Danh mục bảng biểu TT 10 11 Tên bảng Bảng 1.1 Một số thông số vật lý CD Bảng3 1: Xác định thời gian đun sôi diệt enzym Bảng 3.2: Xác đinh thời gian hấp để diệt enzym Bảng3 3: Xác định nồng độ chất thích hợp Bảng 3.4:Xác định nồng độ enzym AMG thích hợp Bảng3 5.Xác định thời gian thuỷ phân thích hợp cho trình thủy phân Bảng ảnh hởng tỷ lệ than hoạt tính lên màu dịch sau tẩy màu Bảng 3.7 ảnh hởng nồng độ dịch đến trình kết tinh -CD Bảng 3.8 ảnh hởng lợng nhân cấy đến trình kết tinh Bảng 3.9: ảnh hởng thời gian tới trình kết tinh -CD Bảng 3.9: theo dõi trình kết tinh nhiệt độ phòng Trang 33 35 37 35 40 43 45 46 48 40 Danh mục hình vẽ Tên hình vẽ TT Hình 1 Cấu trúc kích thớc CD [49] Hình 1.2 Sơ đồ phản ứng CGTaza xúc tác (hình tròn biểu thị phân tử glucoza, đầu màu trắng đầu khử) a) Phản ứng thuỷ phân, b) phản ứng trao đổi, c) Phản ứng vòng hoá, d) Phản ứng kết hợp Hình 1.3 Mô hình trung tâm hoạt động CGTaza từ B.circulans Hình 3.1 Sơ đồ quy trình sản xuất dịch CD Hình 3.2: Sắc ký đồ dịch sau CD hóa Hình 3.3 : sắc ký đồ dịch sau thủy phân AMG Hình 3.4: Sắc ký đồ mẫu phân tích tinh thể -CD sau sấy Hình 3.5 Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất -CD từ tinh bột sắn Trang 16 18 29 30 42 52 53 Danh mục từ viết tắt TT Từ Cyclodextrin cyclodextrin glucozyltransferaza Dextrose Equivalen Viết tắt CD CGTaza DE Mở đầu Tiến tới kỉ 21, kỷ ngành công nghệ sinh học phát triển sản phẩm ngành công nghệ sinh học đợc lên ngôi, ví dụ điển hình sản phẩm sinh học Cyclodextrin Cyclodextrin oligosaccharit mạch vòng đợc tạo nên glucopyranoza nối với liên kết - 1,4 glucozit Cyclodextrin đợc sản xuất từ tinh bột phản ứng vòng hoá chuỗi glucopyranoza mạch thẳng nhờ enzim cyclodextrin glucozyltransferaza Sản phẩm thu đợc thờng hỗn hợp ba loại cyclodextrin chủ yếu - , - -cyclodextrin với tỷ lệ phụ thuộc vào nguồn gốc enzim thời gian phản ứng Hiệu suất chuyển hoá thờng khoảng 20- 30% [3] Cấu trúc vòng cyclodextrin cho phép tạo phức bao dạng khách thể - chủ thể với nhiều hợp chất hữu Sự tạo phức bao dẫn đến làm thay đổi tính chất lý hoá phân tử chất khách thể Nhờ đó, cyclodextrin đợc ứng dụng rộng rãi nhiều ngành công nghiệp khác Trong công nghiệp thực phẩm, cyclodextrin đợc dùng làm chất mang hữu hiệu cho hơng liệu vốn dễ bị trình chế biến bảo quản dùng để loại cholesterol mùi vị khó chịu khỏi sản phẩm Trong công nghệ dợc phẩm, cyclodextrin đợc dùng để ổn định hoạt chất, làm tăng khả hoà tan khả hấp thụ thuốc đồng thời làm giảm tác dụng phụ thuốc Trong công nghiệp hoá học, cyclodextrin đợc dùng để xúc tác số phản ứng Trong công nghiệp mỹ phẩm, cyclodextrin góp phần làm ổn định màu mùi thơm sản phẩm Cyclodextrin đợc ứng dụng nông nghiệp để sản xuất loại thuốc diệt cỏ, thuốc trừ sâu Mặc dù cyclodextrin có nhiều ứng dụng nhng Việt Nam cha có đơn vị nghiên cứu sản xuất cyclodextrin Cyclodextrin sử dụng Việt Nam hoàn toàn nhập ngoại từ nớc nh Nhật Bản, Trung Quốc, Mĩ với giá thành cao Trong nguồn nguyên liệu để sản xuất cyclodextrin tinh bột sắn Việt Nam lại có sản lợng lớn (năm 2005 sản lợng sắn xuất Việt Nam đứng thứ giới sau Thái Lan), nguồn nguyên liệu thứ hai để sản xuất cyclodextrin enzim thời kì kinh tế thị trờng mở dễ nhập mà giá thành lại hạ, nguồn nhân công Việt Nam rào Chính việc nghiên cứu sản xuất Cyclodextrin việc làm cần thiết để: Giảm nhập ngoại, chủ động sản xuất, tiết kiện đợc ngoại tệ, tận dụng đợc nguồn nguyên liệu sẵn có nớc, giải việc làm cho số lao độngHiện viện Công Nghiệp Thực Phẩm tiến hành sản xuất đợc cyclodextrin hỗn hợp Để nâng cao giá trị sản phẩm, đề tài kế thừa thành giới nớc để tiếp tục tiến hành nghiên cứu công đoạn trình sản xuất cyclodextrin Nghiên cứu điều kiện công nghệ tối u cho trình thu hồi Beta - cyclodextrin Chơng I : tổng quan I.1 Giới thiệu cyclodextrin