in farmed Pangasius hypophthalmus (Sauvage) from the Mekong delta, Vietnam Journal of fish disease 2001, 24, page 509-513 Gunasena H.P.M,