BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CNSH & KTMT  VI SINH VẬT CÔNG NGHIỆP Đề tài: KHÁNG SINH NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT PENICILLIN GVHD: Th.S ĐỖ THỊ HOÀNG TUYẾN NHÓM: 13 TP HCM, tháng năm 2016 BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CNSH & KTMT  VI SINH VẬT CÔNG NGHIỆP Đề tài: KHÁNG SINH NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT PENICILLIN DANH SÁCH THÀNH VIÊN STT HỌ VÀ TÊN MSSV Trần Hạ Nghi 2008140452 Phan Thị Kim Ngân 2008140422 Võ Minh Toàn 2008140320 Nguyễn Đức Sang 2008140247 GVHD: Th.S ĐỖ THỊ HOÀNG TUYẾN NHÓM: 13 TP HCM, tháng năm 2016 Kháng sinh – Nghiên cứu quy trình sản xuất Penicillin MỤC LỤC Nhóm 13 Page Kháng sinh – Nghiên cứu quy trình sản xuất Penicillin A LỜI MỞ ĐẦU Kháng sinh nhóm thuốc thiết yếu y học đại Nó giống vũ khí quan trọng để chống lại vi khuẩn gây bệnh Nhờ thuốc kháng sinh mà y học loại bỏ dịch bệnh nguy hiểm dịch hạch, tả, thương hàn,… Theo số liệu thống kê , kháng sinh chiếm khoảng 10 % tổng số thuốc sử dụng toàn giới (tính sở giá trị tiến thuốc đô la Mỹ) Ngày có nhiều loại kháng sinh người biết đến, chế phẩm kháng sinh phổ biến Penicillin Penicillin chất kháng sinh tìm sản xuất sớm dùng chữa số bệnh vi khuẩn vào năm đầu chiến tranh giới thứ hai Ngày chất kháng sinh sản xuất với lượng lớn dùng phổ biến y học Đề tài “Nghiên cứu quy trình sản xuất penicillin” thực nhằm nghiên cứu rõ phương pháp sản xuất penicillin thông qua trình nhân giống nấm Penicillium chrysogenum nguyên tắc để sử dụng kháng sinh an toàn hiệu Nhóm 13 Page Kháng sinh – Nghiên cứu quy trình sản xuất Penicillin B NỘI DUNG CHƯƠNG TỔNG QUAN VỀ KHÁNG SINH PENICILLIN I LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU Trước đầu kỷ 20, cách trị nhiễm trùng chủ yếu dựa phương pháp y học dân gian Nhiều văn hóa cổ, bao gồm Hy Lạp cổ đại Ai Cập cổ đại sử dụng nấm mốc chọn lọc đặc biệt nguyên liệu thực vật chiết xuất để trị nhiễm khuẩn[1] Louis Pasteur nhận xét, "nếu can thiệp vào đối lập vi khuẩn quan sát, có nhiều hi vọng lớn phương pháp điều trị"[2] Các quan sát gần thực phòng thí nghiệm kháng sinh vi sinh vật đưa đến phát kháng sinh tự nhiên tạo từ vi sinh vật Năm 1895, Vincenzo Tiberio, nhà vật lý học đại học Naples phát nấm mốc (Penicillium) nước có hoạt động kháng khuẩn tốt Hình Nấm mốc (Penicillium) Penicillium notatum phân Alexander Fleming phân lập năm 1926 [3] Năm 1928, Alexander Fleming (nhà khoa học Scotland) lần thấy môi Nhóm 13 Page Kháng sinh – Nghiên cứu quy trình sản xuất Penicillin trường nuôi cấy tụ cầu vàng có lẫn nấm penicillium khuẩn lạc gần nấm không phát triển Năm 1939, Flovey Chain chiết từ nấm chất penicillin dùng điều trị Vì phận sinh sản loài mốc có hình dạng giống bút lông nên đặt tên penicillium (Tiếng la-tinh penicillium nghĩa bút lông) Năm 1938, Fleming nhận thư hai nhà khoa học từ trường Đại học Oxford Ernst Boris Chain Howard Walter Florey, với lời đề nghị hợp tác với ông để tiếp tục thực công trình nghiên cứu penicillin họ thử nghiệm thành công penicillin chuột vào năm 1940 Năm 1941, nhóm chọn loại nấm penicillin ưu việt chủng Penicillin Chrysogenium, chế loại penicillin có hoạt ính cao triệu lần penicillin Fleming tìm thấy lần đầu năm 1928 Năm 1945, Fleming giải thưởng Nobel y học với Flovey Chain Ngày người biết khoảng 8000 chất kháng sinh, 100 loại dùng Y khoa Thú y II GIỚI THIỆU CHUNG VỀ KHÁNG SINH PENICILIIN Cấu trúc tính chất Penicillin loại kháng sinh thuộc nhóm β –lactam  Cấu trúc: Penicillin dẫn xuất acid 6-aminopenicilamic (viết tắt A6AP) (gồm vòng thiazolidin vòng β- lactam) Hình Cấu trúc chung penicillin (A- vòng thiazolidin, B- vòng β- lactam) Nhóm 13 Page Kháng sinh – Nghiên cứu quy trình sản xuất Penicillin  Tính chất