Cyclodextrin (CD) oligosacarit mạch vòng đợc tạo nên đơn vị glucopyranoza hình ghế 4C1 nối với liên kết -1,4-glucozit CD (còn đợc gọi dextrin Schardinger) đợc biết đến từ 100 năm Năm 1881, CD lần đợc sản xuất từ tinh bột vi khuẩn Bacillus amylobacter Năm 1903, cấu trúc tính chất hợp chất đợc biết đến qua mô tả Schardinger [38] Sau đó, Tilden Hudson (1939) chứng minh enzim cyclodextrin glucosyltransferaza, chiết xuất từ môi trờng nuôi cấy vi khuẩn Bacillus macerans, tác nhân chuyển hoá tinh bột thành CD Từ năm 1950 nay, nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu tính chất CD, nh việc sản xuất ứng dụng I.1.1 Cấu tạo cấu trúc CD Có tất gần 30 loại CD, nhng có loại CD thờng gặp -CD, -CD -CD chứa tơng ứng 6, đơn vị glucopyranoza phân tử Các CD lớn (đến 31 đơn vị glucoza) CD nhỏ (ít đơn vị glucoza) bền [10] Kích thớc thể tích lỗ hang CD số phân tử glucoza vòng CD định Trong vòng CD, gốc glucoza đợc xắp xếp cho nhóm hydroxyl bậc (C2 C3) nằm phía vòng, nhóm hydroxyl bậc (C 6) nằm phía bên Kết tạo phân tử có dạng hình nón cụt với phía chứa C6 hẹp khả quay tự C [9] (Hình 1.1) Cấu trúc đợc giữ chặt liên kết hydro nhóm hydroxyl bậc gốc glucoza kề [3] Các nhóm hydroxyl bậc bậc hớng bên mạch vòng, mặt nguyên tử hydro không cực (ở C C5) nguyên tử oxi cầu nối Nhờ có cấu trúc phân tử nh nên CD có bề mặt bên tơng tác háo nớc không gian bên lại kị nớc Cấu trúc cho phép CD tạo phức bao bền vững với phân tử kỵ nớc (các chất hữu cơ, muối halogen ) Cấu trúc CD đợc mô tả nh hình 1.1: Hình 1 Cấu trúc kích thớc CD I.1.2 Tính chất CD I.1.2.1 Tính chất vật lý Một số thông số vật lý CD đợc cho bảng 1.1 Bảng 1.1 Một số thông số vật lý CD [68,71] -CD -CD -CD + Khối lợng phân tử 972 1135 1297 + Số đơn vị glucoza + Số phân tử H2O lỗ 11 17 + Đờng kính () 4,7 - 5,3 6,0 - 6,6 7,5 - 8,3 + Đờng kính () 14,6 15,4 17,5 79 79 79 + Chiều cao () + Thể tích lỗ hang (ml/mol) 174 262 472 (ml/g) 0,1 0,14 0,2 (nm3) 0,174 0,262 0,472 14,2 1,85 23,2 255 - 260 255 - 265 240 - 245 12,33 12,2 12,08 + Độ tan (g/100ml, 25C) nớc + Điểm nóng chảy (C) + PKa + Khả tan nớc Trong phân tử CD, nhóm hydroxyl hớng bên ngoài, CD có khả tan nớc Khi nhiệt độ tăng, độ tan CD tăng: 25C, độ tan -CD là1,85 g/100ml (bảng 1.1) 50C, độ tan 5,628 g/100ml [14] -CD, nhóm hydroxyl C2và C3 phân tử glucoza kề quay theo hớng làm cho tơng tác chúng chặt chẽ, nên chúng tơng tác với phân tử nớc dung môi bên Vì độ hoà -CD tơng đối thấp Các phân tử khách thể có ảnh hởng đáng kể đến độ tan CD Một số hợp chất tạo phức không tan với CD số khác tạo phức tan tốt, chí tan tốt CD cha tạo phức Hiện tợng phân tử khách thể tơng tác với CD làm thay đổi hớng quay chúng Vì vậy, có trờng hợp phức tạo thành từ chất khách thể với -CD tan phức với - hay -CD Khi CD bị biến đổi (thay nhóm hydroxyl metyl hoá, amin hoá, este hoá, ete hoá), độ hoà tan tăng giảm Chẳng hạn, biến đổi nhóm 2- 3-hydroxyl CD phá vỡ cầu nối hydro miệng vòng CD, làm cho nhóm hydroxyl tơng tác tốt với nớc, CD trở nên tan tốt [14] + Khả tan dung môi hữu Nhìn chung, CD không tan hầu hết dung môi hữu cơ, nhiên chúng tan số dung môi hữu phân cực aprotic (chẳng hạn metanol, etanol, propanol, isopropanol, axeton ) + Độ bền nhiệt Các CD bền nhiệt nhiệt độ 250C, CD nóng chảy phân huỷ nhiệt bắt đầu xảy [bảng 1] + Khả hút ẩm Hàm ẩm cân -CD môi trờng có độ ẩm tơng đối 85% tơng ứng 13,5% 30C CD giữ trạng thái bột mịn, không bị hoá lỏng để lâu môi trờng có độ ẩm tơng đối cao [14] I.1.2.2 Tính chất hoá học + Độ bền hoá học So với oligosacarit mạch thẳng CD phân tử bền Các axít mạnh nh axít clohydric thuỷ phân CD, tạo hỗn hợp oligosaccarit khác (từ mạch thẳng phân tử CD bị mở vòng tận glucoza) Tốc độ thuỷ phân tăng nhiệt độ tăng nhng chậm - lần so với oligosacarit mạch thẳng tơng ứng [5] Trong môi trờng