Phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh vật (biofilm) và bước đầu định hướng ứng dụng xử lý ô nhiễm nước thải

1.2. Khả năng tồn tại của màng sinh vật Màng sinh vật phát triển mạnh ở những nơi có nƣớc, chẳng hạn nhƣ trong nhà bếp, kính áp tròng và thậm chí trong cơ thể sinh vật. Khi hệ thống mạng lƣới sinh vật phát triển đầy đủ, có thể quan sát thấy bằng mắt thƣờng. 1.2.1. Trong môi trƣờng tự nhiên Trong các rừng mƣa nhiệt đới điều kiện độ ẩm cao là điều kiện thuận lợi cho sự phát triển phong phú của màng sinh vật nhƣ rêu và những cặn bám dƣới đáy ao Khóa luận tốt nghiệp Đoàn Diệu Linh 4 K53A Sinh học hồ, hay những mảng rêu địa y bám trên thân cây, hay những váng nổi trên bề mặt ao, hồ… (Hình 2A) Màng sinh vật còn có thể đƣợc tìm thấy ở sa mạc. Một trong những hình thức phổ biến của dạng màng sinh vật sa mạc đƣợc gọi là vec-ni sa mạc (varnish desert), một thuật ngữ mô tả hiện tƣợng những hòn đá vách núi có màng sinh vật phát triển xuất hiện những vết màu. Màng sinh vật cũng có thể đƣợc tìm thấy phát triển trong môi trƣờng cực trị nhƣ sông băng ở Nam Cực, hay các mạch suối nƣớc nóng… Đối với thực vật, một số loài thực vật cộng sinh với vi khuẩn có trong màng sinh vật bám ở rễ cây. Rễ cây tiết ra một lƣợng đáng kể các loại đƣờng, axit amin, vitamin… nhƣ là chất dinh dƣỡng cho các màng sinh vật. Ngƣợc lại, màng sinh vật tạo điều kiện thuận lợi cho khả năng hấp thụ chất dinh dƣỡng của thực vật [39]. 1.2.2. Trong các vật liệu, hệ thống Trong khi màng sinh vật đối với tự nhiên mang nhiều yếu tố tích cực thì đối với công nghiệp, màng sinh vật lại là nguyên nhân của nhiều vấn đề tiêu cực nhƣ sự ô nhiễm và tắc nghẽn màng sinh vật (biofouling) xảy ra gần nhƣ ở tất cả những khâu xử lý trong công nghiệp có liên quan đến việc sử dụng nƣớc nhƣ hoạt động làm mát, sản xuất bột giấy… Màng sinh vật là nguyên nhân gây ra hiện tƣợng tắc ống dẫn ăn mòn ống dẫn và làm ô nhiễm nguồn nƣớc. Trong các vật dụng hàng ngày cũng có sự xuất hiện của màng sinh vật. Những mảng bám trên vòi hoa sen, bồn rửa mặt, sự tắc nghẽn đƣờng ống nƣớc là những ví dụ cho sự có mặt của màng sinh vật (Hình 2B) [39]. 1.2.3. Trong y tế và cơ thể sinh vật Trên thực tế cơ thể con ngƣời và các sinh vật nói chung là nơi tồn tại của hệ thống rất đa dạng các loài vi sinh vật. Tuy nhiên đôi khi sự mất cân bằng về hệ vi sinh vật trong cơ thể là nguyên nhân gây ra các vấn đề về nhiễm trùng. Trong đó màng sinh vật là một trong số những nguyên nhân gây ra một số bệnh nhiễm trùng mãn tính viêm tai hay thƣờng gặp nhất là trên những mảng bám răng. Thậm chí bề mặt của những dụng cụ y tế đặt trong cơ thể nhƣ van tim niệu quản nhân tạo cũng có thể là nơi phát triển của biofilm (hình 2C) [38]. Khóa luận tốt nghiệp Đoàn Diệu Linh 5 K53A Sinh học A B C Hình 2. Một số vị trí tồn tại của màng sinh vật A: Màng sinh vật phát triển trên mặt hồ B: Màng sinh vật phát triển trong hệ thống ống dẫn C: Màng sinh vật phát triển trong một số bộ phận cơ thể ngƣời 1.3. Thành phần của màng sinh vật Mạng lƣới màng sinh vật nói chung bao gồm 97% nƣớc, 2-5% là các tế bào vi khuẩn, 3-6% các hợp chất ngoại bào và các ion [36]. 