ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  DƯƠNG THÚC HUY KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA BỐN LOÀI ĐỊA Y THU HÁI Ở MIỀN NAM VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 62 44 27 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Thành phố Hồ Chí Minh 2016 Công trình hoàn thành Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp Hồ Chí Minh Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Nguyễn Kim Phi Phụng GS.TS Joel Boustie Phản biện 1: PGS.TS Trần Hùng Phản biện 2: PGS.TS Phạm Đình Hùng Phản biện 3: PGS.TS Trần Công Luận Phản biện độc lập 1: TS Nguyễn Trọng Tuân Phản biện độc lập 2: TS Lê Hoàng Duy Luận án bảo vệ Hội đồng chấm luận án cấp trường họp Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp Hồ Chí Minh vào hồi ngày tháng năm 2016 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện trường Đại học Khoa học Tự nhiên-HCM - Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp HCM I GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Đặt vấn đề Địa y loài thực vật bậc thấp đặc biệt, kết cộng sinh nấm (mycobiont) phận quang hợp (photobiont phycobiont) thường tảo vi khuẩn lam (cyanobacterium) Nhờ dạng sống này, địa y sống nhiều nơi đất đá, thân cây, cây, điều kiện môi trường từ vùng khô hạn đến vùng khắc nghiệt Ngay từ thời cổ đại, địa y sử dụng để làm thuốc chữa bệnh, làm thực phẩm, mỹ phẩm, xà phòng, nước hoa, …Nhiều hợp chất địa y cô lập vài hợp chất số xác định có tính kháng khuẩn, kháng vi rút, kháng ung thư, giảm đau, hạ sốt, … Chi Parmotrema, họ Parmeliaceae, loài địa y phiến, phổ biến vùng nhiệt đới Trên giới có khoảng 220 loài thuộc chi có nhiều loài khảo sát mặt hóa dược, cho kết khả quan Ngoài chi Roccella nghiên cứu giới mặt hóa thực vật Với lý chọn đề tài “Khảo sát thành phần hóa học thử nghiệm số hoạt tính sinh học bốn loài địa y thu hái miền Nam Việt Nam” Đối tƣợng nghiên cứu Địa y Parmotrema tsavoense (Krog & Swincow) Krog & Swincow thu hái núi Tà Cú, huyện Hàm Thuận Nam, tỉnh Bình Thuận Địa y Roccella sinensis (Nyl.) Hale thu hái chùa Hang, huyện Liên Hương, tỉnh Bình Thuận Địa y Parmotrema planatilobatum (Hale) Hale Parmotrema sancti-angelii (Lynge) Hale thu hái thành phố Bảo Lộc, tỉnh Lâm Đồng Nhiệm vụ nghiên cứu Thu mẫu, xử lý, bảo quản định danh đối tượng nghiên cứu Ngâm, chiết mẫu địa y để thu cao tương ứng Sắc ký cột silica gel cao để cô lập hợp chất tinh Xác định cấu trúc hoá học hợp chất cô lập phương pháp quang phổ Thử hoạt tính sinh học dịch chiết, số hợp chất cô lập Hình 1.1: Địa y Parmotrema sancti-angelii (Lynge) Hale (trái) Parmotrema planatilobatum (Hale) Hale (phải) Hình 1.2: Địa y Parmotrema tsavoense (Krog & Swincow) Krog & Swincow Hình 1.3: Địa y2 Roccella sinensis (Nyl.) Hale Phƣơng pháp nghiên cứu Các phương pháp chiết với dung môi hữu thông dụng để thu cao Các phương pháp sắc ký, kết tinh, để cô lập hợp chất tinh khiết Các phương pháp quang phổ NMR MS để xác định cấu trúc hóa học hợp chất tinh khiết cô lập từ loài địa y lựa chọn khảo sát Các phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào Ý nghĩa khoa học thực tiễn, đóng góp luận án Luận án cô lập xác định 49 hợp chất có 15 hợp chất lần cô lập tự nhiên với 14 hợp chất lần tìm thấy chi Parmotrema Roccella Đã thử hoạt tính gây độc bốn dòng tế bào ung thư vú (MCF–7), ung thư cổ tử cung (HeLa), ung thư phổi (NCI-H460), ung thư gan (HepG2) Kết cho thấy hợp chất 6αacetoxyhopan-16β,22-diol (13), hopan-6α,16α,22-triol (15), parmosidone C (34), parmoether B (32), montagnetol F (48) thể hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư xác định giá trị IC50 Kết IC50 cho thấy có hợp chất 32 cho hoạt tính trung bình NCI-H460, MCF-7 HepG2 Bố cục luận án Luận án gồm 117 trang có 19 bảng 43 hình Luận án bao gồm phần sau: Chương 1: Tổng quan (23 trang) Chương 2: Thực nghiệm (14 trang) Chương 3: Kết thảo luận (61 trang) Chương 4: Kết luận kiến nghị (8 trang) Danh mục công trình liên quan luận án (1 trang) Tài