TÁCH CHIẾT COLLAGEN TỪ DA CÁ TRA (Pangasius hypophthalmus) BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC ISOLATION COLLAGEN FROM CATFISH SKIN (Pangasius hypophthalmus) BY CHEMICAL METHODS Trần Thị Huyền1,*, Nguyễn Anh Tuấn2, Hoàng Ngọc Anh3, Vũ Lệ Quyên4 (1*), (2), (4) Khoa Công nghệ Thực phẩm (3) Viện nghiên cứu Công nghệ sinh học Môi trường Đại học Nha Trang (*)Email liên lạc tác giả: huyencncb@gmail.com Tóm tắt Quy trình tách chiết collagen từ da cá tra phương pháp hóa học nghiên cứu Kết cho thấy để tăng hiệu cho trình tách chiết collagen, ban đầu da cá tra xử lý NaOH 0,2M, w/v=1/10, thời gian 20 giờ, thay dung dịch xử lý lần, tiếp tục xử lý axit citric 0,003M, w/v= 1/8, thời gian 30 phút Xử lý hydroperoxide(oxy già) không hiệu để khử sắc tố da cá Quá trình chiết collagen thực với acid acetic 0,5M, w/v =1/10 34 giờ, dịch chiết kết tủa collagen NaCl 2,5M Công đoạn làm thực với dung môi Na2HPO4 0,02M Hiệu suất thu collagen 76,9% (tính theo % khối lượng khô), khả giữ nước 415%, nhiệt độ biến tính 390C, collagen thu có loại protein có khối lượng phân tử 217kDa, 185kDa, 156kDa, 104kDa Abstract The process of extracting collagen from catfish skin by chemical methods was studied The results showed that to increase the efficiency of extracting collagen, first, catfish skin was treated with 0.2 M NaOH, w / v = / 10, during 20 hours, changing treatment solution every hours, and then processing by 0.003 M citric acid, with a solid/solution ratio of 1/8, in 30 minutes Handling the skin with hydroperoxide (hydrogen peroxide) was not effective in reducing the pigment in the fish skin Collagen extraction process was performed with 0.5 M acetic acid, a solid/solution ratio of / 10 in 34 hours, collagen extracts were precipitated with NaCl 2.5 M The purification was done with solvent Na2HPO4 0.02 M Yield of collagen is 76.9% (% of dry weight), water holding capacity is 415%, denaturation temperature was 390C, collagen obtained proteins of molecular weight 217kDa, 185kDa, 156kDa, and 104kDa Từ khóa: collagen, chiết collagen, da cá Tra I.ĐẶT VẤN ĐỀ Cá tra loài thủy sản nuôi phổ biến tỉnh đồng sông Cửu Long lượng đáng kể Pangasius hypophthalmus Sản lượng thu hoạch cá tra Việt Nam năm 2010 ghi nhận 1,141 triệu tấn, sản lượng xuất đạt 645.000 tấn, kim ngạch xuất đạt 1,39 tỉ USD(Hiệp hội Chế biến & Xuất Thủy sản Việt Nam) Ước tính đưa vào sản xuất 700.000 cá tra loại 100.000 mỡ khoảng 50.000÷70.000 phế liệu da xương Như nguồn phụ phẩm da cá dồi để nghiên cứu sản xuất collagen Collagen mà đặc biệt collagen từ thủy sản đánh giá có khả ứng dụng cao ngành thực phẩm mà ngành mỹ phẩm dược phẩm (C Meena cộng sự, 1999, Bryan Jeun cộng sự, 2002) Trên giới việc nghiên cứu sản xuất collagen quan tâm từ năm 1990 Việt Nam chưa có công bố nghiên cứu thu nhận collagen đưa vào ứng dụng Các tác giả giới nghiên cứu thu nhận