axít yếu nh axít hữu cơ, thuỷ phân hầu nh không xảy Cũng nh oligosaccarit polisaccarit tính khử khác, CD không bị thuỷ phân bazơ, chí nhiệt độ cao dung dịch kiềm đặc (trong dung dịch NaOH 0,35N, 70C không thấy có thuỷ phân CD) CD bền với nhiệt độ, tia UV hay IR Với tác nhân oxi hoá, CD bị oxi hoá làm mở vòng glucoza, nhng không tạo formaldehyt hay axít focmic (vốn chất độc) CD tính khử + Khả biến đổi hoá học Bằng phơng pháp hoá học enzim thay nhóm hydroxyl CD nhóm khác (metyl, amin, este, ete ) Khi đờng kính CD không bị thay đổi nhng chiều sâu lỗ hang giảm xuống [5] Mục đích biến đổi nhằm làm thay đổi độ hoà tan, thay đổi khả tạo phức (độ bền phức, độ chọn lọc khách thể) thêm nhóm có chức đặc hiệu dùng xúc tác I.1.2.3 Phức bao từ CD + Khả tạo phức CD Đây tính chất đặc biệt quan trọng CD, nhờ mở khả ứng dụng rộng rãi CD CD tạo phức bao (dạng khách thể - chủ thể) với nhiều hợp chất khác nhau, bao gồm chất béo mạch thẳng hay phân nhánh, aldehyt, keton, alcohol, axít hữu cơ, chất thơm, chất khí, hợp chất phân cực nh halogen, oxiaxít amin [18] Đây tợng chất khách thể bị giữ, bị bao bọc lỗ hang phân tử chủ thể CD phức này, CD đợc gọi phân tử "chủ thể", phân tử đợc bao bọc bên đợc gọi phân tử "khách thể" Các phân tử khách thể đợc bao bọc phần hay toàn vào lỗ hang phân tử chủ thể CD [9] Nhìn chung, phân tử CD bao chứa đợc phân tử khách thể Trong trờng hợp chất khách thể có khối lợng phân tử nhỏ lớn hơn, tỷ lệ 1/2 hay 2/1 Kích thớc lỗ hang khác CD làm cho chúng nhiều có tính chất chọn lọc tạo phức với phân tử có kích thớc khác Chẳng hạn, phân tử phenyl ăn khớp hoàn toàn với lỗ hang -CD, nhng với lỗ hang CD trống khoảng không nhỏ phân tử phenyl lung lay nhẹ bên lỗ Với lỗ hang lớn -CD, vòng phenyl lung lay phần khoảng không trống lớn hơn.Trong nhiều trờng hợp, phân tử liên kết đợc với -CD liên kết với -CD, phân tử liên kết với -CD liên kết với -CD Để phức tạo thành đợc bền, phân tử khách thể cần đợc bao khít lỗ hang CD I.1.3 ứng dụng phức bao CD Do có cấu tạo đặc biệt nên CD có khả tạo phức bao với nhiều hợp chất, qua thay đổi tính chất lý hoá chúng.Phức bao CD làm: - Thay đổi phản ứng hóa học phân tử chất khách thể + Tạo độ bền cho chất nhạy cảm với ánh sáng hay oxy + Phối trộn đợc phân tử hoạt động mạnh mà bất + Lựa chọn phản ứng cánh bao bọc nhóm định chức - Gắn cố định chất dễ bay + Cải tiến trình tàng trữ bảo quản + Giảm lợng chất thơm cần thiết nhờ giảm tổn thất + Thiết lập đợc công thức liều lợng cần thiết tốt - Thay đổi tính chất lý hóa + Tăng độ hòa tan khả tạo nhũ cho số chất + Cải thiện độ phân tán + Che khuất cục số hợp chất hỗn hợp phức tạp (chất thơm, chất màu) Với u điểm độ hoạt động tơng đối thấp lại độc nên CD đợc sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực nghiên cứu ứng dụng, đặc biệt công nghiệp dợc phẩm thực phẩm Nhờ tính chất mà CD có ứng dụng rộng rãi nghành nh: - Trong công nghệ thực Sử dụng CD để sản xuất dầu ăn, chất thơm, chất màu, vitamin, -CD đợc dùng để loại bỏ cholesteron chất béo sữa, nh để vận tải chất thơm Nhìn chung tác dụng lớn CD công nghiệp thực phẩm vừa có khả cố định hơng đồng thời có khả che giấu mùi khó chịu cho thực phẩm - Trong công nghiệp dợc CD đợc ứng dụng nhiều công nghiệp dợc với khả bật làm tăng hoạt tính sinh học thuốc (thông qua làm tăng độ hoà tan, độ bền, độ hấp thụ làm giảm tác dụng phụ thuốc) CD đợc dùng rộng rãi công thức thuốc giảm đau, thuốc chống nhiễm trùng, thuốc chống dị ứng, co giật, thuốc lợi niệu, chất chống nghiện [5] - Trong trình chuyển hoá sinh học lên men CD tạo phức với chất độc hay chất cạnh tranh sinh học làm giảm yếu tố ức chế enzim vi sinh vật Ngoài ra, CD làm tăng độ hoà tan chất hữu vốn tan nớc, tạo điều kiện nâng cao hiệu suất trình CD có khả tạo phức không tan với số sản phẩm trình chuyển