liệu tham khảo, sử dụng 75 tài liệu liên quan (7 trang) Các phụ lục phổ (261 phổ, trình bày 147 trang) Địa y Parmotrema sancti-angelii (950,0 g bột) Bột không tan P (30,0 g) Rửa aceton nóng Cao thô (145,1 g) Cao aceton (110,4 g) A 20% 10% H0 (6,1 g) CC/H:A H1 (2,1 g) 30% C (15,4 g) EA1 (4,5 g) H0.2-0.4 (1,9 g) H1.1 (1,1 g) C 100% C 100% EA2 (5,0 g) CC/A CC/A H0.1 (3,3 g) 70-100% 60% 40% H1.2+4 (0,5 g) H1.5 (197,3 mg) EA1.1 (1,9 g) EA3 (20,0 g) EA1.2 (2,1 g) CC/A pTLC/C H0.1.1-0.1.3 (1,5 g) H0.1.4 (1,0 g) H1.1.1 (200,2 mg) CC/A H0.1.4.1 (695,8 mg) CC H:A 9:1 (495,8 mg) 12 (6,8 mg) 18 (3,9 mg) H0.1.4.2 (119,5 mg) 17 (19,8 mg) H1.1.2 (498,4 mg) EA1.1.1 (998,9 g) Washing by aceton 16 (4,9 mg) CC/A 11 (99,2 mg) pTLC C:M 100:4 (197,9 mg) (98,8 mg) (395,7 mg) (19,7 mg) 10 (4,9 mg) 13 (5,2 mg) 14 (10,1 mg) 15 (19,8 mg) Hệ dung môi A Hexan: ethyl acetat: acid acetic 9:1:0.5 Hệ dung môi B Hexan: ethyl acetat : methanol 7:3:0.02 Hệ dung môi C Hexan: ethyl acetat : methanol 7:3:0.4 Lichen Parmotrema (350 g dry thallus) Sơ đồ Sơ đồ phân lập cácplantạiilobtạium hợp chất từ địa y P sancti-angelii EA1.1.2 (219,5 mg) CC/B (14,7 mg) 19 (3,8 mg) Hỗn hợp 5+6+7 CC/A (295,8 mg) (198,8 mg) (49,5 mg) Địa y Parmotrema planatilobatum (350 g bột) Tủa P (2,0 g) Cao methanol thô (63,0 g) Chiết pha rắn, giải ly với petroleum ether - ethyl acetat 0% 20-50% Cao P.E (1,5 g) Cao EA1 (22,1 g) EA1.2-1.3 (6,3 g) EA1.1 (7,9 g) Cao EA2 (12,1g) Cao M (10,2 g) CC/C:M 9:1:0.5 EA1.1.2 (2,0 g) C18-Rp CC/ M:W 2:3 20 (5,9 mg) 21 (14,7 mg) 22 (5,8 mg) 23 (7,9 mg) Methanol EA1.4 (1,5 g) CC/ C:M 9:1 EA1.1.1 (3,5 g) 60-100% EA1.4.1 (495,7 mg) CC/C:M 9:1 24 (295,7 mg) 26 (795,6 mg) EA: ethyl acetat Ac: aceton C: chloroform M: methanol W: nước EA1.4.2 (197,8 mg) C18-Rp CC/ M:W 2:3 pTLC C:EA:Ac 9:1:1 25 (5,0 mg) C18-Rp Sắc ký cột pha đảo C18 Sơ đồ Sơ đồ phân lập hợp chất từ địa y từ P planatilobatum Địa y Parmotrema tsavoense (1350 g bột) Rửa aceton Cao methanol (249,8 g) Tủa (79,7 g) 29 (19,8 g) 30 (29,9 mg) CC/H:A 9:1-0:10 A 10% 20% 30% P1 (9,9 g) P2 (2,8 g) P3 (3,3 g) 50% P4 (3,1 g) P5 (16,1 g) P3.1 (0,1 g) CC/A 11 (19,7 mg) P3.2 (0,8 g) CC/F 31 (6,9 mg) 36 (3,1 mg) P3.3 (1,1g) P5.1(1,1g) CC/G P5.2-5.4 (10,7g) CC/A 100% P6 (9,9 g) Phần lại A:M 9:1-0:10 Sephadex LH-20 P6.1 (3,0 g) P6.2 (2,5 g) P6.3 P7 (3,8 g) (5,1 g) CC/D pTLC/D 27 (10,9 mg) 37 (6,1 mg) 38 (4,2 mg) P5.1.1 (0,2 g) P5.1.2 (0,2 g) CC/A 33 (7,9 mg) 32 (5,9 mg) Ghi chú: EA: ethyl acetat Ac: aceton C: chloroform M: methanol W: nước 60% CC/A CC/A CC/A (98,9 mg) (295,7 mg) (199,1 mg) (99,8 mg) 40% CC/B pTLC/C 28 (4,8 mg) 34 (5,9 mg) 35 (9,8 mg) Hệ dung môi A Hệ dung môi B Hệ dung môi C Hệ dung môi D Hệ dung môi E Hệ dung môi F Hệ dung môi G H:EA:AcOH C:EA:AcOH C:EA:AcOH C:M C:M C:EA H:C:EA Sơ đồ Sơ đồ phân lập hợp chất từ địa y từ Parmotrema tsavoense 9:1:0.02 85:15:0.02 75:25:0.02 88:12 70:30 5:0.04 1:1:1 M (80,1 g) Địa y Roccella sinensis (1.700 g bột) Cao methanol thô (450 g) CC/H:A 9:1-0:10 EA (0%) (10%) H (10,2 g) (20%) EA1 (21,1 g) EA2 (66,1 g) CC/H:A:AcOH 9:1:0.02-0:10:0.02 EA1.1 (2,8 g) CC/A EA1.1.1 EA1.1.2 (298,8 mg) (1.2 g) (lấy 300 mg) CC/A pTLC/A EA1.2 (15,1 g) CC/A pTLC/A EA3 (29,8 g) EA1.2.2 (3,4 g) pTLC/C (195,5 mg) (295,7 mg) 49 (7,8 mg) (6,9 mg) 46 (8,8 mg) 45 (14,8 mg) 47 (9,7 mg) EA4 (64,2 g) EA2.1.1 (8,0 g) 41 (20,2 mg) 43 (1,5 g) 44 (1,0 g) 48 (13,1 mg) EA4.2 (25,3 g) EA4.1.1-3 EA4.1.4 (8,1 g) (6,4 g) EA4.3 (15,2 g) Ghi chú: EA: ethyl acetat Ac: aceton C: chloroform M: methanol W: nước CC/B 39 (6,1 mg) (30,1 mg) 40 (9,9 mg) 42 (79,7 mg) Hệ dung môi A Hệ dung môi B Hệ dung môi C Hệ dung môi D Hệ dung môi E H:EA:AcOH C:EA:Ac C:EA:Ac:AcOH H:EA:AcOH H:EC:A Sơ đồ Sơ đồ phân lập hợp chất từ địa y từ Roccella sinensis Methanol (50,4 g) CC/D pTLC/E EA2.1.2 EA2.1.3 (2,5 g) (10,2 g) CC/B pTLC/C Methanol CC/H:A:AcOH 7:3:0.02-0:10:0.02 CC/H:A:AcOH 9:1:0.02-0:10:0.02 CC/B EA1.2.1 (0,3 g) (70-100%) EA1.3 (1,1 g) EA2.1 (22,1 g) EA2.2 (33,9 g) EA4.1 (16,1 