Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên trong quá trình sản xuất bánh men rượu
Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ nguồn tự nhiên trình sản xuất bánh men rượu PHẦN ĐẶT VẤN ĐỀ Trong giới vi sinh vật, bên cạnh vi khuẩn, nấm mốc nấm men chiếm tỉ lệ lớn, bao gồm chủng có lợi có hại Đặc biệt số chủng nấm men có khả lên men số loại thực phẩm, sử dụng để sản xuất thực phẩm truyền thống Việc sử dụng nấm men với mục đích phục vụ cho người nhà bác học người Pháp Louis Pasteur nhà bác học người Đan Mạch E.C Hansen tiên phong nghiên cứu từ năm 1800 từ thời điểm này, công trình nghiên cứu tính đa dạng sản phẩm thực phẩm sản xuất có tác động nấm men cho thấy vai trò to lớn Ban đầu, để sản xuất cồn từ tinh bột, Châu Á, người ta thường dùng loại bánh men truyền thống; Châu Âu Châu Mỹ, người ta dùng chế phẩm enzyme thu nhận từ malt để đường hóa Theo thời gian, công nghệ sản xuất cồn rượu ngày hoàn thiện Từ bánh men thuốc bắc, thuốc nam người Châu Á, nhà khoa học phân lập giống vi sinh vật khiết có khả đường hóa cao ứng dụng thành công công nghiệp như: nấm Rhizopus Mucor (trong phương pháp amylose) hay loài nấm sợi Aspergillus phương pháp mycomalt Ngày nay, thay công đoạn nuôi cấy mốc, người ta sử dụng trực tiếp chế phẩm enzyme công nghiệp công đoạn đường hóa, làm tăng hiệu suất đường hóa hiệu suất lên men nhiều Các phương pháp sản xuất rượu theo quy mô công nghiệp có nhược điểm yêu cầu điểu kiện vô trùng nghiêm ngặt Trong đó, việc sản xuất rượu gạo theo phương pháp truyền thống chế phẩm bánh men rượu không đòi hỏi điều kiện nghiêm ngặt vi sinh, lại thu rượu có hương vị thơm ngon Do đó, nghiên cứu gần có xu hướng quay lại công nghệ lên men rượu truyền thống Hầu hết nghiên cứu nhằm nâng cao ổn định hiệu suất lên men truyền thống: nghiên cứu phân lập, ứng dụng chủng giống đặc biệt vào lên men rượu truyền thống Nhật Bản, Page Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ nguồn tự nhiên trình sản xuất bánh men rượu Philipines, Trung Quốc… Trong nước, có nhiều nghiên cứu đặc tính chủng giống nấm men, nấm mốc phân lập từ bánh men rượu; nghiên cứu ứng dụng loại bánh men có bổ sung hỗn hợp nấm men nấm mốc lên men rượu gạo có kiểm soát: nghiên cứu ảnh hưởng vị thuốc lên hệ vi sinh vật bánh men [16] Do cần phân lập nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng nấm men phân lập từ nguồn tự nhiên để tìm cách tối ưu hóa, ứng dụng vào việc sản xuất bánh men rượu cần thiết Xuất phát từ yêu cầu đó, tiến hành đề tài : “Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ nguồn tự nhiên trình sản xuất bánh men rượu” Page Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ nguồn tự nhiên trình sản xuất bánh men rượu PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan nấm men 2.1.1 Định nghĩa, hình thái cấu tạo nấm men 2.1.1.1 Định nghĩa [3], [12], [17] Nấm men (Yeast, levure) loại nấm đơn bào sinh sản hình thức nẩy chồi phân đôi tế bào, có cấu tạo hoàn chỉnh gần giống tế bào thể bậc cao Chúng cư trú nhiều nơi, đặc biệt lá, hoa đất, nước, lương thực, thực phẩm có hàm lượng đường cao Nấm men vi sinh vật có khả sử dụng nhiều loại hydratcacbon đường khác Loài nấm men Saccharomyces cerevisae có khả hấp thụ nhiều loại đường như: glucoza, fructoza, mannoza, galactoza, sacaroza, maltoza, maltotrioza phần rafinoza Ngoài loài có ích là: Saccharomyces cerevisae Saccharomyces uvarum (carlsbergensis) có khả sử dụng dextrin melibioza tương ứng Tuy nhiên, loài Saccharomyces loài có quan hệ gần gũi với khả chuyển hóa tất loại đường pentoza (riboza, xyloza, arabinoza), xenlobioza (sản phẩm thủy phân hemixenluloza, xenluloza), lactoza, insulin xenluloza [2], [10] 2.1.1.2 Hình thái tế bào nấm men [3], [11], [12] Nấm men vi sinh vật điển hình cho nhóm nhân thật Tùy loài nấm men mà tế bào có hình dạng khác hình cầu, hình trứng, hình ovan, hình elip thường không ổn định, phụ thuộc vào tuổi, loài điều kiện nuôi cấy So với vi sinh vật khác tế bào nấm men có kích thước tương đối lớn: đường kính khoảng 1µm; chiều dài 8µm.Và kích thước thay đổi tùy theo loài, lứa tuổi, điều kiện nuôi cấy 2.1.1.3 Cấu tạo tế bào nấm men [4], [11] Nấm men có cấu tạo tế bào phức tạp gần giống tế bào thực vật Có đầy đủ cấu tạo thành tế bào, màng, tế bào chất, ty thể, riboxom, nhân, không bào hạt dự trữ Page Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ nguồn tự nhiên trình sản xuất bánh men rượu Thành tế bào