collagen phương pháp hoá phương pháp hoá học kết hợp với sinh học (Takeshi Nagai, 2000; LS Sensrsture, 2006; Sang Moo Kim, 2007) Mục đích nghiên cứu bước đầu xây dựng quy trình thu nhận collagen từ da cá tra Việt Nam phương pháp hoá học Nghiên cứu đề xuất quy trình tách chiết collagen xác định số tính chất sản phẩm collagen II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chuẩn bị mẫu Da cá tra lấy từ xí nghiệp chế biến cá tra thuộc công ty cổ phẩn Nam Việt, khu công nghiệp Mỹ Quý, phường Mỹ Quý, thành phố Long Xuyên, tỉnh An Giang Da cá sơ chế cấp đông dạng block, đóng gói PE, có trọng lượng 6kg/block, đạt tiêu chuẩn xuất Nguyên liệu cho vào thùng xốp cách nhiệt, trì nhiệt độ bảo quản nước đá gel vận chuyển phòng thí nghiệm bảo quản đông nhiệt độ ≤-20oC sử dụng Cách chuẩn bị nguyên liệu cho thí nghiệm: bánh da cá sau rã đông tự nhiên rửa sơ để loại bỏ bớt mỡ, thịt vụn sót lại, đem cắt thành miếng nhỏ kích thước 1x1cm, phục vụ cho thí nghiệm Phương pháp nghiên cứu 2.1 Phương pháp phân tích Xác định màu mẫu thử máy đo màu Chroma meter CR- 400 Xác định nhiệt độ biến tính: theo phương pháp Kimura cộng (1988) Xác định khả giữ nước collagen theo phương pháp Mc Connel cộng (1974) Hàm lượng collagen xác định từ hàm lượng hydroxyproline theo phương pháp C George Carlson áp dụng công thức chuyển đổi theo AOAC 990.26 Phân tích hàm lượng protein tổng số phương pháp Kjeldahl theo TCVN 4295-86 Phân tích hàm lượng khoáng phương pháp nung theo TCVN 5105-90 Phân tích điện di protein theo phương pháp Weber Osborn 1969 2.2 Phân tích số liệu Số liệu thí nghiệm xử lý phần mềm Microsoft Excel 2.3 Sơ đồ nghiên cứu Các công đoạn nghiên cứu bố trí theo sơ đồ hình Da cá sau rửa, cắt nhỏ với kích thước khoảng 1x1cm xử lý qua kiềm NaOH để khử tạp chất phi collagen lipit, protein khoáng, sắc tố số chất nguyên liệu da cá Để đạt mục đích khử khoáng cần nghiên cứu chế độ xử lý axit citric thích hợp (nồng độ 0,001 ÷ 0,005 M; thời gian 10 ÷ 50 phút tỷ lệ xử lý w/v: 1/6, 1/8, 1/10) cho nguyên liệu da cá Da cá sau xử lý axit citric rửa lại nước thường đem xử lý oxy già để tẩy màu cho nguyên liệu nhằm mục đích sản phẩm collagen thu có màu sáng Việc tẩy màu quy trình Da cá tra thu nhận collagen bố trí Rửa thử nghiệm thời điểm thu kết tủa để so sánh hiệu tẩy trắng oxy Cắt miếng già để lựa chọn chế độ tẩy màu thích Xử lý kiềm hợp (nồng độ 10 0/00 ÷ 400/00, thời gian ÷ 13 phút ) Sau xác định Rửa thông số xử lý thích hợp da cá - Nồng độ a citric nghiên cứu chiết xuất collagen - Thời gian xử lý Xử lý axit số axit hữu khác để - Tỷ lệ w/v citric tìm chế độ chiết hiệu (axit Rửa - Nồng độ axetic nồng độ 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, H2O2 Xử lý oxy già 0,6M; thời gian 16, 34, 52, 70 giờ; - Thời gian (*) w/v 1/8, 1/10, 1/12, 1/14), (Axit Rửa - Loại axit lactic nồng độ 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6M, - Nồng