Đang tải... (xem toàn văn)
BÀI 1: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITRIT, NITRAT TRONG MẪU RAU BẰNG PHƯƠNG PHÁP UV VIS BÀI 2: ĐỊNH LƯỢNG FE TRONG SỮA VÀ NƯỚC MẮM BẰNG PHƯƠNG PHÁP UVVIS BÀI 3:XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG Fe VÀ Mn BẰNG PHƯƠNG PHÁP ASS Bài 4: PHƯƠNG PHÁP CHUẨN XÁC ĐỊNH ACID BENZOIC – AICD SORBIC BẰNG KỸ THUẬT HPLC BÀI 5: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CAFEIN TRONG THỰC PHẨM
Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại GVHD: Vũ Hoàng Yến BÀI 1: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITRIT, NITRAT TRONG MẪU RAU BẰNG PHƯƠNG PHÁP UV - VIS Nguyên tắc: I Trong môi trường acid (pH = 2) nitrit bị diazo hố acid sulphanilic, sau kết hợp với alpha naphthylamin cho hợp chất naphathylamino azobenzen sulphonic có màu đỏ khơng bền Nitrat nước, sản phẩm thịt rau cadimi khử thành nitrit Đánh giá nitrit trước sau khử nitrat thành nitrit tính tốn hàm lượng nitrat phép so sánh nitrit trước sau khử Quá trình tổng hợp diễn theo bước: Bước 1: Sự tạo thành muối diazonium từ phản ứng HNO muối amin thơm bậc Bước 2: Sự ghép cặp muối diazonium tác nhân than điện tử với hợp chất thơm có tính than hạch tương đối cao amin,phenol để tạo hợp chất azo có màu Đầu tiên nitrit phản ứng với axit sunfanilic tạo thành muối điazo: Sau muối phản ứng với α- naphtylamin tạo thành hợp chất azo có màu hồng NHĨM 1 Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại GVHD: Vũ Hồng Yến Thiết bị, dụng cụ, hố chất:ơ II Thiết bị Dụng cụ Máy UV-Vis Bình định mức 50ml, 100ml, 250ml, 1000ml Cân phân tích có độ xác 0,1mg Cốc thuỷ tinh 50ml, 100ml, 200ml Máy xay đồng Ống đong 100ml Máy lắc Chai lọ đựng thuốc thử Cân kĩ thuật Bếp điện Pipet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml Quả bóp cao su Bình tia Phễu thuỷ tinh Giấy lọc Hoá chất: Dung dịch kali ferrocyanua trihydrat 10 % hòa tan 10,6g kali ferrocyanua trihydrat vào nước,pha loãng tới 100ml với nước (thuốc thử 1) Dung dịch kẽm acetat dihydrat 21,9 % : hòa tan 21,9g kẽm acetat dihydrat nước,thêm 2ml acid acetic băng pha loãng tới 100ml với nước (thuốc thử 2) Dung dịch dinatri tetraborat decahydrat % : hòa tan 50 g dinatri tetraborat decahydrat 1000ml nước (thuốc thử 3) NHĨM Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại GVHD: Vũ Hồng Yến Dung dịch sulphanilamin 0,2% Cách pha: hoà tan 2g sulphanilamin 800ml nước nóng, lọc, thêm 100ml acid hydrochloric đặc, khuấy kỹ pha loãng tới 1000ml với nước cất (thuốc thử 4) Dung dịch N-1 naphthylethylen diamin dihydrochlorua 0,1% Cách pha: hoà tan 0,25g N-1 naphthylethylen diamin dihydrochlorua nước Pha loãng tới 250ml với nước