chung: + Do có nhóm –COOH nên có tính acid + Không bền vững, dễ bị phân huỷ gặp ẩm môi trường kiềm, vi khuẩn tiết men penicilinase + Penicillin dùng y học: sát trùng cách giết vi khuẩn hạn chế sinh trưởng chúng  Dựa vào phổ kháng khuẩn, Pinicillin phân thành nhóm sau [4]: Bảng Phân nhóm kháng sinh Penicillin theo phổ kháng khuẩn Nhóm 13 Page Kháng sinh – Nghiên cứu quy trình sản xuất Penicillin Vi sinh vật sản xuất Penicillin Những vi sinh vật sinh penicillin thuộc giống nấm mốc penicillium Aspergillus Nhưng chủng thuộc nhóm Penicillium notatum, Penicillium chrysogenum có hoạt lực cao dùng công nghiệp kháng sinh Những chủng nuôi cấy phương pháp bề mặt sở chất tự nhiên tạo thành 10-15 đv/ml kháng sinh (Đơn vị kháng sinh lực tích tụ kháng sinh chủng hay nồng độ chất kháng sinh thường biểu thị đơn vị : mg/ml, µg/ml, hay đơn vị kháng sinh UI/ml, hay UI/g, International Unit)[5] Penicillium chrysogenum thường tạo thành hai kiểu khuẩn lạc:  Kiểu I: khuẩn lạc tròn trặn, nếp nhăn rõ nét Khuẩn ty khí sinh mọc tốt có màu xanh; theo rìa khuẩn lạc có đường viền rộng 2-5 mm khuẩn ty bạc trắng bào tử; khuẩn ty chất màu nâu; chất màu không hoà vào môi trường Hình Khuẩn lạc Penicillium chrysogenum  Kiểu II: khuẩn lạc có khuẩn ty màu trắng, phát triển yếu; khuẩn ty chất có màu nâu Khuẩn lạc kiểu I cho hoạt lực cao, kiểu II thường xuyên cho hoạt tính kháng sinh thấp Vì cần phải tách khuẩn lạc kiểu I môi trường Nhóm 13 Page Kháng sinh – Nghiên cứu quy trình sản xuất Penicillin thường xuyên kiểm tra để chọn khuẩn lạc có hoạt lực cao, giữ đặc tính giống Nấm penicillium thường dễ biến đổi hình thái giảm khả kháng sinh Khi xảy biến đổi sinh hàng loạt chủng từ giống nhiệm vụ nhà vi sinh vật lúc phải chọn lại khuẩn lạc khoẻ có nhiều ưu điểm, cần phải tiến hành biện pháp bảo quản thích hợp Giống công nghiệp P.chrysogenum bảo quản lâu dài dạng đông khô, bảo quản siêu lạnh -70oC bảo quản nitơ lỏng Giống từ môi trường bảo quản cấy chuyền môi trường thạch hộp để hoạt hoá nuôi thu bào tử Dịch huyền phù bào tử thu từ hộp petri cấy chuyển tiếp sang môi trường bình tam giác, sang thiết bị phân giống nhỏ, qua thiết bị nhân giống trung gian cuối thiết bị nhân giống sản xuất Yêu cầu quan trọng của công đoạn nhân giống phải đảm bảo cung cấp đủ lượng giống cần thiết, với hoạt lực cao, chất lượng đảm bảo thời điểm cho công đoạn nhân giống cuối cung cấp đủ lượng giống đạt yêu cầu kỹ thuật cho lên men sản xuất Trong thực tiễn, để đảm bảo cho trình lên men thuận lợi người ta thường tính toán lượng giống cấp cho mật độ giống dịch lên men ban đầu khoảng - 5.109 bào tử / m3 Quá trình sinh tổng hợp Penicillin Nhìn chung, trình sinh tổng hợp Penicillin trải qua bước: - Bước 1: Từ tiền chất ban đầu L-α-aminoadipic acid, L-cysteine, L-valine thành tripeptide Trước ngưng tụ thành tripeptide, amino acid L-valine trải qua trình epimerization trở thành D-valine Sau trình ngưng tụ , đặt tên tripeptide δ-(L-α-aminoadipyl)-L-cysteineD-valine (viết tắt ACV) Trong trình phản ứng cần enzyme xúc tác ACVs enzyme While this reaction occurs, we must add in a required catalytic enzyme ACVS, which is also known as δ-(L-α-aminoadipyl)-Lcysteine-D-valine syntheta This catalytic enzyme ACVs is required for the Nhóm 13 Page Kháng sinh – Nghiên cứu quy trình sản xuất Penicillin activation of the three amino acids before condensation and the epimerization of transforming L-valine to D-valine.ACVs enzyme cần thiết cho việc kích hoạt ba axit amin trước ngưng tụ epimerization biến đổi L-valine thành valine-D - Bước 2: Các tripeptide ACV trải qua trình oxy hóa, sau khép mạch tạo vòng thiazolidin vòng β- lactam, tạo thành isopenicillin N - trung gian yếu không hiển thị nhiều hoạt động kháng sinh - Bước 3: Trao