Đang tải... (xem toàn văn)
CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN21.1 Tổng số vi sinh vật hiếu khí21.2 Tổng nấm men, nấm mốc3CHƯƠNG 2 : PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH62.1 Vật liệu, hóa chất, dụng cụ62.2 Phương pháp thu, bảo quản và chuẩn bị mẫu thực phẩm82.2.1 Thu và chứa mẫu82.2.2 Vận chuyển và bảo quản mẫu92.2.3 Chuẩn bị mẫu 92.3 Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí112.3.1 Nguyên tắc phân tích tổng số vi khuẩn hiếu khí112.3.2 Môi trường sử dụng122.3.3 Quy trình phân tích122.3.4 Thuyết minh quy trình122.5.5 Ý nghĩa172.4 Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí trên thịt và một số sản phẩm từ thịt (theo TCVN 56671992):172.5. Xác định tổng nấm men, nấm mốc trong thực phẩm252.5.1 Nguyên tắc252.5.2 Môi trường và hóa chất252.5.3 Quy trình phân tích định tính nấm mốc262.5.4 Quy trình định lượng tổng nấm men nấm mốc262.5.5 Ý nghĩa282.6. Định lượng nấm men nấm mốc trong thịt và các sản phẩm từ thịt (Theo TCVN 71372002)292.7. Xác định mật số và lên men vi sinh vật trong lên men ca cao (báo cáo khoa học – Tạp chí Khoa học – Đại học Cần Thơ)38
TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM LỜI NÓI ĐẦU Phân tích vi sinh vật học thực phẩm môn học quan trọng hệ đại học ngành công nghệ thực phẩm Môn học giúp có kiến thức hữu ích việc phân tích tiêu vi sinh thực phẩm Hiên nay, việc phân tích vi sinh thực phẩm số sản phẩm thiết yếu thịt-các sản phẩm từ thịt, thủy sản, sữa,… tiêu chuẩn hóa, nên những vấn đề đề cập tiểu luận vấn đề Những làm, làm lĩnh vực phải thường xuyên cập nhật thông tin, tiêu chuẩn hóa kiến thức mình, phù hợp với thay đổi tiêu chí chất lượng thực phẩm ngày cao xã hội Nội dung tiểu luận • Tổng số vi sinh vật hiếu khí • Tổng nấm men, nấm mốc CHƯƠNG : TỔNG QUAN GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ NHÓM TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM Khái quát 1.1 Tổng số vi sinh vật hiếu khí Vi khuẩn hiếu khí Vi khuẩn hiếu khí vi khuẩn tăng trưởng hình thành khuẩn lạc điều kiện có oxi phân tử Quá trình hiếu khí * Quátrình oxy hóa (hay dị hóa) (COHNS) + O2 + VK hiếukhí → CO2 + NH3 + sảnphẩmkhác + nănglượng (1.1) Chất hữu * Quátrìnhtổnghợp (đồnghóa) (COHNS) + O2 + VK hiếukhí + nănglượng → C5H7O2N (tb vi khuẩnmới) (1.2) Quá trình yếm khí Trong điều kiện yếm khí (khôngcó oxy), vi khuẩn yếm khí phân hủy chất hữu sau: (COHNS) + VK yếmkhí → CO2 + H2S + NH3 + CH4 + chất khác + lượng (COHNS) + VK yếm khí + lượng → (1.3) C5H7O2N (tb vi khuẩn mới) (1.4) Ghichú: C5H7O2N công thức hóa học thông dụng để đại diện cho tế bào vi khuẩn Trong điều kiện chất hữu vi khuẩn trải qua trình hô hấp nội bào tự oxy hóa sử dụng thân chúng làm nguyên liệu C5H7O2N + 5O2 → 5CO2 + NH3 + 2H2O + nănglượng (1.5) CO2 NH3 chất dinh dưỡng loài tảo GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ NHÓM TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM Trong điều kiện ánh sáng thích hợp, trình quang hợp tảo diễn sau: NH3 + 7,62CO2 + 2.53H2O → C7,62H8,06O2,53N + 7,62O2 (1.6) Tổng vi khuẩn hiếu khí Tổng số vi khuẩn hiếu khí diện mẫu thị mức độ vệ sinh thực phẩm Chỉ số xác định phương pháp đếm khuẩn lạc mọc môi trường thạch dinh dưỡng từ lượng mẫu xác định sở xem khuẩn lạc sinh khối phát triển từ tế bào diện mẫu biểu diễn dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (colony forming unit, CFU) đơn vị khối lượng thực phẩm Chỉ số có số tên gọi khác sau: số vi sinh vật hiếu khí (Aerobic