độ thời gian 10, 22, 34, 46 giờ, w/v Chiết collagen - Thời gian 1/8, 1/10, 1/12, 1/14), (Axit citric - Tỷ lệ nồng độ 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, Kết tủa 0,125M, thời gian 7, 17, 27, 37 giờ, Xử lý oxygià(*) Thu kết tủa w/v 1/6, 1/8, 1/10, 1/12) Kết tủa - Thẩm tích thu tiếp tục nghiên cứu - Hòa tan tủa lại Làm làm tạp chất nhiều lần phương pháp thẩm tích (Na2HPO4 Làm khô 0,02M 24, 36, 48 giờ) phương pháp hoà tan kết tủa lặp lại Bao gói 1lần, lần Sản phẩm thí Bảo quản collagen nghiệm đem kiểm tra tiêu thích hợp để có sở đề xuất quy Hình 1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát trình tách chiết collagen III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN Xác định chế độ xử lý axít citric tách khoáng Xác định chế độ xử lý axit citric thích hợp nồng độ axit citric 0,003M; tỷ lệ da cá/ dd 1/8 thời gian 30 phút, cho hiệu suất khử khoáng 75,53%, nhiệt độ biến tính 39,50C khả giữ nước 365% Khi tăng giá trị nồng độ, tỷ lệ thời gian xử lý axit citric hiệu khử khoáng tăng lên nhiệt độ biến tính khả giữ nước lại giảm Cơ chế loại khoáng 25 250 20 200 15 150 10 100 50 0 0.5 0.6 34 52 80 70 60 50 40 30 20 0.4 0.5 38 350 37.5 300 250 37 200 36.5 150 36 100 35.5 50 T hời gian chiết 34 150 100 50 H iệ u s uấ t thu c olla ge n(% ) 200 1/10 1/12 Nhiệt độ biến tính(độ C) 41.5 300 41 250 40.5 200 40 150 39.5 100 39 50 38.5 38 10 22 34 46 Thời gian chiết(giờ) Nhiệt độ biến tính(độ C) 30 20 10 j) Khả giữ nước(%) 1/10 1/12 Tỷ lệ da cá/dd axit citric (w/v) Khả giữ nước(%) Nồng độ a.citric 0.05M 250 40 200 39 150 38 100 37 50 36 Tỷ lệ da cá/ a.lactic (w/v) Nhiệt độ biến tính(độ C) c) Khả giữ nước(%) 350 37 300 250 36 200 35 150 34 100 33 50 17 27 Nhiệt độ biến tính(độ C) 37 f) Khả giữ nước(%) 42 41 40 39 38 37 36 35 34 33 32 300 250 200 150 100 50 0.3 0.4 Nhiệt độ biến tính(độ C) 300 1/14 1/14 0.5 0.6 i) Nồng độ axit lactic(M) Nồng độ a.citric 0.075M 1/12 1/12 Thời gian chiết (giờ) h) 41 1/10 1/10 38 0.2 42 1/8 50 Khả giữ nước 40 g) Tỷ lệ da cá/a.citric (w/v) 100 Tỷ lệ da cá/a.acetic (w/v) e) 50 1/8 Nhiệt độ biến tính(độ C) 1/8 0.125 Khả giữ nước(%) 1/6 150 32 60 Khả giữ nước(% ) 250 0.1 Nhiệt độ biến tính(độ C) 350 300 0.075 Nồng độ a citric (M) T hời gian chiết 52 38 37.8 37.6 37.4 37.2 37 36.8 36.6 36.4 36.2 0.05 200 Nhiệt độ biến tính(độ C) 0.025 d) Nồng độ axit acet ic (M) 250 b) Khả giữ nước (%) Nhiệt độ biến tính(độ C) 300 1/8 35 350 70 Thời gian chiết (giờ) Nhiệt độ biến tính(độ C) Hiệu suất thu collagen (%) Nhiệt độ biến tính (độ C) Khả giữ nước 10 Nhiệt độ biến tính (độ C) 50 16 90 Nhiệt độ biến tính(độ C) 100 a) Nồng độ axit acetic (M) Nhiệt độ biến tính (độ C) 150 Nhiệt độ biến tính(độ C) 0.4 200 Khả giữ nước(%) 0.3 250 Khả giữ nước(%) 60 Khả giữ nước(%) 0.2 300 Khả giữ nước(% ) 300 400 Khả giữ nước(%) 30 350 450 39.5 39 38.5 38 37.5 37 36.5 