hoá dùng để tách chọn lọc sản phẩm - Trong công nghệ môi trờng CD đóng vai trò quan trọng công nghệ môi trờng nhờ tác dụng làm hoà tan chất ô nhiễm hữu cơ, hấp thụ loại bỏ chất hữu nh kim loại nặng từ đất, nớc không khí trình tạo phức - Trong công nghiệp mỹ phẩm 10 ợng phân tử chất Chính muốn thủy phân hết lợng chất phải cần đến thời gian định - Phản ứng enzim dừng lại khi: + Lợng chất hết + Enzim bị hoạt lực + Sản phẩm phản ứng ức chế lại hoạt động enzim Sau tiến hành nghiên cứu ảnh hởng thời gian đến trình thủy phân dextrin thành đờng khử enzim AMG thu đợc kết với thời gian là thích hợp cho trình thủy phân dịch CD hóa enzim AMG Kết đợc sử dụng để tiến hành thí nghiệm sau 10 15 18.550 323853 16.483 194237 14.208 185246 15.100 303194 12.825 540388 11.283 1245065 9.358 2586613 0.00 8.217 623728 5.192 2267445 0.05 6.958 3722741 Volts 0.10 (beta- Cd) 0.15 10.350 3558627 Sau trình thủy phân dịch CD hóa tiến hành phân tích mẫu HPLC thu đợc kết nh hình 3.3: 20 25 Minutes Hình 3.3 : sắc ký đồ dịch sau thủy phân AMG III.3 Nghiên cứu lợng than thích hợp cho trình tẩy màu làm sạch: 39 Sau trình chuyển hoá, thuỷ phân dung dịch có có màu vàng nhạt lẫn nhiều tạp chất cần phải làm Dịch chuyển hoá đợc tẩy màu than hoạt tính lọc hút chân không Nếu lợng than không đủ để làm dịch, lợng than nhiều ảnh hởng không tốt đến trình lọc lãng phí, không kinh tế Vì cần nghiên cứu lợng than thích hợp cho trình tẩy màu, làm Thí nghiệm đợc tiến hành điều kiện sau: - Dịch sau thủy phân AMG có màu vàng đậm, đo độ hấp thụ quang bớc sóng 230nm 3,421 Nhiệt độ ủ than: 800C - Thời gian ủ than: 30 phút Với tỷ lệ than thay đổi Sau ủ than tiến hành lọc hút chân không dịch nóng Sau xác định cờng độ màu dịch sau lọc cách đo độ hấp thụ quang (Abs) bớc sóng 230nm cảm quan Kết thu đợc đợc trình bày bảng 3.6 Bảng ảnh hởng tỷ lệ than hoạt tính lên màu dịch sau tẩy màu Tỷ lệ than Abs đo = 230nm (% so chất khô) Nhận xét màu cuả dịch 3,421 Vàng đậm 0,5 0,334 Vàng sẫm 0,8 0,275 Vàng nhạt 1,0 0,254 vàng nhạt trắng 1,5 0,202 trắng 2,0 0,191 trắng 40 Kết luận: từ bảng kết thu đợc đa kết luận nh sau: - Nếu trình tẩy màu dịch đem kết tinh bẩn, tinh thể -CD thu đợc có độ tinh khiết thấp bán sản phẩm thị trờng giá thành thấp mà lại không đợc tiêu dùng a chuộm Vì bắt buộc phải có công đoạn tẩy màu làm - Khi tỷ lệ than tăng từ 0,5 1,5%(so với hàm lợng chất khô), trắng thể cờng độ hấp thu ánh sáng giảm từ 0,304 0,202 Nhng tiếp tục tăng tỷ lệ than vợt 1,5% cờng độ hấp thụ ánh sáng không giảm Nguyên nhân lợng than đủ hấp phụ hết tạp chất - Sau tiến hành thí nghiệm thu đợc kết là: với tỷ lệ than 1,5%(so với chất khô) thích hợp cho trình tẩy màu làm III.4 Nghiên cứu điều kiện tối u cho trình kết tinh -CD Kết tinh khâu cuối để thu hồi -CD nhng khâu định thành lao động.Muốn thu hồi -CD với hiệu suất cao điều kiện kết tinh yếu tố vô quan trọng có nồng độ dịch kết tinh, lợng nhân kết tinh, thời gian kết tinh, nhiệt độ kết tinh cần xác định tố để nâng cao hiệu suất kết tinh, giảm giá thành sản phẩm: III.4.1 nghiên cứu xác định nồng độ chất khô dịch thích hợp cho trình kết tinh-CD Do -CD có độ hòa tan nớc thấp, 1,85g/100ml 250C, phơng pháp tách -CD đơn giản làm cho nồng độ -CD dung dịch vợt điểm bão hòa -CD kết tinh dễ dàng Tuy nhiên nồng độ dịch cao cản trở lại trình kết tinh mà lại tốn lợng để cô đặc Vì cần xác định nồng độ chất khô dịch kết thích hợp cho trình kết tinh -CD Thí nghiệm đợc tiến hành điều kiện sau: 41 Hỗn hợp dịch CD hóa đợc thủy phân, tẩy màu đạt yêu cầu đem cô đặc tới nồng độ chất khô khác Tiến hành thủy phân điều kiện: - Bổ sung thêm 10/00 lợng nhân cấy - Kết tinh nhiệt độ 50C - Thời gian kết tinh: ngày Sau tiến hành lọc hút chân không thu tinh thể -CD, sấy nhiệt độ 40 C thu đợc kết nh bảng 3.7 Bảng 3.7 ảnh hởng nồng độ dịch