BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG BÙI THỊ KIM THU NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHITOSAN HÒA TAN TRONG NƯỚC VÀ ỨNG DỤNG ĐỂ KÍCH THÍCH SỰ NẢY MẦM CỦA LÚA LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA - 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG BÙI THỊ KIM THU NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHITOSAN HÒA TAN TRONG NƯỚC VÀ ỨNG DỤNG ĐỂ KÍCH THÍCH SỰ NẢY MẦM CỦA LÚA LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60420201 Quyết định giao đề tài: 529/QÐ-ÐHNT ngày 17/6/2014 Quyết định thành lập HÐ: Ngày bảo vệ: Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS TRANG SĨ TRUNG Chủ tịch Hội đồng: Khoa sau đại học: KHÁNH HÒA - 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết đề tài: “Nghiên cứu sản xuất chitosan hòa tan nước ứng dụng để kích thích nảy mầm lúa” công trình nghiên cứu cá nhân chưa công bố công trình khoa học khác thời điểm Khánh Hòa, Ngày tháng Tác giả luận văn i năm LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này: Trước hết xin gửi đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm Viện Công nghệ Sinh học Môi trường niềm kính trọng, tự hào học tập trường năm qua Sự biết ơn sâu sắc xin dành cho PGS.Ts Trang Sĩ Trung – hiệu trưởng trường Đại học Nha Trang tận tình hướng dẫn, giúp đỡ truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu cho suốt trình thực luận văn tốt nghiệp Đặc biệt xin ghi nhớ chân thành cảm ơn đến NCS Nguyễn Công Minh trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm động viên suốt trình Xin cảm ơn giúp đỡ thầy, cô giáo Bộ môn Công nghệ Sinh học – Viện Công nghệ Sinh học Môi trường Bộ môn Công nghệ Thực Phẩm – Khoa Công nghệ Thực Phẩm – trường Đại học Nha Trang giúp đỡ nhiệt tình tạo điều kiện thuận lợi hóa chất, dụng cụ, thiết bị… cho suốt trình Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, người thân bạn bè tạo điều kiện, động viên khích lệ để vượt qua khó khăn trình học tập vừa qua thực luận văn Xin chân thành cảm ơn! Khánh Hòa, Ngày tháng Tác giả luận văn năm MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ vii TRÍCH YÊU LUẬN VĂN x MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chitosan chitosan hòa tan nước 1.1.1.Cấu trúc tính chất chitosan 1.1.1.1 Cấu trúc chitosan .3 1.1.1.2 Tính chất chitosan 1.1.1.3 Ứng dụng chitosan 1.1.2.Chitosan hòa tan nước 1.1.2.1 Muối chitosan 1.1.2.2 Chitosan phân tử lượng thấp 10 1.2 Tổng quan lúa (thóc) số chất kích thích sinh trưởng cho lúa 13 1.2.1 Lúa gạo 13 1.2.1.1 Hạt lúa 13 1.2.1.2 Sự nảy mầm hạt lúa .14 1.2.2 Một số chất kích thích sinh trưởng cho lúa 17 1.3 Một số nghiên cứu nước chitosan hòa tan nước khả kích thích nảy sinh trưởng trồng 21 1.3.1.Tình hình nghiên cứu giới 21 1.3.2 Tình hình nghiên cứu nước 25 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Vật liệu nghiên cứu 28 2.1.1 Chitosan 28 2.1.2 Lúa giống 28 2.1.3 Hoá chất 28 2.2 Phương pháp nghiên cứu 29 2.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 29 iii 2.2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm quy trình sản xuất muối chitosan phương pháp rắn 30 2.2.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng loại acid đến khả tạo muối chitosan 30 2.2.2.2 Ảnh hưởng kích thước chitosan đến khả tạo muối chitosan 45 2.2.2.3 Xác định ảnh hưởng tỉ lệ chitosan/acid lactic đến khả tạo muối chitosan 46 2.2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm quy trình sản xuất muối chitosan phương pháp sấy phun 34 2.2.3.1 Ảnh hưởng loại acid đến khả tạo muối chitosan .34 2.2.3.2 Ảnh hưởng nồng độ chitosan đến khả tạo muối chitosan .36 2.2.3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ sấy – nhiệt độ tách ẩm đến khả tạo muối chitosan 37 2.3 Các phương pháp phân tích 40 2.3.1 Phương pháp phân tích hóa học 40 2.3.2.Phương pháp xác định tiêu vật lí lúa giống 41 2.4 Phương pháp xử lí số liệu .41 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .42 3.1 Nghiên cứu quy trình sản xuất muối chitosan hòa tan nước .42 1 Nghiên cứu quy trình sản xuất muối chitosan phương pháp rắn .42 3.1 1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng loại acid ảnh hưởng đến khả tạo muối 42 3.1.