cất Bảo quản lọ nâu nút kín giữ tủ lạnh (thuốc thử 5) Dung dịch acid HCL 18,9 % Cách pha: pha loãng 445ml acid hydrochloric đặc tới 1000ml với nước (thuốc thử 6) Dung dịch chuẩn gốc natri nitrit nồng độ 1000mg/l Cách pha: hoà tan 1g natri nitrit nước pha loãng tới 1000ml (thuốc thử 7) Dung dịch làm việc natri nitrit nồng độ 50mg/l Cách pha: pha loãng 5ml dung dịch gốc tới 1000ml với nước (thuốc thử 8) Dung dịch dihydrogen dinatri ethylene diamine tetra acetat dihydrat 1% Cách pha: hoà tan 20ml acid hydrochloric đặc với 500ml nước cất, thêm 10g dihydrogen dinatri ethylene diamine tetra acetat dihydrat 55ml dung dịch aminiac đặc Pha loãng tới 1000ml với nước Chỉnh pH = 9,6 – 9,7 (thuốc thử 9) Cadimi kim loại (thuốc thử 10) III Cách tiến hành: Chuẩn bị mẫu: Chiết nitrit nitrat từ sản phẩm thịt Lấy 200g mẫu đại diện mẫu, đồng mẫu cách dùng dao xắt nhuyễn Cân xác khoảng 9g-10g mẫu đồng vài bình tam giác thấm ướt với 5ml dung dịch thuốc thử borax (thuốc thử 3)cho vào cốc 200ml, thêm vào 150 ml nước cất đun nóng (>70oC) Đun nồi cách thuỷ sôi khoảng 30 phút để chiết nitrit nitrat mẫu thịt Để nguội, cho vào bình định mức 250ml thêm 2ml thuốc thử sau 2ml thuốc thử lắc Định mức tới vạch nước cất Để dung dịch 30 phút sau chắt cẩn thận lớp chất lỏng trên, lọc qua giấy lọc (khơng có nitrit nitrat), thu lấy dịch lọc Xây dựng đường chuẩn: NHĨM Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại GVHD: Vũ Hoàng Yến Hút 0; 5; 10; 20 25ml dung dịch chuẩn gốc natri nitrit nồng độ 50mg/l cho vào bình định mức 100ml, dung dịch có nồng độ tương ứng 0; 2,5; 5,0; 7,5 10mg/l natri nitrit, sử dụng dung dich để xây dựng đường chuẩn sau: Hút 10ml dung dịch chuẩn cho vào bình định mức 100ml tương ứng,thêm khoảng 50ml nước cất, 10ml thuốc thử 6ml thuốc thử vào bình.để dung dịch vào bóng tối phút Tiếp thêm 2ml thuốc thử vào trộn hỗn hợp, để vào chỗ tối phút Pha loãng dung dịch tới vạch mức nước cất nồng độ nitrit dung dịch ;0,25 ;0,5 ;0,75 ;1,0 ml/l trộn hỗn hợ đo độ hấp thu bước sóng 538nm Định lượng nitrit: Hút 10ml dịch lọc từ mẫu thịt cho vào bình định mức 100ml Thêm vào khoảng 50ml nước cất, , 10ml thuốc thử 6ml thuốc thử vào bình Để dung dịch chỗ tối phút Tiếp theo thêm 2ml thuốc thử vào lắc hỗn hợp, để vào chỗ tối phút Sau phút lấy định mức tới vạch nước cất, lắc hỗn hợp đo độ hấp thu bước sóng 538nm Căn vào đường chuẩn dung dịch đo có nồng độ Cx (mg/l) Đối với mẫu để định lượng nitrat: Hút 5ml thuốc thử khoảng 1g cadimi ướt cho vào bình định mức 100ml, cho cadimi vào bình định mức phễu nhỏ sử dụng lượng nhỏ nước cất tráng phễu Thêm 25ml dịch lọc, đậy nút lắc 10 phút máy lắc Pha loãng tới vạch nước cất, trộn