ĐạI HọC THáI NGUYÊN TRƯờNG ĐạI HọC NÔNG LÂM nguyễn thị nõn Tên đề tài: T Nghiên cứu số đặc tính chủng Bacillus subtilis điều kiện in vitro nhằm tạo chế phẩm ứng dụng chăn nuôi khóa luận TốT NGHIệP đại học Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2010 - 2014 Thái Nguyên, 2014 ĐạI HọC THáI NGUYÊN TRƯờNG ĐạI HọC NÔNG LÂM nguyễn thị nõn Tên đề tài: T Nghiên cứu số đặc tính chủng Bacillus subtilis điều kiện in vitro nhằm tạo chế phẩm ứng dụng chăn nuôi khóa luận TốT NGHIệP đại học Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH - CNTP Lớp : 42 - CNSH Khoá học : 2010 - 2014 Giảng viên hớng dẫn : GS.TS Nguyễn Quang Tuyên Viện Khoa học Sự sống - Trờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên TS Nguyễn Văn Duy Khoa CNSH - CNTP, Trờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên Thái Nguyên, 2014 LI CM N hon thnh khúa lun, tụi nhn c rt nhiu s quan tõm, giỳp ca mi ngi Trc tiờn, tụi xin gi li cm n chõn thnh ti Ban Giỏm Hiu trng i hc Nụng Lõm, cựng ton th cỏc thy cụ giỏo Vin Khoa hc S sng cng nh cỏc thy cụ khoa Cụng ngh Sinh hc Cụng ngh Thc phm ó tn tỡnh giỳp tụi sut thi gian hc v lm khúa lun tt nghip Tụi xin dnh li cm n sõu sc nht n thy Nguyn Quang Tuyờn, ch Bớch Du, B mụn Cụng ngh Vi sinh, Vin khoa hc S sng v thy Nguyn Vn Duy, ging viờn Khoa Cụng ngh Sinh hc Cụng ngh Thc phm, trng i hc Nụng Lõm ó nh hng, dỡu dt v tn tỡnh hng dn tụi sut thi gian tụi thc hin khúa lun tt nghip ny Tụi xin gi li cm n n cỏc bn sinh viờn lp 42 CNSH, cựng ton th cỏc bn sinh viờn thc ti phũng thớ nghim ó nhit tỡnh giỳp tụi Cui cựng, tụi by t lũng bit n chõn thnh n gia ỡnh, bn bố, nhng ngi luụn quan tõm giỳp , ng viờn, ng thi l ch da tinh thn rt ln giỳp tụi hon thnh tt mi cụng vic c giao sut thi gian hc v thc hin khúa lun va qua Em xin chõn thnh cm n! Thỏi Nguyờn, ngy 10 thỏng nm 2014 Sinh viờn Nguyn Th Nừn DANH MC CC BNG Trang Bng 3.1: Cỏc húa cht s dng nghiờn cu 21 Bng 3.2: Cỏc thit b s dng nghiờn cu 21 Bng 3.3: Cỏc dng c s dng nghiờn cu 22 Bng 3.4: Thnh phn mụi trng MPA dng thch 22 Bng 3.5: Thnh phn mụi trng MPA dch th 22 Bng 4.1: Kt qu xỏc nh kh nng chng chu ca cỏc chng Bacillus subtilis mụi trng pH axớt thp v pH kim 27 Bng 4.2: Kt qu xỏc nh kh nng chng chu ca cỏc chng Bacillus subtilis mụi trng mui mt 30 Bng 4.3: Kh nng chng chu axit d dy v mui mt ca cỏc chng Bacillus subtilis mụi trng dch d dy mụ phng 32 Bng 4.4 Kh nng chng chu mui ca chng Bacillus subtilis 33 Bng 4.5: Kh nng c ch cỏc chng vi khun kim nh ca bn chng vi khun Bacillus subtilis 35 Bng 4.6: Kt qu xỏc nh tớnh i khỏng gia chng 37 Bng 4.7: Kh nng khỏng cht khỏng sinh ca vi khun 38 DANH MC CC HèNH Trang Hỡnh 2.1: Hỡnh thỏi Bacillus subtilis 12 Hỡnh 4.1: Kh nng chng chu ca cỏc chng Bacillus subtilis mụi trng pH axit v pH kim (CFU/ml) 28 Hỡnh 4.2: Kh nng chng chu ca cỏc chng Bacillus subtilis mụi trng mui mt (CFU/ml) 30 Hỡnh 4.3: Kh nng chng chu axit d dy v mui mt ca cỏc chng Bacillus subtilis mụi trng dch d dy mụ phng 32 Hỡnh 4.4: Kh nng c ch cỏc chng vi khun kim nh 36 Hỡnh 4.5: Kh nng i khỏng gia chng Bacillus subtilis 37 Hỡnh 4.6 : Kh nng khỏng khỏng sinh ca chng MBS2 38 DANH MC V THUT NG VIT TT T v thut ng vit tt Ngha y ca t, thut ng FAO Food and Agriculture Organization T chc Lng thc v Nụng nghip SCAN Scientific committee for anilmal nutrition y ban khoa hc v dinh dng ng vt MPA Malt-Peptone-Agar WHO World Health Organization T chc y t Th gii VSV Vi sinh vt CFU Colony form unit n v hỡnh thnh khun lc KL Khun lc SKK Sinh khụ cs Cng s MC LC Trang PHN M U 1.1 t 1.2 Mc tiờu nghiờn cu 1.3 í ngha ca ti 1.3.1 í ngha khoa hc 1.3.2 í ngha thc tin PHN TNG QUAN TI LIU 2.1 Gii thiu chung v probiotic 2.1.1 Lch s nghiờn cu probiotic 2.1.2 nh ngha Probiotic 2.1.3 Vai trũ ca Probiotic 2.1.4 H vi sinh vt ng rut v tỏc ng ca h vi sinh