g) CC/B EA1.1.3 (1,2 g) (40%) 9:1:0.05 9:1:3 9:1:3:0.02 7:3:0.02 1:1:1 II NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN Phần tổng quan luận án trình bày về:  Định nghĩa, ứng dụng, hoạt tính sinh học sinh tổng hợp hợp chất địa y  Tổng kết công trình nghiên cứu nước giới hóa học hoạt tính sinh học loài địa y thuộc chi Parmotrema chi Roccella CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1 Hóa chất, thiết bị Phần mô tả chi tiết hóa chất thiết bị sử dụng cho nghiên cứu 2.2 Nguyên liệu Phần mô tả chi tiết nguyên liệu, mẫu địa y sử dụng cho nghiên cứu 2.3 Trích ly cô lập hợp chất Phần mô tả chi tiết trình trích ly cô lập hợp chất từ bốn loài địa y sử dụng cho nghiên cứu 2.4 Thử nghiệm hoạt tính sinh học Hoạt tính gây độc tế bào kháng lại dòng tế bào ung thư (Hela, MCF-7, HepG2 NCIH460) mẫu hợp chất tinh thực nồng độ 100 µg/mL, sử dụng chất nhuộm Sulforhodamine B (SRB) chất chứng dương camptothecin Mẫu gửi thử nghiệm Bộ môn Di truyền Khoa Sinh Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên 227 đường Nguyễn Văn Cừ Quận 5, TP Hồ Chí Minh CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất cô lập Từ bốn loài địa y khảo sát trình bày chương 2, cô lập 49 hợp chất, có 15 hợp chất Cấu trúc hóa học hợp chất cô lập xác định cách phân tích liệu phổ nghiệm IR, MS, 1D 2D–NMR, đo lực triền quang nhiệt độ nóng chảy, kết hợp so sánh với số liệu tài liệu tham khảo, trình bày chi tiết luận án proton nhóm methyl thứ hai ( 2.62, H3-9') với carbon  115.6 (C-1'), 131.6 (C-5'), 139.6 (C-6'), 162.2 (C-2'), 170.6 (C-7') Hai tương quan 4J H3-9' giúp xác định vị trí lân cận nhóm methyl nhóm carboxyl vòng B Vì thế, vòng B 38 xác định 2',4',5'-trihydroxy-3'-hydroxymethylene-6'-methyl-1'-carbonyl Trong trình xác định cấu trúc 38, nhận thấy liệu phổ 38 có tương đồng với liệu phổ acid protocetraric (Brandao L F G et al., 2013 [10]) Tuy nhiên, so sánh chi tiết liệu phổ 13C NMR 38 acid protocetraric cho thấy có khác tín hiệu thuộc vòng B chúng, cụ thể với carbon C-2' (C = +7.8), C-5' (C = 10.3), C-6' (C = +10.3) chúng đo dung môi DMSO-d6 Sự thay đổi liệu phổ 13C xuất phát từ thay đổi vị trí nhóm nhân thơm B Kết hợp tất liệu phổ MS, 1D 2D-NMR giúp xác định nhân B 38, nhóm methyl tráo đổi vị trí với nhóm hydroxymethylene Ngoài ra, từ phân tích lân cận nhóm methyl nhóm carboxyl giúp xác định nhóm carboxyl tráo đổi vị trí với nhóm hydroxyl, so sánh với acid protocetraric, para-depsidone biết Như vậy, 38 đề nghị meta-depsidone, đặt tên parmosidone A, với công thức trình bày hình 3.5 Hình 3.5: Một số tương quan HMBC 31, 37, 38 10 Bảng 3.3: Dữ liệu phổ NMR 29-31, 37-38 29a N 1' 2' 3' 4' 5' 6' 7' 8' 9' 7'OCH3 δH, J (Hz) 6.83 (s) 10.59 (s) 2.43 (s) 4.60 (s) 2.40 (s) 30a δC 112.4 161.2 111.8 163.8 117.0 152.0 163.9 191.7 21.3 116.6 155.0 118.6 144.5 141.7 129.4 170.1 52.9 14.3 δH, J (Hz) 6.84 (s) 10.58 (s) 2.42 (s) 4.50 (s) 2.40 (s) 3.22 (s) 31a δC 112.5 161.5 112.5 164.4 117.6 152.2 164.6 192.0 21.8 116.5 155.9 116.3 146.0 142.6 131.4 170.8 62.8 15.0 δH, J (Hz) 6.80 (s) 10.62 (s) 2.42 (s) 2.07 (s) 2.57 (s) 37b 38b δCb 113.8 164.9 111.6 164.9 116.8 151.9 162.0 192.2 21.4 116.8 162.0 115.0 143.7 128.9 139.9 nd 9.1 14.1 δH, J (Hz) 6.78 (s) 10.61 (s) 2.41 (s) 4.49 (s) 2.62 (s) δC 112.5 161.9 111.6 164.1 116.7 151.9 162.2 192.2 21.4 115.6 162.2 117.5 143.8 131.6 139.6 170.6 52.5 14.2 δH, J (Hz) 2.23 (s) 112.6 150.7 132.2 150.8 114.4 133.7 163.3 19.9 4.46 (s) 2.77 (s) 115.1 163.3 116.6 144.0 132.2 139.9 170.9 52.9 14.2 6.54 (s) 57.9 10.27 (s) 8.85 (s) Tất phổ NMR đo DMSO-d6: a 500 MHz, b 400 MHz, nd: không xác định 11 δC Parmoether A (33) Hợp chất 33 cô lập dạng vô định hình, màu trắng Phổ HR-ESI-MS giúp xác định công thức phân tử 33 C28H28O11, có nguyên tử oxygen có nhiều nguyên tử hydrogen so sánh với 34 Phổ 1H-NMR kết hợp với phổ HSQC 33 cho thấy diện 15 tín hiệu singlet, bao gồm nhóm aldehyde (δ 10.31), hai proton nhân thơm (δ 6.55 6.11), hai nhóm methoxy (δ 3.06 3.78), nhóm methylene (δ 3.78), bốn nhóm methyl (δ 2.35, 2.08, 1.98, 1.89), năm nhóm hydroxy (δ 11.94, 9.89, 9.62, 9.23 8.82) Phổ 13 C- NMR cho thấy diện 28 carbon bao gồm nhóm aldehyde (δ 194.4), hai nhóm carboxyl ester (δ 170.6 165.4), 18 carbon nhân thơm cộng hưởng vùng 162-107 ppm, có hai nhóm methine δ 111.7, 107.3 Ở vùng từ trường cao, phổ 13CNMR cho thấy hai nhóm methoxy (δ 51.6 51.3), nhóm methylene (δ 20.4), bốn nhóm methyl (δ 19.9, 17.5, 16.1 8.9) So sánh liệu phổ NMR MS 33 34 cho thấy 33 chứa ba nhân thơm carbon carboxyl chứa nhiều nhóm methoxy nhóm methine nhân thơm Trên vòng A, phổ HMBC (Hình 3.8) cho thấy tương quan H-5 δ 6.55 với carbon δ 113.7 (C-1), 109.7 (C-3), 162.3 (C-4), 19.9 (C-9); H3-9 δ 2.08 với C-1, C-2, C-3, nhóm aldehyde δ 10.31 (H-8) 4-OH δ 11.94 với C-3, C-4, C-5 Những tương quan giúp xác định hợp chất 33 phải sở hữu đặc điểm cấu trúc vòng A tương tự atranorin (2), hay vòng A hợp chất 29, 31, 37, 38 Tuy nhiên, khác biệt rõ rệt độ dịch chuyển hóa học 1H NMR proton thơm (H-5), proton aldehyde (H-8), proton nhóm methyl (H3-9) 33 so sánh với nhóm tương tự hợp chất 29, 31, 37, 38 chúng đo dung môi DMSO-d6 (Bảng 3.5), có thay đổi khung sườn vòng A 33 dẫn chứng chứng tỏ 33 depsidone Cụ thể, vòng lactone bảy cạnh hợp chất 29, 31, 37, 38 bị mở vòng để thành nhóm methoxycarbonyl gắn C-1 nhân A nhóm hydroxyl gắn C-4' nhân B Hơn đặc điểm cấu trúc xác định tương quan HMBC nhóm methoxy δ 3.06 với carbon carboxyl δ 165.4 Vì thế, 33 phải có cấu trúc diphenyl ether 12 Bảng 3.5: Dữ liệu phổ NMR 25, 32, 33 33 (DMSO-d6)a NO 1' 2' 3' 4' 5' 6' 7' 8' 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6'' 7'' 8'' 9'' 7-OCH3 7''-OCH3 4-OH 2'-OH 4'-OH δH 6.54 (1H, s) 10.31 (1H, s) 2.08 (3H, s) 3.08 (3H, s) 6.11 (1H, s) 3.77 (2H, s) 1.89 (3H, s) 1.97 (3H, s) 2.35 (3H, s) 3.08 (3H, s) 3.77 (3H, s) 11.94 (1H, s) 9.89 (1H, s) 9.23 (1H, s) 2''-OH 9.61 (1H, s) 4''-OH 8.82 (1H, s) δC 113.7 157.4 109.7 162.3 111.7 146.5 165.4 194.4 19.9 107.3 151.9 112.1 148.0 134.0 128.4 20.4 16.1 111.7 154.2 109.0 156.1 118.0 134.5 170.6 8.9 17.5 51.3 51.6 32 (Acetone-d6)b δH 6.53 (1H, s) 10.42 (1H, s) 2.16 (3H, s) 6.22 (1H, s) 3.99 (2H, s) 1.95 (3H, s) 10.32 (1H, s) 2.56 (3H, s) 3.28 (3H, s) 3.94 (3H, s) 12.11(1H, s) 25 (CDCl3)b δC 115.4 153.6 110.8 164.4 113.1 148.3 166.3 195.6 20.0 108.7 151.3 112.7 148.3 134.0 129.5 20.5 16.7 108.4 158.7 106.5 164.6 121.2 149.4 171.9 194.8 20.0 51.9 52.7 δH 6.53 (1H, s) 10.32 (1H, s) 2.21 (3H, s) 6.27 (1H, s) 3.85 (2H, s) 1.98 (3H, s) 6.30 (1H, s) 6.30 (1H, s) δC 115.1 158.3 110.2 164.0 114.0 145.8 167.3 193.6 20.8 110.4 151.5 112.8 147.3 136.1 129.1 17.5 16.9 109.8 154.3 110.8 154.3 109.8 139.0 2.18 (3H, s) 21.3 3.23 (3H, s) 12.03 (1H, s) 52.2 Phổ NMR ghi a 400 MHz, b 500 MHz Sự so sánh liệu NMR 33 34 cho thấy vòng C 33 dẫn xuất methyl -orsellinate Hơn nữa, đặc điểm cấu trúc tái xác định phổ HMBC 33 (Hình 3.8) với tương quan nhóm H3-8'' δ 1.98 với carbon δ 109.0 (C3''), 154.2 (C-2''), 156.1 (C-4''); H3-9'' δ 2.35 với carbon δ 111.7 (C-1''), 13 118.0 (C-5''), 134.5 (C-6''); 2''-OH δ 9.62 với carbon δ 111.7 (C-1''), 154.2 (C-2''), 109.0 (C-3'') nhóm methoxy δ 3.78 (7''-OCH3) với carbon carboxyl δ 170.6 Như vậy, vòng A C 33 xác định Vì thế, so sánh với hợp chất 34, biến carbon carboxyl đồng thời với xuất nhóm methine thơm 33 vòng B giúp suy thay nhóm carbonyl nhóm methine 33 Trên vòng B, tương quan HMBC H-1' δ 6.11 với carbon δ 151.9 (C-2'), 134.0 (C-5'), 112.1 (C-3'), 16.1 (C-8') H3-8' δ 1.89 với carbon δ 107.3 (C-1'), 128.4 (C-6'), 134.0 (C-5') Ngoài ra, tương quan NOESY giúp xác định lân cận H-1' H3-8' Proton H2-7' δ 3.78 cho tương quan HMBC với carbon δ 112.1 (C-3'), 148.0 (C-4'), 151.9 (C-2') vòng B, với carbon δ 118.0 (C-5''), 134.5 (C-6''), 156.1 (C-4'') vòng C Vì thế, vòng C phải kết nối với vòng B thông qua carbon nhóm methylene (C-7') Dựa vào đặc điểm trên, cấu trúc phù hợp 33 dẫn xuất ether xuất phát từ acid furfuric (một para-depsidone) (Cấu trúc 33x, Hình 