36 35.5 35 34.5 Khả giữ nước(%) 350 400 Nhiệt độ biến tính(độ C) 35 450 39.5 39 38.5 38 37.5 37 36.5 36 35.5 35 34.5 Hiệu suất thu collagen(%) 400 Kh ả n ăn g g iữ n ướ c(% ) 450 40 Nh iệt đ ộ biến tín h (đ ộ C) 45 Khả giữ nước (%) Nhiệt độ biến tính (độ C) axit citric giải thích tượng Các nhóm –COOH cho proton để tạo thành muối citrat với ion kim loại, muối dễ tan nước nên loại bỏ chế độ rửa Tuy nhiên nồng độ axit citric, tỷ lệ da cá/dd thời gian xử lý tăng lên mức độ tiếp xúc da cá cao nên có tác dụng tháo xoắn tác dụng lên mạch thành phần phân tử collagen làm cho khả chịu nhiệt collagen giảm Nồng độ H+ cao khoá bớt gốc NH2 làm cản trở liên kết hyđrô với phân tử nước nên khả hút nước collegen giảm Xác định chế độ chiết collagen 50 40 30 20 10 k) Khả giữ nước(%) 0.2 0.3 0.4 Nồng độ axit lactic(M) Thời gian chiết 22 l) Thời gian chiết 34 Hình 2: Ảnh hưởng nồng độ, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi thời gian chiết axit khác đến khả giữ nước, nhiệt độ biến tính hiệu suất thu collagen Trong a, b, c, d chiết axit acetic; e, f, g, h chiết axit citric; i, j, k,l chiết axit lactic 2.1 Chiết axit acetic Khi tăng nồng độ axit acetic từ 0,3 ÷ 0,5 M khả giữ nước nhiệt độ biến tính có khả tăng đạt giá trị lớn nồng độ axit acetic 0,5 M(lần lượt 415% 39 0C) Tiếp tục thí nghiệm với nồng độ axit acetic 0,5 M thời gian chiết 34 tỷ lệ da cá/dd axit acetic 1/10 cho khả giữ nước nhiệt độ biến tính lớn Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ axit acetic thời gian chiết đến hiệu suất thu chế phẩm collagen trình bày hình 2d Theo đó, nồng độ chiết axit acetic 0,3 M thực chiết 34 hiệu suất thu collagen thấp (48,6%) chiết 52 giờ(63,15%) Nhưng nồng độ axit acetic 0,4 0,5 M ngược lại hiệu suất thu chế phẩm collagen cao 76,9 % (tính theo khối lượng khô) nồng độ axit acetic 0,5 M Từ kết nghiên cứu cho thấy chế độ chiết collagen axit acetic thích hợp là: axit acetic nồng độ 0,5 M, thời gian chiết 34 giờ, tỷ lệ da cá/ dd axít acetic 1/10 2.2 Chiết axit citric Chế độ chiết cho khả giữ nước, nhiệt độ biến tính chế phẩm collagen lớn nồng độ axít citric 0,05 M, thời gian chiết 17 tỷ lệ w/v 1/8 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ axít citric tỷ lệ da cá/ dd axit citric (w/v) đến hiệu suất thu chế phẩm collagen biểu diễn hình 2h Ở nồng độ dung môi chiết hiệu suất thu chế phẩm collagen giảm dần tăng tỷ lệ w/v chiết với axit citric có nồng độ 0,05M hiệu suất thu chế phẩm collagen cao chiết với nồng độ 0,075M Điều độ mạnh axit citric kết hợp với việc tăng tỷ lệ w/v làm ảnh hưởng không tốt đến cấu trúc mạch phân tử collagen làm cho collagen tan mà không kết tủa lại nên hiệu suất thu chế phẩm collagen giảm Kết nghiên cứu cho phép đề xuất chế độ chiết collagen thích hợp axit citric nồng độ 0,05M, tỷ lệ w/v 1/8 thời gian 17 2.3 Chiết axit lactic Khi nồng độ axit lactic lớn 0,3M nhiệt độ biến