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng kích thước chitosan nguyên liệu thích hợp 44 3.1.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ chitosan/acid lactic đến khả tạo muối chitosan 47 3.1.2 Nghiên cứu quy trình sản xuất muối chitosan hòa tan nước phương pháp sấy phun 49 3.1.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng loại acid đến khả tạo muối chitosan hòa tan nước 49 3.1.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ chitosan ban đầu đến khả tạo muối chitosan hòa tan nước .51 3.1.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ sấy – nhiệt độ gió trình sấy đến khả tạo muối chitosan hòa tan nước 52 3.2 Nghiên cứu chế độ bảo quản muối chitosan .55 3.3 Nghiên cứu khả kích thích nảy mầm lúa muối chitosan .63 3.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng muối chitosan sản xuất phương pháp rắn đến khả kích thích nảy mầm lúa 63 3.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng muối chitosan lactate sấy phun đến khả kích thích nảy mầm lúa 76 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .73 KẾT LUẬN 73 KIỀN NGHỊ .73 TÀI LIỆU THAM KHẢO 74 PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABA: Abxixic CK-L: Đóng gói chân không (95%) bảo quản nhiệt độ lạnh (8-100C) CK-RT: Đóng gói chân không (95%) bảo quản nhiệt độ phòng COS: Oligochitosan CTS: Chitosan GA: Gibberellin GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase HTPC: N-[(2-hydroxy-3-trimethylammonium)propyl] chitosan chloride LOC_Os03g03720: 1,3-bisphosphoglycerate LOC_Os04g38600: Glyceraldehyde-3 phosphate LOC_Os05g41640: 3-phosphoglycerate LOC_Os10g08550 : Enolase LOC_Os10g11140: Phosphoglucomutase N,O-CMC: N,O-carboxy methyl chitosan O-CMC: O-carboxymethyl chitosan O-CM-HTPC: Dẫn xuất carboxymethyl HTPC PGK: Phosphoglycerate kinase T-L: Đóng gói thường bảo quản nhiệt độ lạnh (8-10 0C) T-RT: Đóng gói thường bảo quản nhiệt độ phòng DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình1.1 Cấu trúc hóa học chitosan .3 Hình 1.2 Cấu trúc chitosan đồng phân chitosan Hình 1.3 Sơ đồ dẫn xuất từ chitin, chitosan Hình 1.4 Công thức cấu tạo muối chitosan 10 Hình 1.5 Đồ thị biểu diễn mức độ hấp thụ chất béo chitosan 13 Hình 1.6 Cấu tạo hạt lúa 14 Hình 1.7 Quá trình nảy mầm phát triển lúa 15 Hình 1.8 Quá trình biến đổi dẫn đến nảy mầm hạt lúa .16 Hình 1.9 Cơ chế kéo dài tế bào chất kích thích .19 Hình 2.1 Sơ đồ quy trình bố trí thí nghiệm tổng quát 29 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng loại acid đến khả tạo muối chitosan 31 Hình 2.3 Sơ đồ bố trí nghiệm xác định kích thước chitosan ban đầu 32 Hình 2.4 Sơ đồ bố trí nghiệm xác định tỉ lệ acid tạo muối chitosan 36 Hình 2.5 Sơ đồ bố trí nghiệm xác định loại acid tạo muối chitosan 35 Hình 2.6 Sơ đồ bố trí nghiệm xác định nồng độ chitosan trước sấy .36 Hình 2.7 Sơ đồ bố trí nghiệm xác định nhiệt độ sấy muối chitosan 37 Hình 2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện bảo quản muối chitosan…… 38 Hình 2.9 Sơ đồ bố trí nghiệm xác định nồng độ muối chitosan thích hợp 39 Hình 3.1 Ảnh hưởng loại acid đến độ tanvà độ nhớt biểu kiến muối chitosan sản xuất phương pháp rắn 42 Hình 3.2 Muối chitosan sản xuất phương pháp rắn 43 Hình 3.3 Ảnh hưởng kích thước chitosan ban đầu đến độ tanvà độ nhớt biểu kiến muối chitosan 45 Hình 3.4 Ảnh hưởng tỷ lệ chitosan/ acid bổ sung vào đến độ tanvà độ nhớt biểu kiến muối chitosan 47 Hình 3.5 Ảnh hưởng loại acid đến độ tanvà độ nhớt biểu kiến muối chitosan 50 Hình 3.6 Muối chitosan sản xuất phương pháp sấy phun 51 Hình 3.7 Ảnh hưởng nồng độ chitosan ban đầu đến độ tan, hiệu suất thu hồi độ nhớt biểu kiến muối chitosan 51 vii Hình 3.8 Ảnh hưởng loại acid đến độ tan, hiệu suất thu hồi độ nhớt biểu kiến muối chitosan 54 Hình 3.9 Phổ FTIR chitosan 56 Hình 3.10 Phổ FTIR muối chitosan sản xuất phương pháp rắn 56 Hình 3.11 Phổ FTIR muối chitosan sản xuất phương pháp sây phun 57 Hình 3.12 Kết phân tích Xray chitosan muối chitosan lactate 57 Hình 3.13 Ảnh hưởng chế độ thời gian