1.3.1. Thành phần các hợp chất ngoại bào (EPS) Việc hình thành các hợp chất ngoại bào là điều kiện tiên quyết cho sự hình thành màng sinh vật. Mạng lƣới ngoại bào (EPS) có độ dày từ 0 2 đến 1µm. Ở một vài loài vi khuẩn độ dày của lớp EPS mỏng hơn không vƣợt quá 10 đến 30nm. Ngoài những đặc tính cấu trúc, bảo vệ và thẩm thấu EPS còn là nơi dự trữ chất dinh dƣỡng cho tế bào phát triển trong điều kiện thiếu chất dinh dƣỡng [21] . Sự phân bố của EPS trong màng sinh vật thay đổi theo không gian và thời gian. Hàm lƣợng EPS tăng theo độ dày và độ già của màng sinh vật. Màng sinh vật mỏng có lƣợng EPS thấp và giàu protein. Thành phần EPS phong phú hơn khi vào sâu trong cấu trúc màng sinh vật. Hầu nhƣ lƣợng EPS đƣợc sản sinh trong màng sinh vật cũng có nhiều điểm khác so với các vi sinh vật phù du [19]. Thành phần EPS thay đổi theo thành phần vi sinh vật và điều kiện môi trƣờng hình thành nên màng sinh vật. EPS thông thƣờng bao gồm 40-95% polysaccharide, 1-60% protein, 1-10% axit nucleic và 1-40% lipid [12]. Khóa luận tốt nghiệp Đoàn Diệu Linh 6 K53A Sinh học Bảng 1. Vai trò của các thành phần trong EPS [13] Chức năng của hợp chất ngoại bào Thành phần của EPS Chức năng trong biofilm Cấu trúc Polysaccharide trung tính Cấu tạo nên biofilm Amyloid Kênh dẫn Polysaccharide tích điện hoặc kị nƣớc Kênh dẫn ion, kênh dẫn nƣớc Hoạt hóa Các enzym ngoại bào Phân hủy các hợp chất hữu cơ Hoạt hóa bề mặt Amphiphlic Tƣơng tác bề mặt Màng bao Xuất bào, kênh dẫn nƣớc Thông tin di truyền Lectin Đặc trƣng nhận dạng Axit nucleic Thông tin di truyền, cấu trúc Hoạt hóa quá trình oxi hóa khử Hợp chất hữu cơ chịu nhiệt của vi khuẩn Thu nhận electron Chất dinh dƣỡng Các loại polymer Nguồn cung cấp cacbon, nitơ, photpho 1.3.1.1. Vai trò của protein ngoại bào Nhìn chung, thành phần protein trong EPS là tƣơng đối lớn, song vai trò của chúng trong màng sinh vật chƣa đƣợc biết đến một cách rõ ràng. Đối với một số loại vi khuẩn protein đóng vai trò là pili roi curli và sợi amyloid đƣợc cho là yếu tố quan trọng cho sự hình thành màng sinh vật. Ngoài ra, những enzym ngoại bào, thông thƣờng là protease và glycosidase trong màng biofilm, đóng vai trò trao đổi chất [33]. 1.3.1.2. Vai trò của polysaccharide ngoại bào Polysaccharide là thành phần quan trọng để tạo nên cấu trúc hoàn chỉnh biofilm. Các polysaccharide có thể rất đa dạng về các đặc tính sinh lý, sinh hóa thông qua dạng liên kết glycoside giữa các phân tử (β-1 4 β-1 3 hay α-1 6) hay đơn vị monomer cấu tạo nên. Polysaccharide có thể là các đồng phân tử cấu tạo bởi một đơn phân monosacharide duy nhất nhƣ cellulose dextran hay dị phân tử cấu tạo bởi 2 đến 4 dạng đơn phân khác nhau nhƣ alginate emulsan gellan. Các Khóa luận tốt nghiệp Đoàn Diệu Linh 7 K53A Sinh học monosaccharide phổ biến trong biofilm là D-glucose, D-galactose, D-mannose, Lfucose nhóm axit uronic nhƣ axit D-glucuronic, axit D-galacturonic. Thành phần các đƣờng đơn có ảnh hƣởng đến đặc tính của polysaccharit và qua đó ảnh hƣởng đến tính chất của biofilm [7]. 