đổi nhóm bên chuỗi để isopenicillin N (trao đổi nhóm αaminoadipyl với phenylacetic) tạo thành penicillin G (hay penicillin V) Hình Cơ chế sinh tổng hợp penicillin từ L-α - aminoadipic, L-cystein L-valin Nhóm 13 Page 10 Kháng sinh – Nghiên cứu quy trình sản xuất Penicillin CHƯƠNG 2: QUY TRÌNH SẢN XUẤT PENICILLIN I Đặc điểm chung Công nghệ lên men sản xuất penicillin mang nét đặc thù riêng sở sản xuất thông tin hạn chế cung cấp công khai, sáng chế thường giới hạn công đoạn định; khó đưa công nghệ tổng quát chung Theo công nghệ lên men hãng Gist-Brocades (Hà Lan), toàn dây chuyển sản xuất thuốc kháng sinh penicillin phân chia làm bốn công đoạn sau:  Lên men sản xuất penicillin tự nhiên (thường thu penicillin V penicillin G)  Xử lý dịch lên men tinh chế thu bán thành phẩm penicillin tự nhiên  Sản xuất penicillin bán tổng hợp (từ nguyên liệu penicillin tự nhiên)  Pha chế loại thuốc kháng sinh penicillin [6]  Sơ Sơ đồ đồ khối Hình dây chuyền sản xuất Penicillin (Theo Gist-Brocades – Hà Lan) Nhóm 13 Page 11 Kháng sinh – Nghiên cứu quy trình sản xuất Penicillin II Chuẩn bị môi trường lên men Thành phần môi trường nhân giống cần tính toán để đảm bảo cung cấp đủ nguồn thức ăn C, N, chất khoáng thành phần khác, đảm bảo cho hình thành phát triển thuận lợi pellet  Nguyên liệu lên men[7]: - Cân đong, pha chế riêng rẽ thành phần môi trường lên men thùng chứa phù hợp - Thanh trùng gián đoạn 1210C ( hay trùng liên tục khoảng 1401460C) lọc qua vật liệu siêu lọc bơm vào thùng lên men Nếu đặc tính công nghệ thiết bị lên men cho phép, pha chế trùng đồng thời dịch lên men thiết bị Tất cấu tử bổ sung vào môi trường lên men phải xử lý khử khuẩn trước sau bổ sung theo chế độ vận hành vô khuẩn  Thiết bị lên men Phải vô khuẩn trước đưa vào sử dụng Thường trùng nhiệt 2,5 – 3,0 at thời gian Đông thời khử khuẩn nghiêm ngặt tất hệ thống ống dẫn, khớp nối, van, phin lọc tất thiết bị phụ trợ khác….Trong trình lên men luuôn cố gắng trì áp suất dư thiết bị nhằm hạn chế rũi ro nhiễm tạp Nhóm 13 Page 12 Kháng sinh – Nghiên cứu quy trình sản xuất Penicillin Hình Các thiết bị dùng sản xuất Penicillin  Không khí Thường khử khuẩn sơ nén đoạn nhiệt, sau qua màng lọc vô khuẩn hay màng siêu lọc III Các trình lên men Hiện người ta sản xuất penicillin theo hai phương pháp: Nhóm 13 • Phương pháp lên men bề mặt • Phương pháp lên men chìm Page 13 Kháng sinh – Nghiên cứu quy trình sản xuất Penicillin Quá trình lên men bề mặt Áp dụng từ lâu, không triển khai sản xuất lớn nữa.Gồm có phương pháp: Lên men nguyên liệu rắn (cám mì, cám ngô có bổ sung đường lactose) Lên men bề mặt môi turờng lỏng tĩnh (phổ biến sử dụng môi trường - lactose – nước chiết ngô)  Nguyên liệu Cám hạt ngũ cốc loại thường sử dụng nguyên liệu sản xuất penicillin phương pháp bề mặt Nguyên liệu bổ sung nước cho độ ẩm đạt 55-60%W hấp trùng 121oC 30-45 phút Ngay sau kết thúc trùng, chúng tải vào khay hình chữ nhật có kích thước dài 1-1.2 m, rộng 0.6-0.8 m, cao 5-6 cm Lớp môi trường cho vào dày 2-3 cm để đảm bảo độ thóang khí tòan bề mặt mặt môi trường Một số sở dùng nguyên liệu hạt ngũ cốc lớp môi trường dày (3-4 cm) hạt ngũ cốc tạo môi trường có độ thoáng khí Trong trường hợp cám mịn phải trộn thêm trấu xay nhỏ (thêm khoảng 20-25%) cùi bắp xay nhỏ trước trùng Nguồn Cacbon: loại bột hạt ngũ cốc, cám mì, cám gạo, vỏ khoai tây, o rỉ đường, loại đường (glucose, fructose, matlose, lactose,…) dextrin, glyxerin, ecid acetic,… o Nguồn Nitơ: bột đậu tương, nước chiết ngô, cao nấm men, nước chết nấm men, pepton, muối NO3-, NH4-,… o Các nguyên tố khoáng đa lượng thường gặp như: P, S, Mg, Fe, Ca, K, Na, … Các nguyên tố vi lượng như: Cu, Zn, Co, Mo, chất sinh trưởng…  Quá trình nhân giống Quá trình nhân giống ống nghiệm Trong