Đang tải... (xem toàn văn)
Phân tích tính đa dạng DNA tập đoàn cây gỗ Sưa
Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: “Phân tích tính đa dạng DNA tập đồn gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis) thị RAPD ISSR” Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS Vũ Đình Hịa TS Đinh Thị Phòng Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Vân Anh Lớp: CNSH K51 Báo cáo khóa luận tốt nghiệp - 2010 Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nơng nghiệp Hà Nội NỘI DUNG CHÍNH PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Báo cáo khóa luận tốt nghiệp - 2010 Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ Cây gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis) thuộc chi Dalbergia, họ đậu (Fabaceae) Ghi nhận Danh lục đỏ Việt Nam Chính phủ Việt Nam quy định nhóm IA Nghị định 32/2006/NĐ-CP lồi đặc biệt quý hiếm, có nguy đe doạ tuyệt chủng Cây Sưa bị khai thác mức việc bảo tồn việc làm cấp thiết Báo cáo khóa luận tốt nghiệp - 2010 Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ Trước đây, việc đánh giá đa dạng di truyền loài gỗ thường sử dụng thị hình thái Tuy nhiên, độ xác khơng cao nên có nhiều hạn chế Ngày nay, Công nghệ Sinh học khắc phục nhược điểm thị hình thái đưa hoàng loạt thị phân tử: (RFLP, AFLP, RAPD, ISSR …) để đánh giá đa dạng di truyền Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) tương đối đơn giản, dễ thực nên sử dụng phổ biến rộng rãi Báo cáo khóa luận tốt nghiệp - 2010 Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ “Phân tích đa dạng DNA tập đồn gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis) thị RAPD thị ISSR” Mục đích: Xem xét, đánh giá mối quan hệ di truyền giống tập đoàn gỗ Sưa Làm sở cho công tác bảo tồn tái tạo nguồn gen quý Báo cáo khóa luận tốt nghiệp - 2010 Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nơng nghiệp Hà Nội Hình 1.1: Hình ảnh gỗ Sưa Báo cáo luận khóa luận nghiệp - 2010 Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU A Vật liệu nghiên cứu Vật liệu thực vật 35 mẫu gỗ Sưa phòng Sinh học thuộc Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam cung cấp bảng 2.1 Các thị sử dụng nghiên cứu 17 thị (7 thị RAPD 10 thị ISSR) Báo cáo luận khóa luận nghiệp - 2010 Bảng 2.1 Bảng kí hiệu địa điểm thu thập mẫu Stt Kí hiệu Địa điểm thu thập Stt Kí hiệu Địa điểm thu thập Dt1 Công viên Thủ Lệ - Hà Nội 19 Dt19 Nguyễn Văn Huyên-Cầu Giấy-Hà Nội Dt2 Đồng Xa-Từ Liêm-Hà Nội 20 Dt20 Nguyễn Văn Huyên-Cầu Giấy-Hà Nội Dt3 Đồng Xa-Từ Liêm-Hà Nội 21 Dt21 Nguyễn Văn Huyên-Cầu Giấy-Hà Nội Dt4 Đồng Xa-Từ Liêm-Hà Nội 22 Dt22 Viện đo lường-Hoàng Quốc Việt-Hà Nội Dt5 Đồng Xa-Từ Liêm-Hà Nội 23 Dt23 Mỹ Đình-Cầu Giấy-Hà Nội Dt6 Đồng Xa-Từ Liêm-Hà Nội 24 Dt24 