ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG THIẾT BỊ SẮC KÝ LỎNG HPLC 1200 ĐỂ PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG AFLATOXIN TRONG MỘT SỐ LOẠI NÔNG SẢN THỰC PHẨM Mã số: ĐH 2012-TN 10-05 Chủ nhiệm đề tài: TS NGUYỄN THỊ HẢI THÁI NGUYÊN, NĂM 2013 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG THIẾT BỊ SẮC KÝ LỎNG HPLC 1200 ĐỂ PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG AFLATOXIN TRONG MỘT SỐ LOẠI NÔNG SẢN THỰC PHẨM Mã số: ĐH 2012-TN 10-05 Chủ nhiệm đề tài: TS NGUYỄN THỊ HẢI Người tham gia thực hiện: TS Nguyễn Thị Thúy Mỵ ThS Nguyễn Thế Cường Vũ Thị Ánh Dương Thị Khuyên Nguyễn Thị Duyên Đỗ Bích Duệ Xác nhận quan chủ trì đề tài (ký, họ tên, đóng dấu) THÁI NGUYÊN, NĂM 2013 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG THIẾT BỊ SẮC KÝ LỎNG HPLC 1200 ĐỂ PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG AFLATOXIN TRONG MỘT SỐ LOẠI NÔNG SẢN THỰC PHẨM Mã số: ĐH 2012-TN 10-05 Chủ nhiệm đề tài: TS NGUYỄN THỊ HẢI Người tham gia thực hiện: TS Nguyễn Thị Thúy Mỵ ThS Nguyễn Thế Cường Vũ Thị Ánh Dương Thị Khuyên Nguyễn Thị Duyên Đỗ Bích Duệ Xác nhận quan chủ trì đề tài (ký, họ tên, đóng dấu) THÁI NGUYÊN, NĂM 2013 2.2.2 Hàm lượng aflatoxin mẫu lạc 27 2.2.3 Hàm lượng aflatoxin mẫu khô đỗ tương 29 2.2.4 Hàm lượng aflatoxin mẫu cám gạo 31 2.2.5 Hàm lượng aflatoxin mẫu gạo 32 Phần 3: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 5.1 KẾT LUẬN 34 5.2 KIẾN NGHỊ 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1 Các giới hạn tối đa (ML) theo quy định FDA 12 Bảng 1.2: Các giới hạn tối đa (ML) theo quy định Bộ Y tế VN 13 Bảng 1.3: Hàm lượng AF số nguyên liệu làm thức ăn gia súc VN Bảng 1.4: Quy định hàm lượng tối đa AFB AF tổng số (B +B +G +G ) thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho vật nuôi 13 14 Bảng 1.5 Tiêu chí đánh giá RSD theo hàm lượng chất 19 Bảng 1.6 Tiêu chí đánh giá độ thu hồi nồng độ khác 20 Bảng 2.1 Đánh giá độ lặp lại phương pháp 24 Bảng 2.2 Hệ số thu hồi quy trình thử nghiệm 25 Bảng 2.3 Bảng so sánh kết thử nghiệm tham chiếu liên phòng 26 Bảng 2.4 Kết phân tích hàm lượng aflatoxin mẫu ngô 27 Bảng 2.5 Kết phân tích hàm lượng aflatoxin mẫu lạc 29 Bảng 2.6 Kết phân tích hàm lượng aflatoxin mẫu khô đỗ tương 31 Bảng 2.7 Kết phân tích hàm lượng aflatoxin mẫu cám gạo 32 Bảng 2.8 Kết phân tích hàm lượng aflatoxin mẫu gạo 34 DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình Trang Hình 2.1 Sắc đồ aflatoxin điểm xác định LOD 21 Hình 2.2 Sắc đồ aflatoxin mẫu chuẩn 23 Hình 2.3 Đường chuẩn aflatoxin 23 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT A.flavus Aspergillus flavus A.nomius Aspergillus nomius A.paraciticus Aspergillus paraciticus ADN Acid Deoxyribo nucleic AFB1 aflatoxin B1 AFB2 aflatoxin B2 AFG1 aflatoxin G1 AFG1 aflatoxin G1 ARN Acid ribonucleic AOAC Association of Official Analytical Chemists CS Cộng FDA Cục quản lý thực phẩm dược phẩm Hoa Kỳ HPLC Phương pháp sắc ký lỏng cao áp HPTLC Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu suất cao IARC Trung tâm nghiên cứu ung thư môi trường giới NN-PTNT Nông nghiệp Phát triển Nông thôn ppb parts per billion QĐ-BYT Quyết định Bộ Y tế rADTZ recombinant aflatoxin detoxifizym enzyme TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TX Thị xã UV tia tử ngoại VCK Vật chất khô WHO Tổ chức Y tế giới Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Hiện nay, lương thực - thực phẩm, đặc biệt nông sản ngành nông nghiệp thóc, gạo, ngô, khoai, sắn, đậu, đỗ, lạc… nguồn lượng nuôi sống người Bởi vậy, việc nâng cao chất lượng nông sản vấn đề tổ chức Quốc tế nói chung Việt Nam nói riêng đặc biệt quan tâm Nước ta nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, mưa nhiều, thuận lợi cho nấm mốc phát triển Hiện nay, phát hàng trăm loài nấm mốc độc tố nấm mốc có mặt thức ăn nguyên liệu làm thức ăn Trong