vt ti sc khe vt nuụi 2.2 C ch tỏc ng ca Probiotic 2.2.1 Probiotic sn sinh cỏc cht c ch 2.2.2 Cnh tranh húa cht/nng lng vi nhng vi khun khỏc 2.2.3 Cnh tranh v trớ bỏm dớnh vi vi khun cú hi 2.2.4 Tng cng ỏp ng dch 2.2.5 Mt s tỏc ng khỏc 2.3 Cỏc tiờu chun chn vi khun probiotic 2.4 Cỏc vi sinh vt probiotic 10 2.5 Tớnh an ton ca probiotic trờn ng vt 11 2.6 Vi khun Bacillus subtilis 12 2.6.1 c im chng Bacillus subtilis 12 2.6.2 Mt s c tớnh probiotic ca Bacillus subtilis 16 2.7 Tỡnh hỡnh nghiờn cu c tớnh probiotic ca Bacillus subtilis trờn th gii v Vit Nam 17 2.7.1 Trờn th gii 17 2.7.2 Vit Nam 18 PHN VT LIU, NI DUNG V PHNG PHP NGHIấN CU 21 3.1 Vt liu nghiờn cu 21 3.2 a im v thi gian tin hnh 21 3.3 Húa cht v thit b s dng 21 3.3.1 Húa cht 21 3.3.2 Cỏc thit b nghiờn cu 21 3.3.3 Cỏc dng c nghiờn cu 22 3.4 Mụi trng s dng 22 3.5 Ni dung nghiờn cu 23 3.5.1 Nghiờn cu kh nng tn ti v phỏt trin ca Bacillus subtilis mụi trng cú pH axớt thp v pH kim 23 3.5.2 Kh nng tn ti v phỏt trin ca Bacillus subtilis mụi trng cú mui mt 23 3.5.3 Th nghim kh nng chng chu axit d dy v mui mt ca Bacillus subtilis mụi trng dch d dy mụ phng 23 3.5.4 nh hng ca NaCl n sinh trng ca Bacillus subtilis 23 3.5.5 Nghiờn cu kh nng Bacillus subtilis c ch cỏc chng vi sinh vt kim nh 23 3.5.6 Kim tra tớnh i khỏng gia cỏc chng Bacillus subtilis 23 3.5.7 Kh nng khỏng cỏc loi khỏng sinh ca cỏc chng Bacillus subtilis 23 3.6 Phng phỏp nghiờn cu 23 3.6.1 Phng phỏp hot húa ging 23 3.6.2 Phng phỏp m s lng t bo vi khun [9] 23 3.6.3 Cỏc phng phỏp la chn chng Bacillus subtilis cú hot tớnh probiotic 24 PHN KT QU NGHIấN CU V THO LUN 27 4.1 Kt qu xỏc nh kh nng chng chu ca cỏc chng Bacillus subtilis mụi trng pH axớt thp v pH kim 27 4.2 Kt qu xỏc nh kh nng chng chu mui mt ca cỏc chng Bacillus subtilis 29 4.3 Kt qu xỏc nh kh nng chng chu axit d dy v mui mt mụi trng dch d dy mụ phng ca cỏc chng Bacillus subtilis 32 4.4 nh hng ca NaCl n phỏt trin ca vi khun Bacillus subtilis 33 4.5 ỏnh giỏ kh nng c ch vi sinh vt kim nh ca vi khun Bacillus subtilis 34 4.6 Kt qu xỏc nh tớnh khỏng gia cỏc chng Bacillus subtilis 36 4.7 Kt qu xỏc nh kh nng khỏng khỏng sinh ca vi khun Bacillus subtilis 38 PHN KT LUN V KIN NGH 40 5.1 Kt lun 40 5.2 Kin ngh 40 TI LIU THAM KHO 41 PHN M U 1.1 t Probiotic l thc n b sung vi khun sng cú li m nh hng n ng vt ch bng cỏch ci thin s cõn bng vi khun ng rut ca mỡnh [28] Yờu cu ca probiotic l cỏc vi sinh vt sng, a vo ng tiờu húa chỳng phi cũn sng v cú kh nng sinh trng, phỏt trin ng tiờu húa Mt loi vi sinh vt cú li, s c coi l ng c viờn cho vic ch to cỏc ch phm probiotic chỳng ỏp ng c mt cỏc tiờu c bn ú l (i) kh nng sng sút mụi trng dch d dy; (ii) Cú kh nng chng chu vi mui mt rut non; (iii) Cú nh hng tt n sc khe vt nuụi [40] Cỏc vi khun probiotic ó c chng minh cú th to nhiu li ớch cho ngi v vt nuụi nh tng cng kh nng khỏng vi bnh nhim trựng, ngn nga cỏc bnh ng rut, chng nhim trựng ng tit liu v sinh dc, gim nguy c ung th rut v tng kh nng khỏng vi cỏc húa liu phỏp chng ung th, v ngn chn vic sinh trng ca h vi sinh vt cú hi hay iu chnh trng thỏi dch mụ niờm mc khoang ming Chim thnh phn ụng o nht s cỏc probiotics l cỏc vi khun thuc chi Bifidobacterium v Lactobacillus Ngoi ra, cỏc i din ca chi Bacillus hay cỏc chng Escherichia coli cng c s dng lm probiotics [30] Cỏc loi Bacillus ó c s dng nh probiotics cỏch õy ớt nht 55 nm vỡ ch phm Enterogerminađ ó c ng ký t nm 1958 Italia Trong s vi khun chi Bacillus tng c s dng lm probiotics, cỏc loi ó c nghiờn cu sõu rng nht l Bacillus subtilis,Bacillus clausii, Bacillus cereus, Bacillus coagulans v Bacillus licheniformis [32] Hin nay, trờn th trng nc ta cú mt s sn phm probiotic s dng chn nuụi, nhiờn giỏ thnh cũn cao Hn na cỏc nh khoa hc cho rng tỏc dng ca probiotic i vi vt nuụi cũn ph thuc vo h vi sinh vt ca vt