cấu tạo hai lớp phân tử bao gồm 90% hợp chất glucan mannan, phần lại protein, lipit glucozamin Glucan hợp chất cao phân tử D- Glucozamin, mannan hợp chất cao phân tử D Mannoza Trên thành tế bào có nhiều lỗ, qua chất dinh dưỡng hấp thu sản phẩm trình trao đổi chất thải Màng tế bào có chiều dày không 1nm dính chặt vào tế bào chất Tế bào chất có cấu trúc không đồng thể keo Độ nhớt tế bào chất cao nước 800 lần Nhân tế bào nấm men nhân điển hình, có màng nhân, bên chất dịch nhân có chứa hạch nhân Nhân tế bào nấm men ADN có protein nhiều loại men Ty thể quan lượng tế bào Ty thể nấm men có hình bầu dục, bao bọc lớp màng, màng gấp khúc thành nhiều lược nhiều ống nhỏ làm cho diện tích bề mặt màng tăng lên Cấu trúc lớp màng ty thể giống cấu trúc màng nguyên sinh chất Trên bề mặt màng có dính vô số hạt nhỏ hình cầu Các hạt có chức sinh lượng giải phóng lượng ty thể Trong ty thể có thành phần cần cho trình tổng hợp protein riboxom, loại ARN loại enzym cần thiết cho tổng hợp protein Riboxom tế bào nấm men có loại: loại 80S ( gồm tiểu thể 60S 40S) nằm tế bào chất, số khác gắn với tế bào chất; loại 70S( gồm tiểu thể 40S 30S) Ngoài quan trên, nấm men có không bào hạt dự trữ hạt volutin, hạt glycogen hạt lipit 2.1.2 Các trình sinh lý, sinh hóa tế bào nấm men 2.1.2.1 Dinh dưỡng nấm men [4], [12] Chất dinh dưỡng thấm qua màng vào tế bào từ chất môi trường nuôi cấy bên Khi tế bào trạng thái môi trường nghèo cạn chất dinh dưỡng chất dự trữ nội bào glycogen, tregaloza, lipit, hợp chất chứa nitơ sử dụng: dinh dưỡng nội bào Các chất dinh dưỡng sử dụng vào thành phần tế bào để phục vụ cho sinh trưởng cung cấp lượng cần thiết cho đời sống tế bào Page Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ nguồn tự nhiên trình sản xuất bánh men rượu * Dinh dưỡng cacbon Các hợp chất hữu khác loại đường dẫn xuất, rượu, axit hữu cơ, axit amin nguồn dinh dưỡng cacbon nấm men Hầu hết loại nấm men enzym polyhdrolaza có amylaza xenlulaza Vì nấm men không sử dụng trực tiếp tinh bột xenluloza hemixenluloza Hầu hết loài nấm men sử dụng đường glucoza Tỷ số đường nấm men sử dụng đặc điểm riêng loài Các loài sacharomyces lên men rượu vang sử dụng glucoza, fructoza, maltoza, saccaroza, galactoza, với rafinoza sử dụng phần, lactoza, melibioza, dextrin, pentoza tinh bột lại hoàn toàn không sử dụng Các axit hữu chiếm vị trí quan trọng trao đổi chất nấm men Chúng có khả kích thích ức chế sinh trưởng nấm men Chúng nguồn dinh dưỡng cacbon lượng Các axit béo làm nguồn cacbon dinh dưỡng phụ thuộc vào chủng loài nấm men, vào nồng độ axit, vào chiều dài mạch cacbon phân tử axit mức độ điện ly * Dinh dưỡng Nitơ [4], [12] Nguồn N cần thiết cho tổng hợp cấu tử chứa nitơ hợp chất hữu vô có sẵn môi trường Các hợp chất hữu chứa nitơ tế bào axit amin, nucleotit burin, pyrimidin, protein số vitamin Đa số nấm men không đồng hóa nitrat Nguồn nitơ vô nấm men sử dụng tốt muối amoni axit vô hữu Đó amoni sunphat, phosphat đến muối axetat, lactat, malat sucxinat Các nguồn nitơ hữu thường hỗn hợp axit amin, peptit, nucleotic Trong thực tế người ta hay dùng cao ngô, cao nấm men, dịch thủy phân protein tự nhiên ( đậu tương, khô lạc ) làm nguồn nitơ hữu Nấm men tiêu hóa tốt axit amin, pepton hoàn toàn không sử dụng protein Nấm men sử dụng axit amin dạng tự nhiên (L - axit amin) Trong trình nuôi cấy nấm men axit amin vừa nguồn nitơ vừa nguồn cacbon dinh dưỡng Page Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ nguồn tự nhiên trình sản xuất bánh men rượu * Dinh dưỡng nguyên tố vô khác [4], [12] Các nguyên tố vô nuôi cấy vi sinh vật nói chung, có nấm men phospho quan tâm trước hết, sau kali, magiê lưu huỳnh + Phospho tham gia vào thành phần quan trọng tế bào nucleoproteit, axit nucleic, polyphosphat, phospholipit hợp chất phospho đóng vai trò xác định biến đổi hóa sinh khác nhau, đặc biệt trao đổi chất hydratcacbon vận chuyển lượng Trong điều kiện kỵ khí nấm men tiêu hóa phospho chủ yếu giai đoạn đầu, dùng tới 80 - 90% tổng nhu cầu nguyên tố + Lưu huỳnh: thành phần số axit amin phân tử protein nhóm phụ (- SH) số enzym Trong môi trường với hàm lượng nhỏ làm tăng nảy chồi nấm men nồng độ 1mg/l lưu huỳnh kìm hãm trình + Các ion kali, canxi cần có môi trường nuôi cấy lên men Thông thường ion kali bổ sung với muối phosphat sunfat, Ca2+ Mg2+ thường có đủ nước sinh hoạt + Các nguyên tố vi lượng cần thiết để trình sinh lý tế bào nấm men xảy bình thường + Các nguyên