đó, nguy hiểm phải kể tới độc tố aflatoxin Độc tố nấm Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus sản sinh ra, có mặt nhiều ngô, lạc vài loại hạt khác có chứa dầu Aflatoxin không độc tố nấm mốc gây nhiễm độc, rối loạn chức năng, suy giảm miễn dịch, thoái hóa gan thận mà gây chết gia súc trường hợp nhiễm hàm lượng lớn độc tố Aflatoxin chứng minh chất độc gây ung thư, nguy hiểm người vật nuôi (Bùi Thanh Hà, 2001)[11] Thiết bị sắc ký lỏng hiệu cao đời từ năm 1967 - 1968 sở phát triển cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển Phương pháp phân tích dựa nguyên tắc hóa lý (hấp thụ nhả hấp thụ liên tục chất phân tích) hỗ trợ thiết bị dựa nguyên tắc quang điện để định lượng chất phân tích Trên giới, kỹ thuật phân tích thiết bị sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) sử dụng rộng rãi từ lâu Ở Việt Nam, thiết bị trang bị số phòng thí nghiệm hóa sinh để phân tích chất dạng vết nhiều lĩnh vực khác hóa dược, chăn nuôi thú y, trồng trọt, mỹ phẩm… Thiết bị HPLC khai thác để xác định hàm lượng chất kháng sinh nhóm tetracylin, ractopamine HCl, axit amin, vitamin, … Việc phân tích xác định hàm lượng aflatoxin thiết bị sắc ký lỏng hiệu cao HPLC cho kết xác, tiết kiệm dung môi tiết kiệm thời gian phân tích Từ lý trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu sử dụng thiết bị sắc ký lóng HPLC 1200 để phân tích hàm lượng aflatoxin số loại nông sản thực phẩm” với mong muốn khai thác thêm ứng dụng thiết bị HPLC 1200 Viện Khoa học sống - Đại học Thái Nguyên góp phần vào công tác kiểm soát chất lượng sinh an toàn thực phẩm 1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Nghiên cứu ứng dụng thiết bị HPLC 1200 để định lượng aflatoxin nông sản thực phẩm góp phần vào công tác kiểm soát chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm 1.3 TỔNG QUAN VỀ AFLATOXIN 1.3.1 Lịch sử phát Aflatoxin Vào năm 1960, nghề nuôi gia cầm nước Anh bị tổn thương nặng nề, lúc đầu 10.000 gà tây chết bệnh gọi “bệnh gà tây X” (Turkey X disease) Sau đó, loại gia cầm khác vịt, gà lôi bị nhiễm bệnh tử vong nhiều Qua điều tra, người ta xác định bệnh có liên quan đến loại độc tố nấm có thức ăn sinh Đến năm 1961 người ta tìm chất hoá học độc chất Aflatoxin vi nấm Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus Aflatoxin có dẫn xuất quan trọng AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 Giữa loại AFB1 chiếm nhiều nông sản gây tác hại nhiều nhất, gây ngộ độc nhanh phổ biến (Nabil Saad, 2004) [32] Năm 1961, công trình nghiên cứu công nhận Aflatoxin tạo nấm Aspergillus flavus nguyên nhân gây khối u gan động vật (Chaver Sanchehez, 1994) [27] Từ trở có nhiều công trình nghiên cứu độc tố Aflatoxin Các nhà khoa học xác định công thức phân tử công thức cấu tạo Aflatoxin 1.3.2 Công thức cấu tạo số tính chất lý hóa Aflatoxin Aflatoxin gồm loại (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2), có công thức phân tử là: • AFB1: C17H12O6 • AFB2: C17H14O6 • AFG1 : C17H12O7 • AFG2 : C17H14O7 Ngoài loại trên, aflatoxin có thêm hai sản phẩm trao đổi chất aflatoxin M1 aflatoxin M2 M1 4-hydroxy aflatoxin B1 aflatoxin M2 4dihydroxy aflatoxin B2 Theo Vitoria (2001) [35], Công thức cấu tạo loại aflatoxin sau: Hình 1.1: Công thức cấu tạo hoá học AFB1, AFB2, AFG1 AFG2 Tính chất lý học loại aflatoxin: - AFB1: Có điểm nóng chảy 268-269 oC, có màu xanh lam đèn huỳnh quang - AFB2: Có điểm nóng chảy 286-289 oC, có màu xanh lam đèn huỳnh quang - AFG1: Có điểm nóng chảy 244-246 oC, có màu xanh lục đèn huỳnh quang - AFG2: Có điểm nóng chảy 229-231 oC, có màu xanh lục đèn huỳnh quang (Hendricks, 2002) [30] 1.3.3 Sự diện phát triển Aflatoxin tự nhiên 1.3.3.1 Sự diện Aflatoxin Aflatoxin thường xuất sản phẩm nông nghiệp cánh đồng trước thu hoạch sau thu hoạch sản phẩm không phơi khô hay ẩm độ sản phẩm cao tạo điều kiện cho nấm mốc phát triển Trong điều