thật kỹ hỗn hợp để yên khoảng 10 phút cho cadimi lắng Hút 20ml dung dịch (đã xử lý với cadimi để khử nitrat thành nitrit) cho vào bình định mức 100ml tạo màu xác định nitrit IV KẾT QUẢ Kết đo quang NHĨM Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại GVHD: Vũ Hồng Yến Bình định mức Mẫu Mẫu C(ppm) 0.4 0.8 1.6 2.4 Cx1 Cx2 Abs 0.095 0.192 0.381 0.599 0.002 0.011 Vẽ phương trình hồi qui tuyến tính Từ kết Abs đo vẽ phương trình hồi qui tuyến tính thể mối tương quan nồng độ độ hấp thu Tính kết quả: Căn vào độ hấp thu dung dịch mẫu từ đường chuẩn, tính nồng độ nitrat nitrit mẫu Ta có Abs mẫu 0.002, mẫu 0.0007 phương trình đường chuẩn có dạng y = 0.2481x - 0.0047 với R = 0.9990 từ ta tính Cx1 ,Cx2 mẫu cách vào phương trình đường chuẩn: y = 0.2481x - 0.0047 NHĨM Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại GVHD: Vũ Hoàng Yến 0.002 = 0.2481x1 – 0.0047 => Cx1 = 0.0270 0.011 = 0.2481x2 – 0.0047 => Cx2 = 0.0633 Hàm lượng nitrit (mg/kg) mẫu tính theo cơng thức sau: C1 (mg / kg ) = C X ×100 × 250 C1 × 2500 = 10 × m m C1(mg/kg) = = 0.3375 (mg/kg) Hàm lượng tổng nitrit (mg/kg) mẫu sau khử nitrat tính theo cơng thức sau: C2 (mg / kg ) = C X × 100 × 100 × 250 C X × 5000 = 25 × 20 × m m C2(mg/kg) = = 1.5825 (mg/kg) Hàm lượng nitrit mẫu = (tổng nitrit sau khử nitrat-nitrit trước khử nitrat) =>Hàm lượng nitrit mẫu = 1.5825 – 0.3375 = 1.2450 (mg/kg) Trong đó: CX1: Nồng độ nitrit mẫu tính theo đường chuẩn (mg/l) CX2: Nồng độ tổng nitrit mẫu sau khử nitrat tính theo đường chuẩn (mg/l) m :khối lượng mẫu lấy phân tích Nhận xét: NHĨM Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại GVHD: Vũ Hồng Yến So với Thơng tư 27/2012/BYT hàm lượng muối Nitrit muối Nitrat không vượt giới hạn quy định thông tư 168 mg/kg Hàm lượng nitrit mẫu 1.2450 (mg/kg) , Vậy hàm lượng nitrit mẫu đạt mức cho phép R2 đường chuẩn đáng tin cậy (R2 = 0.9990) Các kết có độ tin cậy khơng cao trình chuẩn bị mẫu đo độ hấp thu có sai số NHĨM Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại GVHD: Vũ Hoàng Yến BÀI 2: ĐỊNH LƯỢNG FE TRONG SỮA VÀ NƯỚC MẮM BẰNG PHƯƠNG PHÁP UV-VIS I Nguyên tắc: Fe(II) dung dịch, kết hợp với 1,10-phenaltroline thành phức chất màu cam đỏ bền môi trường pH 3-9 Nếu muốn màu không bị ảnh hưởng thuốc thử dư có mặt ion khác, phản ứng cần tiến hành pH 3,5-4,5 Phức chất gồm phân tử 1,10-phenaltroline kết hợp với ion Fe(II) Phản ứng đặc hiệu cho Fe(II) nên phải chuyển hết Fe(III) Fe(II) cách khử với hydroquinone hay hydroxylamine clohydic 2NH2OH + 4Fe3+ N2O + 4Fe2+ + 4H+ + H2O II Thiết bị, dụng cụ, hoá chất: Thiết bị Dụng cụ Hóa chất Máy UV-Vis Bình định mức 50ml, 100ml, 250ml, 500ml, 1000ml Dung dịch hydroxylamine