nhà máy, lần cấy chuyển giống, người ta thường cấy làm ống: - Một ống dùng kiểm tra trước sản xuất Nhóm 13 Page 14 Kháng sinh – Nghiên cứu quy trình sản xuất Penicillin - Một ống dùng để sản xuất Một ống dùng để bảo quản Để làm môi trường nhân giống, người ta làm giống Chỉ có điểm khác sau làm ẩm môi trường đến độ ẩm định, người ta phân phối chúng vào dụng cụ thủy tinh (chai thủy tinh hay bình tam giác) với khối lượng 1/5 hay 1/6 dung tích dụng cụ, đậy kín nút trùng 121oC(0.5 at) 30 phút để nguội cấy giống Đổ thêm 10ml nước trùng làm nguội vào ống giống, lắc thật chuyển sang tủ ấm 30-37oc Nuôi điều kiện bào tử nấm xuất phát triển khắp môi trường, gọi trình nhân giống cấp Cứ thực ta có giống cấp 2, cấp đủ 5-10% giống cho sản xuất Cứ cấp độ nhân giống từ cấp sang cấp khác, khối lượng môi trường tăng từ 10-15 lần Trong trường hợp vượt ký người ta nuôi khay  Quá trình lên men Nấm penicillium trình phát triển thường tạo nhiệt nấm Aspergillus Tuy nhiên, để tăng cường khả phát triển sinh tổng hợp, người ta thường thổi khí quạt gió có lắp hệ thống làm Quá trình lên men kéo dài 6-7 ngày 24-28oC Trong lên men bề mặt, người ta sử dụng môi trường lỏng, bao gồm: Cao ngô (bắp) 50g Lactose 30g KH2PO4 0.5g MgSO4 0.25g C6H5CH2COOH 0.2g ZnSO4 0.044g NaNO3 3g Nước 1000ml Váng nấm sợi giữ lại sau rút hết dịch lên men, tiếp tục sử dụng cho lần lên men Ở lần lên men người ta đổ Nhóm 13 Page 15 Kháng sinh – Nghiên cứu quy trình sản xuất Penicillin thêm dịch lên men vào Các thí nghiệm cho thấy nên sử dụng lại 3-4 lần, lần sau hiệu suất thu nhận kháng sinh giảm dần Quá trình lên men chìm Kỹ thuật len men chìm kỹ thuật áp dụng hầu hết cở sản xuất penicillin công nghiệp hiên Được vận hành theo phương pháp lên men bán liên tục, gồm phương án lên men gián đoạn theo mẻ có bổ sung liên tục (hay bán liên tục) hay vài cấu tử kết hợp với phương án tuần hoàn lại phần hệ sợi mẻ lên men trước (hoặc không)  Quá trình nhân giống Trong trình lên men chìm người ta nhân giống môi trường lỏng Để làm môi trường lỏng, người ta sử dụng cao ngô, glucose, lactose, muối amon, thiosunfat, photphat kali natri,…Môi trường trùng 121 oC thời gian 30 phút, để nguội nhân giống, Quá trình nhân giống bắt đầu việc chuyển giống từ ống nghiệm sang bình tam giác chứa sẵn môi trường nhân giống Nhiệt độ trình nhân giống trì khoảng 26 ± oC thời gian nhân giống cấp độ khoảng 72 Tuy nhiên nhiệt độ không hoàn toàn cố định mà có thay đổi theo giống vi sinh vật mà ta áp dụng vào sản xuất Khi ta thấy tổng số lượng tế bào bắt đầu đạt lớn ta đưa chúng sang giai đoạn sản xuất Mục tiêu thu số lượng tế bào cao Môi trường nhân giống lên men penicillin khác với môi trường sản xuất không chứa lactose, số khoáng chất tiền chất Người ta thường nhân giống penicillium môi trường có thành phần sau: Nhóm 13 Page 16 Kháng sinh – Nghiên cứu quy trình sản xuất Penicillin Cao ngô 2% Glucose2% Nitrat amon 0.125% Sunfat magiê0.025 Kaliphotphat monoboric 0.2%  Quá trình lên men lactose 0.5% sunfat natri 0.05% CaCO3 0.5% Trong trình nuôi cấy chìm nấm Penicillium chrysogenum trải qua sáu giai đoạn phát triển: Giai đoạn I: Các bào tử nấm mốc nảy mầm, phát triển thành chồi nhỏ, tế bào chất chưa phân hoá Thỉnh thoảng không bào có hạt nhỏ bắt màu đỏ trung tính Giai đoạn II: Khuẩn ty phát triển, tế bào chất ưa kiềm, hạt nhỏ không bào dần biến Ở cuối giai đoạn xuất giọt chất béo nhỏ Giai đoạn III: Tạo thành giọt chất béo to, không không bào, tế bào chất ưa kiềm Giai đoạn IV: Xuất không bào với hạt dễ bắt màu đỏ trung tính, hạt chất béo nhỏ giai đoạn III, tính ưa kiềm giảm Giai đoạn V: Khuẩn ty có hình trống có chứa không bào,ở có một vài hạt lớn Các hạt chất béo biến Tính ưa kiềm tiếp tục giảm Giai đoạn VI: Khuẩn ty giữ dạng hình