bảo quản đến độ ẩm muối chitosan sản xuất theo phương pháp rắn (A) phương pháp sấy phun (B) 58 Hình 3.14 Ảnh hưởng chế độ thời gian bảo quản đến độ tan muối chitosan sản xuất theo phương pháp rắn (A) phương pháp sấy phun (B) 59 Hình 3.15 Ảnh hưởng chế độ thời gian bảo quản đến độ nhớt muối chitosan sản xuất theo phương pháp rắn (A) phương pháp sấy phun (B) 60 Hình 3.16 Mẫu muối chitosan sản xuất theo phương pháp rắn chế độ thời gian bảo quản khác .61 Hình 3.17 Mẫu muối chitosan sản xuất theo phương pháp sấy phun chế độ thời gian bảo quản khác 62 Hình 3.18 Ảnh hưởng nồng độ muối chitosan sản xuất theo phương pháp rắn đến khả nảy mầm tỷ lệ nảy mầm mạ .63 Hình3.19 Ảnh hưởng nồng độ chitosan lactate sản xuất theo phương pháp rắnđến chiều dài thân chiều dài rễ mạ .65 Hình 3.20 Ảnh hưởng nồng độ muối chitosan sản xuất theo phương pháp rắn đến hàm lượng ẩm mạ 66 Hình 3.21 Ảnh hưởng nồng độ muối chitosan sản xuất theo phương pháp rắn đến hàm lượng chlorophyll a, chlorophyll b carotene mạ 67 Hình 3.22 Các mẫu lúa kích thích muối chitosan lactate sản xuất theo phương pháp rắn 68 Hình 3.23 Ảnh hưởng nồng độ muối chitosan sản xuất theo phương pháp sấy phun đến khả nảy mầm tỷ lệ nảy mầm mạ 69 Hình 3.24 Ảnh hưởng nồng độ muối chitosan sản xuất theo phương pháp sấy phunđến chiều dài thân chiều dài rễ mạ 70 Hình3.25 Ảnh hưởng nồng độ muối chitosan sản xuất theo phương pháp sấy phun đến hàm lượng ẩm mạ 71 Hình 3.26 Ảnh hưởng nồng độ muối chitosan sản xuất theo phương pháp sấy phun đến hàm lượng chlorophyll a, chlorophyll b carotene mạ 71 Hình 3.27 Các mẫu lúa kích thích muối chitosan lactate 72 vol 47, pp.39–51 13 Boonlertnirun, S & Boonraung, C 2008 Application of Chitosan in Rice Production Journal of Metals, Materials and Minerals, vol 18(2), pp.47–52 14 Qin, C & et al 2002 Enzymic preparation of water-soluble chitosan and their antitumor activity International Journal of Biological Macromolecules, vol 31(1-3), pp.111–117 15 Cardile et al 2008 Improved adhesion to mucosal cells of water-soluble chitosan tetraalkylammonium salts Vol 362, pp.88–92 16 Cervera, M et al 2011 Effects of Spray Drying on Physicochemical Properties of Chitosan Acid Salts AAPS PharmSciTech, vol 12(2), pp.637–649 Available at: http://link.springer.com/10.1208/s12249-011-9620-3 17 Chandkrachang, S 2002 Study on utilization of chitinous materials Advance in chitin science, vol 5, pp.458–462 18 Czechowska – Biskup, B 2005 Radiation – induced and sonochemical degradation of chitosan as a way to increase its fat – binding capacity Science Direct, pp.383–390 19 Defang, Z & Xinrong, L 2012 Physiological Effects of Chitosan Coating on Wheat Growth and Activities of Protective Enzyme with Drought Tolerance Open Journal of Soil Science, vol 2, pp.282–288 20 Du, Y et al 2009 Preparation of water-soluble chitosan from shrimp shell and its antibacterial activity Innovative Food Science & Emerging Technologies, vol 10(1), pp.103–107 Available at: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1466856408000702 [Accessed November 16, 2014] 21 Mendis, E et al 2007 An in vitro cellular analysis of the radical scavenging efficacy of chitooligosaccharides Life Sciences, vol 80(23), pp.2118–2127 22 Emmanuel, B 1997 Study of the solid – state hydrolysis of chitosan in presense of HCl Polyme Science, vol 35, pp.3181–3191 23 Guan, Y et al 2009 Seed priming with chitosan improves maize germination and seedling growth in relation to physiological changes under low temperature stress Journal of Zhejiang University Science, vol 10(6), pp.427– 33 Available at: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2689555&tool=pmc entrez&rendertype=abstract [Accessed January 14, 2015] 24 Choi, J; Hadwiger, L.A & Kloslerman S 2002 The mode of action of chitosan 75 and its oligomerss in including plant promotors and developing disease resistance in plant Advance in chitin science, vol 5, pp.452–457 25 Irri photos 2014 Stages of the Rice Plant flickr.com Available at: https://www.flickr.com/photos/ricephotos/13596658733 [Accessed April 3, 2014] 26 Jaroslaw, M