PlateCount, APC), tổng số đếm đĩa (Total Plate Count, TPC), tổng số vi sinh vật sống ( Total Viable Count, TVC), số đếm đĩa chuẩn (Standard Plate Count, SPC) Nguyên tắc Tổng số nhóm vi khuẩn thực phẩm xác định phương pháp nuôi cấy trải lên bề mặt thạch phương pháp tạo hộp đổ Tổng số vi sinh vật hiếu khí đếm cách đổ đĩa ủ điều kiện hiếu khí 300C/72 ± 370C/48 ± Thông qua số lượng khuẩn lạc đếm đĩa peptri cho phép xác định lượng vi sinh vật có khả sinh trưởng môi trường mẫu ban đầu Để đếm kết xác số vi khuẩn đĩa phải giới hạn 25-250 khuẩn lạc Nếu vượt giới hạn phải tiến hành pha loãng chọn độ pha loãng lớn 1.2 Tổng nấm men, nấm mốc Nấm men nấm mốc nhóm vi sinh vật đa dạng, có 400.000 loài nấm men nấm mốc mô tả Đây nhóm vi sinh vật nhân thật, có vách tế bào lớp chitin, có nhân bào quan khác Tất loài men mốc thuộc nhóm vi sinh vật dị dưỡng, chúng cần nguồn carbon hữu để cung cấp GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ NHÓM TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM lượng từ môi trường bên Vì vi sinh vật thường xuyên phân lập từ thực phẩm hay nguồn giàu dinh dưỡng khác Có thể phân biệt nấm men nấm mốc theo khái niệm đơn giản sau: nấm mốc vi nấm dạng sợi, sinh sản bào tử hay khuẩn ty; nấm men tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nảy chồi, tồn dạng khuẩn ty giả tế bào kết thành chuổi Đơn vị hình thành khuẩn lạc nấm mốc nấm men mầm để tạo nên khuẩn lạc nuôi cấy môi trường Mầm bào tử, tế bào hay đoạn khuẩn ty Quá trình tăng trưởng nấm men nấm mốc phụ thuộc vào nhiều yếu tố từ môi trường Hầu hết nấm mốc, nấm men thuộc nhóm vi sinh vật ưa mát, nhiệt độ thích hợp cho phát triển chúng khoảng 20 – 28 0C, số ưa lạnh hay ưa nóng Nước hoạt tính nhân tố ảnh hưởng tất quan trọng đến tăng trưởng Hầu hết loại nấm men nấm mốc phát triển tốt chất có nước hoạt tính khoảng 85% hay lơn hơn, số loài tăng trưởng chất có nước hoạt tính thấp khoảng 60 – 70% Nấm mốc nấm men tăng trưởng vùng pH từ 2-9, pH thích hợp nằm khoảng -6,5 Hầu hết nấm mốc, nấm men thuộc nhóm hiếu khí bắt buộc, số phát triển điều kiện vi hiếu khí Một số tiếp nhận oxy nguyên tử từ chất chúng dù dạng oxy nguyên tố cần thiết cho trình phát triển nấm men nấm mốc Tất loài nấm men nấm mốc thuộc nhóm vi sinh vật dị dưỡng, chúng có khả nhận chất dinh dưỡng dạng hòa tan Trong trình trao đổi chất xảy tế bào chúng lại có khả chuyển hóa chất hào tan thành chất không hòa tan thành lignocellulose Ngoài ra, chúng tạo chất độc, chất độc chúng gọi chung độc tố vi nấm ( mycotoxins) Tiêu biểu có Aspegillus flavus, Aspegillus parasiticus, Aspegillus moninus, Penicillium italicum, Penicillium roquefortii, Penicillium cammenbertii, Penicillium digitatum Trong thực phẩm nấm men nấm mốc diện tăng trưởng làm thay đổi màu thực phẩm, làm GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ NHÓM TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM phát sinh mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cấu thực phẩm, số tạo độc tố gây ngộ độc thực phẩm Một số loại nấm men như: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces liquefacien Nấm men sinh sản cách nẩy chồi, nguồn chất có đường Hình dạng chúng đa dạng hình cầu, hình trứng, hình oval (hình 2.4) Hình 1: Khuẩn lạc tế bào nấm men [11] Nấm mốc sinh sản bào tử hay đoạn sợi, có hệ sợi sợi khí sinh ( sợi sinh sản), nhiệt độ thích hợp từ 28-320C, ẩm độ chất 60%, có nguồn chất bội đường ( hình 2.5) Hình 2: Khuẩn lạc hệ sợi nấm mốc [11] Cách phân