nuụi bn a Do ú, vic nghiờn cu to ch phm probiotic t vi sinh vt bn a s cú tỏc dng gim giỏ thnh sn phm, tng hiu qu i vi vt nuụi nc ta 31 Nng 0,05% chng CK, M1, B2 cú t l t bo sng tng i bng Chng BC phỏt trin kộm nht ch t 5,0x106CFU/ml, chng MBS2 t lng t bo tn ti v phỏt trin nhiu nht l 4,9x107CFU/ml nng 0,1% chng MBS2 thu c t bo nhiu nht t 4,0x107CFU/ml, sau ú l cỏc chng B2, M1, CK, M2 v BC cú s lng t bo tn ti v phỏt trin ln lt l 1,5x107CFU/ml, 1,0x107CFU/ml, 8,9x106CFU/ml v hai chng M2 v BC cựng t 6,9x106 CFU/ml nng 0,15% mui mt, s t bo tn ti v phỏt trin tng i cao Thp nht l chng CK vi lng t bo sng l 1,1x107 CFU/ml, hai chng M2 v BC cựng cú s t bo sng l 1,2x107CFU/ml, chng M1 l 2,2x107CFU/ml, chng B2 cú s t bo phỏt trin l 2,2x107CFU/ml Riờng chng MBS2 cú s lng t bo tn ti nhiu nht t 4,1x107CFU/ml Khi lng mui mt tng lờn, cỏc chng cú kh nng tn ti B sung 0,3% mui mt chng phỏt trin tt, thu c t bo nhiu nht l chng M2 v BC cựng t c 3,3 x107CFU/ml Kh nng chu mui mt gia cỏc chng l khụng ging nhau, chng cú chng MBS2 t c lng t bo cao nht Lng sinh khụ thu c nng 0,3% v 0,1% l 3,2 mg/ml Cú s chờnh lch gia lng t bo sng v sinh khụ vỡ cỏc chng khỏc nờn kh nng chu ng cỏc nng mui cng khỏc Chng CK cú lng sinh khụ tng dn theo nng mui mt, t 1,2 mg/ml nng 0,05% lờn ti 2,4 mg/ml nng 0,3% Riờng cng BC li khụng cú s thay i nhiu v sinh khụ cỏc nng mụi trng khỏc Chng MBS2 sinh trng tt nht c nng , u thu c lng t bo v sinh khụ cao, sau ú l chng B2 Cỏc kt qu trờn cho thy: c chng vi khun c kho sỏt u cú kh nng sng sút v chu ng phự hp mụi trng ng tiờu húa vi cỏc c im c trng l pH cú tớnh axớt v cú nng mui mt cao Kt qu ny 32 tng ng vi nghiờn cu ca H Trung Thụng v cs cỏc chng Bacillus subtilis thớch hp phỏt trin nht nng mui mt bng 0,3% [13] 4.3 Kt qu xỏc nh kh nng chng chu axit d dy v mui mt mụi trng dch d dy mụ phng ca cỏc chng Bacillus subtilis Kh nng chu mui mt v axit dch d dy l nhng c tớnh phi cú ca mt chng vi khun probiotic Bng 4.3: Kh nng chng chu axit d dy v mui mt ca cỏc chng Bacillus subtilis mụi trng dch d dy mụ phng Mụi trng axit d dy Mụi trng mui mt STT Ký hiu chng Mụi trng axit d dy (CFU/ml) i chng (CFU/ml) Mụi trng mui mt (CFU/ml) i chng (CFU/ml) M2 9,5x106 1,0 x107 5,4 x106 9,5x106 MBS2 8,1x106 1,1 x107 7,2 x106 9,1x106 CK 7,7x106 1,0 x107 5,0 x106 8,6x106 M1 9,1x106 1,1 x107 5,4 x106 6,8 x106 B2 5,0 x106 8,1 x106 4,5 x106 6,3 x106 BC 7,7 x106 6,8 x106 5,9 x106 6,8x106 Hỡnh 4.3: Kh nng chng chu axit d dy v mui mt ca cỏc chng Bacillus subtilis mụi trng dch d dy mụ phng 33 Khi nuụi cy cỏc chng Bacillus subtilis 4h liờn tc cha pH axit v mui mt, cỏc chng cũn tn ti v phỏt trin Khi b sung vi khun vo mụi trng axit, t l s t bo tn ti v phỏt trin cao hn so vi mụi trng cha mui mt Trong mụi trng pH d dy, chng M2 cú s t bo tn ti v phỏt trin cao nht, ln lt gim dn theo cỏc chng M1 (9,1x106CFU/ml), MBS2 (8,1x106 CFU/ml), CK v BC cựng s t bo l 7,7x106 CFU/ml v cui cựng l B2 (5,0x106CFU/ml) Mụi trng cha mui mt, lng t bo tn ti cao nht l chng MBS2 (7,2 x106CFU/ml), thp nht l chng B2 (4,5 x106CFU/ml) S t bo sng ca chng M2 v M1 gim rừ rt t 9,5x106CFU/ml v 9,1x106CFU/ml xung 5,4x106CFU/ml, chng MBS2 t 8,1x106CFU/ml gim cũn 7,2x106CFU/ml chuyn t mụi trng axit sang mụi trng cha mui mt Do cỏc chng vi sinh vt c b sung vo mụi trng cha pH thp, lm gim lng t bo phỏt trin, tip theo ú li phi chng chu vi mụi trng cha mui mt nờn s t bo gim i Tt c chng vi khun probiotic nghiờn cu ny u th hin s chng chu cao c ngõm dch mt bóo hũa hay dch mụ phng axit d dy Sau x lý v cy ria, tt cỏc cỏc chng cú tc mc tng i so vi mu i chng khụng x lý Kt qu ny cng phự hp vi kt qu ca mt s nghiờn cu khỏc phn ỏnh rng cỏc chng vi khun probiotic gn nh khụng b nh hng bi mui mt v pH thp ca dch d dy [37] 4.4 nh hng ca NaCl n phỏt trin ca vi khun Bacillus subtilis Sỏu chng