clohydric 1% Cân phân tích Cốc thuỷ tinh 50ml, 100ml,200ml Dung dịch đệm pH 4,0 Cân kĩ thuật Ống đong 100ml Dung dịch 1,10-phenalthroline 0,1% Bếp điện Chai lọ đựng thuốc thử Dung dịch HCl tinh khiết Lò nung Pipet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml Dung dịch HCl 20% Chén nung Quả bóp cao su Giấy lọc Dung dịch Fe2+ chuẩn Bình tia Phễu thuỷ tinh NHÓM Dung dịch hydroxylamine clohydric 1% Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại GVHD: Vũ Hoàng Yến II Cách tiến hành Chuẩn bị mẫu: Đồng mẫu cân xác 1g mẫu sữa cần phân tích, sau tiến hành vơ hố bếp điện đến than hố đen, nung thành tro trắng nhiệt độ 500 oC khoảng 2g Hoà tan tro 5ml HCl tinh khiết , đun cách thuỷ tới khô nồi cách thuỷ sôi Làm lại lần thứ thứ hòa tan 5ml HCl 20%, Lọc giấy lọc không tro Rửa nhiều lần cặn, giấy lọc, chén nung phễu nước cất nóng để thu hết lượng mẫu Dịch lọc nước rửa cho tất vào bình định mức 100ml, thêm nước cất đến khoảng 80-90ml Điều chỉnh đến pH 3.5 -4.5 CH 3COONa 2M với CH3COONa 0.2M Sau cho them nước cất tới vạch lắc Xây dựng đường chuẩn: Dung dịch Fe chuẩn có nồng độ 1000ppm nên pha loãng xuống nồng độ 10ppm để dễ dàng phân tích Hút 1ml dung dịch Fe chuẩn 1000ppm cho vào bình định mức 100ml, định mức tới vạch sau lắc đều, ta dung dịch sắt chuẩn 10ppm để xây dựng đường chuẩn Hút 0; 1; 2; 4ml dung dịch Fe chuẩn 10ppm vào bình định mức chuẩn bị sẵn thêm vào bình 1ml hydroxylamine 10% lắc đều, thêm vào 5ml đệm pH 5, 1ml 1,10-phenontroline 0.1% vào bình, lắc nhẹ để yên phút, sau dùng nước cất định mức tới vạch ta nồng độ tương ứng bình 0; 0.2; 0.4; 0.6 0.8ppm Mang bình định mức đo độ hấp thu λ = 510nm KẾT QUẢ Kết đo quang: III Bình định mức mẫu Fe(II) 10ppm NHÓM Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại Mẫu Hydroxylamin 10% Đệm pH GVHD: Vũ Hoàng Yến 0 0 10 1 1 5 5 5 1 1 1 (lắc phút) 1,10phenantroline 0,1% Nước cất C(ppm) Lắc nhẹ, sau phút dùng nước cất định mức tới vạch 10 20 30 40 Cx 0,325 0.002 Sau 15 phút đem đo λ = 510nm Abs 0,077 0,164 0,245 Vẽ phương trình hồi qui tuyến tính: Từ kết Abs đo vẽ phương trình hồi qui tuyến tính thể mối tương quan nồng độ độ hấp thu NHÓM 10 Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại GVHD: Vũ Hoàng Yến Nguyên lý I Aicd sorbic, acid benzoic tách chiết khỏi thực phẩm phương pháp thủy phân với NaOH trước sau tách chiết methanol Hàm lượng acid sorbic, acid benzoic xác định kỹ thuật sắc ký lỏng cao cấp (HPLC) Giới hạn phát phương pháp với benzoic acid 2mg/kg (2ppm) acid sorbic 6mg/kg (6ppm) bước sóng λ = 230nm II - Dụng cụ - Hóa chất – Thiết bị Dụng cụ Cốc có mỏ dung tích 50ml, 100ml, 250ml Bình định mức 10ml, 25ml, 50ml, 