biệt nấm men, nấm mốc • Nấm men vi nấm dạng sợi, sinh sản bào tử khuẩn ty GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ NHÓM TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM • Nấm mốc tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nẩy chồi Thỉnh thoảng nhìn thấy tế bào kết nối thành chuỗi Đơn vị hình thành khuẩn lạc nấm mốc nấm men mầm tạo nên khuẩn lạc nuôi cấy môi trường Mầm bào tử, tế bào hay đoạn khuẩn ty Trong thực phẩm, nấm mốc nấm men diện tăng trưởng làm thay đổi màu thực phẩm, làm phát sinh mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cấu thực phẩm CHƯƠNG : PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH 2.1.Vật liệu, hóa chất, dụng cụ: Vật liệu Mẫu thực phẩm chế biến sẵn Hóa chất – môi trường • Buffer Pepton Water (BPW) • Plate Count Agar (PCA) • Tryptone Soya Agar (TSA) • Violet Red Bile Agar ( VRB) • Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL) • Eosine Methylene Blue Agar(EMB) • Canh trypton • Canh MR-VP • Thạch Simmon citrate Agar • Thuốc khử Kovac’s • Thuốc khử Methyl Red • Thuốc khử α- naphtol 5% • KOH 40% • Môi trường canh Escherichia coli Broth (EC) GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ NHÓM TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM • Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar ( DRBC) • Môi trường canh LSB Dụng cụ • Ống nghiệm không nắp • Ống nghiệm có nắp • Đĩa Petri vô trùng • Cân điện tử • Bình tam giác • Bình định mức • Cốc thủy tinh • Kéo • Đũa thủy tinh • Túi nilon vô khuẩn • Đèn cồn • Que cấy thẳng • Que cấy vòng • Bình chứa môi trường • Khăn giấy • Bông y tế • Bông không thấm nước • Pipetman Thiết bị • Autoclave • Tủ lạnh • Bếp từ • Tủ ấm 44oC GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ NHÓM TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM • Tủ ấm 30oC • Tủ ấm 37oC • Tủ sấy 180oC • Tủ cấy • Bếp đun • Bể ổn nhiệt 2.2 Phương pháp thu, bảo quản chuẩn bị mẫu thực phẩm 2.2.1 Thu chứa mẫu Kết thí nghiệm phụ thuộc nhiều vào phương pháp lấy mẫu bảo quản mẫu Kế hoạch lấy mẫu áp dụng cho trường hợp cụ thể mang phòng thí nghiệm phản ánh tình trạng mẫu cần phân tích Dụng cụ thu mẫu thay đổi tùy loại sản phẩm Trường hợp thực phẩm đông lạnh, sử dụng ống khoan tay vô trùng, dao sát trùng để tách thành lượng mẫu cần thiết, sau dùng thìa, kéo… mẫu vào dụng cụ chứa Lưu ý tránh thu mảng băng Trường hợp thực phẩm đóng gói thành nhiều mức, thực thu mẫu cách chọn lấy gói lớn từ lấy bao nhỏ Khối lượng tổng cần thu mẫu thay đổi tùy thuộc số lượng tiêu cần phân tích khoảng 100 – 250g Mẫu cần đảm bảo tính đại diện để có khối lượng mẫu cần thiết, cần thu gộp mẫu nhiều vị trí nguyên liệu hay thành phẩm Trường hợp mẫu phân tích bán thành phẩm chế biến, cần thực thu mẫu nhiều vị trí công đoạn Đối với loại mẫu thịt hay cá, nơi nhiễm vi sinh vật chủ yếu bề mặt Do vậy, sử dụng que vô trùng quét diện tích bề mặt định hay cắt lát với bề dày - 3mm để thu mẫu Dụng cụ chứa mẫu thường bình nhựa có nắp nhôm hay chất dẻo, bao nylon chứa mẫu Tránh sử dụng bình thủy tinh để chứa mẫu dễ vỡ 2.2.2 Vận chuyển bảo quản mẫu GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ NHÓM TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM Mẫu sau thu bảo quản cách độc lập với thùng bảo quản mẫu làm lạnh bao nước đá Nước đá phải không tan chảy suốt trình vận chuyển mẫu phòng thí nghiệm Tại phòng thí nghiệm mẫu chuyển vào tủ đông phân tích Nếu không phân tích ngay, mẫu phải bảo quản -20 oC phân tích Trường hợp mẫu bảo quản đông bảo quản tủ lạnh – 4oC không 36 Các loại thực phẩm đồ hộp, thực phẩm có độ ẩm thấp hay thực phẩm khó hư hỏng bảo quản nhiệt độ phòng phân tích 2.2.3 Chuẩn bị mẫu Rã đông mẫu trước phân tích Mẫu đông lạnh phải giải đông điều kiện vô trùng trước phân tích Trường hợp phải phối trộn mẫu trước phân tích, mẫu phải giải đông bên dụng chứa sử dụng để thu mẫu chuyển mẫu phòng thí nghiệm, không chuyển mẫu sang dụng cụ chứa khác Việc giải đông thực nhiệt độ – oC khoảng 18 Khi cần thiết, giải đông nhanh 45 oC 15 phút Trường hợp này, cần liên tục lắc bình chứa mẫu để làm tăng tốc độ giải đông làm đồng nhiệt độ bên mẫu Cân mẫu Cân xác lượng mẫu xác định để tiến hành phân tích tùy theo yêu cầu tiêu phân tích với sai số cho phép ±0,1g Lượng mẫu cho vào bình chứa nhựa hay bao nhựa vô trùng Với kỹ thuật đếm khuẩn lạc mẫu cần phân tích pha loãng liên tiếp xác định vài nồng độ pha loãng định để cấy vào môi trường thích hợp kỹ thuật pha loãng thường qua bước sau: • Dung dịch pha loãng mẫu: số dung dịch dùng pha loãng làm chết tế bào nước muối nước cất.các dung dịch pha loãng sau lấy từ tủ lạnh không GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ NHÓM TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM dùng gây sóc cho vi sinh vật làm cho vi sinh vật phát triển • Chuẩn bị chuỗi pha loãng: bơm xác 9ml dung dịch pha loãng vào ống nghiệm có nắp Mẫu cần phân tích mẫu thực phẩm thao tác tiến hành pha loãng sau: cân 25g mẫu thực phẩm cần phân tích cho vào túi dựng thêm vào túi 225ml dung dịch pha loãng ta độ pha loãng 10 -1, hút 1ml mẫu 10 -1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng lắc ta có 10-2 tương tự ta lấy 1ml 10-2 cho vào 9ml dung dịch pha loãng chuẩn bị sẵn ta có mẫu 10-3 Theo cách ta làm có nồng độ pha loãng mong muốn ( hình 3.1) Hình : Pha loãng mẫu Đồng mẫu GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ 10 NHÓM TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM 2.3.1 Phương pháp đếm mật số vi sinh vật Dùng phương pháp đếm mật số môi trường chuyên biệt cho nhóm vi sinh vật, bao gồm: vi sinh vật tổng số: Plate Count Agar (PCA); nấm men: Oxytetracycline D - Glucose Yeast Extract Agar (OGYEA); nấm mốc: Czapek-Dox Agar; vi khuẩn acid lactic: MRS Agar; vi khuẩn acid acetic: YPGD (D-glucose 5g/L, yeast extract 5g/L, glycerol 5g/L polypeptone 5g/L bổ sung ethanol 4% CaCO3 0,5%) vi khuẩn Bacillus: Nutrient Agar 2.3.2 Các thử nghiệm xác định phân loại vi khuẩn Đối với vi khuẩn acid lactic: Đếm khuẩn lạc phát triển môi trường thạch MRS sau ủ vi hiếu khí 30oC 48 Sau đó, để khẳng định vi khuẩn acid lactic cách nhuộm Gram, thử nghiệm catalase thử nghiệm khả lên men acid lactic thuốc thử Ufermen Tiêu chuẩn xác định vi khuẩn acid lactic: Gram dương, trực khuẩn, cầu khuẩn cầu trực khuẩn; catalase âm tính; chuyển màu thuốc thử Ufermen Đối với vi khuẩn acid acetic: Đếm khuẩn lạc phát triển môi trường thạch YPGD sau ủ hiếu khí nhiệt độ 37oC 48 Sau đó, để khẳng định vi khuẩn acid acetic tiến hành nhuộm Gram thử nghiệm catalase Tiêu chuẩn xác định vi khuẩn acid acetic: Vi khuẩn acetic acid sử dụng ethanol tạo acid acetic, CaCO3 bị phá vỡ, xung quanh khuẩn lạc hình thành vùng sáng môi trường YPGD (bổ sung 4% ethanol 0,5% CaCO3), Gram âm catalase dương tính Đối với vi khuẩn Bacillus: Đếm khuẩn lạc phát triển môi trường thạch Nutrient agar sau ủ hiếu khí nhiệt độ 37ºC 48 Sau đó, để khẳng định vi khuẩn Bacillus cách nhuộm Gram