tính chế phẩm collagen giảm nhanh khả giữ nước giảm không đáng kể Thời gian chiết 22 34 cho kết nhiệt độ biến tính khả giữ nước chế phẩm collagen tương đối cao( 41oC 270%; 39,8oC 200% ) Tỷ lệ w/v 1/10 cho kết khả giữ nước nhiệt độ biến tính cao đáng kể so với tỷ lệ khác Từ kết thăm dò tiếp tục thực nghiên cứu ảnh hưởng chế độ chiết lựa chọn đến hiệu suất thu chế phẩm collagen Kết thu biểu diễn hình 2l Rõ ràng với nồng độ axit lactic 0,3M thực chiết thời gian 22 thu nhiều chế phẩm collagen Kết hợp với kết thăm dò cho phép lựa chọn chế độ chiết collagen axit lactic thích hợp nồng độ axit lactic 0,3M, thời gian chiết 22 giờ, tỷ lệ w/v 1/10 Các kết chiết collagen loại axit cho phép đề xuất chế độ chiết collagen thích hợp axit acetic 0,5M thời gian 34 tỷ lệ w/v 1/10 Nghiên cứu sử dụng hydro peroxit để khử màu Bảng 1: Ảnh hưởng hydroperoxit đến tính chất collagen Thời Kết nghiên cứu ảnh Khả Nồng độ Nhiệt độ biến Mầu sắc gian hưởng nồng độ hydroperoxit, giữ hiđro tính( oC) thời gian xử lý đến hiệu khử (phút) peroxit(0/oo) nước(%) màu sắc chế phẩm collagen 10 381 38,6 60,35 không đáng kể Cụ thể mẫu 20 379 38,4 61,03 collagen trước sau xử lý 30 376 37,9 62,57 hydro peroxit có độ trắng tăng từ 40 365 36,4 64,07 59,97 lên 64,94 Tuy nhiên nhiệt độ 10 381 38,6 62,17 biến tính khả giữ nước 20 378 38,2 62,37 chế phẩm collagen lại giảm: nhiệt 30 374 37,5 64,94 độ biến tính giảm từ 38,90C xuống 40 364 35,9 65,33 37,50C, khả giữ nước giảm từ 11 10 380 38,4 62,39 382% xuống 374% Từ kết 20 378 38,0 62,78 cho thấy hydroperoxit cho hiệu 30 370 36,3 65,23 khử màu không cao mà gây 40 362 35,2 65,54 ảnh hưởng đến đến liên kết 13 10 380 38,4 62,44 mạch bên mạnh peptid làm 20 376 37,5 62,87 giảm khả chịu nhiệt liên kết 30 365 36,0 65,48 40 357 35,0 65,98 với nước collagen Xác định chế độ làm chế phẩm collagen 4.1 Kết nghiên cứu thử nghiệm thẩm tích chế phẩm collagen Kết nghiên cứu thẩm tích chế phẩm collgen cho thấy tăng thời gian thẩm tích hàm lượng protein tăng hàm lượng khoáng lại giảm Cụ thể sau thời gian thẩm tích 24 hàm lượng protein tăng từ 82,6% lên 86,9%, hàm lượng khoáng giảm từ 15,26% xuống 7,82% Tiếp tục tăng thời gian thẩm tích lên 36 hàm lượng protein tăng lên 94,8% hàm lượng khoáng 2,26% Tuy nhiên tiếp tục tăng thời gian thẩm tích lên 48 hiệu làm tăng lên không đáng kể 4.2 Kết nghiên cứu thử nghiệm chiết lặp lại cho chế phẩm collagen Sau chế phẩm collagen hoà tan kết tủa lại lần lần hàm lượng prottein collagen tăng Tuy nhiên tăng nhỏ so với phương pháp làm màng thẩm tích Cụ thể sau lần hoà tan kết tủa lại hàm lượng protein tăng từ 82,6% lên 87,2%, hàm lượng collagen tăng từ 76,9% lên 78,4% Từ kết cho thấy phương pháp làm cách hoà tan kết tủa lại cho hiệu không cao phương pháp thẩm tích Như bước đầu đề xuất chế độ làm tốt hai chế độ thử nghiệm thực làm chế phẩm collagen cách thẩm tích dung môi Na2HPO4 0,02M