tố vi lượng mangan, đồng, sắt, kẽm, molipden, bo, liti, rubidi, coban Các nguyên tố cần lượng nhỏ 2.1.2.2 Quá trình trao đổi chất cuả nấm men [12] Dị hóa đồng hóa tế bào nấm men * Sự dị hóa Sự dị hóa trình phân giải hợp chất dinh dưỡng có phân tử lớn để qua màng làm nội bào, sau tiếp tục phân giải chất hữu có phân tử nhỏ thành hợp chất trung gian thu nhận lượng Nấm men phân giải triệt để hợp chất hữu (kể sản phẩm trung gian) thành sản phẩm cuối CO2 H2O phần lớn lượng dạng ATP Phần lớn sản phẩm trình dị hóa vật liệu tế bào dùng cho sinh tổng hợp hợp chất cấu trúc tế bào mới, số sản phẩm tế bào không sử dụng thải môi trường như: rượu etylic, CO2, glycerin Page Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ nguồn tự nhiên trình sản xuất bánh men rượu Các chất dinh dưỡng nấm men thường dùng loại đường như: monosaccharit (glucoza, fructoza, galactoza ), disaccharit ( lactoza, maltoza, sacchroza ) trisaccharit (xenlobioza ) * Sự đồng hóa Đồng hóa sử dụng hợp chất trao đổi trung gian trình dị hóa tạo thành có sẵn môi trường để thực trình sinh tổng hợp cấu trúc tế bào, hợp chất cao phân tử polysaccharit, protein, axit nucleic, lipit tạo tế bào từ tiền chất đơn giản (axit amin, bazơ purin pyrimidin, axit hữu cơ) Các trình đồng hóa dị hóa thường xảy vùng khác tế bào, song chúng lại xảy đồng thời enzym đặc hiệu Các trình lên men hô hấp phản ứng hiếu khí hay kị khí đóng vai trò trao đổi chất tế bào nấm men Các phản ứng trao đổi chất tế bào nhờ chất xúc tác sinh học enzym Trong tế bào vi sinh vật có hàng ngàn enzym chuyển hóa xúc tác phản ứng đặc trưng Những enzym hệ enzym khác khu trú quan tế bào đơn giản chúng hòa tan tế bào chất Các enzym invertaza, permeaza đảm nhận việc đồng hóa loại đường vận chuyển chất qua màng tế bào Trao đổi lượng Nấm men cần nguồn lượng trình phân giải (hay oxy hóa đốt cháy) hợp chất dinh dưỡng từ vào tế bào Nguồn cung cấp lượng chủ yếu cho nấm men gluxit, thực chất số loại đường đơn đường đôi Các loại đường trước hết biến thành glucoza fructoza Hai loại đường bị biến đổi qua số phản ứng tới axit pyruvic giải phóng hợp chất lượng giàu ATP Tiếp theo giai đoạn đường phân phân giải triệt để hợp chất trung gian thành sản phẩm cuối CO2 H2O Hô hấp Nấm men thể sống kỵ khí tùy tiện Chúng sống điều kiện hiếu khí kỵ khí Chính chúng có kiểu hô hấp khác nhau, tùy thuộc vào lượng oxy cung cấp cho trình trao đổi chất Page Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ nguồn tự nhiên trình sản xuất bánh men rượu Hô hấp hiếu khí: C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H20 + 674 cal Hô hấp kỵ khí: C6H12O6 CH3CH2OH + 2CO2 + 33 cal 2.1.2.3 Sinh trưởng nấm men [12] Khi cấy nấm men hay vi sinh vật nói chung vào môi trường dinh dưỡng, chúng sinh sản chất dinh dưỡng cần thiết môi trường giảm tới mức thấp Khi sinh trưởng phát triển chậm dần ngừng hẳn, tế bào vài lần phân chia tiếp, phân tăng sinh khối không đáng kể Nếu trình nuôi cấy ta không bổ sung loại bỏ sản phẩm trao đổi chất ta có quần thể tế bào không gian sống có giới hạn Quá trình sinh trưởng phát triển vi sinh vật nói chung, có nấm men chia làm pha: - Pha lag (pha tiềm phát hay pha làm quen): Đây giai đoạn nấm men cấy vào môi trường chưa sinh sản Vận tốc sinh trưởng xem không Đây pha tiềm phát, nấm men thích nghi với môi trường mới, tế bào bị ức chế, chí chết Số lượng tế bào nấm men lúc không tăng tăng không đáng kể, trao đổi chất chúng xảy mạnh mẽ Tế bào có kích thước tăng lên đáng kể, hàm lượng chất tăng lên Trong môi trường đầy đủ dinh dưỡng, giống nấm men cấy vào non, khỏe pha lag ngắn - Pha logarit (pha phát triển số hay pha phát triển theo cấp số nhân) Trong pha nấm men phát triển số lượng tế bào theo cấp số nhân với tốc độ sinh trưởng cực đại Trong pha này, nấm men có hoạt tính sinh lý sinh hóa đặc trưng chúng nhạy cảm với nhân tố không thuận lợi tế bào trưởng thành trạng thái ổn định Trong pha số tế bào phát triển ạt, chất dinh dưỡng môi trường vô tận mà ngược lại ngày giảm đi, môi trường xuất tích tụ sản phẩm trao đổi chất không cần thiết giống nuôi cấy Như trình chất dinh Page Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ nguồn tự nhiên trình sản xuất bánh men rượu dưỡng cạn dần, sản phẩm sinh làm cho điều kiện thuận lợi cho sinh trưởng trình chuyển sang pha ổn định - Pha ổn định: Trong pha tế bào sống ổn định mật thể quần thể tối đa - Pha suy vong: Trong pha tế bào sống giảm dần tế bào chất