thử nghiệm catalase Tiêu chuẩn xác định vi khuẩn Bacillus trực khuẩn Gram dương catalase dương tính 2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu Kết nhận giá trị trung bình lần lặp lại vẽ biểu đồ phần mềm Microsoft Excel Các số xử lý chương trình StatGraphics Plus Version GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ 42 NHÓM TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM 3, Manugistics, Inc., Rockville, USA KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Sự thay đổi mật số vi sinh vật trình lên men ca cao Sự thay đổi mật số vi sinh vật bao gồm tổng số vi khuẩn hiếu khí, nấm men, nấm mốc, vi khuẩn acid lactic, vi khuẩn acid acetic vi khuẩn Bacillus thể Hình Hình 1: Sự thay đổi mật số vi sinh vật lên men ca cao Kết Hình cho thấy mật số vi sinh vật biến đổi suốt trình lên men Thịt ca cao chứa nhiều đường pH ban đầu thích hợp cho phát triển nấm men, chúng sử dụng carbohydrate từ cơm hạt điều kiện hiếu khí kỵ khí Mật số nấm men đạt giá trị cao ngày thứ (6,4 log cfu/g) có khác biệt GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ 43 NHÓM TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ý nghĩa mặt thống kê mức 5% so với ngày lại So với kết lên men ca cao Indonesia Ardhana Fleet (2003), nấm men diện với mật số cao trình lên men ca cao 7,0 - 8,0 log cfu/g suốt 24 - 36 đầu lên men Sau đó, mật số giảm nhanh ngày đến ngày lên men thứ mật số nấm men 2,7 log cfu/g Sự giảm mật số nấm men trình lên men nấm men gia tăng mật số điều kiện hiếu khí giai đoạn đầu điều kiện kỵ khí chúng sinh rượu ức chế trở lại hoạt động nấm men Nhiệt độ khối lên men tăng cao đồng thời pH giảm điều kiện khối ủ trở nên thông thoáng số dòng tạo pectinolytic enzyme phá vỡ lớp kết dính vách tế bào cơm hạt Nhu mô khối tế bào bị xẹp xuống phần cơm hạt gần hạt, kết hình thành khoảng không xâm nhập không khí Vì vậy, điều kiện khối ủ không thích hợp cho phát triển nấm men Tuy nhiên, mật số nấm men không thay đổi nhiều từ ngày thứ đến thứ có giảm rõ rệt vào ngày lên men thứ điều kiện môi trường không thuận lợi Vi khuẩn acid lactic (LAB) diện bắt đầu lên men đến kết thúc trình lên men điều kiện thích hợp, LAB gia tăng nhanh mật số LAB đạt mật số cao khoảng ngày thứ bắt đầu lên men (6,3 log cfu/g) Trong lên men ca cao Indonesia, LAB đạt cao - log cfu/g 36 đầu lên men (Ardhana Fleet, 2003) Nhưng mật số giữ thời gian ngắn sau giảm xuống khoảng 4,0 log cfu/g vào ngày thứ tăng trở lại vào ngày thứ mật số đạt khoảng 5,7 log cfu/g mật số dao động nhẹ ngày cuối trình lên men (4,7 log cfu/g) Nhìn chung, trình lên men, mật số LAB khác biệt ý nghĩa mặt thống kê mức 5% ngày lên men Kết thể Hình cho thấy có liên tiếp chiếm ưu vi sinh vật suốt trình lên men Khi điều kiện khối ủ trở nên thoáng khí hơn, tạo điều kiện thích hợp cho phát triển vi khuẩn acid acetic (AAB) Mật số AAB đạt cao vào ngày thứ (7,3 log cfu/g) Mật số AAB theo kết Vương Thanh Tùng (2005) đạt cao vào ngày thứ (7,0 log cfu/g) Sau đó, mật số giảm GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ 44 NHÓM TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM khoảng 5,5 log cfu/g vào ngày thứ Vi khuẩn acid acetic oxy hóa rượu thành acid acetic chuyển hóa tiếp acid acetic thành CO2 H2O Phản ứng tỏa nhiệt đưa nhiệt độ khối ủ lên men lên cao Mật số AAB giảm dần cuối trình lên men (2,6 log cfu/g) Tổng số vi khuẩn hiếu khí ban đầu có khuynh hướng giảm mật số gia tăng sau ngày thứ 2, đạt mật số cao vào ngày thứ 4, đạt 10,5 