trống hạt bắt màu trung tính, không bào bắt màu da cam màu hồng đồng Các hạt chất béo không Xuất tế bào riêng biệt bắt đầu tự phân Do đó, trình lên men chìm gồm pha: - Pha thứ nhất: pha sinh khối, tốc độ sinh sản nấm xảy nhanh Sự tạo thành Pencillin bắt đầu (giai đoạn I, II, III) Pha thứ hai: hệ sợi phát triển chậm lại, pha penicillin tạo với mức độ cực đại (giai đoạn IV, V, VI) Giống nấm mốc penicillin chrysogenum loại hiếu khí bắt buộc Hơn trình tổng hợp penicillin xảy điều kiện hiếu khí mạnh Do suốt trình lên men, việc thổi khí điều cần thiết • Nhiệt độ nên trì khoảng 26 ± 1oC Nhóm 13 Page 17 Kháng sinh – Nghiên cứu quy trình sản xuất Penicillin • pH trì 7-7.5 • Chế độ thổi khí 1.2-1.5 thể tích/lít/phút Trong lên men để sản xuất penicillin người ta sử dụng nhiều loại môi trường khác nhau, tùy theo giống penicilium sử dụng Hiệu xuất thu nhận penicillin phụ thuộc vào lượng sinh khối có môi trường Nhiều kết cho thấy penicillium phát triển mạnh, tạo nhiều sinh khối hàm lượng penicillin thu nhiều Do muối dinh dưỡng phải cung cấp đầy đủ Mặt khác, cần cung cấp nhiều oxy nấm penicillin cần oxy dạng hòa tan để phát triển Lượng oxy phụ thuộc nhiều vào lượng chất dinh dưỡng Mối quan hệ thường tỷ lệ thuận với Để thu 100 kg muối natri penicillin G cần phải cung cấp: 1200 kg đường 60 kg dầu mơ 220 kg axit phenylaxetic 100kg axitphennylaccetic 3000kw điện 4000 m3 nước IV 770 kg cao ngô 50000 m3 không khí QUÁ TRÌNH TINH SẠCH CHẤT KHÁNG SINH Có ba phương pháp thu nhân tinh chế kháng sinh penicillin từ môi trường nuôi cấy (cả phương pháp bề mặt phương pháp chìm): • Trích ly dung môi hữa • Hấp thu • Trao đổi ion Trong đó, phương pháp trích ly dung môi hữu sử dụng nhiều muối penicillin dễ tan nước acid penicillin dễ tan dung môi hữa Nhóm 13 Page 18 Kháng sinh – Nghiên cứu quy trình sản xuất Penicillin Công đoạn xử lý dịch lên men tinh chế thu penicillin tự nhiên tóm tắt bao gồm công đoạn sơ đồ đây:  Lọc sợi nấm từ dịch lên men Mục đích : Penicillin sản phẩm lên men ngoại bào Vì vậy, sau kết thúc trình lên men người ta thường tiến hành lọc để giảm tổn hao phân huỷ penicillin giảm bớt khó khăn tinh chế, tạp chất tạo hệ sợi nấm tự phân Thiết bị lọc: phổ biến thiết bị lọc hút kiểu băng tải kiểu thùng quay Thông thường, người ta cần lọc lần làm lạnh dịch để chuyển sang công đoạn Chỉ trường hợp đặc biệt cần phải xử lý kết Nhóm 13 Page 19 Kháng sinh – Nghiên cứu quy trình sản xuất Penicillin tủa phần protein lọc lại dịch lần thứ hai Hiện tượng tự phân hệ sợi nấm thường kéo theo hậu làm cho dịch khó lọc Thu hồi sinh khối nấm: Phần sinh khối nấm rửa sạch, sấy khô sử dụng để chế biến thức ăn gia súc  Trích ly lần Penicillin thường trích ly dạng axít khỏi dịch lọc dung môi amylacetat butylacetat pH = 2,0 - 2,5, nhiệt độ - 0C Để hạn chế lượng penicillin bị phân huỷ, trình trích ly thực thời gian ngắn thiết bị trích ly ngược dòng liên tục kiểu ly tâm nhiều tầng cánh Đồng thời, thời gian trích ly cần giám sát chặt chẽ: nhiệt độ, pH, độ vô khuẩn để hạn chế tổn thất phân huỷ penicillin Dịch lên men sau lọc bơm trộn đồng thời với dung dịch H2SO4 H3PO4 loãng có bổ sung thêm chất chống tạo nhũ bơm song song với dung môi trích ly vào thiết bị Tỉ lệ dịch lọc: dung môi thường chọn khoảng - 10V dịch lọc /1V dung môi Trong số công nghệ, nhằm cải thiện chất lượng sản phẩm, người ta áp dụng phương pháp trích ly hai lần dung môi, với lần đầu trích ly penicillin amylacetat butylacetat; penicillin lại trích ly ngược sang dung dịch đêm pH = 7,2 - 7,5, thường dung dịch KOH loãng dung dịch NaHCO 3; sau penicillin lại trích ly sang dung môi lần thứ 2, với lượng dung môi  Hấp phụ than hoạt tính, lọc than Để tẩy màu loại bỏ số tạp chất khác, người ta thường bổ sung trực tiếp chất hấp