tăng dần, số tế bào chất bị tự phân enzym proteaza nội bào Các tế bào sống trở nên già đi, kích thước nhỏ lại, biến dạng tế bào chất xuất dạng hạt Tế bào chất bị tự phân trở nên trống rỗng bên hạt chất béo nhỏ 2.1.2.4 Sinh sản nấm men [3], [4], [12], [13] Nấm men có hình thức sinh sản: sinh dưỡng (bằng nảy chồi phân cắt tế bào), hữu tính ( bào tử) vô tính (bằng bào tử) Tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy tế bào nấm men sinh sản theo cách sinh sản vô tính hay cách sinh sản hữu tính * Sinh sản sinh dưỡng Là hình thức sinh sản đơn giản nấm men Có hình thức sinh sản sinh dưỡng: nảy chồi hình thức phân đôi tế bào Ở hình thức nảy chồi, từ cực tế bào mẹ nảy chồi thành tế bào con, sau hình thành vách ngăn ngang tế bào Tế bào tách khỏi tế bào mẹ dính với tế bào mẹ lại tiếp tục nảy chồi làm cho nấm men giống hình dạng xương rồng tai nhỏ * Sinh sản vô tính: hình thức bào tử túi bào tử bắn Bào tử túi bào tử hình thành túi nhỏ gọi nang Trong nang thường chứa từ đến bào tử, đến 12 bào tử Bào tử bắn bào tử sau hình thành nhờ lượng tế bào bắn mạnh phía đối diện Đó hình thức phát tán tế bào * Sinh sản hữu tính: tế bào nấm men kết hợp với hình thành hợp tử Hợp tử phân chia thành bào tử nằm nang, nang chín bào tử phát tán Nếu tế bào nấm men có hình thái kích thước giống tiếp hợp với gọi tiếp hợp đẳng giao Nếu tế bào nấm men khác gọi tiếp hợp dị giao Page Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ nguồn tự nhiên trình sản xuất bánh men rượu 2.1.3 Một số ứng dụng nấm men 2.1.3.1 Vai trò ứng dụng nấm men công nghiệp thực phẩm [12], [13], [17] Các sản phẩm từ nấm men nuôi cấy hiếu khí ta thu lượng lớn sinh khối sản phẩm chủ yếu sinh khối nấm men dùng làm men bánh mỳ, bổ sung vào thức ăn chăn nuôi để cân đối protein vitamin phần dinh dưỡng, nuôi cấy kị khí ta thu rượu etylic sản phẩm chủ yếu, có loạt sản phẩm phụ, CO sản phẩm kinh tế, lại hợp chất có mùi vị hương thơm làm cải thiện làm giảm chất lượng cho rượu thành phẩm Nấm men nhóm vi sinh vật phân bố rộng rãi thiên nhiên, tham gia vào trình chuyển hóa vật chất, phân hủy chất hữu đất Hoạt tính sinh lý nhiều loại nấm men ứng dụng công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp ngành khác Đặc biệt trình sản xuất lọai rượu, cồn, nước giải khát lên men, làm thức ăn gia súc; y học sản xuất chất kháng sinh penixilin, việc tổng hợp loại axit hữu cơ, loại enzym, nhân tố sinh trưởng, công nghệ enzym nấm men nhân tố tích cực Ngoài hoạt tính sinh lý, thân tế bào nấm men có nhiều loại vitamin axit amin, đặc biệt axit amin không thay Đặc tính dùng để chế tạo thức ăn gia súc từ nấm men 2.1.3.2 Ứng dụng nấm men sản xuất rượu [12], [14] Bản chất trình lên men Về chất, lên men trình oxy hóa khử sinh học thực hoạt động sống vi sinh vật xúc tác enzym nhằm cung cấp lượng hợp chất trung gian cần thiết cho chúng Cũng trình oxy hóa khử sinh học thể khác, mạch phản ứng đường phân, chu trình Krebs, chu trình pentosophosphat phanr ứng hóa sinh trình lên men tế bào vi sinh vật Khác với trình hô hấp, trình lên men, hydro (gồm e - H+) tách khỏi chất chuyển tới chất nhận cuối chất hữu Page 10 Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ nguồn tự nhiên trình sản xuất bánh men rượu Hình 4.1 Đồ thị biểu diễn khả sinh trưởng chủng nấm men theo thời gian nuôi cấy Từ bảng 4.2 nhận thấy, từ - 12h chủng nấm men sinh trưởng chậm, thời kỳ chủng nấm men sinh tổng hợp chất protein, axitnucleotit, enzym thời gian chúng với thích nghi môi trường Sau 12h tất chủng nấm men có sinh khối tăng lên rõ rệt đạt mức cực đại 24h (giá trị OD đo từ 0.723 - 1.126) Điển hình chủng Y1, 12h mật độ quang đo 0.579, sau 24h mật độ quang đo 0.994 (gần gấp lần) Tuy nhiên, thời gian nuôi cấy dài lượng sinh khối giảm dần chủng nấm men sau 72h mật độ quang đo 0.484 - 0.750 Điều giải thích sau: giai đoạn đầu trình sinh trưởng phát triển (pha lag pha log) vi sinh vật sinh tổng hợp mạnh mẽ hợp chất để tăng kích thước số lượng tế bào dẫn đến kết sinh khối nấm men tăng mạnh (ở 24h), nhiên đến pha cân pha tử vong chất dinh dưỡng giảm nhanh chúng đồng hóa mạnh môi trường trường tích lũy chất độc nguyên nhân dẫn đến tế bào chết hàng loạt [12] Từ kết kết luận thời gian tối thích để sinh khối đạt giá trị cực đại chủng nấm men 24h Do Page 26 Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ nguồn tự nhiên trình sản xuất bánh men rượu chọn thời gian nuôi cấy thích hợp 24h để nghiên cứu tính chất 4.2.