et al 2005 Degradation of chitosan anh sodium alginate by gamma radiation, sonochemical and ultraviolet methods Radiation Physics and Chemistry, vol 73, pp.287–295 27 Kerch, M 2010 The effect of chitosan oligosaccharides on bread staling Vol 7, pp.491–495 28 Koning, R 1994 Seeds and Seed Germination Plant Physiology Information Website Available at: http://plantphys.info/plants_human/seedgerm.shtml 29 Lay, K et al 2006 Chitosan as a growth stimulator in orchid tissue culture Vol 170, pp.1185–1190 30 Lehduwi, N et al 1997 Study on untilization of chitosan material Vol 1, pp.448–450 31 Li, Y et al 2007 Physicochemical characterization and antibacterial property of chitosan acetates Vol 67, pp.227–232 32 Lichtenthaler, H & Wellbum, A 1985 Determination of Total Carotenoids and Chlorophylls A and B of Leaf in Different Slovents Advances in Photosynthesis Research, vol 2, pp.9–10 33 Nitar Nwe et al 2004 Application of chitosan in Myanmar’s Agricultural sector 34 Nutraceutical 2009 Marine Products for Healthcare A Functional and Bioactive, pp.194–196 35 Nutraceutical 2009 Marine Products for Healthcare B Marine Products for Healthcare, pp.207–208 36 Orienti, I et al 2002 Influence of different chitosan salts on the release of sodium diclofenac in colon-specific delivery Int J Pharm, vol 238, pp.51–59 37 Wei, P et al 2008 Chitooligosaccharides induce apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells via upregulation of Bax Carbohydrate Polimers, vol 71(4), pp.509–514 38 Muzzarelli, R 1977 Chitin Oxford Pergamon Press 39 Rinaudo & Domard 1989 Chitin and chitosan, London 40 Tsujikawa, T et al 2003 Supplementof a chitosan and ascorbic acid mixture for Crohn’s disease: a pilot study Nutrit Investig, vol 19, pp.137–139 41 Tungtong, S et al 2012 Solubility , viscosity and rheological properties of water-soluble chitosan derivatives Maejo Int J Sci Technol, vol 6(02), pp.315–322 42 Vasyukova, N.I et al 2001 Modulation of Plant Resistance to Diseases by Water-Soluble Chitosan Vol 37(1), pp.103–109 43 Ou-Jin jeon, Pyo-Jam Park, Se-Kwon Kim 2004 Antitumor effects of various lowmolecular-weight chitosans are due to increased natural killer activity of intestinal intraepithelial lymphocytes in sarcoma 180-bearing mice Journal of Nutrition, vol 134(4), pp.945–950 44 Zhang, Z et al 2009 Efficient hydrolysis of chitosan in ionic liquids Carbohydrate Polymers, vol 78(4), pp.685–689 Available at: http://dx.doi.org/10.1016/j.carbpol.2009.06.002 77 PHỤ LỤC Phụ lục Nội dung Số trang Phụ lục Các phương pháp phân tích sử dụng đề tài Phụ lục Kết thí nghiệm xác định thông số cho quy trình sản xuất muối chitosan phương pháp rắn Phụ lục Kết thí nghiệm xác định thông số cho quy trình sản xuất muối chitosan phương pháp sấy phun Phụ lục Kết thí nghiệm xác định chế độ bảo quản muối chitosan Phụ lục Kết thí nghiệm xác định ảnh hưởng muối chitosan đến khả nãng nảy mầm lúa Phụ lục Một số thiết bị phân tích sử dụng luận vãn Phụ lục 1: Các phương pháp phân tích sử dụng đề tài Xác định hàm lượng ẩm hàm lượng tro (AOAC, 1994) Cốc sấy sấy khô nhiệt độ 105oC (đến khối lượng không đổi), sau để bình hút ẩm để làm nguội Cân xác định khối lượng cốc sấy W1 Cho mẫu cho vào cốc sấy cân khối lượng W2 Sấy 1050C 24 giờ, cân khối lượng W3 (AOAC, 1990) Tất khối lượng xác định tính theo gram Hàm lượng ẩm tính theo công thức sau: % Hàm lượng ẩm = [(W2 – W3)/( W – W1)] x 100 Sau xác định hàm lượng ẩm, ta đem nung cốc sấy có chứa mẫu khô nhiệt độ 600 C, khoảng giờ, để bình hút ẩm cân khối lượng W4 Hàm lượng tro xácđịnh theo công thức sau: % Hàm lượng tro = [(W4 – W1)/(W2 – W1)] x 100 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp microbiuret (Hein cộng sự, 2004) 2.1 Thuốc thử Microbiuret Dung dịch 1: Hòa tan 173 g natri citrat and 100 g of natri carbonat 500 ml nước cất nóng Dung dịch 2: hòa tan 17,3 g đồng sunfat 100 ml nước cất Trộn dung dịch dung dịch sau làm đầy đến 1000 ml nước cất Dung dịch thuốc thử giữ chai màu 2.2 Xây dựng đường chuẩn Pha dung dịch protein chuẩn BSA nồng độ 0,05; 0,1, 0,15, 0,2, 0,25 mg/ml Cho vào ống