kiện bảo quản không tốt, sản phẩm bị sâu mọt loài gậm nhấm đục khoét điều kiện thuận lợi làm cho sản phẩm bị nhiễm aflatoxin Các sản phẩm thường có nguy bị nhiễm aflatoxin cao ngô, đậu tương hạt (Nguyễn Xuân Mai, 2005) [17] Theo Stoloff (1989) [34] Ai Cập có 32% số ngũ cốc 6% số loại bột cá đem kiểm nghiệm bị nhiễm aflatoxin từ 1-50 ppb; 8% số ngũ cốc 16% số loại bột cá bị nhiễm từ 201-2.000 ppb Ở Indonesia, người ta điều tra phát Aflatoxin đậu từ 404100 ppb tỉ lệ đậu nhiễm nấm từ 60-80%, ngô 5,3-291,11 ppb (Cotty, Bayman, 1993) [28] Theo Gayatri (2000) [29], 3.320 mẫu nguyên liệu có nguồn gốc động, thực vật Pakistan kiểm nghiệm có chứa AFB1 với hàm lượng thấp 13 ppb cao 78 ppb Hầu hết mẫu cám gạo, cám lúa mì, bột bắp, bột cá, bột hướng dương, bột đậu nành bột hạt có hàm lượng AFB1 cao mức khuyến cáo (20 ppb) tổ chức FDA (Food and Drug Administration, Hoa Kỳ) Aflatoxin diện loại thực phẩm chế biến, đặc biệt sản phẩm từ bắp Tuy nhiên, nhà sản xuất có phương pháp thích hợp nhằm hạn chế tối đa loại độc tố Những sản phẩm từ sữa sữa bột, phô mai, sữa chua phát có aflatoxin 1.3.3.2 Điều kiện thuận lợi cho phát triển Aflatoxin Theo Đậu Ngọc Hào (2003) [12], hầu hết chủng A.parasiticus sinh độc tố, sản sinh aflatoxin A.flavus phụ thuộc vào chủng, mặt khác phụ thuộc vào điều kiện xung quanh Sự sinh sản aflatoxin kết 27 aflatoxin B2 từ 3,78 – 50,45 ppb (chiếm 66,67% số mẫu phân tích) G1 từ 1,31 – 23,07 ppb (chiếm tỷ lệ 44,44% số mẫu phân tích); mẫu nhiễm aflatoxin G2 Khi so sánh hàm lượng aflatoxin mẫu phân tích với tiêu chuẩn cho phép Bộ Y tế có 16/16 mẫu nhiễm aflatoxin B1 vượt tiêu chuẩn cho phép từ 1,23 đến 40,42 lần chiếm tỷ lệ 100%; có 7/12 mẫu nhiễm aflatoxin B2 vượt tiêu chuẩn cho phép từ 1,01 đến 3,36 lần chiếm tỷ lệ 58,33% mẫu nhiễm Các mẫu nhiệm aflatoxin G1 ngưỡng cho phép Bộ Y tế Song song với việc phân tích xác định hàm lượng aflatoxin, tiến hành xác định hàm lượng vật chất khô mẫu để tìm mối tương quan chúng Qua kết nhận thấy mẫu có hàm lượng vật chất khô thấp (tức độ ẩm cao) tỷ lệ nhiễm aflatoxin cao ngược lại, Điều với đánh giá cảm quan ban đầu mẫu ngô thu thập, mẫu có tượng mốc số hạt, mẫu bảo quản lâu có tỷ lệ nhiễm cao mẫu lại Kết nghiên cứu hoàn toàn phù hợp với kết nghiên cứu Lê Thiên Minh (2010) [18] Tóm lại, kết phân tích cho thấy ngô bị nhiễm aflatoxin mức đô cao, đặc biệt hàm lượng aflatoxin B1 Sự nhiễm aflatoxin phụ thuộc vào nhiều yếu tố: độ ẩm hạt thời gian, điều kiện bảo quản Vì vậy, sử dụng ngô làm thức ăn cho gia súc cần đánh giá tình trạng nhiễm độc tố nấm mốc để hạn chế tác hại gây 2.2.2 Hàm lượng aflatoxin mẫu lạc Lạc loại nông sản có hàm lượng lipit khác cao, sử dụng nhiều ngành công nghiệp chế biến thực phẩm, bên cạnh ăn phổ biến bữa cơm gia đình người Việt Tuy nhiên, phương thức canh tác điều kiện khí hậu nước ta thuận lợi cho phát triển nấm mốc nói chung nấm mốc sản sinh độc tố aflatoxin nói riêng Chúng tiến hành phân tích hàm lượng aflatoxin mẫu lạc, kết thể bảng sau: 28 Bảng 2.5 Kết phân tích hàm lượng aflatoxin mẫu lạc Đơn vị: ppb Tên mẫu Stt Địa điểm lấy mẫu Tiêu chuẩn cho phép [1] Phổ Yên Lạc lai trắng Thái Nguyên Phú Bình Lạc lai trắng (sau tháng) Thái Nguyên Phú Lương Lạc ta (mới thu hoạch) Thái Nguyên Phú Lương Lạc đỏ (sau tháng) Thái Nguyên Định Hóa Lạc đỏ Thái Nguyên TX Bắc Kạn Lạc sen Bắc Kạn Chợ Đồn Lạc ta Bắc Kạn Hiệp Hòa Lạc đỏ lai (mới thu hoạch) Bắc Giang Tân Yên Lạc đỏ lai (sau tháng) Bắc Giang Tân Yên Lạc Tiên LPH 04 10 Bắc Giang Yên Dũng Lạc đỏ 11 Bắc Giang VCK Hàm lượng aflatoxin (%) B1 B2 15 G1 15 G2 15 86,78 22,47 6,89 0 85,82 89,45 12,12 0 88,89 0 0 86,03 77,19 22,16 0 85,34 107,02 25,53 0 87,54 39,47 2,12 0 87,23 68,24 8,85 0 88,64 0 0 86,67 24,26 0 88,16 12,47 0 87,19 0 0 12 Lạc ta Hà Giang 87,42 45,41 5,56 0 13 Lạc trắng Hà Giang 86,77 68,82 13,81 0 14 Lạc đỏ lai Hà Giang 86,46 93,61 21,06 0 