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến khả phát triển chủng nấm men Để đánh giá khả sinh trưởng chủng nấm men phân lập được, tiến hành lên men trong môi trường Hansen lỏng (MT2) nhiệt độ khác nhau: 25oC , 30oC, 35oC, 40oC Khả sinh trưởng chủng thể cách đo tăng sinh khối thông qua giá trị OD bước sóng 620nm suốt chu kỳ lên men Kết trình bày bảng 4.3 hình 4.2 - 4.5 Từ bảng 4.3 nhận thấy rằng: tất chủng nấm men có xu hướng phát triển theo nhiệt độ tương đương nhau, cụ thể tăng nhiệt độ cao chủng nấm men phát triển mạnh (giá trị OD thu từ 0.620 - 1.188), chủng Y2 có khả thích ứng với khoảng nhiệt độ mạnh (OD đo đạt mức cao xử lý thống kê không thấy có sai khác khoảng nhiệt độ (1.115 - 1.188) Trong khoảng nhiệt độ từ 250C - 300C hầu hết chủng nấm men có khả sinh trưởng phát triển mạnh (giá trị OD tăng mạnh 0.620 1.126), sau khoảng thời gian 300C sinh trưởng phát triển chủng nấm men vào mức ổn định có xu hướng giảm 40 0C Như vậy, khoảng nhiệt độ thích hợp đến khả phát triển chủng nấm men nghiên cứu 30 - 350C Kết hoàn toàn phù hợp với số tác giả [6], [12] cho đa số nấm men tốt khoảng nhiệt độ từ 28 - 32 0C Đồng thời, Qureshi S K cộng (2007) nghiên cứu số đặc tính sinh lý, sinh hóa chủng nấm men phân lập từ mốt số nước trái thuộc họ cam, quýt nước mía hầu hết chủng phân lập phát triển tốt nhiệt độ 300C [19] Page 27 Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ nguồn tự nhiên trình sản xuất bánh men rượu Bảng 4.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả phát triển chủng nấm men Nhiệt độ (0C) 25 30 35 40 OD620nm Y1 0.620b 1.012a 1.121a 1.102a Y2 1.115 1.126 1.188 1.187 Y3 0.723b 1.072a 1.107a 0.917ab K2 0.724b 1.073a 1.170a 0.915ab Ghi chú: - Số liệu trình bày bảng giá trị trung bình với n (n=3) - Số liệu cột có mũ khác sai khác có ý nghĩa ( α = 0.05) Hình 4.2 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng chủng Y1 Page 28 Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ nguồn tự nhiên trình sản xuất bánh men rượu Hình 4.3 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến khả phát triển chủng Y2 Hình 4.4 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến khả phát triển chủng Y3 Page 29 Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ nguồn tự nhiên trình sản xuất bánh men rượu Hình 4.5 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến khả phát triển chủng K2 4.2.3 Khảo sát khả lên men nguồn đường chủng nấm men Ở thí nghiệm này, sử dụng môi trường lên men môi trường nước chiết giá đậu có bổ sung 2% loại đường glucoza, saccharoza, maltoza lactoza (MT3) Tiến hành lên men nhiệt độ 300C thời gian 24h Kết trình bày bảng 4.4 Bảng 4.4 Khả lên men nguồn đường chủng nấm men Kí hiệu khuẩn lạc Hiện tượng Glucoza Saccharoza Maltoza K2 + + Y1 + + Y2 + + Y3 + + Ghi chú: (-) : khả lên men (+) : có khả lên men + + + + Lactoza - Đối chứng - Page 30 Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ nguồn tự nhiên trình sản xuất bánh men rượu Qua bảng nhận thấy rằng: tất chủng nấm men K2, Y1, Y2, Y3 có khả lên men loại đường là: glucoza, saccharoza maltoza khả lên men đường lactoza Sở dĩ có kết thu glucoza nguồn cacbon hầu hết vi sinh vật dễ sử dụng Đường sacharoza, tác dụng enzyme invertaza bị thủy phân tạo thành đường glucoza fructoza nấm men sử dụng [14] Đường maltoza thủy phân enzym maltoaza tạo thành phân tử đường glucoza Ngoài ra, nấm men không sử dụng đường lactoza [3], [12],[13] Kết phù hợp với nguyên lý Kluyver Dekker: “Những loài nấm men không lên men đường glucoza không lên men loại đường khác” nấm men đồng thời lên men maltoza lactoza ” [12] Tương tự, Qureshi S K cộng (2007) khảo sát khả lên men nguồn đường glucoza, saccharoza, maltoza lactoza chủng nấm men S cerevecise, S kluyeri, S ludwigii, S exigus, S octosporus thu kết tất chủng không lên men đường lactoza [19] Từ kết thu dựa vào phương pháp xác định nấm men Nguyễn Lân Dũng [1] khẳng định chủng: K2, Y1, Y2, Y3 phân lập từ nho dứa nấm men 4.2.4 Khảo sát khả thủy phân tinh bột chủng nấm men Từ chủng nấm men có khả lên men đường tiếp tục khảo sát khả thủy phân tinh bột Sau 24h nuôi cấy nhiệt độ 30 0C, nhỏ dung dịch Lugol, quan sát vòng phân giải tinh bột, kết trình bày bảng 4.5 Bảng 4.5 Kết khảo sát khả thủy phân tinh bột chủng nấm men Kí hiệu khuẩn lạc Khả thủy phân tinh bột K2 Y1 Y2 Y3 Ghi chú: (+) : Có khả thủy phân tinh bột (-) : Không có khả thủy phân tinh