phụ vào dung môi chứa penicillin sau trích ly, sử dụng phổ biến than hoạt tính Sau than hoạt tính tách rửa lại sử dụng thiết bị lọc hút băng tải thiết bị lọc hút kiểu thùng quay Phần than sau lọc đưa chưng thu hồi dung môi xử lý hoàn nguyên, phục vụ cho mẻ sau  Kết tinh, lọc, rửa, sấy thu penicillin tự nhiên Việc kết tinh penicillin V hay penicillin G dạng muối thực đơn giản, cách bổ sung trực tiếp vào dung môi sau tẩy màu Nhóm 13 Page 20 Kháng sinh – Nghiên cứu quy trình sản xuất Penicillin lượng nhỏ kali acetat (hay natri acetat) người ta trích ly lại sang dung dịch KOH loãng (hay NaOH loãng), tiến hành cô chân không nhiệt độ thấp, sau bổ sung BuOH để penicillin tự kết tinh Sau kết tinh, tinh thể penicillin lọc tách máy lọc hút thùng quay Các thông số công nghệ có ảnh hưởng lớn đến hiệu qủa kết tinh là: Nồng độ penicillin, nồng độ muối acetat, pH dung môi hay pH dung dịch cô đặc, nhiệt độ kết tinh,… Để đảm bảo độ tinh khiết cao hơn, tiến hành hòa tan kết tinh lại penicillin Khi sản phẩm đạt độ tinh theo yêu cầu, thường độ tinh khiết không 99,5%, chúng lọc tánh tinh thể rửa làm khô sơ dung môi kỵ nước izopropanol hay butylalcohl; hút chân không tách dung môi máy lọc băng tải sấy không khí nóng đến dạng sản phẩm bột muối penicillin Sản phẩm này, phần sử dụng trực tiếp để pha chế thuốc kháng sinh penicillin; lại, phần lớn sử dụng làm nguyên liệu phục vụ cho việc sản xuất sản phẩm penicillin cephalosporin bán tổng hợp khác Ngoài ra, để sản xuất sản phẩm penicillin có độ tinh khiết cao, người ta cần phải sử dụng phối hợp thêm số giải pháp công nghệ khác CHƯƠNG MỘT SỐ VẤN ĐỀ LƯU Ý KHI SỬ DỤNG KHÁNG SINH I NGUYÊN TẮC KHI SỬ DỤNG THUỐC KHÁNG SINH Các nguyên tắc sử dụng thuốc kháng sinh cụ thể sau[8]:  Chỉ dùng kháng sinh có nhiễm khuẩn Các tác nhân gây bệnh cho người virus, vi khuẩn, nấm, sinh vật ký sinh vật ( giun, sán…) Các kháng sinh thông dụng có tác dụng với vi khuẩn, kháng sinh có tác dụng với virus, nấm gây bệnh, sinh vật đơn bào Mỗi nhóm kháng sinh lại có tác dụng với số loại vi khuẩn định; đó, trước Nhóm 13 Page 21 Kháng sinh – Nghiên cứu quy trình sản xuất Penicillin định sử dụng loại kháng sinh cần phải thăm khám lâm sàng, bao gồm việc đo nhiệt độ, phóng vấn khám cho bệnh nhân Đây bước quan trọng phải làm trường hợp, giúp cho thầy thuốc dự đoán tác nhân gây bệnh qua đường thâm nhập vi khuẩn  Phải biết lựa chọn kháng sinh hợp lý Lựa chọn kháng sinh phụ thuộc vào yếu tố: - Lựa chọn kháng sinh phải phù hợp với vi khuẩn gây bệnh - Lựa chọn kháng sinh theo vị trí nhiễm khuẩn: Để điều trị thành công kháng sinh phải thấm vào nơi nhiễm khuẩn, người thầy thuốc phải nắm vững đặc tính dược động học thuốc chọn kháng sinh thích hợp - Lựa chọn kháng sinh theo địa bệnh nhân: Những khác biệt sinh lý như: Ở trẻ nhỏ, người cao tuổi phụ nữ có thai… có ảnh hưởng đến dược động học kháng sinh Những thay đổi bệnh lý suy giảm miễn dịch, bệnh gan, thận nặng, làm giảm rõ rệt chuyển hóa xuất thuốc gây tăng cách bất thường nồng độ kháng sinh dẫn tới ngộ độc tăng tác dụng phụ kháng sinh Kháng sinh với trẻ em: Các kháng sinh phải chống định với trẻ em không nhiều hầu hết phải hiệu chỉnh lại liều theo lứa tuổi Kháng sinh với phụ nữ có thai: Nói chung, chống định tuyệt phụ nữ có thai Trong số trường hợp nhiễm khuẩn nặng đe dọa đến tính mạng việc cân nhắc ưu tiên cho người mẹ  Phối hợp với biện pháp điều trị khác Khi nhiễm khuẩn có ổ mủ, hoại tử mô, vật lạ (sỏi) cho kháng sinh phải kèm theo thông mủ, phẫu thuật Bổ sung vitamin ý đến công tác hộ lý  Dùng đủ thời gian Trên thể nhiễm khuẩn, vi khuẩn nhiều giai đoạn khác với kháng sinh Nếu sau ngày dùng kháng sinh, sốt không giảm, cần thay phối hợp kháng Nhóm 13 Page 22 Kháng sinh – Nghiên cứu quy trình sản xuất