Công viên Bách Thảo-Hà Nội Dt7 Nguyễn Văn Huyên-Cầu Giấy-Hà Nội 25 Dt25 Công viên Bách Thảo-Hà Nội Dt8 Nguyễn Văn Huyên-Cầu Giấy-Hà Nội 26 Dt26 Vườn quốc gia Phong Nha Kẻ Bàng Dt9 Nguyễn Văn Huyên-Cầu Giấy-Hà Nội 27 Dt27 Vườn quốc gia Phong Nha Kẻ Bàng 10 Dt10 Nguyễn Văn Huyên-Cầu Giấy-Hà Nội 28 Dt28 Vườn quốc gia Phong Nha Kẻ Bàng 11 Dt11 Nguyễn Văn Huyên-Cầu Giấy-Hà Nội 29 Dt29 Vườn quốc gia Phong Nha Kẻ Bàng 12 Dt12 Nguyễn Văn Huyên-Cầu Giấy-Hà Nội 30 Dt30 Vườn quốc gia Phong Nha Kẻ Bàng 13 Dt13 Nguyễn Văn Huyên-Cầu Giấy-Hà Nội 31 Dt31 Vườn quốc gia Phong Nha Kẻ Bàng 14 Dt14 Nguyễn Văn Huyên-Cầu Giấy-Hà Nội 32 Dt32 Vườn quốc gia Phong Nha Kẻ Bàng 15 Dt15 Nguyễn Văn Huyên-Cầu Giấy-Hà Nội 33 Dt33 Vườn quốc gia Phong Nha Kẻ Bàng 16 Dt16 Nguyễn Văn Huyên-Cầu Giấy-Hà Nội 34 Dt34 Vườn quốc gia Phong Nha Kẻ Bàng 17 Dt17 Nguyễn Văn Huyên-Cầu Giấy-Hà Nội 35 Dt35 Vườn quốc gia Phong Nha Kẻ Bàng 18 Dt18 Nguyễn Văn Huyên-Cầu Giấy-Hà Nội Bảng 2.2 Danh sách tên trình tự nuleotide 17 thị nghiên cứu Chỉ thị Tên thị Trình tự mồi GGGGTGACGA OPC19 CTCTCCGCCA OPN16 OPN05 AAGCGACCTG ACTGAACGCC OPP08 ACATCGCCCA OPP19 GGGAAGGACA IS2 GACAGACAGACAGACA IS5 CCGCCGCCGCCGCCGCCG IS7 GGCGGCGGCGGCGGCGGC IS15 P51 CACACACACACACACAA GAGAGAGAGAGAGAGAA P55 ACACACACACACACACT Rout cộng sự, 2003 CAACAACAACAACAA IS3 ISSR Tài liệu tham khảo GTTGCCAGCC OPG13 RAPD OPD13 Mohd cộng sự, 2009 Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU B Phương pháp nghiên cứu Tách chiết DNA tổng số từ Sưa DNA tách chiết dựa theo quy trình CTAB Doyle Doyle, 1987 DNA tổng số xác định hàm lượng độ Điện di kiểm tra DNA gel agarose 0,9% Xác định hàm lượng độ DNA quang phổ kế Báo cáo khóa luận tốt nghiệp - 2010 Khoa Cơng nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết tách chiết DNA tổng số từ 35 mẫu gỗ Sưa Kết phân tích tính đa dạng DNA 35 mẫu gỗ Sưa với thị RAPD 10 thị ISSR Mối quan hệ di truyền 35 mẫu gỗ Sưa với thị RAPD 10 thị ISSR Báo cáo khóa luận tốt nghiệp - 2010 Khoa Cơng nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết tách chiết DNA tổng số từ 35 mẫu gỗ Sưa 10 11 12 13 14 Hình 3.1: Hình ảnh DNA tổng số đại diện 14 mẫu gỗ Sưa chạy điện gel agarose 0,9% Báo cáo khóa luận tốt nghiệp - 2010 Bảng 3.1: Bảng giá trị đo OD 35 mẫu nghiên cứu ← Tên mẫu OD260 OD280 Độ DNA (OD260nm/280nm) Hàm lượng DNA (ng/µl) Tên mẫu OD260 OD280 Độ DNA (OD260nm/280nm) Hàm lượng DNA (ng/µl) Dt1 0,091 0,049 1,857 910 Dt19 0,083 0,043 1,930 830 Dt2 0,085 0,045 1,889 850 Dt20 0,077 0,041 1,878 770 Dt3 0,065 0,036 1,805 650 Dt21 0,080 0,040 2,000 880 Dt4 0,098 0,051 1,922 980 Dt22 0,059 0,030 1,967 590 Dt5 0,071 0,036 1,972 710 Dt23 0,072 0,036 2,000 720 Dt 0,088 0,047 1,872 880 Dt24 0,086 0,044 1,955 860 Dt 0,076 