log cfu/g mật số lại giảm cuối trình lên men Điều giải thích Schwan Wheals (2004) lúc đầu lượng thịt nhiều ngăn cản trình xâm nhập oxy vào khối ủ nên vi khuẩn hiếu khí khó phát triển Sau nhờ phát triển nấm men phân hủy lớp cơm hạt tạo điều kiện thoáng khí thuận lợi cho phát triển vi khuẩn hiếu khí Vì vậy, vi khuẩn hiếu khí gia tăng mật số đạt mật số cao giảm dần theo đường cong sinh trưởng vi sinh vật Mật số vi sinh vật có ích giảm dần vào hai ngày cuối giai đoạn lên men điều kiện gia tăng thông thoáng khí, làm tăng giá trị pH nhiệt độ tăng giai đoạn sau trình lên men kết hợp với phát triển vi khuẩn hiếu khí Bacillus Vi sinh vật đạt mật số cao vào ngày thứ 7,6 log cfu/g sau mật số giảm vào ngày thứ 7,4 log cfu/g Điều kiện thông thoáng khí thuận lợi cho phát triển nấm mốc Hai ngày đầu trình lên men mật số nấm mốc giảm, sau gia tăng vào ngày thứ (5,0 log cfu/g) lại tiếp tục giảm nhiệt độ khối ủ cao môi trường có pH thấp vào ngày thứ (3,4 log cfu/g) gia tăng trở lại vào cuối giai đoạn lên men (4,4 log cfu/g) điều kiện thuận lợi 3.2 Phân lập định danh vi sinh vật lên men ca cao 3.2.1 Kết phân lập định danh nấm men Các dòng nấm men phân lập môi trường Oxytetracycline Yeast Extract Agar (OGYA) Sau phân lập tạo giống thuần, tiến hành quan sát kính hiển vi đặc điểm hình thái tế bào, hình thức sinh sản kết hợp với quan sát hình thái khuẩn lạc giống nấm men nuôi cấy môi trường thạch đĩa GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ 45 NHÓM TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM petri để chọn giống nấm men khác Kết phân lập 20 dòng phân lập Qua quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc tế bào phân loại xếp dòng phân lập ròng vào nhóm riêng, dòng phân lập có đặc điểm giống xếp vào nhóm; đại diện tiêu biểu dòng phân lập nhóm mô tả cụ thể đặc điểm khuẩn lạc tế bào, sở phân loại định danh dòng đại diện theo Lương Đức Phẩm (2005) Kết chọn dòng phân lập khác định danh thuộc giống Hanseniaspora, Saccharomyces Brettanomyces Đặc điểm khuẩn lạc CY-1: đường kính khoảng 0,3 - 0,35 cm, chiều dày 0,1 mm, bề mặt khuẩn lạc phẳng, trơn, bìa nguyên, màu trắng sữa Tế bào nấm men hình ellip, có đầu nhọn, sinh sản cách nảy chồi đầu xác định thuộc giống Hanseniaspora (Hình 2) Hình 2: Khuẩn lạc CY-1 tế bào kính hiển vi X100 Khuẩn lạc CY-2 có bề mặt trơn, lồi, bìa nguyên; màu trắng sữa, đường kính khoảng 0,3 - 0,4 cm, dày 0,1 mm; khuẩn lạc có vòng đồng tâm Tế bào hình ovan (hình trứng), sinh sản vô tính cách nảy chồi, có chứa bào tử nang xác định thuộc giống Saccharomyces (Hình 3) Dòng CY-3 có đặc điểm tương tự tế bào nấm men có dạng hình cầu xác định thuộc giống Saccharomyces Hình 3: Khuẩn lạc CY-2 tế bào kính hiển vi X100 GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ 46 NHÓM TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM Khuẩn lạc CY-4 có đường kính khoảng 0,2 -0,3 cm, dày 0,1 mm, bề mặt khuẩn lạc trơn, phẳng, bìa nguyên, màu trắng sữa Tế bào hình ovan thót nhọn đầu kéo dài ra, nảy chồi hai đầu xác định thuộc giống Brettanomyces (Hình 4) Hình 4: Khuẩn lạc CY-4 tế bào kính hiển vi X100 3.2.2 Kết phân lập định danh nấm mốc Kết phân lập 13 dòng phân lập ròng, dòng phân lập có đặc điểm giống xếp thành nhóm Dựa vào đặc điểm phân loại nấm mốc theo mô tả Samson et al (2004) chọn dòng phân lập có đặc điểm đặc trưng khác định danh thuộc giống Rhizopus Aspergillus Dòng phân lập CF-1 xác định giống Rhizopus đặc điểm đặc trưng mô tả chi tiết Hình Khuẩn lạc