15 Lạc đỏ Phú Thọ 88,02 25,91 0 16 Lạc trắng Phú Thọ 86,93 58,29 9,29 0 87,12 45,79 7,96 0 Trung Bình Qua bảng 2.5 cho thấy, mẫu lạc khác có hàm lượng aflatoxin khác Có 13/16 mẫu lạc phân tích nhiễm aflatoxin B1 từ 12,47 - 107,02 ppb (chiếm tỷ lệ 81,25% số mẫu phân tích), 10/16 mẫu aflatoxin B2 với hàm lượng từ 2,12 25,53 ppb (chiếm tỷ lệ 62,50% số mẫu phân tích) mẫu nhiễm G1 G2 29 Khi so sánh hàm lượng aflatoxin mẫu lạc với Tiêu chuẩn cho phép Bộ Y tế kết cho thấy: 13/13 mẫu nhiễm aflatoxin B1 vượt Tiêu chuẩn cho phép từ 2,49 đến 21,40 lần chiếm tỷ lệ 100% mẫu nhiễm có 3/10 mẫu nhiễm aflatoxin B2 vượt Tiêu chuẩn cho phép từ 1,40 - 1,70 lần chiếm tỷ lệ 30% mẫu nhiễm Trong trình thu thập mẫu tiến hành xác định thời gian thu hoạch bảo quản nhận thấy: Những mẫu nhiễm aflatoxin cao thường mẫu lạc có thời gian bảo quản lâu từ - tháng, mẫu lạc thu hoạch hàm lượng aflatoxin thấp Khi tiến hành xác định vật chất khô mẫu cho kết tương tự, mẫu có hàm lượng vật chất khô thấp (tức độ ẩm cao) mức độ nhiễm cao Như vậy, phương thức bảo quản ảnh hưởng đến mức độ nhiễm độc aflatoxin mẫu lạc 2.2.3 Hàm lượng aflatoxin mẫu khô đỗ tương Khô đỗ tương sản phẩm trình chiết ép chiết ly đỗ tương, hàm lượng protein cao, thành phần thiếu phối trộn phần ăn cho gia súc, gia cầm Tuy nhiên, trình thu thập mẫu nhận thấy việc bảo quản mẫu không đảm bảo nguyên nhân sinh nấm mốc Kết phân tích hàm lượng aflatoxin mẫu khô đỗ thể bảng 2.6 Qua bảng 2.6 cho thấy có 15/16 mẫu khô đỗ phân tích nhiễm aflatoxin B1 với hàm lượng từ 4,25 - 110,67 ppb (chiếm tỷ lệ 93,75% số mẫu phân tích); 9/16 mẫu nhiễm aflatoxin B2 với hàm lượng từ 0,44 - 23,64 ppb (chiếm tỷ lệ 56,25% số mẫu phân tích); 5/16 mẫu nhiễm aflatoxin G1 với hàm lượng từ 0,32 - 3,12 ppb (chiếm 31,25% số mẫu phân tích); mẫu nhiễm G2 Trong 15 mẫu nhiễm aflatoxin B1 có 14 mẫu vượt ngưỡng tiêu chuẩn cho phép Bộ Y tế từ 1,53 đến 22,13 lần chiếm tỷ lệ 93,33%; Có 2/9 mẫu nhiễm aflatoxin B2 vượt Tiêu chuẩn cho phép từ 1,02 đến 1,58 lần, chiếm tỷ lệ 22,22%; Mức độ nhiễm aflatoxin G1 ngưỡng cho phép Bảng 2.6 Kết phân tích hàm lượng aflatoxin mẫu khô đỗ tương Đơn vị: ppb 30 Stt 10 11 12 13 14 15 16 Địa điểm Đánh giá cảm lấy mẫu quan Tiêu chuẩn cho phép [1] Phổ Yên Khô đỗ tương Màu nâu vàng Thái Nguyên Phổ Yên Màu vàng, Khô đỗ tương Thái Nguyên m ốc Sông Công Khô đỗ tương Màu nâu vàng Thái Nguyên Phú Lương Khô đỗ tương Màu nâu vàng Thái Nguyên Định Hóa Màu nâu vàng, Khô đỗ tương Thái Nguyên h i m ốc Màu vàng, TX Khô đỗ tương không mốc, có Bắc Kạn mùi thơm Chợ Đồn Màu nâu vàng, Khô đỗ tương Bắc Kạn h i m ốc Hiệp Hòa Màu nâu vàng, Khô đỗ tương Bắc Giang không mốc Yên Dũng Màu nâu vàng, Khô đỗ tương Bắc Giang h i m ốc Việt Yên Màu nâu vàng, Khô đỗ tương 10 Bắc Giang mốc nhiều Màu vàng, Khô đỗ tương 11 Cao Bằng m ốc Màu vàng, Khô đỗ tương 12 Cao Bằng m ốc Màu nâu vàng, Khô đỗ tương 13 Phú Thọ không mốc Màu vàng, Khô đỗ tương 14 Phú Thọ mốc Hà Tây Màu vàng, Khô đỗ tương 15 Hà Nội mốc Hà Tây Màu vàng, Khô đỗ tương 16 Hà Nội mốc Trung bình Tên mẫu VCK (%) Hàm lượng aflatoxin B1 B2 G1 G2 15 15 15 90,02 12,47 0 89,16 49,15 12,92 2,12 90,75 7,64 0 89,93 47,19 11,06 2,56 88,09 78,34 5,64 2,09 89,02 0 0 85,16 55,15 15,32 3,12 89,75 12,64 0 86,93 87,19 11,06 0 88,09 110,67 23,64 0 84,08 76,23 0 89,38 41,05 1,24 0 89,12 4,25 0 90,14 20,15 0,32 89,95 36,27 1,35 0 88,87 12,42 0,44 0 88,65 40,68 5,17 0,64 Qua phân tích hàm lượng vật chất khô mẫu phân tích cho thấy: hàm lượng vật chất khô cao tỷ lệ nhiễm aflatoxin thấp ngược lại Khi kiểm tra trạng thái cảm quan nhận thấy: mẫu nhiễm aflatoxin mức độ cao quan sát mắt qua màu sắc khác thường trạng thái mốc Vì vậy, vấn đề lớn công ty sản xuất thức ăn chăn nuôi phải để hạn chế tác hại aflatoxin gây với vật nuôi người Từ lý trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu sử dụng thiết bị sắc ký lóng HPLC 