0,041 1,854 760 Dt25 0,091 0,048 1,896 910 Dt 0,078 0,042 1,857 780 Dt26 0,079 0,042 1,881 790 Dt 0,095 0,048 1,979 950 Dt27 0,084 0,046 1,826 840 Dt10 0,075 0,038 1,974 750 Dt28 0,080 0,044 1,818 800 Dt11 0,082 0,043 1,907 820 Dt29 0,076 0,039 1,949 760 Dt12 0,069 0,037 1,865 690 Dt30 0,068 0,034 2,000 680 Dt13 0,090 0,047 1,915 900 Dt31 0,066 0,035 1,886 660 Dt14 0,087 0,042 1,952 870 Dt32 0,073 0,037 1,973 730 Dt15 0,064 0,034 1,882 640 Dt33 0,091 0,049 1,857 910 Dt16 0,101 0,053 1,907 1010 Dt34 0,085 0,045 1,889 850 Dt17 0,070 0,038 1,842 700 Dt35 0,075 0,038 1,974 750 Dt18 0,099 0,051 1,941 990 Bảng 3.2: Giá trị PIC % phân đoạn đa hình 35 mẫu gỗ Sưa phân tích với 17 thị STT Tên thị Giá trị PIC Phân đoạn đa hình Phân đoạn đồng hình Tổng số phân đoạn % Phân đoạn đa hình OPD13 0,042 75 OPC19 0,056 66,67 OPG13 0,056 1 50 OPN16 0,357 75 OPN05 0,150 16,67 OPP08 0,056 60 OPP19 0,504 71,42 IS2 0,019 33,33 10 IS3 IS5 0,413 0,240 5 100 25 11 IS7 0 6 12 IS15 0,342 75 13 P51 0,310 71,43 14 P55 0,297 4 50 15 P56 0,496 75 16 P61 0,378 75 17 P67 0,471 66,67 45 34 79 57 Tổng Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chỉ thị OPP08 M 1011 12 1314 15 16 17 1819 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3031 32 33 34 35 1,3kb 1kb 0,75kb 0,5kb 0.35kb 0,25kb Hình 3.2: Sản phẩm PCR-RAPD 35 mẫu gỗ Sưa với thị OPP 08 (giếng 135: thứ tự xếp mẫu gỗ Sưa bảng 2.1; M: marker phân tử 10kb) Báo cáo khóa luận tốt nghiệp - 2010 Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chỉ thị OPP19 M 1011 12 1314 15 16 17 1819 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3031 32 33 34 35 1kb 0,75kb 0,5kb 0.8kb 0,25kb Hình 3.2: Sản phẩm PCR-RAPD 35 mẫu gỗ Sưa với thị OPP 19 (giếng 135: thứ tự xếp mẫu gỗ Sưa bảng 2.1; M: marker phân tử 10kb) Báo cáo khóa luận tốt nghiệp - 2010 Khoa Cơng nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chỉ thị IS15 M 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 0.75kb 0.75kb 0.5kb 0.45kb Hình 3.3: Sản phẩm PCR-ISSR 35 mẫu gỗ Sưa với IS15 (giếng 1-35: thứ tự xếp mẫu gỗ Sưa bảng 2.1; M: marker phân tử 10kb) Báo cáo khóa luận tốt nghiệp - 2010 Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tổng hợp kết phân tích DNA 35 mẫu gỗ Sưa bảng 3.3 Tổng số phân đoạn DNA nhân 35 mẫu với 17 thị 2246 Trong đó: Chỉ thị P55 nhân nhiều phân đoạn (215 phân đoạn) Chỉ thị OPG13 nhân phân đoạn (68 phân đoạn) Số lượng phân đoạn DNA nhân phân tích với 17 thị dao động từ 60 đến 70 Trong đó, mẫu Dt22 có số phân đoạn nhân (60 phân đoạn DNA) nhiều mẫu Dt05 (70 phân đoạn DNA) ← Báo cáo khóa luận tốt nghiệp - 2010 Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Bảng 3.4: Giá trị tương quan kiểu hình (r) 35 mẫu gỗ Sưa UPGMA WPGMA COMPLETE