Bacillus subtilis c nuụi cy trờn mụi trng MPA cú b sung NaCl cỏc nng 1%, 3%, 5%, 6%, 7% v 0% (i chng) Sau ngy nuụi cy, kt qu thu c c trỡnh by bng 4.4 Bng 4.4 Kh nng chng chu mui ca chng Bacillus subtilis Nng mui Chng M2 MBS2 CK M1 B2 BC 0% ++ ++ ++ ++ ++ ++ 1% ++ ++ +++ ++ ++ ++ 3% + +++ ++ +++ +++ + 5% + ++ ++ + + - 6% ++ + ++ - 7% - 34 Ghi chỳ: +++: sinh trng tt ++: sinh trng trung bỡnh +: sinh trng yu -: khụng sinh trng Trong mụi trng cú cha mui, hu ht chng u cú kh nng sng sút nng 1%, 3%, 5% Tuy nhiờn khụng cú chng no sng mụi trng cha 7% nng 1%, cỏc chỳng M2, MBS2, M1, B2 v BC u phỏt trin trung bDỡnh Ch cú chng CK sinh trng tt Vi mụi trng cú b sung 3% NaCl, cỏc chng sinh trng ng u, MBS2, M1v B2 sinh trng tt, cú CK v M2 phỏt trin trung bỡnh, chng M2 v BC phỏt trin kộm n nng 5%, cỏc chng cú biu hin ca s phỏt trin yu i nh M2, M1, B2, BC cht nng 5% Hai chng M2, B2 v BC cht nng mui l 6%, CK phỏt trin rt yu MBS2 v M1 phỏt trin trung bỡnh Kt qu ny hon ton tng ng vi nghiờn cu ca H Th Trng Thy v Bacillus subtilis B20 chu nng mui 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6% [14] T cỏc kt qu trc, chn c chng cú hot tớnh probiotic cú kh nng to ch phm Chỳng tụi chn chng cú tim nng nht l MBS2, M1, CK, B2 tin hnh cỏc thớ nghim tip theo 4.5 ỏnh giỏ kh nng c ch vi sinh vt kim nh ca vi khun Bacillus subtilis ng rut ca gia sỳc gia cm cú s hin din rt ln h vi sinh vt bao gm c nhng vi sinh vt cú li (nh Lactobacillus, Bifidobacteria) v vi sinh vt cú hi (E coli, Staphylococcus, ) Nu cỏc chng chn la khụng khỏng c nhng vi sinh vt gõy hi thỡ s b chớnh cỏc vi sinh vt ny tiờu dit v s khụng phỏt huy c vai trũ probiotic ca mỡnh Nờn kh nng i khỏng vi cỏc chng kim nh l iu kin tiờn quyt ca cỏc chng probiotic Cn c tuyn chn cỏc chng vi khun probiotic l kh nng c ch cỏc vi sinh vt gõy bnh bng vic tit cỏc cht cú kh nng c ch cỏc vi khun khỏc nh cỏc cht khỏng sinh, bacteriocin, siderophores, lysozyme, protease, hydro peroxit v cỏc axớt hu c 35 Hot tớnh khỏng khun ca cỏc chng Bacillus subtilis c xỏc nh bng phng phỏp c l thch: cy tri chng vi khun kim nh trờn mụi trng MPA dng thch, sau ú tin hnh c l thch Nh 50àl dch nuụi cy ó loi b cn t bo ca chng vi khun Bacillus subtilis (dch nuụi cy ó c trung hũa v pH=7 bng NaOH 0,1N) vo cỏc l ó c, 4oC 6h, sau ú chuyn cỏc a thch ny sang 37oC 24h [22] Kt qu trỡnh by bng 4.5 Bng 4.5: Kh nng c ch cỏc chng vi khun kim nh ca bn chng vi khun Bacillus subtilis ng kớnh vũng c ch (D = D d, mm) STT Ký hiu chng Escherichia coli Salmonella typhimurium MBS2 12,0 13,0 CK 12,5 11,5 M1 9,0 10,0 B2 10,0 11,0 (*D = D d : ng kớnh vũng c ch) Sau 24h nuụi cy 37oC c bn chng u cú kh nng c ch hai chng kim nh l Escherichia coli v Salmonella typhimurium Trong ú chng CK cú kh nng c ch Escherichia coli mnh nht (ng kớnh vũng vụ khun l 12,5 mm Tip theo ln lt l cỏc chng MBS2, B2 v M1vi ng kớnh vũng vụ khun l 12mm, 10mm, 9mm i vi kh nng c ch Salmonella typhimurium, chng MBS2 cú hot tớnh c ch cao nht (ng kớnh vũng phõn gii l 13mm) ng kớnh vũng vụ khun ca cỏc chng CK, B2, M1 ln lt l 11,5mm, 11mm, 10mm Kt qu cng cho thy kh nng c ch ng thi c Escherichia coli v Salmonella typhimurium tt nht thuc v hai chng MBS2 v CK 36 Escherichia coli Ghi chỳ: (1) MBS2 Salmonella typhimurium (3) M1 (2) CK (4) B2 (5) i chng Hỡnh 4.4: Kh nng c ch cỏc chng vi khun kim nh ca cỏc chng Bacillus subtilis 4.6 Kt qu xỏc nh tớnh khỏng gia cỏc chng Bacillus subtilis sn xut c ch phm probiotic b sung vo thc n chn nuụi cho gia sỳc gia cm, thỡ ch phm cng c b sung nhiu chng vi sinh vt vo thỡ cng mang li nhiu li ớch cho vt ch nu mi chng cú mt u th riờng Song gia cỏc chng phi khụng cú s i khỏng ln bi vỡ nu i khỏng thỡ vo ng rut chỳng s t tiờu dit ln v khụng phỏt huy c tỏc dng probiotic Vỡ vy, cn phi tin hnh xỏc nh tớnh i khỏng ca cỏc chng Bacillus