1.3.2. Thành phần tế bào Cấu trúc màng sinh vật bao gồm thành phần tế bào liên kết với nhau một cách có trật tự đảm bảo cho sự trao đổi thông tin liên tục diễn ra giữa các tế bào. Mạng lƣới chất ngoại bào quy định sự sắp xếp tế bào và tạo nên những kênh dẫn truyền nƣớc bên trong màng sinh vật. Chính nhờ cấu trúc này mà các chất dịch, nƣớc có thể lƣu thông qua màng sinh vật tạo điều kiện cho các chất dinh dƣỡng đƣợc khuếch tán, phân phối đến khắp các tế bào trong màng đồng thời loại đi những chất thải không cần thiết [23]. Màng sinh vật có thể đƣợc hình thành bởi tập hợp các tế bào của một hoặc nhiều loài vi sinh vật khác. Trong biofilm các tế bào tập hợp thành các đơn vị cấu trúc là các vi khuẩn lạc. Thành phần này đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành biofilm đặc biệt là ở giai đoạn đầu bởi nó qui định đặc tính hình thành biofilm cho từng loài vi sinh vật đảm nhiệm chức năng tiết các hợp chất ngoại bào cũng nhƣ có chứa các yếu tố phụ trợ tế bào nhƣ lông roi lông nhung hỗ trợ cho việc bám dính của các tế bào khác lên bề mặt giá thể. Giữa các tế bào trong hệ thống mạng lƣới màng sinh vật có các kênh dẫn, cho phép di truyền ngang các tính trạng mới trong quần thể sinh vật [6]. 1.4. Quá trình hình thành màng sinh vật Dựa trên các phƣơng pháp phân tích di truyền học, proteomics và sinh học phân tử, cùng với những phân tích về mặt cấu trúc, hóa học màng sinh vật, các nhà khoa học đã đƣa ra một mô hình cấu trúc màng sinh vật cơ bản [8]. Trong mô hình này, vi khuẩn hình thành nên các vi khuẩn lạc và đƣợc bao quanh bởi một mạng lƣới chất ngoại bào giúp các thành phần tế bào liên kết với nhau một cách có trật tự đảm bảo sự trao đổi thông tin liên tục diễn ra giữa các tế bào đồng thời tạo nên những kênh dẫn truyền dịch ngoại bào bên trong màng sinh vật. Nhờ đó dịch tế bào có thể đi qua màng sinh vật tạo điều kiện cho việc khuếch tán, phân phối chất dinh dƣỡng đến khắp các tế bào trong màng cũng nhƣ loại bỏ các chất thải [34]. Sự tạo thành màng sinh vật cũng giống nhƣ một quá trình phát triển của vi sinh vật và cần phải trải qua một số bƣớc bao gồm: sự gắn kết của các tế bào vi Khóa luận tốt nghiệp Đoàn Diệu Linh 8 K53A Sinh học sinh vật trôi nổi tự do lên một bề mặt, sự tăng trƣởng và liên kết các tế bào thành vi khuẩn lạc, sự tạo thành màng sinh vật trƣởng thành (hoàn chỉnh), và cuối cùng là sự tách rời của các tế bào vi sinh vật thành dạng dịch lỏng tế bào (Hình 3). Hình 3. Các giai đoạn chính hình thành màng biofilm [11] 1.Giai đoạn gắn kết lên bề mặt, 2. Hình thành lớp tế bào trên bề mặt, 3. Hình thành mạng lƣới ngoại bào, 4. Hình thành biofilm hoàn chỉnh, 5. Quá trình tách rời Giai đoạn 1: Gắn kết thuận nghịch Các bề mặt trong môi trƣờng thủy sinh thƣờng đạt đƣợc điều kiện cho sự hấp thụ của các chất vô cơ và hữu cơ. Dƣới một số điều kiện nhất định và tùy thuộc đặc tính lý hóa, các vi khuẩn có thể di chuyển hƣớng đến bề mặt bởi chuyển động Brown hay hóa ứng động và hình thành mối tƣơng tác tạm thời với bề mặt thông qua các lực tƣơng tác yếu nhƣ lực Van der Waals, lực hút tình điện, liên kết hydro. Nhờ khả năng di chuyển độc lập bằng các cử động co rút tế bào hay sử dụng các tiêm mao, và khả năng tiết các chất ngoại bào giúp các tế bào riêng rẽ đƣợc bao bọc trong một mạng lƣới và bắt đầu sự hình thành màng sinh vật [30]. Tuy nhiên, các tế bào này chƣa hẳn đã đi vào quá trình hình thành màng sinh vật và có thể rời bề mặt để tiếp tục đời sống tự do riêng lẻ. Giai đoạn 2: Gắn kết không thuận nghịch Khóa luận tốt nghiệp Đoàn Diệu Linh 