bột Page 31 Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ nguồn tự nhiên trình sản xuất bánh men rượu Qua bảng 4.5 thu kết quả: tất chủng nấm men khảo sát chủng có khả thủy phân tinh bột (môi trường bắt màu xanh với dung dịch Lugol) Điều giải thích rằng: chủng nấm men enzyme amylaza nên chúng thủy phân tinh bột nhuộm dung dịch Lugol tạo màu với Iod Từ kết thu được, kết luận chủng nấm men phân lập từ nguồn nho dứa khả thủy phân tinh bột 4.2.5 Khảo sát khả lên men rượu chủng nấm men Từ chủng tiến hành khảo sát khả lên men rượu cách sử dụng bình tam giác có chứa 200ml dịch lên men (MT4), bổ sung 3% dịch nấm men chủng sau tiến hành nhân giống sau 24h Lên men thời gian 24 – 48h, tiến hành quan sát tượng định tính, định lượng tạo thành CO2 bình lên men Kết thể bảng 4.5 Bảng 4.6 Kết khảo sát khả lên men rượu chủng nấm men Kết Kí hiệu Phản ứng với Phản ứng khuẩn lạc Hiện tượng Ba(OH)2 với K2Cr2O7 + + Sủi bọt khí thành lớp dày Y1 bề mặt Y3 Sinh bọt khí không nhiều K2 Sinh bọt khí ít, sủi bọt khí từ lên, bọt nhỏ, không bền + + + + + + Khả sinh bọt khí mạnh, thành lớp dày bề mặt Ghi chú: Phản ứng với Ba(OH)2 (+): Tạo kết tủa trắng (- ): tượng Phản ứng với K2Cr2O7 (+): tạo dung dịch màu xanh lam (-) : màu nâu đậm Y2 Page 32 Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ nguồn tự nhiên trình sản xuất bánh men rượu Kết nghiên cứu cho thấy: sau 48h quan sát, tất chủng nấm men có phản ứng dương tính với (BaOH) K2Cr2O7, H2SO4 đậm đặc Điều chứng tỏ: chủng nấm men phân lập có khả lên men đường tạo rượu CO2 Đồng thời quan sát tượng suốt trình lên men, nhận thấy rằng: Trong 12 đầu chủng Y1, Y2, Y3, K2 chủ yếu giai đoạn thích nghi với môi trường tiến hành sinh sản để tăng số lượng tế bào nên hàm lượng CO2 tạo giai đoạn không đáng kể Sau đó, chủng nấm men tiến hành trình hô hấp yếm khí, sử dụng nguồn chất glucoza để lên men sinh rượu CO2 Lúc môi trường bắt đầu có bọt bề mặt sủi bọt khí, số lượng tế bào nấm men đạt cực đại thời gian từ 12 – 24h (đã khảo sát thi nghiệm trên) làm cho trình lên men bắt đầu tăng nhanh thời điểm Nhưng lượng rượu tạo trình lên men tăng dần ức chế hoạt động nấm men làm cho trình lên men bị giảm sau 48h Kết phù hợp với nghiên cứu Trần Xuân Nghạch cộng [10] nghiên cứu Vụ công nghiệp “ lên men sản phẩm cồn nhẹ”[21] 4.2.6 Khảo sát khả lên men chủng nấm men cách định lượng CO2 sinh Để đánh giá khả lên men chủng nấm men phân lập được, tiến hành định lượng CO2 thông qua việc xác định hàm lượng CO sinh phương pháp cân trọng lượng bình lên men [5] Kết trình bày bảng 4.7 hình 4.6 Bảng 4.7 Hàm lượng CO2 sinh chủng nấm men Thời gian (h) Hàm lượng CO2 ( gCO2/100ml ) 12 24 36 48 Y1 1.085m 3.948j 5.408gh 7.796d Y2 9.620c 11.614b 12.596a 13.101a Y3 2.240l 5.485fg 6.061ef 6.260e K2 1.840l 3.276k 4.167ij 4.773ih Chủng Ghi chú: - Số liệu trình bày bảng giá trị trung bình với n (n=3) - Số liệu bảng có mũ khác sai khác có ý nghĩa ( α = 0.05) Page 33 Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ nguồn tự nhiên trình sản xuất bánh men rượu Hình 4.6 Đồ thị thể khả sinh CO2 chủng nấm men Qua kết bảng 4.6 cho thấy: tất chủng nấm men có lượng CO2 sinh trình lên men tăng dần theo thời gian Trong chủng Y2 có hàm lượng CO sinh cao tất chủng thời điểm khảo sát, hàm lượng CO đạt cực đại 48h lên men (13.101g CO 2/100ml dịch lên men) Điều kết luận rằng: chủng Y2 có khả lên men tốt So sánh với kết nghiên cứu khác Qureshi S K cộng (2007) [19] khảo sát khả sinh khí chủng nấm men S cerevecise, S kluyeri, S ludwigii, S exigus, S octosporus nhận thấy tất chủng sinh khí mạnh sau ngày lên men (24h) Teramoto cộng (2005) [20] khảo sát lượng CO2 sinh chủng S cerevisiae W4, S cerevisiae ET99, S cerevisiae K7 300 C 11.5 – 13.2 (gCO2/100ml), kết tương tự với kết thu hàm lượng CO sinh chủng Y2 sau 24h lên men (11.614 - 13.101 gCO2/100ml) Vì chọn chủng Y2 để sản xuất bánh men rượu Page 34 Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ nguồn tự nhiên trình sản xuất bánh men rượu 4.3 Quy trình sản xuất bánh men rượu 4.3.1 Phương pháp tạo bánh men: Theo kết khảo sát khả thủy phân tinh bột chủng nấm men phân lập K2, Y1, Y2 Y3 bảng 4.5 cho kết luận chủng khả thủy phân tinh bột Vì vậy, quy trình sản xuất bánh men nghiên cứu bổ sung kết hợp chủng nấm men nấm môc Aspergillus oryzae chủng có khả thủy phân tinh bột mạnh Phương pháp tạo bánh men rượu: Gạo tẻ sau ngâm nước, vớt để nước xay thành bột mịn, sau đem trộn