subtilis theo phng phỏp cy vch a thch, s dng mụi trng MPA trờn a petri, cy vch thng u chng chộo nhau, kh nng i khỏng hay khụng ca cỏc chng s c biu hin v trớ giao gia cỏc ng cy cỏc chng Qua quỏ trỡnh nghiờn cu chỳng tụi thu c kt qu sau: 37 Bng 4.6: Kt qu xỏc nh tớnh i khỏng gia chng Bacillus subtilis Ký hiu chng MBS2 MBS2 M1 CK B2 - - - - - M1 - CK - - B2 - - - (*): - : khụng i khỏng Hỡnh 4.5: Kh nng i khỏng gia chng Bacillus subtilis Kt qu bng 4.6 cho thy: Sau 24h nuụi t m 37oC cỏc chng Bacillus subtilis u sinh trng rt tt v trớ giao gia cỏc ng khụng thy xut hin s c ch phỏt trin ca cỏc chng vi nhau, biu hin ch cỏc chng sinh trng bỡnh thng v trớ giao thnh cỏc ng thng lin mch (hỡnh 4.5) iu ny chng t chng Bacillus subtilis khụng cú s i khỏng v hon ton cú th s dng kt hp vi quỏ trỡnh to ch phm probiotic 38 4.7 Kt qu xỏc nh kh nng khỏng khỏng sinh ca vi khun Bacillus subtilis Kh nng v bn cht khỏng khỏng sinh ca cỏc chng vi khun probiotic l rt khỏc nhau, c cựng mt loi v cn cú thờm cỏc nghiờn cu m bo cỏc chng khỏng khỏng sinh l an ton s dng Nu cỏc chng cú kh nng khỏng khỏng sinh thỡ b sung cht khỏng sinh vo c th vt nuụi, cỏc chng Bacillus subtilis cú th tn ti v phỏt trin c Tuy nhiờn, nu chng vi khun khụng khỏng c khỏng sinh thỡ phi b sung vi sinh vt mi vo c th ng vt Bng 4.7: Kh nng khỏng cht khỏng sinh ca vi khun Bacillus subtilis Khỏng sinh STT Ký hiu chng Kanamycin Gentamycin MBS2 + + CK - - M1 - - B2 - - Ghi chỳ: -: Khụng khỏng khỏng sinh +: Khỏng khỏng sinh Hỡnh 4.6 : Kh nng khỏng khỏng sinh ca chng MBS2 39 Trong bn chng th nghim thỡ ch cú chng MBS2 cú kh nng khỏng c c loi khỏng sinh Ba chng CK, M1, B2 khụng khỏng khỏng sinh Cn cú cỏc th nghim khỏc ỏnh giỏ kh nng khỏng sinh ca cỏc chng Bacillus subtilis 40 PHN KT LUN V KIN NGH 5.1 Kt lun Qua mt s quỏ trỡnh nghiờn cu v c tớnh ca sỏu chng M2, MBS2, CK, M1, B2, BC chỳng tụi ó a c cỏc kt lun sau: - Sỏu chng Bacillus subtilis kho sỏt u cú kh nng tn ti v phỏt trin iu kin in vitro mụi trng cú pH = 2,0 - 8,5 Trong ú, chng MBS2 l chng cú kh nng chng chu tt nht - Cỏc chng u cú kh nng chu c nng mui mt t 0,05% 0,3% Trong ú, hai chng M1 v B2 thớch nghi cao v n nh nht mụi trng cha mui mt - Trong mụi trng axit d dy v mui mt mụ phng c chng u tn ti v phỏt trin - Cỏc chng Bacillus subtilis u cú kh nng tn ti mụi trng cha nng mui 1-3% - Bn chng Bacillus subtilis c la chn u c ch cỏc vi khun kim nh, ú, chng MBS2 l chng c ch mnh nht vi chng kim nh - Cỏc chng Bacillus subtilis khụng cú biu hin i khỏng v cú th s dng kt hp vi quỏ trỡnh to ch phm probiotic - Kh nng khỏng khỏng sinh ca chng yu, ch cú MBS2 khỏng c c loi khỏng sinh kanamycin v gentamycin Nh vy, tt c cỏc chng la chn u cú kh nng sng sút cỏc iu kin bt li in vitro õy s l c s cho vic chn la cỏc chng ch to ch phm sau ny 5.2 Kin ngh - Kho sỏt kh nng bỏm dớnh ca cỏc chng Bacillus subtilis - Cn nghiờn cu sn xut v tinh sch cú th a vo sn xut ch phm ng dng chn nuụi, 41 TI LIU THAM KHO Hoi Anh (2008), Probiotic li ớch v trin vng, Tp chn nuụi (08) Tụ Minh Chõu, Vng Th Vit Hoa, V Th Lõm An, Lõm Thanh Hin, Nguyn Th Ngc Dip v NguynThỳy Hng(2000), Vi sinh vt hc i cng, Trng i Hc Nụng Lõm Tp.HCM Nguyn Lõn Dng, Hong c Nhun (1976), Mt s phng phỏp nghiờn cu vi sinh vt hc I, II, III, Nxb Khoa hc k thut Bựi Th Huyn (2010), Phõn lp v tuyn chn cỏc chng vi sinh vt hu ớch phc v cho sn xut cỏc ch phm probiotic dựng chn nuụi Lun thc s Nguyn Th Huyn, Nguyn Th Thu Hng, Trnh Th Thựy Linh, Nh Th H, Trnh Th Ho, Nguyn Thnh Linh v ng Xuõn Nghiờm (2014), Kho sỏt thnh phn vi sinh v cỏc c tớnh probiotic ca cỏc sn phm men tiờu húa trờn th trng, Tp Khoa hc v Phỏt trin, 12 (1): 65-72 Lờ Thanh Hong (2012), Tinh sch protein cú hot tớnh khỏng nm t chng Bacillus subtilis XL62, ng dng th nghim ch phm trờn mụ hỡnh in vitro, Lun thc s, Vin Khoa hc