đến trình kết tinh -CD STT Nồng độ dịch Hiệu suất kết tinh (Bx) kết tinh (%) 25 43,74 30 55,04 35 66,11 40 65,67 45 64,80 Kết luận: Trong khoảng nồng độ 25ữ350Bx hiệu suất kết tinh tăng tăng nhanh ( hiệu suất kết tinh tăng từ 43,74 66,11%), nhng khoảng nồng độ 35ữ500Bx hiệu suất kết tinh giảm chậm ( giảm từ 66,11- 64,80%) Có thể giả thích tợng là: - Do nồng độ thấp số phân tử -CD kết tinh số phân tử -CD nằm lại dịch nhiều so với kết tinh nồng độ cao Nhng nồng độ cao ảnh hởng không tốt tới tình kết tinh do:ở nồng độ dịch kết tinh cao độ nhớt dịch lớn cản trở khuyếch tán phân tử Nếu nồng độ dịch kết tinh cao hàm lợng đờng 42 dịch kết tinh vợt hàm lợng đờng bão hòa đờng kết tinh -CD làm cho độ tinh khiết sản phẩm giảm - Sau tiến hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hởng nồng độ đến trình kết tinh rút kết luận: nồng độ dịch kết tinh 35 0Bx thích hợp cho trình kết tinh Kết đợc áp dụng cho thí nghiệm sau III.4.2 ảnh hởng lợng nhân cấy đến trình kết tinh Lợng nhân cấy ảnh hởng lớn đến trình kết tinh để hiểu rõ ảnh hởng lợng nhân cấy đến trình kết tinh thì: Thí nghiệm đợc tiến hành điều kiện sau: - Nồng độ dịch kết tinh là:350Bx - Nhiệt độ kết tinh: 50C - Thời gian kết tinh : ngày Lợng nhân cấy bổ sung vào thay đổi từ 1,5 0/00 (so với lợng-CD có dịch kết tinh ) Sau lọc hút chân không, thu tinh thể sấy nhiệt độ thấp(40 0C ) kết thu đợc trình bầy bảng 3.8 Bảng 3.8 ảnh hởng lợng nhân cấy đến trình kết tinh: STT Lợng nhân kết tinh bổ Hiệu suất kết sung (0/00) tinh (%) 57,04 0,5 62,96 1,0 66,11 1,5 66,21 43 Kết luận: nồng độ dịch kết tinh ta không sử dụng nhân kết tinh thu đợc tinh thể to nhng hiệu suất kết tinh thấp (hiệu suất kết tinh không bổ sung nhân kết tinh :57,04%), nhng có bổ sung nhân kết tinh lợng nhân kết tinh tăng hiệu suất kết tinh tăng ( lợng nhân kết tinh tăng từ 0,5 1, 00/00 hiệu suất kết tinh tăng từ 57,4 66,11% ) nhng lợng nhân kết tinh tăng đến giới hạn (vợt 1,00/00) hiệu suất kết tinh không tăng nữa, hiệu suất kết tinh -CD điều kiện tiến hành nh đạt đợc hiệu suất kết tinh 66,11% Đồng thời kết tinh có bổ xung thêm nhân kết tinh thu đợc tinh thể mịn thuận lợi cho ứng dụng sau này.Vì -CD khó hòa tan mà muốn ứng dụng -CD -CD thờng phải trạng thái hòa tan mà tinh thể -CD nhỏ mịn dễ dàng cho trình hòa tan-CD Từ bảng kết thu đợc nh qua quan sát cảm quan sản phẩm nên chọn lợng nhân sử dụng để bổ xung vào trình kết tinh là 0/00 (sô với lợng -CD có dịch kết tinh) với nồng độ kết tinh thu đợc mịn, hiệu suất kết tinh cao Kết tinh thu đợc đem sấy khô nhiệt độ thấp(400C) III.4.2 Xác định thời gian thích hợp cho trình kết tinh Thời gian yếu tố quan trọng trình kết tinh -CD Nếu thời gian kết tinh ngắn, cha đủ để toàn lợng - CD dung dịch kết tinh hiệu suất kết tinh thấp, lợng - CD thất thoát lớn Hơn lợng - CD lại dịch kết tinh nhiều có ảnh hởng không tốt đến trình phân tách - CD sau Vì khả hòa tan - CD thấp - CD, để dịch nguyên nh đem kết tinh - CD - CD sót dịch lại đạt tới trạng thái bão hòa kết tinh - CD, độ tinh khiết sản phẩm - CD giảm Còn muốn tạo - CD tinh khiết lại phải tốn thêm lợng enzim để phá vỡ vòng - CD Khi thời gian kết tinh kéo dài lợng -CD không tăng chi phí điện làm lạnh lại tăng lên, chu kì làm việc thiết bị dài dẫn đến giảm hiệu kinh tế Vì nên để thời gian kết tinh cho toàn lợng -CD kết tinh hết Cho nên cần tiến hành thí nghiệm xác định thời gian thích hợp cho trình kết tinh: 44 Thí nghiệm đợc tiến hành điều kiện sau: - Hỗn hợp sau vòng hóa, thủy phân AMG, đợc tẩy màu, làm than hoạt tính - Cô đặc đến Bx = 35 - Bổ xung thêm 10/00 lợng nhân kết tinh - Để kết tinh nhiệt độ 50C Cứ lấy mẫu, tiến hành tách tinh thể -CD khỏi dịch cách lọc hút chân không sấy khô nhiệt độ 400C thu đợc kết theo dõi ảnh hởng thời gian đến trình kết tinh -CD đợc trình bầy