với nước nấm men, nấm mốc giống theo tỷ lệ 5% nấm men 2% nấm mốc Tạo hình bánh men, rải khay phủ lớp trấu, ủ bánh men 30 0C, thời gian khoảng 24 30h Sau đem sấy nhiệt độ 350C thời gian 10 – 15h 4.3.2 Khảo sát ảnh hưởng độ ẩm bột gạo sau nghiền đến chất lượng bánh men Độ ẩm bột nhào yếu tố vô quan trọng trình sản xuất bánh men, với độ ẩm thích hợp chủng nấm men, nấm mốc phát triển mạnh, trình tạo bánh men dễ dàng Độ ẩm bột nhào cao hay thấp ảnh hưởng xấu đến chất lượng nấm men phát triển nấm men xâm nhập đối tượng vi sinh vật lạ Do đó, cần khống chế độ ẩm thích hợp cho phát triển nấm men, nấm mốc cách thuận tiện Tham khảo tài liệu Nguyễn Mạnh Tuấn cộng nghiên cứu tỷ lệ nấm men nấm mốc trình sản xuất bánh men rượu [16] bổ sung 5% nấm men chủng Y2 2% nấm mốc Aspergillus oryzae Kết đánh giá ảnh hưởng độ ẩm bột gạo đến chất lượng bánh men rượu trình bày bảng 4.8 Bảng 4.8 Ảnh hưởng độ ẩm bột gạo đến chất lượng bánh men Độ ẩm (%) Chất lượng bánh men 40 45 50 55 Màu trắng sáng, khô, cứng Màu trắng tối hơn, khô, cứng Màu vàng, khô, cứng Màu vàng đậm hơn, khô, cứng Page 35 Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ nguồn tự nhiên trình sản xuất bánh men rượu Kết cho thấy, độ ẩm thấp bánh men tạo thành khô, bề mặt sần sùi, màu sáng (40 – 45%) Độ ẩm 50 – 55% bánh men tạo thành có bề mặt bóng nhẵn , bánh men có màu vàng nhạt 4.3.3 Khảo sát khả lên men bánh men rượu theo độ ẩm khác Bánh men sau tạo thành với độ ẩm bột gạo khác (40, 45, 50 55%), tiến hành lên men môi trường lên men (MT4) nhiệt độ 300C 48h Để đánh giá khả lên men chủng nấm men phân lập được, tiến hành định lượng CO2 thông qua việc xác định hàm lượng CO sinh phương pháp cân trọng lượng bình lên men Kết trình bày bảng 4.9 hình 4.7 Bảng 4.9 Khả lên men bánh men rượu độ ẩm khác Thời gian (h) Hàm lượng CO2 ( gCO2/100ml) 12 24 36 48 Độ ẩm 40 2.782k 6.412h 8.319f 8.740ed 45 2.103l 3.352j 6.537h 9.311bc 50 4.390i 7.033g 9.035cd 9.893a 55 3.352J 6.480h 8.701e 9.416b Ghi chú: - Số liệu trình bày bảng giá trị trung bình với n (n=3) - Số liệu bảng có mũ khác sai khác có ý nghĩa ( α = 0.05) Page 36 Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ nguồn tự nhiên trình sản xuất bánh men rượu Hình 4.7 : Đồ thị thể khả sinh CO2 bánh men rượu theo độ ẩm khác Kết bảng 4.9 cho thấy: tất loại bánh men rượu có lượng CO2 sinh trình lên men tăng dần theo thời gian (hàm lượng CO2 thu từ 2.10 - 9.893 gCO2/100ml), hàm lượng đạt CO2 sinh đạt cực đại sau 48h lên men (8.740 - 9.893gCO2/100ml) So sánh khả lên men bánh men rượu độ ẩm khác nhau, dễ dàng nhận rằng: hàm lượng CO2 sinh bánh men độ ẩm 50% cao so với loại bánh men thời điểm khảo sát (9.893 gCO2/100ml) So sánh với kết nghiên cứu Nguyễn Mạnh Tuấn cộng [16] khảo sát khả sinh khí bánh men độ ẩm khác nhận thấy bánh men độ ẩm từ 55- 50% sinh khí CO2 mạnh, kết tương tự với kết thu hàm lượng CO sinh bánh men độ ẩm sau 48h lên men (9.416 – 9.893 gCO2/100ml) PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Page 37 Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ nguồn tự nhiên trình sản xuất bánh men rượu 5.1 Kết luận - Từ nguồn nho dứa phân lập chủng nấm men là: K2, Y1, Y2 Y3 - Đã xác định số đặc điểm sinh hóa chủng nấm men như: + Thời gian thích hợp cho sinh trưởng phát triển chủng nấm men từ 12 - 24h đạt giá trị cực đại 24h + Nhiệt độ thích hợp cho phát triển nấm men khoảng 30 350C, nhiêt độ tối thích cho phát triển chủng nấm men 300C + Không có chủng nấm men có khả thủy phân tinh bột + Cả chủng có khả lên men đường glucose, maltose, saccharose Không có chủng nấm men có khả lên men đường lactose + Cả chủng có khả lên men sinh CO trình lên men rượu, chủng Y2 có khả sinh CO2 mạnh Vì chọn chủng Y2 để sản xuất bánh men rượu - Xác định phương pháp sản xuất bánh men rượu + Chất lượng bánh men rượu đánh giá tốt độ ẩm bột gạo từ 50 - 55% + Độ ẩm thích hợp cho bánh men rượu lên men đạt hàm lượng CO2 mạnh 50% 5.2 Kiến nghị - Thử nghiệm nhân giống làm chế phẩm nấm men môi trường cải biến để thay môi trường Hansen đắt tiền - Định danh chủng nấm men phân lập - Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ giống bổ sung vào đến chất lượng bánh men - Nghiên cứu khả ứng dụng nấm men vào thực tế sản xuất lên men sản phẩm truyền thống, sản xuất chế phẩm vi sinh vật Page 38 Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ nguồn tự nhiên trình sản xuất bánh men rượu - Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất bánh men rượu - Khảo sát thông số công nghệ quy trình sản xuất bánh men rượu (độ thông khí, nồng độ cồn, nhiệt độ, thời gian…) - Đánh giá tính chất cảm quan, phương pháp bảo quản bánh men rượu thu Page 39 Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ nguồn tự nhiên trình sản xuất bánh men rượu Page 40 [...]