3.8) hay dẫn xuất parmosidone C (một meta-depsidone) (cấu trúc 33y, Hình 3.8) May mắn thay, tương quan HMBC hai nhóm hydroxyl δ 9.89 (2'-OH) 9.23 (4'-OH) nhóm methylene δ 3.78 (H2-7') với carbon δ 112.1 (C-3') giúp xác định cấu trúc 33 dẫn xuất acid furfuric với vòng bảy cạnh bị mở với nhóm carboxyl nhân B Như vậy, cấu trúc hoá học 33 xác định trình bày hình 3.8 đặt tên parmoether A Hình 3.8: Một số tương quan HMBC NOESY 25, 32, 33 14 Montagnetol A (41) Hợp chất 41 cô lập dạng bột màu trắng Công thức phân tử xác định C12H14O6, dựa phổ HR-ESI-MS (tại m/z 277.0739 [M-H]-, với tính toán 277.0688), chứa độ bất bão hòa Phổ 1H NMR kết hợp với phổ 13C HSQC cho thấy diện nhóm methyl H3-8' (δH 2.50, δC 24.2) hai nhóm methine ghép meta với nhau, CH-3' (δH 6.23, d, 2.0 Hz; δC 101.6) CH-5’ (δH 6.27, d, 2.0 Hz; δC 112.3), tương ứng cho đơn vị orsellinyl (C8H7O4) tín hiệu đơn vị butanetetraol, bao gồm hai nhóm methylene sp3 mang oxygen, CH2-1 (δH 4.10, dd, 10.0, 5.5 Hz, H-1a; δH 3.94, dd, 10.0, 4.0 Hz, H-1b; δC 72.7) CH2-4 (δH 4.00, dd, 9.0, 6.0 Hz, H-4a; δH 3.70, dd, 9.0, 6.0 Hz, H-4b; δC 75.4) hai nhóm methine sp3 mang oxygen, CH-2 (δH 5.45, m; δC 70.9) CH-3 (δH 4.59, m; δC 71.0) Những đặc điểm cấu trúc tương đồng với liệu hợp chất D-(+)-montagnetol (43) Độ dịch chuyển hóa học H-2 (5.45, m) dời vùng từ trường thấp giúp xác định đơn vị orsellinyl C-2, tái xác định nhờ tương quan HMBC H-2 với C-7' Kết hợp với công thức phân tử, 41 sở hữu nhiều độ bất bão hòa so với 43 với việc đơn vị H2O giúp xác định đóng vòng hai nhóm hydroxyl tạo thành ether 41 so sánh với 43 Ngoài ra, proton H-1 cho tương quan HMBC với C-4 ngược lại, củng cố khung sườn tetrahydrofuran 41 Hình 3.14: Một số tương quan HMBC, NOESY 41 Trong trường hợp 41, số ghép tương quan NOESY không đủ tin cậy để xác định hóa lập thể 41, thế, ảnh hưởng nhóm cyclopentane (Edwards D M., 1992) [22] vận dụng để xác định hóa lập thể 41 Về nguyên tắc, proton không tương đương diastereotopic nhóm methylene sở hữu độ dịch chuyển hóa học 1H khác Cụ thể hơn, proton vị trí cis với nhóm chuyển dịch vùng từ trường cao so với tương quan cis với proton khác Trong trường 15 hợp 41, proton vùng từ trường cao H-1b (δH 3.94) H-4b (δH 3.70) phải phía với nhóm 2-OPh 3-OH Ngoài ra, proton H-1b H-4b cho tương quan NOESY với nhóm methyl 6'-CH3, củng cố vị trí cis H-1b H-4b Những nhận định giúp xác định proton H-1a, H-2, H-3, H-4a phải phía với khác phía với nhóm 2-OPh 3-OH Như vậy, cấu trúc 41 xác định trình bày hình 3.14 hợp chất đặt tên montagnetol A Montagnetol D (48) Hợp chất 48 cô lập dạng bột vô định hình, màu trắng Công thức phân tử xác định C20H22O10 dựa phổ HR-ESI-MS (mũi ion phân tử giả [M-H]- m/z 421.1128, với giá trị tính toán 421.1133) Phổ 1H 13C NMR 48 tương đồng với liệu 43, ngoại trừ diện thêm đơn vị thơm orsellinyl Tín hiệu hai đơn vị orsellinyl giống trao đổi phân biệt phần nhờ phổ NOESY (Hình 3.15) Các tương quan NOESY H-2 H-3 với H3-8'' (δH 2.41), H3-8'' với H-5'' (δH 6.25) giúp xác định rõ độ dịch chuyển hóa học 1H hai đơn vị orsellinyl Tuy nhiên, độ dịch chuyển hóa học 13C chúng phân biệt Ngoài ra, proton H-2 vùng từ trường thấp (δH 5.67, dd, 7.0 Hz, 2.5 Hz) H-3 (δH 4.12, m) so với proton H-2 43 [δH 4.00 (H-2) 3.72 (H-3)] giúp xác định vị trí đơn vị orsellinyl C-2 Đặc điểm củng cố nhờ tương quan HMBC H-2 với C-7'' (δC 171.9) H-1 với C-7' (δC 172.4) Hình 3.15: Một số tương quan HMBC NOESY 48 Cấu hình tương đối hai tâm bất đối xứng C-2 C-3 xác định cấu hình erythro dựa số ghép J2,3 7.0 Hz H-2 H-3, tương tự với 43 Vì vậy, cấu trúc 48 xác định Hình 3.13, đặt tên montagnetol D 16 Hopan-6α,16α,22-triol (15) Hợp chất 15 cô lập dạng chất bột vô định hình, màu trắng công thức phân tử xác định C30H52O3, dựa mũi ion phân tử giả m/z 483.3829 (tính toán cho C30H52O3+Na, 483.3814) Phổ 1H NMR cho thấy diện tám nhóm methyl mũi đơn  1.15 (s, H3-23), 1.01 (s, H3-24), 0.90 (s, H3-25), 1.04 (s, H3-26), 1.37 (s, H327), 1.11 (s, H3-28), 1.13 (s, H3-29), 