có đường kính khoảng 2,5 cm sau 24 nuôi cấy, bề mặt nhung mượt, mép khuẩn lạc mỏng, bìa rễ cây; mặt khuẩn lạc có màu đen (màu bào tử) mặt khuẩn lạc có màu trắng (màu khuẩn ty) Khuẩn ty có màu trắng, vách ngăn ngang, khuẩn ty phát triển thành khuẩn GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ 47 NHÓM TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM khuẩn ngang Sinh sản vô tính với bào tử bọc, cọng bào tử phát triển từ khuẩn ty mọc thẳng lên không mang túi bào tử, bào tử có màu đen Hình 5: Khuẩn lạc CF-1 (1), sợi nấm (2, 3) bào tử (4) kính hiển vi X40, cọng mang bào tử (5), túi bào tử (6) khuẩn (7) kính hiển vi X100 Các dòng CF-2, CF-3, CF-4 CF-5 có đặc điểm đặc trưng thuộc giống Aspergillus với đặc điểm khuẩn lạc: đường kính khoảng 2,5 - 3,5 cm có bề mặt nhung mượt, mép khuẩn lạc mỏng, bìa rễ cây; mặt khuẩn lạc có màu đen (CF2), vàng nâu (CF-3), vàng (CF4) trắng (CF-5) Khuẩn ty phân nhánh có vách ngăn ngang Cọng bào tử phát triển từ khuẩn ty mang bào tử đính, bào tử có màu tương ứng mô tả khuẩn lạc Hình thể hình ảnh đặc trưng dòng CF-2 GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ 48 NHÓM TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM Hình 6: Khuẩn lạc CF-2 (8) sợi nấm (9), cọng mang bào tử (10), khuẩn (11), kính hiển vi X10 thể bình (12), bào tử (13) X40 3.2.3 Kết phân lập định danh vi khuẩn acid lactic Các dòng vi khuẩn acid lactic phân lập môi trường MRS Agar có bổ sung natamycine 2% (kháng nấm) Kết phân lập 12 dòng có đặc tính đặc trưng vi khuẩn acid lactic (Gram dương, catalase âm tính, chuyển màu thuốc thử Ufermen) Kết hợp quan sát hình thái tế bào khuẩn lạc để chọn dòng vi khuẩn acid lactic khác nhau, kết phân lập định danh dòng phân lập khác thuộc giống Leuconostoc, Lactococcus, Lactobacillus Streptococcus (Bảng 1) Bảng 1: Đặc điểm giống vi khuẩn acid lactic phân lập GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ 49 NHÓM TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM 3.2.4 Kết phân lập định danh vi khuẩn acid acetic Các dòng vi khuẩn acid acetic phân lập môi trường YPGD có bổ sung CaCO3 cycloheximide (150 mg/L) để kháng nấm Khuẩn lạc vi khuẩn acid acetic tạo vòng sáng vi khuẩn sinh acid acetic hòa tan CaCO3 làm màu trắng đục môi trường Kết phân lập 14 dòng vi khuẩn cho kết phù hợp với đặc tính vi khuẩn acid acetic (Gram âm, catalase dương tính) Quan sát đặc điểm hình thái tế bào khuẩn lạc dựa tài liệu phân loại vi khuẩn Madigan et al (2009) chọn dòng phân lập khác định danh thuộc giống Acetobacter (Bảng 2) Bảng 2: Đặc điểm tế bào khuẩn lạc giống vi khuẩn acid acetic phân lập GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ 50 NHÓM TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 Kết luận Trong lên men ca cao, có diện nhiều nhóm vi sinh vật khác chiếm ưu giai đoạn trình lên men với mật số cao là: nấm men (6,4 log cfu/g), vi khuẩn acid lactic (6,3 log cfu/g), vi khuẩn acid acetic (7,3 log cfu/g), vi khuẩn Bacillus (7,40 log cfu/g) nấm mốc (4,41 log cfu/g) Tổng số vi khuẩn hiếu khí có giá trị cao vào ngày thứ 4, đạt 10,45 log cfu/g Phân lập 20 dòng nấm men, định danh sơ thuộc giống Hanseniaspora, Saccharomyces Brettanomyces Mười ba dòng nấm mốc thuộc giống Rhizopus Aspergillus Đa dạng hơn, 12 dòng vi khuẩn acid lactic thuộc giống (Leuconostoc, Streptococcus, Lactococcus Lactobacillus) Acetobacter giống vi khuẩn xác định cho 14 dòng vi khuẩn acid acetic phân lập 4.2 Đề xuất Định danh cấp độ loài giống