nghiệm ml dung dịch BSA chuẩn sau thêm 200 µl dung dịch thuốc thử Microbiuret, ủ nhiệt độ phòng 15 phút, sau đo phổ UV bước sóng 330 nm Từ số liệu thu được, lập phương trình đường chuẩn để từ tích toán hàm lượng protein mẫu 2.3 Phương pháp chiết mẫu Cân 1g chitin – chitosan, thêm 10 ml NaOH 3% sau ủ 80oC giờ, sau ủ, tiến hành lọc khối ủ (sử dụng 10 – 15 ml NaOH 3% để rữa mẫu) định mức dịch lọc đến thể tích định (V1) Dịch lọc mang ly tâm với tốc độ 5000 vòng 15 phút Sử dụng ml dịch sau ly tâm sau thêm 200µl dung dịch thuốc thử microbiuret, ủ 15 phút nhiệt độ phòng màu bước sóng 330 nm 79 Từ giá trị OD thu được, thay vào phương trình đường chuẩn để suy hàm lượng protein mẫu 2.4 Tính toán kết Hàm lượng protein mẫu chitin chitosan xác định theo công thức sau Hàm lượng protein V1 (ml) x C (mg/ml) x 100 = w (g) x (100-MC)/100 x 1000 (%) Trong đó: mg/g V1: thể tích dịch lọc (ml) C: Hàm lượng protein tính theo đường chuẩn Microbiuret (mg/ml) W: khối lượng mẫu ủ (g) MC: độ ẩm mẫu (%) Xác định độ nhớt chitin chitosan Độ nhớt chitin chitosan xác định nhớt kế Brookfield, model RVT Dung dịch chitin 0,25% hòa tan N,N-dimethylacetamide có 5% LiCl Dung dịch chitosan 1% hòa tan acid acetic 1% Tiến hành đo độ nhớt trục quay số 64, tốc độ quay 30 vòng/phút 25oC, đơn vị tính centipoises (cP) Xác định khối lượng phân tử chitosan (Berth Dautzenberg, 2002) η0: Độ nhớt dung môi η: Độ nhớt dung dịch chitosan t0: Thời gian chảy dung môi t: Thời gian chảy dung dịch chitosan η r: Độ nhớt tương đối η SP: Độ nhớt riêng η g: Độ nhớt nội Độ nhớt tương đối tính sau:  r    Độ nhớt riêng tính theo công thức sau:  t t  SP   r Độ nhớt nội tính sau:  g  lim C 0  SP C Cách tiến hành: Pha đệm acetate 0,02M pH 4,5 (bổ sung NaCl 0,1M) Hòa tan chitosan nồng độ khác nhau: (0; 0,04; 0,06; 0,08; 0,1)% dung dịch đệm acetate 0,02M có pH 4,5 chuẩn bị Sau 24h, lọc dung dịch quamàng lọc kích thước µm Hút 4ml dung dịch chitosan lọc đưa vào thiết bị xácđịnh độ nhớt nội AVS – 470 để xác định thời gian chảy dịch chitosan qua ống maoquản nhiệt độ 250C Thay thông số thời gian chảy dung môi acetate dungdịch chitosan vào công thức để xác định độ nhớt tương đối (η r), độ nhớt riêng (ηSP),độ nhớt nội (ηg) Vẽ đồ thể mối tương quan độ nhớt nội nồng độ chitosan Từ xác định độ nhớt nội dung dịch chitosan Thay độ nhớt nội vào công thức sau để xác định khối lượng phân tử (M): η g = 8,34 × 10-3×M0,92 Phụ lục 2: Kết thí nghiệm xác định thông số cho quy trình sản xuất muối chitosan phương pháp rắn Bảng P2.1 Ảnh hưởng loại acid đến khả tạo muối chitosan Mẫu Ðộ tan (%) Ðộ nhớt biểu kiến (cP) Chitosan lactate Chitosan acetate Chitosan focmate 97,73 ± 0,47a 85,63 ± 2,97b 93,41 ± 2,10a 147 ± 4,36a 725 ± 2,00b 961 ± 5,29c Kết tính lượng chất khô tuyệt đối Các giá trị trung bình cột có ký tự khác khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê (p < 0,05) Bảng P2.2 Ảnh hưởng kích thước chitosan đến khả tạo muối chitosan Kích thước chitosan Ðộ tan (%) Ðộ nhớt biểu kiến (cP) 0,5cm 1cm 98,59 ± 0,39a 98,60 ± 0,91a 101,67 ± 2,89a 147,00 ± 4,36b 81 98,57 ± 1,01a 96,89 ± 0,51ab 95,07 ± 0,61b 2cm 4cm Dạng vảy 160,00 ± 2,00c 171,67 ± 2,98d 205,00 ± 5,00e Kết tính lượng chất khô tuyệt đối Các giá trị trung bình cột có ký tự khác khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê (p < 0,05) Bảng P2.3 Ảnh hưởng tỷ lệ chitosan/acid đến khả tạo muối chitosan Tỷ lệ chitosan/acid (w/v) Ðộ tan (%) Ðộ nhớt biểu kiến (cP) 1/1 1/2 1/3 1/4 1/5 92,41 ± 0,55a 99,72 ± 0,20b 99,84 ± 0,02b 99,34 ± 0,88b 99,69 ± 0,25b 127,33 ± 2,52a 121,67 ± 2,89a 123,67 ± 1,53a 75,67 ± 1,15b 73,33 ± 2,89b Kết tính lượng chất khô tuyệt đối Các giá trị trung bình cột có ký tự khác khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê (p < 0,05) Phụ lục 3: Kết thí nghiệm xác định thông số cho quy trình sản xuất muối chitosan phương pháp sấy phun Bảng P3.1 Ảnh hưởng loại acid đến khả tạo muối chitosan Mẫu Ðộ tan (%) Ðộ nhớt biểu kiến (cP) Chitosan lactate Chitosan acetate Chitosan focmate 98,98 ± 0,85a 90,22 ± 0,68b 93,69 ± 0,10c 182,33 ± 2,52a 761,67 ± 2,89b 1104 ± 10,58c Kết tính lượng chất