100ml Pipet 1ml, 10ml Giấy lọc Thiết bị Cân phân tích Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC): gồm bơm cao áp, bô bơm mẫu, dectector UV - Cột sắc ký lỏng: C18(4,6mm x 150mm x 5µm) Hóa chất Chất chuẩn Acid benzoic tinh khiết 99% trở lên Acid sorbic tinh khiết 99% trở lên Pha dung dịch chuẩn ban đầu Chuẩn bị dung dịch ban đầu 1mg/ml: Cân xác 0,1g loại chuẩn cho vào cốc có mỏ 50ml, hóa tan – 3ml methanol tan hồn tồn Chuyển vào bình định mức 100ml, tráng rửa cốc thêm nước cất đến vạch định mức (chỉ pha dùng) Dung dịch chuẩn ngày Cho vào bình định mức 100ml dung dịch chuẩn ban đầu sau: NHÓM 18 Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại Bình Bình Bình Định mức 50 50 50 (ml) V(ml) chuẩn 100 0.5 ppm Nồng độ CBenzoic(ppm 10 ) Peak area 2629.79053 1.31433e4 2.59936e4 (mAu) Thuốc thử GVHD: Vũ Hoàng Yến Bình Bình Mẫu 50 50 50 10 15 20 50 5.498811e 1.02760e5 1.12898e4 Methanol dùng cho sắc ký lỏng (độ tinh khiết >99%) Acid phosphoric: có chứa hàm lượng H3PO4 98% Natri hydroxyd (NaOH): dùng loại tinh khiết phân tích có chứa hàm lượng kiềm tồn phần khơng nhỏ 97% tính theo NaOH khơng có 2% Na2CO3 Dung dịch NaOH 1N Hòa tan 45g NaOH 100ml nước lắc cho tan hồn tồn Đậy kín bình chứa nút cao su, để yên ngày gạn lấy dung dịch phía pha lỗng với nước cất đun sơi để nguội đến vừa đủ lít Dung dịch NaOH 0,1N Hòa tan 4,5g NaOH 100ml nước lắc cho tan hồn tồn Đậy kín bình chứa nút cao su, để yên ngày gạn lấy dung dịch phía pha lỗng với nước cất đun sôi để nguội đến vừa đủ lít Acid sunfuric (H2SO4): tinh khiết phân tích có chứa hàm lượng H 2SO4 khoảng 96% Dung dịch H2SO4 10%: Cho từ từ, cẩn thận khuấy nhẹ 6ml acid sunfuric vào 50ml nước Làm nguội định mức nước vừa đủ 100ml NHÓM 19 Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại GVHD: Vũ Hoàng Yến Kali fericyanid K3Fe(CN)6 Sử dụng loại tinh khiết phân tích có chứa hàm lượng K3Fe(CN)6 từ 98% trở lên Pha dung dịch K3Fe(CN)6 Hòa tan 10,6g K3Fe(CN)6 50ml nước lắc cho tan hoàn toàn, định mức nước vừa đủ 100ml Pha dung dịch kẽm acetat (CH3COO)2Zn 1M Hòa tan 21,9g (CH3COO)2Zn 50ml nước 3,2ml acid acetic lắc cho tan hoàn toàn Định mức vừa đủ 100ml Dikali hydrophosphat K2HPO4: tinh khiết phân tích có chứa hàm lượng K2HPO4 từ 98% trở lên Dung dịch Carreez I 10 -15%: cân 15g K 4(Fe(CN)6).3H2O, hòa tan nước cất định mức 100ml Dung dịch Carreez II 30%: Cân 30g kẽm sunphat (ZnSO 4.7H2O), hòa tan nước cất định mức 100ml Pha dung dịch K2HPO4 dùng làm pha động: Hòa tan 2,5g K2HPO4 500ml nước cất đun sơi để nguội đến hóa tan hồn toàn, thêm nước cất đến khoảng 980ml, điều chỉnh pH = 6,7 H 3PO4 , vừa đủ lít nước cất, lọc qua giấy lọc 0,45µl III Các bước tiến