1.38 (s, H3-30), hai nhóm methine mang nhóm hydroxyl  3.89 (td, J = 10.5, 4.0 Hz, H-6) 4.64 (m, H-16) Phân tích phổ 13 C NMR HSQC 15 cho thấy diện 30 carbon, bao gồm carbon tứ cấp C 72.9 (C-22), hai nhóm methine mang oxygen C 69.8 (C-16) 69.5 (C-6), năm carbon tứ cấp khác, nhóm methine, nhóm methylene, nhóm methyl (Bảng 3.14) Phổ 1H 13C NMR vòng A B cho thấy tương đồng với liệu leucotylin (16) hay zeorin (11) Nhóm methine H-5 (H 0.86, d, J = 11.0 Hz) cho tương tác spin-spin 1,3-nhị trục 1H-1H với nhóm methine mang oxygen (H 3.89, dt, J = 10.5, 4.0, H-6), từ giúp suy nhóm hydroxyl C-6 định hướng α Vị trí nhóm oxymethine thứ hai H16 xác định dựa phân tích phổ COSY HMBC Những tương quan HMBC quan trọng H-16 với C-14, C-15, C-18; H-17 với C-16, C-18, C-21, C-28; H-21 với C-17, C-18, C-20 C-22, kết hợp với tương quan 1H-1H COSY H-15/H16/H-17/H-21 giúp xác định nhóm hydroxyl C-16 (Hình 3.22) Sự so sánh liệu phổ 15 leucotylin cho thấy chúng tương đồng, ngoại trừ tín hiệu vòng D E Những khác biệt quan trọng chuyển dời vùng từ trường thấp nhóm oxymethine C-16 số ghép cặp proton So sánh độ dịch chuyển hóa học H-16 15 với leucotylin cho thấy proton H-16 15 vị trí xích đạo dựa hiệu ứng bất đẳng hướng cyclohexane (Eliel E L Wilen S H., 1994 [18], xem Hình 3.22) Phân tích ghép cặp proton H-16 cho thấy diện giá trị số ghép nhỏ J = 2.5 Hz 4.0 Hz, tượng trưng cho giá trị Jee Jae H-16 H-17 H-16 H2-15 Cấu hình tương đối 15 xác định nhờ tương quan NOESY Những tương quan NOESY quan trọng phía β vòng H-16 với Hβ15, H-17, H3-29 H-21 với H-17, H3-29, H3-30, củng cố lân cận không gian chúng (Hình 3.22) Vì vậy, 15 xác định hopane-6α,16α,22-triol, hợp chất hopane 17 Hình 3.22: Một số tương quan COSY, HMBC cấu trúc hoá lập thể 15 3.2 HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO ĐỐI VỚI BỐN DÒNG TẾ BÀO UNG THƢ Thử hoạt tính gây độc bốn dòng tế bào ung thư vú (MCF–7), ung thư cổ tử cung (HeLa), ung thư phổi (NCI-H460) ung thư gan (HepG2) theo phương pháp SRB 16 hợp chất cô lập được, có hợp chất Kết cho thấy hợp chất 6αacetoxyhopan-16β,22-diol (13), hopan-6α,16α,22-triol (15), parmosidone C (34), parmoether B (32), montagnetol F (48) có hoạt tính gây độc với dòng tế bào với phần trăm ức chế I từ 6090% Giá trị IC50 xác định hợp chất 6αacetoxyhopan-16β,22-diol (13), montagnetol F (48), parmosidone D (35), parmoether B (32) (xem Bảng 3.18 3.19) Bảng 3.18 : Phần trăm ức chế phát triển dòng tế bào ung thư hợp chất cô lập No Phần trăm ức chế (I %)b Hợp chấta) HeLac 10 11 12 13 14 15 16 Acid orsellinic (5) Acide gyrophoric (7) Methyl lecanortạie (8) 2,4-Dihydroxyphtalide (9) 6α-Acetoxyhopan-16β,22-diol (13) Hopan-6α,16α,22-triol (15) Leucotylin (16) D-Montagenetol (43) D-Erythrin (44) Montagnetol A (51) Montagnetol E (45) Parmosidone A (38) Parmosidone C (34) Parmosidone D (35) Parmoether A (33) Parmoether B (32) Camptothecin (positive control)c) NCI-H460c 7.74±3.99 9.54±3.14 21.09±2.73 10.89±0.76 19.07±5.07 28.63±3.57 58.23.3 MCF-7c HepG2c 12.13±0.99 - -5.06±5.02 - 71.35±1.09 88.10±1.33 80.99±3.31 95.18±0.61 28.85±0.79 20.09±1.75 25.53±3.58 35.25±2.70 8.77 ± 0.31 19.66 ± 3.63 29.89 ± 0.95 50.67 ± 1.67 41.02 ± 6.99 85.51 ± 0.98 77.60.6 88.99±2.43 51.00±2.60 41.68±3.91 26.71±1.87 29.45±5.82 31.89±4.33 66.75±3.42 79.11±3.47 41.22.4 31.04±4.36 45.56±3.13 -7.18±2.24 3.57 ± 1.23 62.56±2.68 59.36±1.91 84.73±0.68 52.270.58 a) Nồng độ thử nghiệm hợp chất 100 μg/mL b) Dữ liệu tính từ ba thử nghiệm ± S.D c) Camptothecin sử dụng chất chứng dương với nồng độ 0.01 μg/mL cho MCF-7 NCI-H 460, 0.07 μg/mL cho HepG2, với μg/mL cho HeLa 18 Bản 3.19 : Giá trị IC50 (μg/mL) dòng tế bào hợp chất 13, 32, 35, 48 No Hợp chấta) HeLa 6α-Acetoxyhopan-16β,22-diol (13) Montagnetol F (48) Parmosidone D (35) Parmoether B (32) 40.95 ± 0.50 - Dòng tế bào NCI-H460 MCF-7 77 86 ± 5.61 47.08±2.64 44.85 ± 1.31 28.86±1.46 63.91±2.28 20.21 ± 1.30 12.37±2.00 HepG2 52.67±2.82 24.78±4.06 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 