bảng 9: Bảng 3.9: ảnh hởng thời gian tới trình kết tinh -CD STT Thời gian kết tinh (giờ) 16 24 32 40 48 56 64 Hiệu suất kết tinh (%) 14.05 24.97 35,25 45.9 55,88 66,25 66,30 66,31 Kết luận:Theo dõi trình kết tinh -CD, nhận thấy sau đầu lợng tinh thể tạo nhanh nhng cha nhiều (hiệu suất kết tinh đạt 14,05%), thời gian dài lợng tinh thể tạo nhiều (hiệu suất kết tinh tăng từ 14,05 66,25% ) Nhng kéo dài thời gian 48 lợng tinh thể tạo thành không tăng (hiệu suất kết tinh đạt đợc với thời gian kết tinh 48 66,25%) Nguyên nhân hàm lợng -CD dung dịch giảm xuống tới mức đủ bão hòa 45 Từ kết thí nghiệm thu đợc nhận thấy với thời 48 đủ cho trình kết tinh -CD Kết đợc chọn để tiến thí nghiệm III.4.4 theo dõi, so sánh trình kết tinh -CD nhiệt độ phòng nhiệt độ lạnh Nhiệt độ ảnh hởng lớn đến khả hòa tan nh khả kết tinh Nếu kết tinh điều kiện nhiệt độ thấp kéo theo chất khác kết tinh làm độ tinh khiết sản phảm giảm đồng thời tốn lợng để làm lạnh Nhng kết tinh nhiệt độ cao hiệu suất kết tinh giảm khả hòa tan tăng nhiệt độ tăng, khó khăn trình rửa tinh thể, dịch kết tinh có chứa đờng môi trờng thuận lợi cho vi sinh vật môi trờng sâm nhập vào phát triển nhiệt độ cao làm cho dịch kết tinh có mùi chua ảnh hởng tới sản phẩm kết tinh III.4.4.1 kết tinh nhiệt độ phòng Để tiết kiệm lợng làm lạnh nh thiết bị làm lạnh trớc tiên thử tiến hành kết tinh nhiệt độ phòng (nhiệt độ tự nhiên, với thời tiết Việt Nam thời điểm tiến hành thí nghiệm nhiệt độ trung bình 300C) Thí nghiệm đợc tiến hành với điều kiện nh sau: + Nồng độ dịch kết tinh là: 350Bx + Bổ xung thêm 10/00 lợng nhân kết tinh + nhiệt độ kết tinh là:300 Theo dõi trình kết tinh lấy mẫu thời gian kết tinh khác Sau tiến hành tách tinh thể -CD khỏi dịch cách lọc hút chân không sấy khô nhiệt độ 400C Kết theo dõi nhiệt độ kết tinh đợc trình bầy bảng sau 3.9: Bảng 3.9: theo dõi trình kết tinh nhiệt độ phòng 46 STT Thời gian kết tinh (giờ) Hiệu suất kết tinh(%) 2,11 16 6.05 24 11,13 32 16,53 40 22,74 48 29,89 56 36,79 64 41,84 10 72 45,72 11 80 49,14 12 88 49,12 Kết luận: Sau tiến hành quan sát thí nghiệm nhận thấy để kết tinh nhiệt độ phòng với thời tiết nóng nh nớc ta thì: Hiệu suất kết tinh tăng chậm, trung bình hiệu suất kết tinh tăng 5% sau kết tinh Vì thời gian kết tinh diễn dài Hơn dịch kết tinh dễ bị nhiễm vi sinh vật Nhận thấy cảm quan, dịch đục có mùi chua khó chịu Khi kết tinh nhiệt độ phòng thu đợc tinh thể nhỏ đay điều không mong muốn trình kết tinh, sau trình lọc hút có qua trình rửa tinh thể tinh thể qua nhỏ dễ bị thất thoát trình rửa III.4.4.2 So sánh trình kết tinh nhiệt độ phòng nhiệt độ lạnh Quá trình kết tinh nhiệt độ lạnh đựơc trình bầy nh phần III.4.3 Từ kết theo dõi hai trình kết tinh tinh đa kết luận: 47 - u điểm trình kết tinh nhiệt độ phòng so với nhiệt độ lạnh: + Không tốn lợng làm lạnh + Không cần thiết bị làm lạnh + Chi phí thiết bị giảm + Kỹ thuật đơn giản Nhợc điểm trình kết tinh nhiệt độ phòng so với kết tinh nhiệt độ lạnh: + Hiệu suất kết tinh thấp (kết tinh nhiệt độ phòng hiệu suất đạt cao 49,14% kết tinh nhiệt độ lạnh 66,11%) + Thời gian kết tinh kéo dài (để kết thúc trình kết tinh nhiệt độ phòng cần 80 kết tinh nhiệt độ lạnh cần 48 giờ), dẫn đến chu kỳ sản suất dài không kinh tế + Kết tinh nhiệt độ phòng dễ sảy tợng dịch kết tinh bị nhiễm vi sinh vật Làm cho dịch có mùi chua, ảnh hởng không tốt tới chất lợng sản phẩm Đồng thời phải tốn công đoạn xử lý dịch muốn sử dụng dịch để tiếp tục sản xuất -, - CD Từ u nhợc điểm phân tích trên, cân lợi ích kinh tế chất lợng sản phẩm quy trình công nghệ chọn phơng pháp kết tinh kết tinh nhiệt độ lạnh 50C Sau kết tinh thu hồi tinh thể - CD, tiến hành sấy tinh thể CD nhiệt độ 400C đợc sản phẩm CD, bao gói xuất thị trờng ta đợc CD thơng phẩm với chất lợng : + Độ tinh khiết 90% Điều đợc