1200 để phân tích hàm lượng aflatoxin số loại nông sản thực phẩm” với mong muốn khai thác thêm ứng dụng thiết bị HPLC 1200 Viện Khoa học sống - Đại học Thái Nguyên góp phần vào công tác kiểm soát chất lượng sinh an toàn thực phẩm 1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Nghiên cứu ứng dụng thiết bị HPLC 1200 để định lượng aflatoxin nông sản thực phẩm góp phần vào công tác kiểm soát chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm 1.3 TỔNG QUAN VỀ AFLATOXIN 1.3.1 Lịch sử phát Aflatoxin Vào năm 1960, nghề nuôi gia cầm nước Anh bị tổn thương nặng nề, lúc đầu 10.000 gà tây chết bệnh gọi “bệnh gà tây X” (Turkey X disease) Sau đó, loại gia cầm khác vịt, gà lôi bị nhiễm bệnh tử vong nhiều Qua điều tra, người ta xác định bệnh có liên quan đến loại độc tố nấm có thức ăn sinh Đến năm 1961 người ta tìm chất hoá học độc chất Aflatoxin vi nấm Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus Aflatoxin có dẫn xuất quan trọng AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 Giữa loại AFB1 chiếm nhiều nông sản gây tác hại nhiều nhất, gây ngộ độc nhanh phổ biến (Nabil Saad, 2004) [32] Năm 1961, công trình nghiên cứu công nhận Aflatoxin tạo nấm Aspergillus flavus nguyên nhân gây khối u gan động vật (Chaver Sanchehez, 1994) [27] Từ trở có nhiều công trình nghiên cứu độc tố Aflatoxin Các nhà khoa học xác định công thức phân tử công thức cấu tạo Aflatoxin 1.3.2 Công thức cấu tạo số tính chất lý hóa Aflatoxin Aflatoxin gồm loại (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2), có công thức phân tử là: 32 ppb (chiếm 28,5% số mẫu phân tích) Có 2/14 mẫu nhiễm aflatoxin G1 (chiếm tỷ lệ 14,2% số mẫu phân tích) Khi đem so sánh kết phân tích với tiêu chuẩn cho phép Bộ Y tế thì: 12/12 mẫu nhiễm có hàm lượng aflatoxin B1 cao tiêu chuẩn cho phép từ 1,04 đến 20,41 lần chiếm tỷ lệ 100% mẫu nhiễm mức độ nhiễm aflatoxin B2 G1 tiêu chuẩn cho phép Bộ Y tế Kết đánh giá cảm quan cho thấy: Những mẫu cám có màu mùi thơm đặc trưng phân tích bị nhiễm aflatoxin B1 từ 5,19 đến 10,04 ppb, mẫu có trạng thái vón cục mùi hắc mức độ nhiễm B1 cao từ 37,13 đến 102,07 ppb Vì vậy, sử dụng cám gạo làm thức ăn cho vật nuôi cần ý đến trạng thái cảm quan chúng 2.2.5 Hàm lượng aflatoxin mẫu gạo Gạo lương thực sử dụng phổ biến ngày Tuy vậy, trình bảo quản chế biến gạo dễ bị hỏng chủ yếu nấm mốc mọt xâm nhập Khi gạo bị mốc giảm giá trị dinh dưỡng, mùi vị, biến màu, làm tăng tỷ lệ acid béo tự do… Khi người, gia súc, gia cầm ăn phải gạo mốc, độc tố tồn thể gây ngộ độc Ở nước ta khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, mùa thu hoạch chủ yếu vào mùa mưa nên dễ bị xâm nhập phá hại Đây điều khó khăn lớn bảo quản người sản xuất trình sử dụng chế biến Chính sau trình thu thập mẫu gạo địa bàn số tỉnh khu vực trung du miền núi phía bắc, tiến hành phân tích hàm lượng độc tố aflatoxin, kết trình bày bảng sau: 33 Bảng 2.8 Kết phân tích hàm lượng aflatoxin mẫu gạo Đơn vị: ppb Stt Tên mẫu Địa điểm lấy mẫu VCK (%) Tiêu chuẩn cho phép [1] B1 Hàm lượng aflatoxin B2 G1 G2 15 15 15 89,78 3,34 0 Gạo Tám Điện Biên Điện Biên Gạo Qui Năm Hà Tây Hà Nội 85,82 20,09 5,88 0 Gạo Xi Dẻo Thái Nguyên 85,39 16,87 20,45 0 Gạo Xi Dẻo Nam Định 85,03 45,06 28,16 0 Gạo Khang Dân Thái Nguyên 84,67 78,54 6,09 0 Gạo Khang Dân Hà Tây 86,43 32,21 11,04 0 Gạo Bao Thai Thái Nguyên 85,866 19,21 0 Gạo nếp nương Cao Bằng 85,82 85,19 25,67 0 Gạo tám Hải Hậu Nam Định 84,78 0 0 10 Gạo Xi Thái Bình Thái Bình 85,82 0 0 11 Gạo Bắc Thơm Thái Bình 87,01 0 0 86,04 27,32 8,84 0,00 0,00 Trung bình Qua bảng 2.8 cho thấy, mẫu gạo khác có hàm lượng aflatoxin khác Có 8/11 mẫu gạo phân tích nhiễm aflatoxin B1 từ 3,34 – 85,19 ppb (chiếm tỷ lệ 100% số mẫu phân tích), 6/11 mẫu aflatoxin B2 với hàm lượng từ 5,88 - 28,16 ppb (chiếm tỷ lệ 54,5% số mẫu phân tích) mẫu nhiễm G1 G2 Khi so sánh hàm lượng aflatoxin mẫu gạo với