vi sinh vật phân lập Phân lập tuyển chọn dòng vi sinh vật có ích lên men ca cao từ nhiều địa phương khác để đa dạng hóa nguồn vi sinh vật Nghiên cứu tác động vi sinh vật đến trình lên men chất lượng hạt ca cao lên men GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ 51 NHÓM TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM CHƯƠNG : KẾT LUẬN Trong thời đại đất nước phát triển hội nhập ngày nay, sống người ngày nâng cao nhu cầu ăn uống phải cải thiện Tuy nhiên, sống họ ngày bận rộn hối hả, nên thời gian dành cho việc tự nấu nướng cho bữa ăn gia đình ngày hạn chế, suất ăn nhanh, cơm tiệm, thức ăn chế biến sẵn giải pháp mà nhiều người lựa chọn Từ cho thực phẩm chế biến sẵn đóng vai trò quan trọng xã hội, vừa đáp ứng nhu cầu nhanh gọn vừa tiết kiệm thời gian Tuy nhiên, mặt vệ sinh GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ 52 NHÓM TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM đảm bảo Vì người kiểm soát trình chế biến sản phẩm chế biến có vấn đề thực cách nhận biết Vì việc phân tích vi sinh thực phẩm đóng vai trò ngày quan trọng việc kiểm soát chất lượng thực phẩm Phân tích vi sinh vật thực phẩm việc dễ dàng mà cần phải có đủ khả chuyên môn lý thuyết thực hành Những kiến thức có từ sách Trong sách giáo trình trình bày kỹ bước tiến hành thí nghiệm điều kiện nghiệm thực tế phát sinh nhiều tình khác Các tiêu chuẩn phân tích vi sinh thay đổi theo hướng nâng cao tiêu chất lượng cảm quan phù hợp với nhu cầu “an8n ngon, mặc đẹp” xã hội Hiện việc phân tích vi sinh thực phẩm Việt Nam dần tiêu chuẩn hóa theo hướng theo kịp với giới Những kiến thức thu nạp điều kiện vật chất nhà trường sau so với tốc độ phát triển nhanh chóng ngành công nghệ thực phẩm, nên phải trau dồi để không trở nên lạc hậu PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT • BGBL : Brilliant Green Bile Lactose broth • BPW : Buffer Pepton Water • CFU : Colony Forming Unit • DG18 : Dichloran Glycerol Agar • DRBC: Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ 53 NHÓM TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM • EC : Escherichia coli Broth • EMB : Eosine Methylene Blue Agar • E.coli : Escherichia coli • EIA Enzyme Immuno Assay : • ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay • LSB Lauryl Sulphate Broth : • LST : Lactose Trypton Laurl Sulphate Broth • MPN : Most Probable Number • MR Methyl red : • PCA : • SPW Plate Count Agar : Saline 54eptone Water • TSA : Tryptone Soya Agar • VP Voges – Proskauer : • VRB : Violet Red Bile Agar TÀI LIỆU THAM KHẢO 1) Phương Pháp Kiểm Nghiệm Vi Sinh Vật Thực Phẩm – Nguyễn Tiến Dũng – Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM 2) Phương Pháp Phân Tích Vi Sinh Vật Trong Nước, Thực Phẩm, Mỹ Phẩm – Trần Linh Phước – NXB Giáo Dục – Tái lần (2006) 3) Giáo Trình Thực Hành Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm – Đại học Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ 54 NHÓM TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM 4) Giáo Trình Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm – Đại học Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM 5) Nguồn tham khảo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) từ trang web văn phòng SPS Việt Nam: http://www.spsvietnam.gov.vn GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ 55 NHÓM TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ 56 NHÓM [...]... LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM X2< 1 1 d X2