chứng minh đem tinh thể - CD thu đợc sau sấy phân tích phơng pháp HPLC, đợc kết nh hình 3.4 sau: 48 10.183 2170544 0.15 5.183 2745082 0.05 9.233 Volts 134161 (beta- Cd) 0.10 0.00 10 15 20 25 Minutes Hình 3.4: Sắc ký đồ mẫu phân tích tinh thể -CD sau sấy Với kết đạt đợc ghép với sơ đồ công nghệ sản suất dịch CD hóa đợc đa trớc viện công nghiệp thực phẩm có xây dựng quy trình sản xuất -CD từ tinh bột sắn nh hình 3.5 49 Dịch tinh bột 10% pha đệm Na-p pH 5,5 CGTaza 2% Dịch hóa 80oC, 15 phút CGTaza 1% CD hóa 55oC, 8h Vô hoạt enzim1200C, 15 phút AMG [E] 0,12%(v/w) Thủy phân dịch CD hóa :Bx 10, 600C, Than hoạt tính1,5% (so với chất khô) Tẩy màu làm 80oC, 30 phút Cô đặc Kết tinh:Bx 35, lượng nhân 10/00, 50C, 2ngày Sấy -CD thành phẩm Hình 3.5 Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất -CD từ tinh bột sắn 50 Kết luận Điều kiện vô hoạt enzin toruzim thích hợp: + Nhiệt độ: 1200C + Thời gian: 15 phút 2.Điều kiện thích hợp cho enzim AMG hoạt động: + Nồng độ chất khô: Bx = 10 + Nồng độ enzim: 0,12%(v/w) + Thời gian thủy phân: Tỷ lệ than thích hợp cho trình làm là:1,5% (so với hàm lợng chất khô) Điều kiện thích hợp cho trình kết tinh -CD + Nồng độ dịch kết tinh: Bx = 35 + Hàm lợng nhân kết tinh bổ sung:10/00 + Thời gian kết tinh: ngày + Nhiệt độ kết tinh : 50C Để hoàn thiện sản phẩm -CD đợc sấy nhiệt độ thấp (400C) hàm ẩm đạt đợc 14%, độ tinh khiết sản phẩm đạt 90% 51 Tài liệu tham khảo Tiếng Việt Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ thị Giang (1998), Công nghệ enzim, nhà suất Nông Nghiệp Nguyễn Văn Mùi (1982), Thực hành hoá sinh học, Nhà xuất khoa học kĩ thuật, Hà nội Đặng Thị Thu,Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ(1975) Nghiên cứu số tinh chất enzim glucoamilaza awamori ảnh hởng số bột Việt nam đến tốc độ phản ứng enzim Lơng thực thực phẩm Lê Ngọc Tú, Bùi Đức Hợi, Lu Duẩn, Ngô Hữu Hợp, Đặng Thị Thu, Nguyễn Trọng Cẩn (1999), Hoá học thực phẩm, Nhà xuất khoa học kĩ thuật, Hà nội Lê ngọc Tú, Lu Duẩn, Đặng Thị Thu, Lê Thị Cúc, Lâm Xuân Thanh, Phạm Thu Thuỷ (2000), Biến hình sinh học sản phẩm từ hạt, Nhà xuất khoa học kĩ thuật, Hà nội Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thăng, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lu Duẩn, Lê Doãn Biên (1997), Hoá sinh học công nghiệp, Nhà xuất khoa học kĩ thuật, Hà nội Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Thị Chân Châu, Nguyễn Lân Dũng Enzim vi sinh vật, tập Nhà xuất khoa học kỹ thuật Tổng cục thống kê (2005), Niên giám thống kê 2005, Nhà xuất Hà nội Tiếng anh B.A Van der Veen, J.C.M Uitdehaag, B.W Dijktra, L Dijkhuizen (2000), "Engineering of cyclodextrin glycosyltransferase reaction and product specificity", Biochim Biophys Acta, 1543, 336-360 10 Graciette Matioli, Gisella M Zanin, F.De Moraes (2002), " Influence of subtrate and product concentrations on the production of cyclodextrin 52 by CGTaza of Bacillus firmus, strain no 37", Appl Biochem Biotechnol., 98-100, 947-961 11 Kobayashi Shoichi, Noriyasu Wanatabe (1995), "Action of cyclodextrin producing enzyme (CGTase) and diglucosyl-cyclodextrin", Oyo Toshitsu Kagaku, 42(2), 203 - 210 12 Mamata Shigh, Rohit Sharma, U.C Banerjee (2002), "Biotechnological applications of cyclodextrin", Biotechnol Adv., 20, 341- 359 13 Starnes (2001), " Thermostable cyclodextrin glycosyltransferase processes using it", US Patent 6,184,001 Internet 14 www.betadexcyclodextrin.com/html/welcome.html 53 and [...]