Tiêu chuẩn cho phép Bộ Y tế kết cho thấy: Có 7/8 mẫu gạo nhiễm aflatoxin B1 vượt Tiêu chuẩn cho phép từ 3,84 – 17,04 lần chiếm tỷ lệ 80% mẫu nhiễm có 3/6 mẫu nhiễm aflatoxin B2 vượt Tiêu chuẩn cho phép từ 1,36 - 1,88 lần chiếm tỷ lệ 50% mẫu nhiễm Qua phân tích hàm lượng vật chất khô mẫu phân tích nhận thấy, hàm lượng vật chất khô cao tỷ lệ nhiễm aflatoxin thấp ngược lại 34 Phần 3: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN - Đã xây dựng quy trình phân tích aflatoxin thiết bị sắc ký lỏng hiệu cao HPLC 1200 với thông số thẩm định: LOD aflatoxin B1 0,3 µg/l, B2 0,1 µg/l, G1 0,2 µg/l, G2 G2 0,1 µg/l LOQ aflatoxin B1 0,99 µg/l, B2 0,33 µg/l, G1 0,66 µg/l, G2 G2 0,33 µg/l Khoảng tuyến tính đường chuẩn đạt yêu cầu với hệ số R2=0,99; Độ lặp đạt, Độ đáp ứng yêu cầu theo tiêu chuẩn AOAC - Áp dụng quy trình để phân tích 75 mẫu nông sản phụ phẩm chế biến (Cụ thể 18 mẫu ngô, 16 mẫu lạc, 16 mẫu khô đỗ tường, 14 mẫu cám, 11 mẫu gạo) thu thập địa bàn tỉnh Thái Nguyên số tỉnh lân cận Kết nghiên cứu hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu trước 5.2 KIẾN NGHỊ - Áp dụng quy trình phân tích aflatoxin thiết bị sắc ký lỏng hiệu cao HPLC 1200 để xác định hàm lượng độc tố aflatoxin mẫu nông sản thực phẩm Viện Khoa học sống - Đại học Thái Nguyên, phòng thí nghiệm khác có điều kiện trang thiết bị phù hợp - Quá trình bảo quản nông sản phẩm không đúng, không đảm bảo nguyên nhân chủ yếu gây nhiễm độc aflatoxin Do vậy, sử dụng nông sản phẩm làm thức ăn cho người động vật cần đặc biệt ý đến vấn đề 35 QUY TRÌNH PHÂN TÍCH AFLATOXIN TRÊN THIẾT BỊ HPLC 1200 Mẫu rắn (Xay nhỏ, trộn đều) Cân 10-20gam Nhiều béo Ít béo + 100ml Methanol:H2O(85:15) Lắc 30 phút, 140v/p +100ml Cloroform Lọc, lấy 40ml dịch lọc +40ml NaCl 1% +25ml Hexan Lắc, để yên đến phân lớp Lắc 30 phút, 140v/p Lớp 25ml,25ml Clorofofm Thu lớp cho vào cô quay Lọc lấy dịch lọc cho vào cô quay Cô cạn, hòa cặn = 10ml Diclomethal Làm cột Hoạt hóa: 3ml Hexan,3 ml Diclomethal Nạp mẫu qua cột (2ml/phút) Rửa tạp: 3ml hexan, 3ml Diclomethal HPLC Cô cạn, hòa cặn 1ml Methanol Rửa giải =10ml hỗn hợp Cloroform:aceton (90:10) 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng Việt Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn (2001), Quy định hàm lượng tối đa độc tố nấm mốc aflatoxin kilogam (kg) thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho gia súc, gia cầm, Quyết định số 104/2001/QĐ/BNN ngày 31 tháng 10 năm 2001 Bộ Y tế Việt Nam (2007), Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học hóa học thực phẩm, Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT ngày 19 tháng 12 năm 2007 Nguyễn Thùy Châu, Đào Thị Hương, Vũ Thị Hương (2011), “Đánh giá mức độ nhiễm nấm mốc độc tố aflatoxin B1 số nông sản giai đoạn bảo quản Việt Nam”, Tạp chí Nông nghiệp Phát triển Nông thôn, số 21, trang 13 - 21 Nguyễn Thùy Châu (2009), “Phòng chống Aspergillus sản sinh aflatoxin ochratoxin cà phê giai đoạn đồng trình bảo quản chủng không sản sinh aflatoxin”, Tạp chí Nông nghiệp Phát triển Nông thôn, số 6, trang 19 - 23 Nguyễn Thùy Châu (1996), Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc sinh độc tố (Mycotoxin) ngô, gạo Việt Nam biện pháp phòng trừ, Luận văn Phó tiến sỹ Khoa học Sinh học, Trường đại học Khoa học tự nhiên - Bộ Giáo dục Đào tạo Lê Doãn Diên, Nguyễn Bá Trinh (1981), Nâng cao chất lượng nông sản, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, trang 56 - 58 Phạm Văn Diễn (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hoá học vi sinh vật, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội Lê Thị Ngọc Diệp, Bùi Thị Tho (2006), Độc chất học thú y, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, trang 135 - 156 Bùi Xuân Đồng (2004), Nguyên lý phòng chống nấm mốc mycotoxin, Nxb Khoa học xã hội, trang 35 - 170 10 Bùi Minh Đức, Phan Thị Kim, Lê Văn Giang (2005), “Khảo