thời gian 36 giờ, thay dung môi lần Đề xuất quy trình thu nhận Collagen từ da cá Tra Từ kết thu cho phép đền xuất quy trình thu nhận collagen phương pháp hóa học hình Đánh giá chất lượng sản phẩm collagen thu Nguyên liệu da từ quy trình đề xuất Collagen thu được phân tích thành Rửa phần hóa học số tính chât đặc trưng sau: Xử lý kiểm NaOH 0,2M, w/v=1/10, 20 Thành phần hóa học sản phẩm Protein 85,3% Rửa Lipit 1,76% Khoáng 2.04% Xử lý axit citric 0,003M, 30 phút, w/v=1/8 Ẩm 10% Hg 0,87 mg/kg Rửa Pb As: không phát Khả giữ nước: 415% Chiết axit acetic 0,5M, w/v=1/10, Nhiệt độ biến tính: 390C Mầu sắc: 59,97 Kết tủa NaCl Hàm lượng collagen: 70,15% (theo % khối lượng khô) Thu kết tủa Khối lượng phân tử: Kết phân tích điện di để xác định khối Thẩm tích Na2HPO4 lượng phân tử collagen thu cho thấy sản phẩm collagen thu có loại protein có khối Sấy khô lượng phân tử 217kDa, 185kDa, 156kDa, 104kDa Kết điện di mẫu collagen biểu diễn Bao gói hình Bảo quản Hình 3: Sơ đồ quy trình thu nhận collagen từ da cá tra Hình 4: Kết điện di protein mẫu collagen Land 1: hỗn hợp chuẩn protein; Land 2: mẫu collagen (50µ protein) IV KẾT LUẬN Collagen thu từ nguyên liệu da cá tra công đoạn xử lý kiềm để khử protein xà phòng hóa lipit, xử lý axit citric để khử bớt khoáng cho nguyên liệu, chiết axit acetic dung muối NaCl để thu kết tủa Kết tủa làm phương pháp thẩm tích Na2HPO4 Sản phẩm collagen thu có thành phần hóa học số tính chất đặc trưng phù hợp với tính chất collagen thu nhận từ thủy sản (Muyonga, coleb, & Duodub, 2004; Nagai & Suzuki, 2001; Sadowska, Kollodziejka, & Niecikowska, 2003) ngoại trừ hàm lượng khoáng cao TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ nông nghiệp phát triển nông thôn (2008), Báo cáo kết thực kế hoạch tháng 12 năm 2008 ngành nông nghiệp phát triển nông thôn Nguyễn Cảnh (1995), Quy hoạch thực nghiệm, Đại học Bách Khoa, Tp Hồ Chí Minh Trần Thị Huyền (2009) Nghiên cứu quy trình sản xuất collagen từ da cá tra Luận văn thạc sĩ ký thuật, Đại học Nha Trang HaiYing Liu, Ding Li, ShiDong Guo (2007), Studies on collagen from the skin of channel catfish (Ictalurus punctaus), Food chemistry, pages 621-625 K A Nam, S G You, and S M.Kim (2007), Physicochemical properties of squid skin collagen, proceedings of the 11th international symposium on the efficient application and preservation of marine biological resources, Nha Trang university, pages 72-89 Takeshi Nagai, Nobutaka Suzuki (2000), Isolation of collagen from fish waste materials- skin, bone, and fins, Food chemistry, pages 277-281 Takeshi Nagai, Masami Izumi, Masahide Ishii (2004), Fish scale collagen-preparation and partial characterization, International Journal of Food Science and, Technology, pages 239-244 Vittayanont, Bebjakul (2005), The extracting collagen from chicken feet, from http://ift.confex.com/ift/2005/techprogram/paper_31440.htm