Cụng ngh Vit Nam Nguyn Vn Minh, Nguyn Hong Tun Duy, Phng Qunh, Vừ Ngc Yn Nhi, Dng Nht Linh, Nguyn Th Ngc Tnh v Lờ Hng Phc (2013), Kh nng kim soỏt sinh hc Edwardsiella Ictaluri gõy bnh ca mt s chng Bacillus spp phõn lp t ao nuụi cỏ tra, Tp Khoa hc v Cụng ngh, 51 (3A): 1-16 Lờ Minh Cm Ngc (2005), Phõn lp Bacillus subtilis t ch phm probiotic, tỡm hiu mụi trng nuụi cy thớch hp v sn xut th nghim, Trng i hc Nụng Lõm TP.HCM TCN TQTP 0013:2006, Tiờu chun ngnh y t, Xỏc nh tng s vi khun lactic thc phm 10 Nguyn Vnh Phc (1976), Vi sinh vt thỳ y, 1, 2, 3, Nxb Nụng nghip H Ni 42 11 Lờ Mai Phng (2004), Phõn lp v giỏm nh vi khun Bacillus subtilis t nhiờn, bc u kho sỏt kh nng sinh enzyme amylase v enzyme protease, i hc M bỏn cụng TP.HCM 12 Hong Ton Thng, Cao Vn (2006), Giỏo trỡnh sinh lý hc vt nuụi, Nxb Nụng nghip H Ni 13 H Trung Thụng, H Lờ Qunh Chõu (2009), Nghiờn cu kh nng sng mụi trng ng tiờu húa ca ng vt ca mt s chng vi sinh vt nhm tng bc chn lc to nguyờn liu sn xut probiotic, Tp khoa hc, i hc Hu(55) 14 H Th Trng Thy, Nguyn N Trang Thựy, Vừ Minh Sn, Kho sỏt c tớnh chng Bacillus subtilis B20.1 lm c s cho vic sn xut probiotic phũng bnh gan thn m Edwardseilla Ictaluti trờn cỏ tra, B Mụn Bnh hc Thy Sn, Khoa Thy Sn Trng i hc Nụng Lõm TP.HCM, Vin nghiờn cu Nuụi Trng Thy Sn 15 Phm Vn Ty, V Nguyờn Thnh (2006), Cụng ngh vi sinh v mụi trng, Cụng ngh sinh hc 5, Nxb Giỏo dc II Ting Anh 16 Abdelkarim Mahdhi , Maria Angeles Esteban , Zeineb Hmila , Karima Bekir , Fathi Kamoun , Amina Bakhrouf andBoubaker Krifi (2012), Survival and retention of the probiotic properties of Bacillus sp strains under marine stress starvation conditions and their potential use as a probiotic in Artemia culture, Research in Veterinary Science(3), pp 1151-1159 17 Anil K Patel, Jayesh J Ahire, Shrikant P Pawar, Bhushan L Chaudhari , Yogesh S Shouche and Sudhir Bhaskarrao Chincholkar (2010), Evaluation of Probiotic characteristics of siderophoregenic Bacillus spp Isolated from dairy waste, Appl BiochemBiotechnol,160, pp 140155 18 Arturo A., Mario Rosa M and Maria A.M (2006), Probiotic for animal nutrition in the European Union, Regulation and safety assessments,45, pp 91-95 43 19 Conway P.L., Gorbach S.L., and Goldin B.R., (1987), Survival of lactic acid bacteria in the human stomach and adhesion to intestinal cells, J Dairy Sci., 70, pp 1-12 20 ChunHung Liu , Chiu Hsia Chiu, ShiWei Wang andWinton Cheng (2012), Dietary administration of the probiotic, Bacillus subtilis E20, enhances the growth, innate immune responses, and disease resistance of the grouper, Epinephelus coioides,Fish & Shellfish Immunology(4,) pp 699-706 21 Corcoran, B M., Stanton, C., Fitzgerald, G F., and Ross, R P (2005), Survival of probiotic Lactobacillus in acidic environments Is enhanced in the presence of metabolizable sugars, Appl Environ Microbiol, 71(6), pp 3060-3067 22 De Angelis M, Siragusa S, Berloco M, Caputo L, Settanni L, Alfonsi G, Amerio M, Grandi A and Gobbetti M (2006), Selection of potential probiotic Lactobacilli from pig feces to be used as additives in pelleted feeding, Research in Microbiology, 157, pp 792-801 23 Deng Yu Tseng, PeiLin Ho, SungYan Huang, Sheng-Chi Cheng, YaLi Shiu, ChiuShia Chiu and ChunHung Liu (2009), Enhancement of immunity and disease resistance in the white shrimp, Litopenaeus vannamei, by the probiotic, Bacillus subtilis E20, Fish & Shellfish Immunology, 26(2), pp 330-344 24 Dunne, C., OMahony, L., Murphy, L., Thornton, G., Morrissey, D., OHalloran, S., Feeney, M., Flynn, S., Fitzgerald, Daly, C., Kiely, B., OSullivan, G.C., Shanahan, F and Collins, J.K (2001), In vitro selection criteria for probiotic bacteria of human origin: correlation with in vivo findings, Am J Clin Nutr 73 (2), pp 386-392 25 Driks, A (1999), Bacillus