sát thực trạng ô nhiễm độc tố vi nấm Ochtoxin A ngô đề xuất giải pháp giảm thiểu ô nhiễm”, Hội nghị khoa học - Vệ sinh an toàn thực phẩm lần 3, Nxb Y học Hà Nội, trang 92 - 100 11 Bùi Thanh Hà (2001), “Tìm hiểu số yếu tô nguy bệnh nhân ung thư nguyên phát”, Hội nghị khoa học vệ sinh an toàn thực phẩm lần 1, TP.HCM 10/2001, trang 405 - 414 37 12 Đâu Ngọc Hào, Lê Thị Ngọc Diệp (2003), Nấm mốc độc tố aflatoxin thức ăn chăn nuôi, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, trang 53 - 198 13 Đậu Ngọc Hào (1996), Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm Mycofix plus để làm vô hoạt aflatoxin thức ăn chăn nuôi, Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Nhà nước 14 Đậu Ngọc Hào (1995), Nghiên cứu xác định tác hại hệ nấm mốc, vi khuẩn gây độc thức ăn, nguyên liệu chế phẩm khác làm thức ăn chăn nuôi, xây dựng biện pháp phòng chống hạn chế ô nhiễm điều kiện chăn nuôi nhiệt đới, Nxb Nông Nghiệp 15 Đậu Ngọc Hào (1992), Nghiên cứu hoàn thiện hệ thống nấm mốc, độc tố nấm mốc thức ăn nguyên liệu thức ăn hỗn hợp cho gia súc gia cầm, Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Nhà nước 16 Phan Thị Kim, Lê Văn Giang, Nguyễn Kim Vũ (2003), “Khảo sát ô nhiễm aflatoxin ngô, lạc vùng kinh tế Nghệ An xây dựng biện pháp phòng tránh”, Hội nghị khoa học Vệ sinh an toàn thực phẩm lần thứ 2, Nxb Y học, Hà Nội, trang - 163 17 Nguyễn Xuân Mai, Từ Thị Hưng (2005), “Điều tra hệ nấm mốc định lượng độc tố aflatoxin B1 nguyên liệu bánh đậu phộng TP HCM”, Hội nghị khoa học - Vệ sinh an toàn thực phẩm lần thứ 3, Nxb Y học, Hà Nội, trang 234 - 240 18 Lê Thiên Minh (2010), “Tác dụng chủng Aspergillus aflavus DA2 không sinh độc tố phòng chống aflatoxin ngô giai đoạn đồng trình bảo quản”, Tạp chí Nông nghiệp Phát triển Nông thôn, số 6, trang 30 - 35 19 Nguyễn Hữu Nam (1999), Một số tiêu biến đổi bệnh lý gà công nghiệp nhiễm aflatoxin B1 thực nghiệm, Luận án Tiến sỹ, Trường ĐH Nông Nghiệp I Hà Nội 20 Nguyễn Phùng Tiến (1982), Nấm mốc số sản phẩm thực phẩm, Luận án Phó tiến sỹ Y học, Viện Dịch tễ Hà Nội 21 Tiêu chuẩn Việt Nam (2007), Phương pháp xác định hàm lượng aflatoxin, TCVN 7596: 2007 (ISO 16050: 2003) 22 Tiêu chuẩn Việt Nam (2007), Phương pháp lấy mẫu, TCVN 4325: 2007 (ISO 6497: 2002), 23 Tiêu chuẩn Việt Nam (2007), Phương pháp xác định hàm lượng vật chất khô, TCVN 4326: 2007 (ISO 6497: 1999) • AFB1: C17H12O6 • AFB2: C17H14O6 • AFG1 : C17H12O7 • AFG2 : C17H14O7 Ngoài loại trên, aflatoxin có thêm hai sản phẩm trao đổi chất aflatoxin M1 aflatoxin M2 M1 4-hydroxy aflatoxin B1 aflatoxin M2 4dihydroxy aflatoxin B2 Theo Vitoria (2001) [35], Công thức cấu tạo loại aflatoxin sau: Hình 1.1: Công thức cấu tạo hoá học AFB1, AFB2, AFG1 AFG2 Tính chất lý học loại aflatoxin: - AFB1: Có điểm nóng chảy 268-269 oC, có màu xanh lam đèn huỳnh quang - AFB2: Có điểm nóng chảy 286-289 oC, có màu xanh lam đèn huỳnh quang - AFG1: Có điểm nóng chảy 244-246 oC, có màu xanh lục đèn huỳnh quang - AFG2: Có điểm nóng chảy 229-231 oC, có màu xanh lục đèn huỳnh quang (Hendricks, 2002) [30] 39 MỘT SỐ HÌNH ẢNH CỦA ĐỀ TÀI Ảnh Mẫu ngô Ảnh Mẫu khô đỗ tương Ảnh Mẫu Cám gạo Ảnh Mẫu Lạc Ảnh Mẫu Cám gạo Ảnh Mẫu Gạo 40 Ảnh Nghiền mẫu Ảnh Lắc mẫu Ảnh Nghiền mẫu Ảnh 10 Chuẩn bị mẫu mẫu Ảnh 11 Kiểm tra máy Ảnh 12 Chạy máy phân tích mẫu 41 SẮC ĐỒ AFLATOXIN TRONG MỘT SỐ MẪU PHÂN TÍCH Sắc đồ aflatoxin mẫu ngô LVN14 (sau tháng) Sắc đồ aflatoxin mẫu khô đỗ tương (Chợ Đồn – BK) Sắc đồ aflatoxin mẫu lạc đỏ (Định Hóa) [...]