hành Chuẩn bị mẫu Đối với mẫu thực phẩm dạng lỏng: Hút xác 20-50 ml mẫu cho vào cốc có mỏ 250ml, thêm 2,5ml NaOH 1N thủy phân cách thủy nước 70 0C 30 phút, làm nguội nhiệt độ phòng chuyển vào bình định mức 100ml, trung hịa mẫu H 2SO4 10% với thị phenolphthalein NHÓM 20 Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại GVHD: Vũ Hoàng Yến đến mẫu màu hoàn toàn (pH mẫu lúc khoảng 8) Thêm ml dung dịch kali fericyanid, lắc, thêm 2ml dung dịch kẽm acetat để loại tạp Dùng methanol tráng rửa cốc cho vào bình định mức, lắc kỹ làm vừa đủ 100ml methanol Lọc mẫu qua giấy lọc thường, sau lọc qua giấy lọc 0,45µm để loại tạp trước bơm vào máy Đối với mẫu thực phẩm dạng rắn: Cân xác 5-10g mẫu đồng xay nhỏ cho vào cốc có mỏ 250ml, thêm 25ml NaOH 0,1N, thủy phân cách thủy nước 70 0C vòng 30 phút, làm nguội nhiệt độ phịng chuyển vào bình định mức 100ml, trung hòa mẫu H 2SO4 10% với thị phenolphthalein đến mẫu màu hoàn toàn (pH mẫu lúc khoảng 8) Thêm ml dung dịch kali fericyanid, lắc, thêm 2ml dung dịch kẽm acetat để loại tạp Dùng methanol tráng rửa cốc cho vào bình định mức, lắc kỹ làm vừa đủ 100ml methanol Lọc mẫu qua giấy lọc thường, sau lọc qua giấy lọc 0,45µm để loại tạp trước bơm vào máy Xử lí mẫu kham khảo - Với mẫu dạng lỏng: hút xác 5-20 ml mẫu vào ống li tâm 50ml Thêm 2ml dung dịch Carreez I, 2ml đung dịch Carreez II 2ml dung dịch (CH 3COO)2Zn 1M - Sau tất đem lắc Vortex định mức thành 50ml tiếp tục lắc Vortex, lọc mẫu qua giấy lọc thường lọc qua màng lọc 0,45µm trước bơm vào HPLC Điều kiện máy - Pha động: dung dịch dikali hydrophosphat: methanol (90:10) Thời gian chạy: 10 phút Thể tích bơm mẫu: 20µl Chạy đẳng dịng Tốc độ dịng: 1ml/phút Nhiệt độ cột: nhiệt độ phịng NHĨM 21 Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại - GVHD: Vũ Hồng Yến Detector: UV bước sóng λ = 230nm (với detector đặt bước sóng đặt detector λ = 193nm cho xác định acid benzoic, λ = 254nm cho xác định acid sorbic) Tiến hành đo mẫu Mẫu sau qua màng lọc 0.45 dãy chuẩn Bơm 20 vào máy sắc kí (HPLC) Detecter UV (λ = 230nm) Ghi độ hấp thụ Chú ý Nếu mẫu phân tích cho chiều cao pic thời gian lưu khoảng phút thấp nên phân tích lại đo λ = 193nm để xác định riêng acid benzoic Nếu mẫu phân tích cho chiều cao pic thời gian lưu khoảng phút thấp nên phân tích lại đo λ = 254nm để xác định riêng acid benzoic Trong trường hợp giới hạn xác định tăng đến 10 lần Sơ đồ tóm tắt quy trình xét nghiệm NHĨM 22 Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại GVHD: Vũ Hoàng Yến Cân mẫu + 25ml NaOH 0,1N (hoặc 2,5ml NaOH 1N) Thủy phân 300C/30 phút Nguội Trung hòa đến Ph=8 H2SO4 10% +2ml dd K3Fe(CN)6 0,3M Lắc kỹ Lắc kỹ Lọc, tráng rửa MeOH