Penicillin sinh Khi điều trị hết sốt, cần cho thêm kháng sinh 2-3 ngày Quy định thời gian dùng kháng sinh loại nhiễm khuẩn khác nhau: - Các nhiễm khuẩn cấp: 5-7 ngày Các nhiễm khuẩn đặc biệt (viêm nội tâm mạc Osler, viêm bể thận): 2-4 tuần Viêm tuyến nhiếp hộ: tháng Nhiễm khuẩn khớp hang: 3-6 tháng Nhiễm lao: tháng  Phải sử dụng liều lượng Muốn chọn liều dùng kháng sinh phải vào độ nhạy cảm vi khuẩn trạng thái người bệnh (có mắc bệnh gan , thận hay không) Đối với bệnh thương hàn:bệnh nặng liều lượng ban đầu nhỏ  Phải biết sử dụng kháng sinh dự phòng hợp lý Chỉ dụng kháng sinh dự phòng phòng nhiễm khuẩn hậu phẫu thuật , phòng nguy viêm nội mạc tim chữa khỏi phải dùng kháng sinh để ngừa tái nhiễm  Chọn thuốc theo dược động học Dựa vào hấp thu, phân phối, chuyển hoá, thải trừ phụ thuộc vào nơi nhiễm khuẩn tình trạng bệnh súc II NGUYÊN NHÂN THẤT BẠI TRONG VIỆC DÙNG KHÁNG SINH Việc dùng thuốc kháng sinh không đạt hiệu chủ yếu nguyên nhân sau đây: [9] - Chọn kháng sinh không phổ tác dụng Kháng sinh không đạt tới ngưỡng tác dụng ổ nhiễm khuẩn, liều lượng không hợp lí, dược động học không thích hợp, tương tác thuốc làm - giảm tác dụng kháng sinh Do vi khuẩn kháng thuốc cần thay kháng sinh khác phối hợp kháng sinh Nhóm 13 Page 23 Kháng sinh – Nghiên cứu quy trình sản xuất Penicillin C KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ Thuốc kháng sinh có lịch sử nghiên cứu lâu đời, hợp chất tự nhiên, bán tổng hợp tổng hợp, có tác dụng diệt khuẩn hay kiềm khuẩn, dùng theo nhiều cách khác (uống, tiêm, bôi da,…) Mỗi thuốc kháng sinh có chế tác dụng động học khác nhau, dựa vào ta chọn thuốc cho thích hợp với loại bệnh nhiễm khuẩn, dùng cần phải cân nhắc liều lượng thời gian cần thiết cho loại thuốc Sự xuất tính kháng lại kháng sinh gây bệnh cho người, sử dụng kháng sinh không hợp lý gây tích luỹ chọn lọc chủng vi khuẩn kháng sinh, làm cho chủng vi khuẩn chóng lại kháng sinh tăng nhanh Vì vậy, sử dụng kháng sinh hợp lý vấn đề hàng đầu Chúng ta cần phải tuân theo nguyên tắc để chọn kháng sinh cho thích hợp Để có thể khoẻ mạnh, đòi hỏi phải có kiến thức trình độ chuyên môn Do vậy, nên sử dụng thuốc kháng sinh thật am hiểu theo định hướng dẫn bác sĩ, dược sĩ,… Nhóm 13 Page 24 Kháng sinh – Nghiên cứu quy trình sản xuất Penicillin D TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Forrest RD (3- 1982) “Early history of wound treatment” J R Soc Med, 198– 205 [2] Kingston W (6- 2008) “Irish contributions to the origins of antibiotics” Irish journal of medical science, 87–92 [3] Bài giảng “Vi sinh vật công nghiệp”, ĐH Công nghiệp thực phẩm, 2013 [4] “Các nhóm thuốc kháng sinh tác dụng”, diễn đàn Bác sĩ nội trú Website: http://bacsinoitru.vn/content/cac-nhom-thuoc-khang-sinh-va-tac-dung1334.html [5] Công nghệ lên men, Khoa Công Nghệ Hoá Học, Nguyễn Thuý Hương (hướng dẫn), ĐH Bách Khoa, 2015 [6] Công nghệ sản xuất chất kháng sinh Penicillin, Khoa Khoa học ứng dụng, Nguyễn Thị Cẩm Vy (hướng dẫn), ĐH Tôn Đức Thắng TP.HCM [7] “Antibiotics - A Review of ED Use”, M Hiller, MD, James Li, MD, Apr 14, 2010, European Society of Clinical Pharmac [8] “7 nguyên tắc sử dụng thuốc kháng sinh”, DS Nguyễn Hữu Đức Website: http://www.ykhoa.net/duoc/sudungthuoc/27_066.htm [9] “Những sai lầm phổ biến dùng thuốc kháng sinh”, PGS TS Nguyễn Tiến Dũng-Trưởng khoa Nhi (BV Bạch Mai) Website: http://dantri.com.vn/suc-khoe/nhung-sai-lam-pho-bien-khi-dung-thuockhang-sinh-1378040906.htm Nhóm 13 Page 25 [...]