khô tuyệt đối Các giá trị trung bình cột có ký tự khác khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê (p < 0,05) Bảng P3.2 Ảnh hưởng nồng độ chitosan đến khả tạo muối chitosan Nồng độ chitosan (%) Ðộ tan (%) 0,25% 0,5% 0,75% 1% 1,25% 98,60 ± 0,1a 98,47 ± 0,15a 98,79 ± 0,15a 98,98 ± 0,85a 96,16 ± 0,17b Ðộ nhớt biểu kiến (cP) 153,33 ± 3,06a 173,67 ± 3,21b 171,00 ± 3,61b 182,33 ± 2,52c 173,33 ± 2,89b Hiệu suất thu hồi (%) 31,95 ± 0,29a 49,28 ± 0,40b 27,95 ± 0,06c 15,65 ± 0,09d 15,55 ± 0,15d Kết tính lượng chất khô tuyệt đối Các giá trị trung bình cột có ký tự khác khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê (p < 0,05) Bảng P3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ sấy – nhiệt độ gió đến khả tạo muối chitosan Nhiệt độ sấy – nhiệt độ gió (0C) 130-60 150-80 170-100 190-120 210-140 230-140 Ðộ tan (%) 97,16 ± 0,09a 98,36 ± 0,16b 98,54 ± 0,18b 98,47 ± 0,14b 98,72 ± 0,27b 98,67 ± 0,07b Ðộ nhớt biểu kiến (cP) 161,67 ± 2,89a 163,33 ± 2,89a 161,67 ± 2,89a 173,67 ± 3,21b 173,33 ± 5,77b 161,67 ± 2,89a Hiệu suất thu hồi (%) 24,99 ± 0,12a 49,34 ± 0,48b 58,74 ± 0,61c 66,56 ± 0,57d 78,46 ± 0,67e 65,97 ± 0,26d Ðộ ẩm (%) 29,28 ± 0,44a 29,38 ± 1,06a 28,88 ± 0,99a 14,53 ± 0,07b 13,20 ± 0,52bc 12,64 ±0,32c Kết tính lượng chất khô tuyệt đối Các giá trị trung bình cột có ký tự khác khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê (p < 0,05) Phụ lục 4: Kết thí nghiệm xác định chế độ bảo quản muối chitosan Bảng P4.1 Độ ẩm muối chitosan sản xuất phương pháp rắn sau ba tháng bảo quản (%) Chế độ bảo quản CK-L CK-RT T-L T-RT Sau tháng bảo quản 29,55 ± 0,35a 31,44 ± 0,30a 32,89 ± 0,64a 32,13 ± 0,82a Sau tháng bảo quản 30,38 ± 0,28a 31,16 ± 0,31b 32,35 ± 0,25b 32,54 ± 0,33c Sau tháng bảo quản 30,13 ± 0,36a 32,38 ± 0,07b 33,52 ± 0,61c 33,47 ± 0,31c Kết tính lượng chất khô tuyệt đối Các giá trị trung bình cột có ký tự khác khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê (p < 0,05) Bảng P4.2 Độ tan muối chitosan sản xuất phương pháp rắn sau ba tháng bảo quản (%) Chế ðộ bảo quản CK-L CK-RT T-L T-RT Sau tháng bảo quản 99,87 ± 0,07a 99,23 ± 0,69a 99,22 ± 0,71a 99,46 ± 0,12a Sau tháng bảo quản 99,82 ± 0,15a 99,56 ± 0,33a 99,55 ± 0,30a 99,48 ± 0,10a Sau tháng bảo quản 98,61 ± 0,21a 98,36 ± 0,21b 98,36 ± 0,20b 98,20 ± 0,18b Kết tính lượng chất khô tuyệt đối Các giá trị trung bình cột có ký tự khác khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê (p < 0,05) 83 Bảng P4.3 Độ nhớt muối chitosan sản xuất phương pháp rắn sau ba tháng bảo quản (cP) Chế độ bảo quản CK-L CK-RT T-L T-RT Sau tháng bảo quản 126,67 ± 2,89a 116,67 ± 3,06b 105,33 ± 5,03c 88,67 ± 1,53d Sau tháng bảo quản 125,67 ± 1,15a 113,33 ± 2,89b 101,67 ± 2,89c 80,67 ± 1,15d Sau tháng bảo quản 122,33 ± 2,52a 106,67 ± 5,77b 98,33 ± 2,89b 78,33 ± 2,89c Kết tính lượng chất khô tuyệt đối Các giá trị trung bình cột có ký tự khác khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê (p < 0,05) Bảng P4.4 Độ ẩm muối chitosan sản xuất phương pháp sấy phun sau ba tháng bảo quản (%) Chế độ bảo quản CK-L CK-RT T-L T-RT Sau tháng bảo quản 14,04 ± 0,14a 14,73 ± 0,27b 14,46 ± 0,28ab 14,43 ± 0,12ab Sau tháng bảo quản 13,29 ± 0,13a 14,79 ± 0,36b 14,93 ± 0,23b 15,49 ± 0,49b Sau tháng bảo quản 16,20 ± 0,20a 16,20 ± 0,13a 17,89 ± 0,19b 17,51 ± 0,32b Kết tính lượng chất khô tuyệt đối Các giá trị trung bình cột có ký tự khác khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê (p < 0,05) Bảng P4.5 Độ tan muối chitosan sản xuất phương pháp sấy phun sau ba tháng bảo quản (%) Sau tháng bảo Sau tháng bảo Sau tháng bảo quản quản quản CK-L 98,57 ± 0,15ab 98,16 ± 0,18a 98,28 ± 0,29a CK-RT 98,50 ± 0,24ab 98,15 ± 0,18a 97,86 ± 0,29ab T-L 98,72 ± 0,27a 97,99 ± 0,30a 96,93 ± 0,20bc T-RT 97,93 ± 0,38b 96,64 ± 0,14b 96,68 ± 0,60c Chế độ bảo quản Kết tính lượng chất khô tuyệt đối Các giá trị trung bình cột có ký tự khác khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê (p < 0,05) Bảng P4.6 Độ nhớt muối chitosan sản xuất phương pháp sấy phun sau ba tháng bảo quản (cP) Sau tháng bảo Sau tháng bảo Sau tháng bảo quản quản quản CK-L 168,33 ± 2,89a 163,33 ± 2,89a 158,33 ± 2,89a CK-RT 163,33 ± 2,89a 158,33 ± 2,89a 153,33 ± 2,89a T-L 151,67 ± 2,89b 146,67 ± 2,89b 143,33 ± 2,89b T-RT 148,33 ± 2,89b 143,33 ± 2,89b 138,33 ± 2,89b Chế độ bảo quản Kết tính lượng chất khô tuyệt đối Các giá trị trung bình cột có ký tự khác khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê (p < 0,05) Phụ lục 5: Kết thí nghiệm xác định ảnh hưởng muối chitosan đến khả nảy mầm lúa Bảng P5.1 Ảnh hưởng nồng độ muối chitosan sản xuất theo phương pháp rắn đến tỷ lệ nảy mầm (%), khả nảy mầm (%), hàm lượng ẩm (%), chiều dài rễ (cm), chiều dài thân (cm) lúa Nồng độ muối Tỷ lệ nảy chitosan (ppm) mầm (%) 82,41 ± 1,31a 500 Khả nảy Chiều dài rễ mầm (%) Chiều dài (cm) thân (cm) 70,75 ± 1,29a 4,54 ± 0,22a 6,51 ± 0,26a 88,87 ± 1,75b 72,28 ±0,43ab 5,64 ± 0,25b 6,88 ± 0,45a 1000 88,02 ± 0,54b 78,50 ± 3,05b 6,09 ± 0,06bc 7,20 ± 0,44ab 1500 88,74 ± 1,56b 78,01 ± 2,36b 6,37 ± 0,21c 7,84 ± 0,91ab 2000 88,26 ± 0,88b 77,37 ± 0,57ab 6,32 ± 0,07bc 8,82 ± 0,05b 2500 88,70 ± 0,43b 77,69 ± 0,48b 6,30 ± 0,17bc 8,82 ± 0,15b Kết tính lượng chất khô tuyệt đối Các giá trị trung bình cột có ký tự khác khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê (p < 0,05) 85 Bảng P5.2 Ảnh hưởng nồng độ muối chitosan sản xuất theo phương pháp rắn đến hàm lượng ẩm (%), hàm lượng chloropyll a, b (µg/g FW), hàm lượng carotene (µg/g FW) lúa Nồng độ muối Hàm lượng Hàm lượng Hàm lượng Hàm lượng chitosan ẩm (%) chloropyll a chloropyll b caroten (µg/g FW) (µg/g FW) (µg/g FW) (ppm) 70,55 ± 1,97a 18,89 ± 1,11a 10,90 ± 0,02ab 1934,81 ± 66,80a 500 76,61 ± 2,23ab 18,50 ± 0,60a 8,51 ± 0,44a 1794,80 ± 66,37a 1000 78,24 ± 3,25b 20,72 ± 0,33a 9,33 ± 0,19ab 1828,83 ± 54,51a 1500 79,27 ± 0,44b 19,21 ± 0,63a 12,70 ± 0,58b 1967,45 ± 67,48a 2000 81,80 ± 0,41b 18,88 ± 0,34a 12,19 ± 1,36b 1961,43 ± 90,88a 2500 80,38 ± 0,30b 18,07 ± 0,76a 12,40 ± 1,46b 1871,14 ± 30,04a Kết tính lượng chất khô tuyệt đối Các giá trị trung bình cột có ký tự khác khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê (p < 0,05) Bảng P5.3 Ảnh hưởng nồng độ muối chitosan sản xuất theo phương pháp sấy phun đến tỷ lệ nảy mầm (%), khả nảy mầm (%), hàm lượng ẩm (%), chiều dài rễ (cm), chiều dài thân (cm) lúa Nồng độ muối Tỷ lệ nảy Khả nãng nảy Chiều dài Chiều dài chitosan (ppm) mầm (%) mầm (%) rễ (cm) thân (cm) 80,50 ± 1,26a 78,33 ± 0,50a 5,76 ± 0,37a 9,19 ± 0,32a 250 86,17 ± 1,73bc 84,00 ± 1,04b 5,33 ± 0,20a 10,47 ± 0,39b 500 85,00 ± 0,58b 82,33 ± 0,50b 6,46 ± 0,09b 11,36 ± 0,11c 750 90,33 ± 1,26c 86,17 ± 0,58c 6,51 ± 0,05b 11,45 ± 0,20c 1000 88,33 ± 1,32bc 83,00 ± 0,58d 6,53 ± 0,10b 11.61 ± 0,22c Kết tính lượng chất khô tuyệt đối Các giá trị trung bình cột có ký tự khác khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê (p < 0,05) Bảng P5.4 Ảnh hưởng nồng độ muối chitosan sản xuất theo phương pháp sấy phun đến hàm lượng ẩm (%) , hàm lượng chloropyll a, b (µg/g FW), hàm lượng carotene (µg/g FW) lúa Nồng độ muối chitosan (ppm) Hàm lượng ẩm (%) Hàm lượng Hàm lượng Hàm lượng chloropyll a chloropyll b caroten (µg/g FW) (µg/g FW) (µg/g FW) 76’77 ± 0,80a 9,84 ± 0,21a 4,33 ± 0,16a 1001,72 ± 26,64a 500 78,18 ± 1,32ab 9,89 ± 0,05a 4,17 ± 0,10a 1089,89 ± 24,38a 1000 79,34 ± 0,48b 11,24 ± 0,21b 3,47 ± 0,31b 1095,39 ±79,71a 1500 81,74 ± 0,46c 9,69 ± 0,13a 4,32 ± 0,05a 1066,33 ± 69,78a 2000 80,25 ± 0,95bc 9,58 ± 0,11a 4,36 ± 0,18a 1003,29 ± 14,75a Kết tính lượng chất khô tuyệt đối Các giá trị trung bình cột có ký tự khác khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê (p < 0,05) Phụ lục 6: Một số thiết bị phân tích sử dụng luận văn Hình P6.1 Thiết bị xác định khối lượng phân tử AVS 470 - Đức Hình P6.2 Tủ sấy Memmert - Đức 87 Hình P6.3 Bể ổn nhiệt BW10G - Đức Hình P6.4 Cân phân tích AY200Shimadzu – Nhật Hình P6.5 Máy khuấy từ gia nhiệt IKA – Đức Hình P6.6 Cân kĩ thuật BL3200 – Shimazu – Nhật Hình P6.7 Máy so màu UV/VIS 3200 – Labomed – Mỹ Hình P6.8 Thiết bị đo độ nhớt LVDV – – Brookfield – Mỹ Hình P6.9 Máy ly tâm Hermle Z323 – Hermle – Đức 89 [...]