SINGLE 0,79177 0,75075 0,72431 0,70281 Dice 0,79618 0,75543 0,63540 0,71825 Jaccard 0,77621 0,75990 0,63516 0,72442 Kiểu phân nhóm Hệ số di truyền SM Báo cáo khóa luận tốt nghiệp - 2010 Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết hệ số tương đồng di truyền 35 mẫu nghiên cứu bảng 3.5 + Hệ số tương đồng di truyền 35 mẫu nghiên cứu dao động từ 0,800 đến 0,978 + Mẫu thu thập địa bàn Hà Nội có kí hiệu Dt1 đến Dt25 có hệ số tương đồng dao động từ 0,884 đến 0,955 với hệ số tương đồng trung bình 0,935 + Mẫu thu thập Vườn Quốc gia Phong Nha Kẻ Bàng – Quảng Bình kí hiệu từ Dt26 đến Dt35 với hệ số tương đồng di tuyền dao động từ 0,800 đến 0,962 với hệ số tương đồng trung bình 0,893 + Các mẫu Hà Nội có mối quan hệ di truyền gần gũi so với mẫu Quảng Bình Báo cáo khóa luận tốt nghiệp - 2010 Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN a a II.2.2 II.2.2 II II II.1 II 0.848 b b II.2 II.2 II.2.1 II.2.1 II.1 0.978 Hình 3.4: Sơ đồ hình 35 mẫu nghiên cứu Báo cáo khóa luận tốt nghiệp - 2010 Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Hình 3.5 Biểu đồ tọa độ đa chiều 35 mẫu nghiên cứu Báo cáo khóa luận tốt nghiệp - 2010 Khoa Cơng nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ A Kết luận Chỉ thị RAPD thị ISSR có hiệu việc sử dụng phân tích tính đa hình DNA tập đồn gỗ Sưa Tính đa hình DNA mẫu nghiên cứu thấp với giá trị PIC dao động từ đến 0,496 Hệ số tương đồng mẫu nghiên cứu cao, dao động từ 0,8 đến 0,978 Các mẫu thu thập Hà Nội có mối quan hệ gần gũi với so với mẫu thu Quảng Bình Biểu đồ hình 35 nghiên cứu phân làm 02 nhánh rõ ràng có mức độ sai khác di truyền từ 2,2% đến 15,2% Những mẫu có địa điểm thu thập có xu hướng tập trung vào nhánh phụ Báo cáo khóa luận tốt nghiệp - 2010 Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ B Kiến nghị Tiếp tục phân tích tính đa dạng di truyền loài với số lượng thị nhiều hơn, thu thập mẫu nhiều địa điểm Các mẫu gỗ Sưa có hệ số tương đồng di truyền cao cần có biện pháp, kế hoạch bảo tồn hợp lý nguồn gen Báo cáo khóa luận tốt nghiệp - 2010 Em xin chân thành cảm ơn! ... PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ ? ?Phân tích đa dạng DNA tập đoàn gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis) thị RAPD thị ISSR” Mục đích: Xem xét, đánh giá mối quan hệ di truyền giống tập đoàn gỗ Sưa Làm sở cho công... LUẬN Kết tách chiết DNA tổng số từ 35 mẫu gỗ Sưa Kết phân tích tính đa dạng DNA 35 mẫu gỗ Sưa với thị RAPD 10 thị ISSR Mối quan hệ di truyền 35 mẫu gỗ Sưa với thị RAPD 10 thị ISSR Báo cáo khóa... Bảng 3.2: Giá trị PIC % phân đoạn đa hình 35 mẫu gỗ Sưa phân tích với 17 thị STT Tên thị Giá trị PIC Phân đoạn đa hình Phân đoạn đồng hình Tổng số phân đoạn % Phân đoạn đa hình OPD13 0,042 75