Định mức 50 ml MeOH Lọc (giấy lọc kích thước 0,45µm) Bơm 25 vào HPLC Kết IV Xử lí kết Vẽ phương trình hồi qui tuyến tính: Từ kết Abs diện tích peak chạy mẫu được, vẽ phương trình hồi qui tuyến tính thể mối tương quan nồng độ diện tích peak NHĨM 23 Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại GVHD: Vũ Hồng Yến Từ biểu đồ ta có phương trình hồi quy tuyến tính: y = 2026.4x +5049.4(1) R2 =0.9806 R2 mẫu cao => kết đáng tin cậy Mối quan hệ nơng độ diện tích peak phụ thuộc vào (tỉ lệ thuận với nhau) Thế mẫu = 1.12898= y vào (1) x = 3.0795(ppm) Do mẫu dạng lỏng nên ta có hàm lượng acid benzoic (mg/lit) C(mg/l)=Cx = Cx =3.0795 Trong Cx số acid benzoic ml dung dịch chiết R hệ số thu hồi sau dịch chiết Cx n độ pha lỗng X, tính miligam kilogam (mg/kg), tính dựa vào đường hồi quy tuyến tính theo cơng thức sau: X = Ci × V ×K m =3.0795=1.833 (mg/Kg) Trong đó, X : hàm lượng chất “i” mẫu phân tích (mg/kg) acid benzoic C : Nồng độ chất “i” tính từ đường chuẩn V :Thể tích dung dịch trước bơm vào HPLC.(ml) m: trọng lượng mẫu phân tích(g) K: hệ số pha lỗng Tuy nhiên q trình phân tích có xảy sai xót dẫn đến việc sai lệch kết như: NHĨM 24 Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại GVHD: Vũ Hoàng Yến Mẫu phân tích sau xử lí để qua thời gian lâu, dẫn đến kết chạy máy HPLC thiếu xác Thao tác sinh viên thực chưa chuẩn xác Sai số thiết bị dụng cụ, thiết bị Ảnh hưởng mơi trường, hóa chất sử dụng BÀI 5: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CAFEIN TRONG THỰC PHẨM 5.1 Phạm vi ứng dụng Tiêu chuẩn qui định phương pháp xác định hàm lượng cafein cà phê bột, cà phê hòa tan, cà phê nguyên liệu phương pháp sắc ký lỏng kết nối với đầu dò UV 5.2 Tài liệu tham khảo Phương pháp xây dựng dựa theo TCVN 6603:2000 Giới thiệu sơ lược: - Công thức phân tử: C8H10N4O2 - Khối lượng phân tử: 194,19 - Công thức cấu tạo: 5.3 Nguyên tắc Cafein mẫu sau chiết nước nóng pha lỗng định lượng hệ thống HPLC với đầu dị UV bước sóng 272nm 5.4 Thiết bị - dụng cụ - hóa chất NHĨM 25 Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại GVHD: Vũ Hồng Yến Hóa chất STT Tên hóa chất Qui cách Sồ lượng Ghi ACN TK, HPLC 500 ml Cả lớp Nước cất lần 500ml nhóm H3PO4 TK, HPLC 500ml Cả lớp STT Tên dụng cụ Qui cách Số lượng Ghi Màng lọc 0,45 µm nhóm xylanh nhóm Pipet 1ml Đức nhóm Pipet bầu 10ml Đức nhóm Pipet 5ml Đức nhóm Bóp cao su nhóm Giấy lọc 1nhóm Vial 2ml 1cái nhóm Vial 2ml Cả lớp 10 Kim tiêm 10 Cả lớp 11 Bình định mức 50ml Đức Cả lớp 12 Bình định mức 100ml Đức nhóm 13 Phễu nhóm Ghi Cột + cột bảo vệ C18 Dụng cụ Thiết bị STT Tên thiết bị Qui cách Sồ lượng Hệ thống HPLC Đầu dò UV Máy li tâm Máy phát siêu âm Máy vortex 5.5 Chuẩn