...Kháng sinh – Nghiên cứu quy trình sản xuất Penicillin CHƯƠNG 2: QUY TRÌNH SẢN XUẤT PENICILLIN I Đặc điểm chung Công nghệ lên men sản xuất penicillin mang nét đặc thù riêng của từng cơ sở sản xuất và các thông tin này rất hạn chế cung cấp công khai, ngay mỗi bằng sáng chế thường cũng chỉ giới hạn ở những... khác….Trong quá trình lên men luuôn cố gắng duy trì áp suất dư trong thiết bị nhằm hạn chế rũi ro do nhiễm tạp Nhóm 13 Page 12 Kháng sinh – Nghiên cứu quy trình sản xuất Penicillin Hình Các thiết bị dùng trong sản xuất Penicillin  Không khí Thường được khử khuẩn sơ bộ nén đoạn nhiệt, sau đó qua màng lọc vô khuẩn hay màng siêu lọc III Các quá trình lên men Hiện nay người ta sản xuất penicillin theo... Lan), toàn bộ dây chuyển sản xuất thuốc kháng sinh penicillin có thể phân chia làm bốn công đoạn chính như sau:  Lên men sản xuất penicillin tự nhiên (thường thu penicillin V hoặc penicillin G)  Xử lý dịch lên men tinh chế thu bán thành phẩm penicillin tự nhiên  Sản xuất các penicillin bán tổng hợp (từ nguyên liệu penicillin tự nhiên)  Pha chế các loại thuốc kháng sinh penicillin [6]  Sơ Sơ đồ... nguyên tố vi lượng như: Cu, Zn, Co, Mo, và các chất sinh trưởng…  Quá trình nhân giống Quá trình nhân giống bắt đầu từ ống nghiệm Trong các nhà máy, mỗi lần cấy chuyển giống, người ta thường cấy làm 3 ống: - Một ống dùng kiểm tra trước khi sản xuất Nhóm 13 Page 14 Kháng sinh – Nghiên cứu quy trình sản xuất Penicillin - Một ống dùng để sản xuất Một ống dùng để bảo quản Để làm môi trường nhân giống, người... hiếu khí bắt buộc Hơn thế nữa quá trình tổng hợp penicillin xảy ra trong điều kiện hiếu khí mạnh Do đó trong suốt quá trình lên men, việc thổi khí là điều hết sức cần thiết • Nhiệt độ nên duy trì khoảng 26 ± 1oC Nhóm 13 Page 17 Kháng sinh – Nghiên cứu quy trình sản xuất Penicillin • pH duy trì ở 7-7.5 • Chế độ thổi khí 1.2-1.5 thể tích/lít/phút Trong lên men để sản xuất penicillin hiện nay người ta sử... của penicillin rất dễ tan trong nước và acid penicillin rất dễ tan trong dung môi hữa cơ Nhóm 13 Page 18 Kháng sinh – Nghiên cứu quy trình sản xuất Penicillin Công đoạn xử lý dịch lên men và tinh chế thu penicillin tự nhiên được tóm tắt bao gồm các công đoạn chính trong sơ đồ dưới đây:  Lọc sợi nấm từ dịch lên men Mục đích : Penicillin là sản phẩm lên men ngoại bào Vì vậy, ngay sau khi kết thúc quá trình. .. khác với môi trường sản xuất là không chứa lactose, một số khoáng chất và tiền chất Người ta thường nhân giống penicillium trong môi trường có thành phần sau: Nhóm 13 Page 16 Kháng sinh – Nghiên cứu quy trình sản xuất Penicillin Cao ngô 2% Glucose2% Nitrat amon 0.125% Sunfat magiê0.025 Kaliphotphat monoboric 0.2%  Quá trình lên men lactose 0.5% sunfat natri 0.05% CaCO3 0.5% Trong quá trình nuôi cấy chìm... người ta sản xuất penicillin theo hai phương pháp: Nhóm 13 • Phương pháp lên men bề mặt • Phương pháp lên men chìm Page 13 Kháng sinh – Nghiên cứu quy trình sản xuất Penicillin 1 Quá trình lên men bề mặt Áp dụng từ lâu, hiện nay hầu như không còn được triển khai trong sản xuất lớn nữa.Gồm có 2 phương pháp: Lên men nguyên liệu rắn (cám mì, cám ngô có bổ sung đường lactose) Lên men trên bề mặt môi turờng... penicillin bán tổng hợp (từ nguyên liệu penicillin tự nhiên)  Pha chế các loại thuốc kháng sinh penicillin [6]  Sơ Sơ đồ đồ khối Hình dây chuyền sản xuất Penicillin (Theo Gist-Brocades – Hà Lan) Nhóm 13 Page 11 Kháng sinh – Nghiên cứu quy trình sản xuất Penicillin II Chuẩn bị môi trường lên men Thành phần môi trường nhân giống cần được tính toán để đảm bảo cung cấp đủ nguồn thức ăn C, N, các chất... men tiếp theo người ta chỉ đổ Nhóm 13 Page 15 Kháng sinh – Nghiên cứu quy trình sản xuất Penicillin thêm dịch lên men vào Các thí nghiệm cho thấy chỉ nên sử dụng lại 3-4 lần, vì những lần sau hiệu suất thu nhận kháng sinh sẽ giảm dần 2 Quá trình lên men chìm Kỹ thuật len men chìm là kỹ thuật được áp dụng trong hầu hết các cơ cở sản xuất penicillin công nghiệp hiên nay Được vận hành theo phương pháp lên