4.1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC Khảo sát hóa học bốn loài địa y thu hái miền nam Việt Nam cô lập 15 hợp chất 34 hợp chất biết Trong số 34 hợp chất biết, hợp chất lần tìm thấy chi Parmotrema hợp chất lần tìm thấy chi Roccella Cấu trúc hóa học hợp chất xác định phương pháp phổ nghiệm so sánh với liệu tài liệu tham khảo  Hợp chất đơn vòng: hợp chất đơn vòng cô lập, bao gồm 1, 3, 4, 5, 9, 10 Hợp chất 10 lần tìm thấy chi Parmotrema  Depside: depside cô lập, bao gồm hợp chất 2, 6-8, 40 Hợp chất 40 lần tìm thấy chi Roccella  Depsidone: depsidone cô lập, bao gồm hợp chấtt 29-31, 36-38 với hợp chất biết 29-30 36 ba hợp chất 31, 37-38 Ba hợp chất chứa khung meta-depsdione  Dẫn xuất acid furfuric: dẫn xuất acid furfuric cô lập, bao gồm 25, 3235 Tất hợp chất hợp chất  Diphenyl ether: hợp chất diphenyl ether cô lập, bao gồm 21-23 Hai hợp chất 22 23 tìm thấy lần chi Parmotrema  Dẫn xuất erythritol: dẫn xuất erythritol cô lập từ địa y Roccella sinensis, có ba hợp chất biết 42-44, sáu hợp chất 41, 45-49 Các hợp chất 46 47 đề nghị chất giả tạo 43 trình cô lập sử dụng acetone làm dung môi Hợp chất 42 lần tìm thấy chi Roccella  Các steroid triterpenoid: sterol triterpene cô lập, hầu hết từ địa y Parmotrema sancti-angelii Hai sterol 17-18 thuộc khung sườn ergostane tìm 19 thấy lần chi Parmotrema Tát triterpene 11-16 dẫn xuất zeorin (11) sở hữu khung hopane, 15 hợp chất Ngoại trừ 11, hợp chất khác lần tìm thấy chi Parmotrema  Các hợp chất mang khung sƣờn khác: gồm có hợp chất khung indole 39, alditol 24 26, acid béo 20, 27, 28, anthraquinone 19 Hợp chất 39 lần tìm thấy chi Roccella Hai hợp chất alditol 24 26 lần tìm thấy chi Parmotrema Hợp chất đơn vòng Depside 20 Depsidone Dẫn xuất acid furfuric 21 Diphenyl ether Dẫn xuất erythritol 22 Các sterol triterpene Các hợp chất khung sƣờn khác 4.2 HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO ĐỐI VỚI BỐN DÒNG TẾ BÀO UNG THƢ Mười sáu hợp chất thử nghiệm hoạt tính gây độc bốn dòng tế bào ung thư vú (MCF–7), ung thư cổ tử cung (HeLa), ung thư phổi (NCI-H460) ung thư gan (HepG2) theo phương pháp SRB Kêt cho thấy hợp chất 6α-acetoxyhopan-16β,22-diol (13), hopan-6α,16α,22-triol (15), parmosidone C (34), parmoether B (32), montagnetol F (48) có hoạt tính gây độc với dòng tế bào với phần trăm ức chế I từ 6090% Giá trị IC50 xác định hợp chất 6α-acetoxyhopan-16β,22-diol (13), montagnetol F (48), 23 parmosidone D (35), parmoether B (32) (xem Bảng 3.18 3.19) Hợp chất 32 sở hữu hoạt tính trung bình với giá trị IC50 36.53 ± 2.35, 22.36 ± 3.61, 44.80 ± 7.34 µM ba dòng tế bào ung thư NCI-H460, MCF-7, HepG2 hợp chất lại hoạt tính Các hƣớng nghiên cứu tiếp theo: Tiếp tục khảo sát phân đoạn lại cao trích tiếp tục thử hoạt tính gây độc tế bào hợp chất lại DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN [1] Dương Thúc Huy, Warinthorn Chavasiri, Joel Boustie, Nguyễn Kim Phi Phụng (2015), New meta-depsidones diphenyl ethers from the lichen Parmotrema tsavoense (Krog & Swinscow) Krog & Swinscow, Parmeliaceae, Tetrahedron, 71, 96849691 [2] Dương Thúc Huy, Trần Thị Thanh Thủy (2014), Collatolic acid derivatives from lichen Parmotrema planatilobatum (Hale) Hale (Parmeliaceae), Tạp chí Khoa Học (Đại Học Sư Phạm TP Hồ Chí Minh), 64, 3541 [3] Dương Thúc Huy, Huỳnh Bùi Linh Chi, Hà Xuân Phong, Tưởng Lam Trường, Tôn Thất Quang, Joel Boustie, Nguyễn Kim Phi Phụng (2012), New diphenyl ether from the lichen Parmotrema planatilobatum (Hale) Hale (Parmeliaceae), Tạp chí Hoá học, 50(4A), 199202 [4] Dương Thúc Huy, Huỳnh Bùi Linh Chi, Hà Xuân Phong, Tôn Thất Quang, Nguyễn Kim Phi Phụng (2011), Some phenolic compounds of the lichen Parmotrema planatilobatum (Hale) Hale (Parmeliaceae), Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ, 14(6), 510 24 [...]... 