bị hóa chất dung dịch chuẩn Chuẩn bị pha động: NHÓM 26 Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại GVHD: Vũ Hoàng Yến - Acetonitrile (ACN): lọc qua màng lọc 0,45 µm, đánh siêu âm đến hết bọt khí trước sử - dụng H3PO4 0,05%: pha nước cất lần khử ion, lọc qua màng 0,45µm, đánh siêu âm đến hết bọt khí trước sử dụng Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Dung dịch chuẩn gốc 100mg/ml Cân 0,01g chất chuẩn hòa tan định mức đến vạch 100ml nước cất lần khử ion Dãy chuẩn: Bình V(ml)dd chuẩn Ccafein 2,5 10 25 Định mức nước cất đến vạch 50ml 10 20 50 5.6 Chuẩn bị mẫu : Cân 0,24g mẫu thử xay nhuyễn cho vào ống ly tâm 15ml, thêm khoảng 12ml nước cất lần, đậy nắp kín Siêu âm khoảng 15 phút, li tâm với tốc độ 5000v/ phút khoảng phút Chuyển phần dung dịch phía bên vào bình định mức 50ml, lặp lại bước khoảng lần Thu toàn dịch chiết thu vào bình định mức 100ml, định mức tới vạch nước cất lần Pha loãng dung dịch mẫu (nếu cần), lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 µm, dịch qua lọc thu vào vial 2ml tiến hành phân tích mẫu 5.7 Tiến hành phân tích máy HPLC Cột sắc ký: cột pha đảo C18 (250mm4.6mm, 5um) - Nhiệt độ: nhiệt độ phòng - Pha động: ACN: H3PO4 0.05% :10/90 (v/v) - Tốc độ dòng: 0.8ml/ phút - Bước sóng cài đặt cho đầu dị UV 272 nm Mẫu sau lọc qua màng 0.45 µm dãy chuẩn Máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Detector UV (λ=272nm) NHÓM 27 Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại GVHD: Vũ Hồng Yến Ghi lại độ hấp thu 5.8 Tính kết quả: Kết đo quang HPLC: Bình Ccafein 2.5 10 25 167,429 334,523 Abs 872,492 Từ bảng số liệu ta có đồ thị sau: Biểu đồ mối quan hệ diện tích pic hàm lượng cafein NHĨM 28 Mẫu 4140,918 Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại GVHD: Vũ Hoàng Yến Kết đo dãy chuẩn HPLC: Đồ thị thể kết đo dãy chuẩn nồng độ 2,5 ppm Đồ thị thể kết đo dãy chuẩn nồng độ 5ppm NHĨM 29 Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại GVHD: Vũ Hồng Yến Đồ thị thể kết đo dãy chuẩn nồng độ 25ppm Tính kết quả: Từ kết đo dãy chuẩn ta có phương trình hồi quy tuyến tính: y = 29,634x + 137,11 (1) Kết đo diện tích pic mẫu :4140,918 vào phương trình (1) ta có: 4140,918 = 29,634x + 137,11 x = 135,108 = C0 (2) Hàm lượng cafein tính theo cơng thức sau: C (mg/100g) = (*) Trong đó: C: Hàm lượng cafein mẫu, tính theo mg/kg mg/100g C0: Hàm lượng cafein dịch chiết, tính thơng qua đường chuẩn mg/l Vdm: Thể tích định mức mẫu, ml m: Lượng cân mẫu thử,g f: Hệ số pha loãng NHĨM 30 Báo cáo Thực Hành phân Tích Hóa Lý Hiện Đại GVHD: Vũ Hoàng Yến thay (2) vào (*) ta có: C = ×50×1= 28147,5 (mg/kg) Vậy hàm lượng cafein mẫu cà phê 28147,5 mg/kg NHÓM 31