subtilis spore coat, Microbiology and Molercular biology reviews, 63(1), pp 1-20 26 FAO/WHO(2001), Health and nutritional properties of probiotic in food including powder milk with live lactic acid bacteria, Report of a jointFAO/WHO expert consultation on evaluation of health and 44 nutritionalproperties of probiotic in food including powder milk with live lacticacid bacteria Argentina October 27 FAO/WHO (2002), Guidelines for the evaluation of probiotic in food, joint FAO/WHO working group report on drafting guidelines for the evaluation of probiotic in food London, Ontario,Canada, April 30 and May 28 Fuller R (1989), Probiotic in man and animals, J Appl Bacteriol, 66, pp 6578 29 Fuller R (1992), History and development of probiotic, In: R Fuller (Ed.) Probiotic: The Scientific Basis, pp 18 30 Gueimonde, M., Sanchez, B., G de Los Reyes - Gavilan, C and Margolles, A (2013), Antibiotic resistance in probiotic bacteria, Front Microbiol 18(4), pp 202 31 Gram L., J Melchiorsen, B Spanggaard, I Huber and T.F and Nielsen (1999), Inhibition of Vibrio anguillarum by Pseudomonas fluorescens AH2, a possiple probiotic treatment of fish, Applied and Enviromental Microbiology, 65, pp 969-973 32 Hong H.A., Duc L.H.and Cutting S.M (2005), The use of bacterial spore formers as probiotics, FEMS Microbiol Rev, 29,pp 813835 33 Hoque M.Z , Akter F , Hossain K.M., Rahman M.S.M , Billah M.M.and Islam K.M.D (2010), Isolation, identification and analysis of probiotic properties of Lactobacillus spp from selective regional yoghurts, World Journal of Dairy & Food Sciences (1), pp 39-46 34 Huang J.M., La Ragione R.M., Nunez A and Cutting S.M (2008), Immunostimulatory activity of Bacillus spores, FEMS Immunol Med Microbio, pp 195-203 35 Kumura H., Tanoue Y., Tsukahara M., Tanaka T and Shimazaki K (2004), Screening of dairy yeast strains for probiotic applications, J Dairy Sci., 87,pp 4050-4056 36 Jans.D (2005), Probiotic in Animal Nutrition, Booklet.www.Fefana.org pp.4-18 45 37 Jensen, H., Grimmer, S., Naterstad, K and Axelsson, L (2012), In vitro testing of commercial and potential probiotic lactic acid bacteria, Int J Food Microbiol 153: 216-222 38 Michail S (2005), The Mechanism of Action of Probiotic, Wright State University School of Medicine, The Childrens Medical Center, Dayton, Ohio 39 Oggioni MR, Pozzi G, Valensin PE, Galieni P and Bigazzi C (1998), "Recurrent septicemia in an immunocompromised patient due to probiotic strains ofBacillus subtilis", J Clin Microbiol 36 (1), pp 3256 40 Ross G.R., Gusils C., and Gonzalez S.N (2008), Microencapsulation of Probiotic Strains for Swine Feeding, Biol Pharm Bull 31(11), pp 2121 - 2125 41 SCAN (2000): Report of the Scientific Committee on Animal Nutrition on the safety of use of Bacillusspecies in animal nutrition European Commission Health & Consumer Protection Directorate-General 42 Thirabunyanon M., Narin Thongwittay (2012), Protection activity of a novel probiotic strain of Bacillus subtilisagainst Salmonella Enteritidis infection,Research in Veterinary Science, 93(1), pp 74 - 81 43 Xiao-Hua Guo, Jong-Man Kim, Hyang-Mi Nam, Shin-Young Park , JaeMyung Kim (2010), Screening lactic acid bacteria from swine origins for multistrain probiotic based on in vitro functional properties, Anaerobe 16, pp 321 - 326 [...]