... nhiều, chitosan hòa tan trong nước tồn tại hai dạng là muối chitosan và chitosan phân tử lượng thấp (COS) COS đã được nhiều nhà nghiên cứu trong nước và ngoài nước quan tâm, tuy nhiên ở Việt Nam thì chưa nhiều công bố nghiên cứu về muối chitosan do đó nghiên cứu sản xuất muối chitosan là cần thiết Mục tiêu của để tài là tìm điều kiện sản xuất muối chitosan hòa tan trong nước có độ tan tốt nhất và ứng dụng. .. (Cardile và cộng sự, 2008) do đó gây khó khăn khi ứng dụng và khi áp dụng quy mô lớn Chitosan hòa tan trong nước có tính tiện dụng cao tuy nhiên các đặc tính cơ bản của chitosan hòa tan trong nước phụ thuộc nhiều vào các điều kiện xử lý và bảo quản 1.1.2 Chitosan hòa tan trong nước Độ hòa tan là một đặc điểm rất quan trọng đối với chitosan Cải thiện hòa tan có thể tạo điều kiện cho các ứng dụng của chitosan. .. nảy mầm lúa bằng muối chitosan: Cơ chế kích thích nảy mầm hạt lúa của muối của chitosan còn chưa biết rõ, tuy nhiên muối chitosan khi hòa tan trong nước có tính chất tương tự như chitosan hòa tan trong acid đó Do đó cơ chế kích thích nảy mầm của muối chitosan có thể là: - Chitosan có hoạt tính làm mềm vách tế bào như vậy có thể tạo điều kiện cho nước dễ di chuyển vào trong hạt, dẫn tới sự khả năng nảy. .. trong nước) cao hơn so với các chitosan hòa tan trong acid Nghiên cứu sản xuất chitosan hòa tan trong nước từ vỏ tôm và hoạt tính ức chế vi khuẩn của Yunjian Du và cộng sự (2009) cho thấy điều kiện tối ưu thu được chitosan hòa tan trong nước là ngâm chitosan thô với H2O2 5,5% ở 42,80C trong 3,5 giờ, thu hồi được 93,5 % Số liệu thực nghiệm cho thấy cả chitosan thô ban đầu và chitosan hòa tan trong. .. nhất và ứng dụng sản phẩm muối để bước đầu nghiên cứu khả năng kích thích nảy mầm lúa của muối chitosan đồng thời đề tài nghiên cứu sự biến đổi của muối chitosan theo thời gian Để đáp ứng mục tiêu trên, đề tài tiến hành thử nghiệm khả năng sản xuất muối chitosan bằng phương pháp rắn và phương pháp sấy phun, muối chitosan sau khi sản xuất được tiến hành bảo quản ở các chế độ khác nhau trong thời gian... chitosan trong y học và thực phẩm Trọng lượng phân tử cao thì khả năng hòa tan trong nước thấp, do đó có thể cải thiện khả năng hòa tan trong nước bằng cách giảm trọng lượng phân tử (Du và cộng sự, 2009) hoặc tạo muối chitosan cũng là một phương pháp để cải thiện độ hòa tan trong nước của chitosan 1.1.2.1 Muối chitosan Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về muối chitosan và cho ra nhiều loại muối chitosan. .. muối chitosan được thử nghiệm khả năng kích thích nảy mầm lúa Kết quả nghiên cứu bước đầu cho thấy, muối chitosan có thể được sản xuất bằng phương pháp rắn và phương pháp sấy phun Muối chitosan có độ tan tốt, màu sắc đẹp, dạng bột và có khả năng bảo quản trong thời gian 3 tháng ở điều kiện lạnh-hút chân không Các kết quả thử nghiệm khả năng kích thích nảy mầm lúa của muối chitosan cho thấy mầm lúa sau... đích của sản phẩm sử dụng mà sử dụng các quy trình công nghệ thích hợp Lúa đã được trồng lâu đời ở Việt Nam nhưng làm sao để nâng cao năng suất, rút ngắn thời gian nuôi trồng mà không gây ô nhiễm môi trường bằng các hóa chất hóa học thì vẫn còn là câu hỏi khó 1 Xuất phát từ những lý do trên tôi quyết định thực hiện đề tài Nghiên cứu sản xuất chitosan hòa tan trong nước và ứng dụng để kích thích sự nảy. .. deacetyl của chitosan Bên cạnh đó các nghiên cứu về việc sử dụng chitin, chitosan phát triển mạnh mẽ trong những năm 1930 và đầu năm 1940 Đến nay việc nghiên cứu sản xuất cũng như ứng dụng của chitin, chitosan cũng vẫn là hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học quan tâm 21 Gần đây oligochitosan (COS) đã nhận được nhiểu sự quan tâm về mặt dược lý và ứng dụng trong dược liệu do khả năng cao và không... lactate sản xuất bằng phương pháp rắn và sấy phun .55 ix TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Chitosan (CTS) là một polymer sinh học có nhiều ứng dụng trong công nghiệp, nông nghiệp, thực phẩm, mỹ phẩm, y tế… Chitosan tan tốt trong môi trường acid và không tan nước và môi trường kiềm do vậy đã làm hạn chế khả năng ứng dụng của chitosan khi áp dụng quy mô lớn Chitosan hòa tan trong nước có tính tiện dụng hơn