9 K53A Sinh học Sau khi gắn kết thuận nghịch ban đầu lên một bề mặt, vi sinh vật không những phải giữ liên kết với bề mặt giá thể mà còn phải tăng trƣởng để hình thành một màng sinh vật hoàn chỉnh. Vì vậy giai đoạn tiếp theo là sự sản xuất các chất ngoại bào nhằm làm tăng tính bám dính ổn định thông qua các cầu nối hữu cơ giữa tế bào và giá thể. Việc chuyển từ giai đoạn bám dính thuận nghịch sang giai đoạn bám dính không thuận nghịch đƣợc thực hiện nhờ lông roi, tiêm mao vào các sợi bám dính. Trong khi sự vận động thông qua trung gian lông roi đƣợc đánh giá là quan trọng trong bƣớc đầu thiết lập sự bám dính của vi sinh vật lên bề mặt thì vận động co rút đƣợc chỉ ra là cần thiết cho sự trƣởng thành của màng sinh vật trong điều kiện tĩnh. Cụ thể nhu động co rút giúp cho sự hình thành nên các vi khuẩn lạc trong màng sinh vật bằng cách tạo điều kiện thuận lợi cho tƣơng tác giữa các vi khuẩn với bề mặt để hình thành nên các nhóm tế bào qua đó giúp tăng cƣờng mức độ bám dính với bề mặt [30]. Giai đoạn 3: Hình thành mạng lƣới ngoại bào Các hợp chất polymer ngoại bào tiếp tục đƣợc tạo ra bởi các tế bào để liên kết các tế bào với nhau một cách có tổ chức đồng thời tạo thành cầu nối giữa các vi khuẩn lạc. Chúng cũng có vai trò trong việc thu hút các tế bào sống trôi nổi (có thể là từ nhiều loài khác nhau) trong môi trƣờng. Kết quả là mật độ tế bào trong một màng sinh vật cũng nhƣ lƣợng các polymer ngoại bào tạo ra tăng lên. Một mạng lƣới màng sinh vật dần đƣợc hình thành [34]. Giai đoạn 4: Hình thành một biofilm hoàn chỉnh Khi tế bào vi sinh vật bám dính không thuận nghịch lên bề mặt thì quá trình trƣởng thành của màng sinh vật bắt đầu. Trong suốt quá trình này, sự phân chia của các tế bào vi sinh vật bám dính không thuận nghịch là nguyên nhân giúp các tế bào phân chia để lan rộng và phát triển dần lên từ các điểm gắn kết để hình thành các vi khuẩn lạc hay các cụm tế bào. Từ một phạm vi ban đầu biofilm có thể mở rộng về không gian cũng nhƣ độ phức tạp tùy thuộc vào điều kiện môi trƣờng. Một biofilm hoàn chỉnh có cấu trúc giống nhƣ tháp hình nấm đƣợc bao quanh bởi các kênh vận chuyển nƣớc có tính thẩm thấu cao tạo điều kiện cho việc vận chuyển chất dinh dƣỡng và oxy vào bên trong biofillm cũng đƣợc quan sát. Các biofilm phát triển khá chậm thƣờng cần vài ngày để đạt đƣợc cấu trúc hoàn chỉnh. Một biofilm trƣởng thành đƣợc coi nhƣ một tổ chức tiên tiến luôn có sự thích nghi liên tục với môi Khóa luận tốt nghiệp Đoàn Diệu Linh 10 K53A Sinh học trƣờng bao quanh điều này cũng có nghĩa là khi điều kiện môi trƣờng bất lợi vi khuẩn có thể tách rời khỏi biofilm để tìm một môi trƣờng mới phù hợp hơn [18]. Giai đoạn 5: Tách rời Khả năng phát triển của màng sinh vật giới hạn trong điều kiện dinh dƣỡng của môi trƣờng nuôi cấy và biểu hiện của các phân tử cảm ứng mật độ tế bào. Các phân tử này đƣợc giải phóng ra nhằm đáp ứng với những hạn chế về dinh dƣỡng, sự tích tụ các sản phẩm độc hại và một số nhân tố khác, bao gồm các yếu tố pH, nguồn cung cấp cacbon, oxy. Trong một số trƣờng hợp, khi màng sinh vật đạt đến khối lƣợng và một mức cân bằng động tối đa thì các tế bào trong đó sẽ tự tách rời và cùng với các tế bào của một màng khác hình thành nên các vi khuẩn lạc [29].