... thông qua các tác nhân hoá học, sinh học để sản xuất các sản phẩm biến tính nh glucoza, maltoza, cồn, mì chính, dextrin Trong sản xuất - CD dạng bột thì đi từ nguyên liệu là tinh bột sắn hồ hoá dới tác dụng của enzim cyclodextrin glucanotransferaza, vòng hoá tạo CD, xử lý và thu hồi - CD vì vậy cần nghiên cứu điều kiện tối u cho enzim xử lý dịch - CD và điều kiện tối u cho quá trình kết tinh - CD I.3... chi phí cho quá trình chuyển hóa và thu hồi sản phẩmnhng nồng độ cơ chất ảnh hởng rất lớn tới quá trình thu phân của enzim Vì vậy cần tiến hành nghiên cứu ảnh hởng của nồng độ cơ chất đến quá trình thủy phân dịch sau vòng hóa bằng enzim AMG Thí nghiệm thu phân dịch CD hóa bằng AMG đợc tiến hành ở các điều kiện: - Dịch sau vòng hoá vô hoạt enzim CGTaza có DE = 8,98 34 - Nhiệt độ thủy phân: 600C - Nồng... mạch tinh bột tạo ra các dextrin thích hợp cho quá trình vòng hóa (nhng hạn chế tạo đờng khử) và dịch có độ nhớt phù hợp Theo nhiều nghiên cứu, để phù hợp với quá trình CD hóa, dịch tinh bột sau dịch hóa phải có DE thấp, trong khoảng từ 2 10, tốt nhất là từ 2 - 5 [13] Quá trình dịch hóa có thể đợc thực hiện bằng enzim -amylaza hay CGTaza với điều kiện thích hợp với từng enzim Sau quá trình dịch hóa, phải... 3.1 Enzim cyclodextrin glucozyltransferaza (CGTaza) I.3.1.1 Giới thiệu vè enim CGTaza và nguồn sinh tổng hợp CGTaza Enzim Cyclodextrin glucozyltransferaza (CGTaza) hay còn gọi là cyclodextrin glucanotransferaza, danh pháp quốc tế là 1, 4-- D-glucan 4-- D(1, 4-- D-glucano)transferaza (EC 2.4.1.19) là enzim thu c họ -amylaza [24] Enzim này còn đợc xếp vào loại exo- enzim và không có khả năng đi qua các điểm... làm nguội dịch đến nhiệt độ thích hợp cho enzim CGTaza hoạt động tạo CD Sản phẩm của quá trình CD hoá thờng là một hỗn hợp của -, -, - CD cùng các oligosacarit khác Tỷ lệ của ba CD trên phụ thu c chủ yếu vào nguồn enzim và thời gian phản, khi sử dụng enzim CGTaza làm enzim vòng hóa thì th- 11 ờng thu đợc tỉ lệ giữa -, -, - CD tơng ứng là 42, 44 và 14[5] Sau quá trình CD hóa, cần vô hoạt enzim và tiến... II.3.5 xác định độ ẩm Dùng máy đo độ ẩm: Precisa HA60 (Thu sĩ) 26 Phần iii: kết quả nghiên cứu và thảo luận Để sản xuất ra -CD thì đề tài này đã kế thừa kết quả của các nghiên cứu trớc đó đã đa ra các điều kiện thích hợp để tạo ra dịch CD hóa có nhiều CD nhất Quy trình công nghệ sản xuất dịch CD đợc miêu tả ở hình 3.1: Dịch tinh bột 10% pha trong đệm Na-p pH 5,5 CGTaza 2% Dịch hóa 80oC, 15 phút CGTaza... một yếu tố không thể bỏ qua chính vì vậy tiến hành nghiên cứu ảnh hởng của nồng độ enzim đến quá trình thủy phân dextrin thành đờng khử của enzim AMG : Thí nghiệm đợc tiến hành ở các điều kiện sau: - Dịch sau CD hóa có :DE = 8,98 - Nồng độ cơ chất 10 0Bx - Nhiệt độ thu phân 600C - Thời gian thu phân 3h Còn nồng độ enzyme thay đổi và đã đạt đợc kết quả trình bầy ở bảng 3.4: Bảng 3.4.Xác định nồng độ... Than hoạt tính Than hoạt tính nhập từ Nhật Bản II.2 Thiết bị - Máy quang phổ UV-vis spectrophotometer 1601 của hãng Shimazu (Nhật) - Máy đo pH: Thermor Orion, Model 410 (Trung quốc) 22 - Máy đo độ ẩm: Precisa HA60 (Thu sĩ) - Khúc xạ kế cầm tay - Nồi cách thu GF1 mbH D3006 (Đức) - và các thiết bị khác của phòng thí nghiệm ii.3 phơng pháp nghiên cứu II.3.1 Phân tích DE: Xác định DE theo phơng pháp axit... quả này đợc sử dụng để tiến hành các thí nghiệm sau III.2 Nghiên cứu điều kiện tối u cho hoạt động của enzim AMG Sau vòng hoá và vô hoạt enzim trong dung dịch vẫn còn một lợng dextrin, các oligosacarit, maltoza, glcoza để thu đợc -CD có độ tinh khiết cao cần phải tiến hành chuyển hóa các chất này thành glucoza bằng cách sử dụng enzim glucoamilaza (AMG) để thủy phân các dextrin thành glucoza Vì vậy... giảm hiệu suất thu hồi CD Đây là một điều không mong muốn Vì vậy, cần tiến hành nghiên cứu để chọn đợc phơng pháp vô hoạt enzim CGTaza cho phù hợp, đảm bảo đạt đợc hiệu suất thu hồi -CD cao nhất có thể III.1.1 Vô hoạt enzym bằng cách đun sôi ở áp suất thờng Hầu hết các enzim bị vô hoạt khi đun sôi ở áp suất thờng Để đơn giản và kinh tế thì trớc tiên chọn phơng pháp vô hoạt enzim bằng cách đun sôi ở