... từ 1 - 28 ngày tuổi (Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2001) [1] 1.6 CÁCH TIẾP CẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.6.1 Cách tiếp cận - Sử dụng phương pháp nghiên cứu trực tiếp để xây dựng quy trình sử dụng thiết bị sắc ký lỏng HPLC Ứng dụng quy trình này để xác định hàm lượng aflatoxin trong nông sản thực phẩm - Sử dụng phương pháp gián tiếp để thu thập mẫu trong cộng đồng dân cư tại một số tỉnh trung du và miền... điện để định lượng chất phân tích Trên thế giới, kỹ thuật phân tích trên thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đã được sử dụng rộng rãi từ rất lâu Ở Việt Nam, hiện nay thiết bị này đã được trang bị ở một số phòng thí nghiệm hóa sinh để phân tích các chất ở dạng vết trong nhiều lĩnh vực khác nhau như hóa dược, chăn nuôi thú y, trồng trọt, mỹ phẩm Thiết bị HPLC đã được khai thác để xác định hàm lượng. .. địa điểm nghiên cứu - Nghiên cứu được tiến hành trên các loại nông sản như ngô, lạc, khô đỗ, gạo, cám dùng làm thức ăn chăn nuôi trên địa bàn tỉnh Thái Nguyên và một số tỉnh lân cận - Thí nghiệm được thực hiện tại phòng Phân tích hoá học - Viện Khoa hoc Sự sống - Đại học Thái Nguyên 15 1.6.3 Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích hàm lượng aflatoxin trên thiết bị sắc ký lỏng hiệu... … Việc phân tích xác định hàm lượng aflatoxin trên thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC có thể cho kết quả chính xác, tiết kiệm dung môi và tiết kiệm thời gian phân tích 27 aflatoxin B2 từ 3,78 – 50,45 ppb (chiếm 66,67% số mẫu phân tích) và G1 từ 1,31 – 23,07 ppb (chiếm tỷ lệ 44,44% số mẫu phân tích) ; không có mẫu nào nhiễm aflatoxin G2 Khi so sánh hàm lượng aflatoxin trong các mẫu phân tích với... quả phân tích ở các aflatoxin B1, B2, G1, G2 lần lượt là - 0,35; - 0,19; - 0,37; - 0,03 Tuy nhiên, sự chênh lệch này nằm trong giới hạn cho phép của TCVN 6910:2001 về độ chính xác của phương pháp và kết quả đo 2.2 ÁP DỤNG QUY TRÌNH ĐỂ PHÂN TÍCH HOÀM LƯỢNG AFLATOXIN TRONG MỘT SỐ NÔNG SẢN THỰC PHẨM Sau khi xây dựng và thẩm định được quy trình phân tích, chúng tôi tiến hành phân tích xác định hàm lượng aflatoxin. .. mẫu lạc 29 Bảng 2.6 Kết quả phân tích hàm lượng aflatoxin trong mẫu khô đỗ tương 31 Bảng 2.7 Kết quả phân tích hàm lượng aflatoxin trong mẫu cám gạo 32 Bảng 2.8 Kết quả phân tích hàm lượng aflatoxin trong mẫu gạo 34 DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình Trang Hình 2.1 Sắc đồ aflatoxin ở điểm xác định LOD 21 Hình 2.2 Sắc đồ aflatoxin mẫu chuẩn 23 Hình 2.3 Đường chuẩn các aflatoxin 23 17 1.6.4.3 Thẩm định phương... bị nhiễm aflatoxin ở mức đô cao, đặc biệt là hàm lượng aflatoxin B1 Sự nhiễm aflatoxin phụ thuộc vào nhiều yếu tố: độ ẩm của hạt và thời gian, điều kiện bảo quản Vì vậy, khi sử dụng ngô làm thức ăn cho gia súc cần đánh giá tình trạng nhiễm độc tố nấm mốc để hạn chế những tác hại của nó gây ra 2.2.2 Hàm lượng aflatoxin trong các mẫu lạc Lạc là một loại nông sản có hàm lượng lipit khác cao, được sử dụng. .. hiệu năng cao HPLC 1.200 tại Viện Khoa học sự sống - Đại học Thái Nguyên + Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp + Xác định khoảng tuyến tính của phương pháp + Đánh giá độ lặp của phương pháp + Đánh giá độ đúng của phương pháp qua hệ số thu hồi và kiểm tra liên phòng - Áp dụng quy trình để phân tích hàm lượng aflatoxin trong một số sản phẩm nông sản thực phẩm trên địa bàn... Thể tích mẫu được dùng trong HPTLC có thể bằng 1 µl so với 510µl mẫu trong phương pháp TLC, như vậy sẽ làm giảm đi rất nhiều diện tích của vết Nồng độ chất chuẩn có thể cần 5pg trong phân tích bằng HPTLC, do đó có thể xác định tới 30pg aflatoxin ở lạc - Phương pháp sắc khí lỏng cao áp (HPLC) : Hệ thống phân tích HPLC là hệ thống phân tích đắt tiền, chọn lọc, dùng định lượng aflatoxin Phương pháp sử dụng. .. số lớn gia cầm con và heo con Bảng 1.2: Các giới hạn tối đa (ML) theo quy định của Bộ Y tế Việt Nam ML (ppm) Tiêu chí 5 Đối với Aflatoxin B1 trong thực phẩm nói chung 15 Đối với Aflatoxin B1, B2, G1, G2 trong thực phẩm nói chung 0,5 Đối với Aflatoxin M1 trong sữa và các sản phẩm sữa (Nguồn: Bộ y tế, 2007), [2] Bảng 1.3: Hàm lượng AF trong một số nguyên liệu làm thức ăn gia súc ở VN Bắp hạt 25 Hàm lượng