... hành thực hiện đề tài Nghiên cứu một số đặc tính của các chủng Bacillus subtilis trong điều kiện in vitro nhằm tạo chế phẩm ứng dụng trong chăn nuôi 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát được sự tồn tại và phát triển của các chủng Bacillus subtilis trong các điều kiện bất lợi in vitro Trên cơ sở đó chọn lựa ra các chủng mang đặc tính probiotic để tạo chế phẩm sau này 1.3 Ý nghĩa của đề tài 1.3.1 Ý nghĩa... Kháng sinh: Vi khuẩn Bacillus subtilis có thể tạo chất kháng sinh subtilin và bacitracin có tác dụng ức chế vi khuẩn Gr (+) và Gr (-) [10] Năm 2009, Hồ Trung Thông và cs đã đánh giá khả năng sống của các chủng vi sinh vật trong đường tiêu hóa ở điều kiện in vitro bao gồm các điều kiện như khả năng sống trong môi trường có pH thấp, trong môi trường có pepsine, trong môi trường pancreatine và trong môi... Thanh Hoàng đã nghiên cứu tạo chế phẩm từ Bacillus subtilis XL62 Sản xuất và phối trộn tạo các chế phẩm BCF dạng đơn và dạng đa để thử nghiệm Trên mô hình in vitro, chế phẩm BCF dạng đơn của chủng Bacillus subtilis XL62 ở nồng độ 1% ức chế 68 – 84% sự sinh trưởng và phát triển của nấm Fusarium và Rhizoctonia, trong khi đó chế phẩm BCF dạng đa phối trộn hoạt chất ngoại bào từ 3 chủng Bacillus subtilis XL62,... diện của Bacillus subtilis với một số lượng lớn sẽ gây ra sự cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh trạnh không gian sống giữa vi khuẩn và nấm Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24h) sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra kháng sinh subtilin nên sự sinh trưởng của nấm bị ức chế [3] 2.6.2.2 Khả năng tồn tại trong đường tiêu hóa Trong các điều kiện in vitro, nhiều chủng Bacillus. .. 3.5.5 Nghiên cứu khả năng Bacillus subtilis ức chế các chủng vi sinh vật kiểm định 3.5.6 Kiểm tra tính đối kháng giữa các chủng Bacillus subtilis 3.5.7 Khả năng kháng các loại kháng sinh của các chủng Bacillus subtilis 3.6 Phương pháp nghiên cứu 3.6.1 Phương pháp hoạt hóa giống Để hoạt hóa chủng, chủng vi khuẩn Bacillus subtilis bảo quản ở 4oC sau khi để ở nhiệt độ phòng 10 phút được cấy chuyển ra các. .. mặn của Bacillus subtilis có vai trò quan trọng vì đây là yếu tố đầu tiên quyết định sự tồn tại của probiotic trong môi trường nước biển Khả năng chịu mặn là đặc tính quý khi sử dụng các chủng này làm chế phẩm cho nuôi trồng thủy sản ở các vùng khác nhau 17 2.7 Tình hình nghiên cứu đặc tính probiotic của Bacillus subtilis trên thế giới và ở Việt Nam 2.7.1 Trên thế giới Nghiên cứu sản xuất chế phẩm. .. khoa học Bổ sung thêm các chủng Bacillus subtilis vào danh sách các vi sinh vật dùng tạo chế phẩm ứng dụng trong chăn nuôi Đồng thời là nguồn tài liệu cho các nghiên cứu tiếp theo 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn Là cơ sở để phục vụ chế tạo probiotic bổ sung vào thức ăn chăn nuôi 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về Probiotic 2.1.1 Lịch sử nghiên cứu probiotic Việc sử dụng probiotic đã được... sinh trong thức ăn chăn nuôi Việc cấm sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi cũng đặt ra những thách thức lớn về kỹ thuật, đặc biệt đối với chăn nuôi gia súc, gia cầm non hoặc trong điều kiện vệ sinh kém và vật nuôi chịu nhiều stress Để vượt qua những thử thách thức đó, đã có rất nhiều những nghiên cứu nhằm tìm ra tác nhân vừa để thay thế kháng sinh, vừa an toàn với vật nuôi Một trong những tác nhân... bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào mới Mỗi tế bào dinh dưỡng chỉ tạo ra một bào tử [11] - Ứng dụng của Bacillus subtilis Trong công nghiệp sản xuất amino acid, thức ăn gia súc, Bacillus subtilis là một trong những chủng vi sinh vật tổng hợp lysine có hàm lượng khá lớn (15-20%) từ tinh bột Trong y dược, Bacillus subtilis được đóng thành ống thuốc Subtilis 10ml trị bệnh tiêu chảy cho trẻ em do vi khuẩn... nước Một chủng Bacillus subtilis được biết trước đây là Bacillus natto được dùng trong sản xuất thực phẩm thương mại của Nhật tương tự như thực phẩm cheonggukjang của Hàn Quốc 16 Bacillus subtilis tái tổ hợp được sử dụng trong sản xuất polyhydroxyalkanoates (PHA) và chúng có thể sử dụng malt phế thải như là nguồn cacbon, nhờ vậy chi phí sản xuất PHA giảm 2.6.2 Một số đặc tính probiotic của Bacillus subtilis