24.78±4.06 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 4.1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC Khảo sát hóa học của bốn loài địa y thu hái ở miền nam Việt Nam đã cô lập được 15 hợp chất mới và 34 hợp chất đã biết Trong số 34 hợp chất đã biết, 9 hợp chất lần đầu tiên được tìm th y trong chi Parmotrema và 3 hợp chất lần đầu tiên được tìm th y trong chi Roccella Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác... của 15 và leucotylin cho th y chúng rất tương đồng, ngoại trừ những tín hiệu trên vòng D và E Những khác biệt quan trọng là sự chuyển dời về vùng từ trường thấp của nhóm oxymethine tại C-16 và hằng số ghép cặp của proton n y So sánh độ dịch chuyển hóa học của H-16 của 15 với leucotylin cho th y proton H-16 của 15 có thể ở vị trí xích đạo dựa trên hiệu ứng bất đẳng hướng của cyclohexane (Eliel E L và Wilen... trừ sự hiện diện của thêm một đơn vị thơm orsellinyl Tín hiệu của hai đơn vị orsellinyl rất giống nhau và có thể trao đổi nhưng có thể phân biệt một phần nhờ phổ NOESY (Hình 3.15) Các tương quan NOESY của H-2 và H-3 với H3-8'' (δH 2.41), cũng như của H3-8'' với H-5'' (δH 6.25) giúp xác định rõ độ dịch chuyển hóa học 1H của hai đơn vị orsellinyl Tuy nhiên, độ dịch chuyển hóa học 13C của chúng thì không... nhóm hydroxymethylene tại δ 4.49 (2H, s) và hai nhóm methyl tại δ 2.41 và 2.62 (mỗi nhóm 3H, s) Phổ 13C NMR và HSQC của 38 (Bảng 3.3) cho th y sự hiện diện của 18 carbon bao gồm một nhóm formyl ( 192.2), hai nhóm carbonyl ( 170.6 và 162.2), 12 carbon nhân thơm, trong đó có 5 carbon mang oxygen cộng hưởng trong vùng 164111 ppm, một carbon oxymethylene tại  52.5 và hai nhóm methyl tại  21.4 và 14.2... nhóm methyl và nhóm carboxyl trên vòng B Vì thế, vòng B của 38 được xác định là 2',4',5'-trihydroxy-3'-hydroxymethylene-6'-methyl-1'-carbonyl Trong quá trình xác định cấu trúc của 38, chúng tôi nhận th y dữ liệu phổ của 38 có sự tương đồng với dữ liệu phổ của acid protocetraric (Brandao L F G et al., 2013 [10]) Tuy nhiên, sự so sánh chi tiết dữ liệu phổ 13C NMR của 38 và acid protocetraric cho th y có... hydroxyl tại C-6 ở định hướng α Vị trí của nhóm oxymethine thứ hai H16 được xác định dựa trên phân tích phổ COSY và HMBC Những tương quan HMBC quan trọng của H-16 với C-14, C-15, và C-18; của H-17 với C-16, C-18, C-21, và C-28; và của H-21 với C-17, C-18, C-20 và C-22, kết hợp với tương quan 1H-1H COSY của H-15/H16/H-17/H-21 giúp xác định nhóm hydroxyl tại C-16 (Hình 3.22) Sự so sánh dữ liệu phổ của. .. phân tử của 33 là C28H28O11, trong đó có ít hơn một nguyên tử oxygen và có nhiều hơn 4 nguyên tử hydrogen khi so sánh với 34 Phổ 1H-NMR kết hợp với phổ HSQC của 33 cho th y sự hiện diện của 15 tín hiệu singlet, bao gồm một nhóm aldehyde (δ 10.31), hai proton nhân thơm (δ 6.55 và 6.11), hai nhóm methoxy (δ 3.06 và 3.78), một nhóm methylene (δ 3.78), bốn nhóm methyl (δ 2.35, 2.08, 1.98, và 1.89), và năm... và C-3, và của nhóm aldehyde tại δ 10.31 (H-8) và 4-OH tại δ 11.94 với C-3, C-4, và C-5 Những tương quan n y giúp xác định hợp chất 33 phải sở hữu đặc điểm cấu trúc vòng A tương tự như atranorin (2), hay vòng A của các hợp chất 29, 31, 37, và 38 Tuy nhiên, những khác biệt rõ rệt trong độ dịch chuyển hóa học 1H NMR của proton thơm (H-5), proton aldehyde (H-8), và proton nhóm methyl (H3-9) của 33 khi... (4'-OH) cũng như của nhóm methylene tại δ 3.78 (H2-7') với cùng carbon tại δ 112.1 (C-3') giúp xác định cấu trúc của 33 là dẫn xuất của acid furfuric với vòng b y cạnh bị mở và với sự mất đi của một nhóm carboxyl trên nhân B Như v y, cấu trúc hoá học của 33 được xác định như trình b y trong hình 3.8 và được đặt tên là parmoether A Hình 3.8: Một số tương quan HMBC và NOESY của 25, 32, và 33 14 Montagnetol... của 41, hằng số ghép cũng như tương quan NOESY không đủ tin c y để xác định hóa lập thể của 41, vì thế, những ảnh hưởng của nhóm thế trên cyclopentane (Edwards D M., 1992) [22] được vận dụng để xác định hóa lập thể của 41 Về nguyên tắc, các proton không tương đương diastereotopic của nhóm methylene sở hữu độ dịch chuyển hóa học 1H khác nhau Cụ thể hơn, một proton vị trí cis với một nhóm thế sẽ chuyển