... của các chủng nấm men như: thời gian, nhiệt độ + Khảo sát khả năng thủy phân tinh bột của các chủng nấm men - Phương pháp sản xuất bánh men rượu + Sản xuất bánh men rượu từ chủng nấm men phân lập được + Ảnh hưởng của độ ẩm đến chất lượng bánh men và khả năng lên men rượu của bánh men 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Nấm men 3.3.1.1 Phân lập nấm men [6[, [7] Page 18 Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân. .. chủng Y1 Page 28 Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên trong quá trình sản xuất bánh men rượu Hình 4.3 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của chủng Y2 Hình 4.4 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của chủng Y3 Page 29 Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên trong quá trình sản xuất bánh men rượu. .. Men mốc giống Xay thành bột Nghiền mịn Trộn men Nước Làm ẩm Tạo hình Ủ Hong khô Bánh men rượu Quy trình sản xuất bánh men rượu theo phương pháp truyền thống Page 16 Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên trong quá trình sản xuất bánh men rượu Thuyết minh quy trình: Nguyên liệu làm bánh men: Bánh men sử dụng trong sản xuất rượu truyền thống là bột gạo ẩm trộn lẫn với bánh men. .. Xanh lam Page 21 Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên trong quá trình sản xuất bánh men rượu 3.3.2 Phương pháp sản xuất bánh men rượu 3.3.2.1 Quá trình nhân giống nấm men, nấm mốc [16] Sau khi xác định khả năng lên men của các chủng nấm men phân lập được, lựa chọn chủng nấm men nào có khả năng lên men tốt nhất đem đi nhân giống trên môi trường Hansen – Cao nấm men (MT2) ở nhiệt... PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng nghiên cứu Page 17 Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên trong quá trình sản xuất bánh men rượu - Nấm men được phân lập từ các nguồn : dứa, nho có trong tự nhiên - Gạo tẻ được mua tại các chợ ở thành phố Huế - Nấm mốc Aspergillus oryzae thuần chủng từ Nhật Bản Môi trường nuôi cấy Các môi trường và thành phần môi trường sử dụng trong nghiên cứu. .. vi sinh vật trong bánh men, để sát trùng hoặc có thể tạo mùi thơm đặc trưng của sản phẩm Page 15 Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên trong quá trình sản xuất bánh men rượu 2.3 Quy trình sản xuất bánh men theo phương pháp truyền thống Giới thiệu bánh men và quy trình sản xuất bánh men theo phương pháp truyền thống [16] Bánh men là một loại men rượu được sản xuất thủ công.. .Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên trong quá trình sản xuất bánh men rượu khác nhau tạo thành các sản phẩm tích tụ trong môi trường Đó là các sản phẩm mà người ta nhận được trong sản xuất lên men Năng lượng giải phóng ra từ sự phân giải các hợp chất hữu cơ trong quá trình sản xuất lên men tuy không nhiều, song do chính là nguồn cung cấp năng lượng đáp ứng nhu cầu... 0.05) Page 33 Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên trong quá trình sản xuất bánh men rượu Hình 4.6 Đồ thị thể hiện khả năng sinh CO2 của các chủng nấm men Qua kết quả ở bảng 4.6 cho thấy: tất cả các chủng nấm men đều có lượng CO2 sinh ra trong quá trình lên men tăng dần theo thời gian Trong đó chủng Y2 có hàm lượng CO 2 sinh ra cao nhất trong tất cả các chủng ở các thời điểm... và đẩy ống Durham để biết nấm men có hay không có khả năng lên men từng nguồn đường Khảo sát khả năng thủy phân tinh bột của các chủng nấm men phân lập được [1] Page 20 Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên trong quá trình sản xuất bánh men rượu Cho môi trường Hansen đã được thay glucoza bằng tinh bột vào các đĩa peptri, sau đó cấy các chủng nấm men theo phương pháp chấm... Phản ứng với K2Cr2O7 (+): tạo dung dịch màu xanh lam (-) : màu nâu đậm Y2 Page 32 Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên trong quá trình sản xuất bánh men rượu Kết quả nghiên cứu cho thấy: sau 48h quan sát, tất cả các chủng nấm men đều có phản ứng dương tính với (BaOH) 2 và K2Cr2O7, H2SO4 đậm đặc Điều này chứng tỏ: các chủng nấm men phân lập được đều có khả năng lên men đường