QUY TRÌNH NUÔI CẤY VÀ ỨNG DỤNG TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ MÁU CUỐNG RỐN NGƯỜI1. Giới thiệu tế bào gốc trung mô (Mesenchymal stem cell – MSC) MSC là tế bào gốc đa năng, chúng có khả năng biệt hoá thành rất nhiều kiểu tế bào chức năng khác nhau như xương, sụn, thần kinh, gan, mỡ…khi được nuôi trong môi trường có tác nhân biệt hóa thích hợp. Máu cuống rốn người chứa một nguồn MSC dồi dào. Do đó ta có thể thu nhận và nuôi cấy MSC để biệt hóa thành những tế bào chức năng khác phục vụ cho y học, thẩm mỹ…2. Quy trình 2.1 Thu nhận máu cuống rốn Máu cuống rốn được thu nhận từ các sản phụ đã được xét nghiệm âm tính với HIV, HBV, HCV… ngay sau khi thai nhi được sinh ra bằng các túi thu máu có chứa sẵn chất chống đông. Sau đó bảo quản lạnh trong đá gel và đưa về phòng thí nghiệm. Thời gian từ khi thu nhận máu đến khi thao tác trong vòng 2 giờ. 2.2 Nuôi cấy sơ cấp tế bào của máu cuống rốn: Chọn lọc MSC Về nguyên tắc, máu cuống rốn có chứa ba loại tế bào: tế bào gốc tạo máu, tế bào máu trưởng thành và MSC. Tế bào gốc tạo máu và MSC thuộc quần thể tế bào đơn nhân do đó ta thu nhận bằng phương pháp ly tâm trên gradient nồng độ Ficoll-paque (sigma) ở tốc độ 2500 vòng/phút, trong 5 phút. Sau khi ly tâm, thu nhận phân đoạn tế bào đơn nhân nằm giữa lớp Ficoll-paque và lớp huyết tương bên trên. Trong quá trình ly tâm, các tế bào đã biệt hóa với kích thước lớn hơn sẽ di chuyển xuyên qua lớp Ficoll và lắng xuống đáy ống ly tâm. Các tế bào hồng cầu không nhân, do nhẹ sẽ nằm ở lớp huyết tương bên trên. Các tế bào đơn nhân với kích thước trung bình sẽ luôn nằm ở giữa. Do MSC khi nuôi cấy sẽ bám dính vào bề mặt giá thể, trong khi tế bào gốc tạo máu không có khả năng này nên ta sẽ dùng phương pháp nuôi cấy để tách MSC ra khỏi tế bào gốc tạo máu trong quần thể tế bào đơn nhân. Sau khi thu được lớp tế bào đơn nhân, ta huyền phù lớp tế bào này trong môi trường nuôi cấy IMDM, 10% FBS và nuôi trong bình nuôi cấy (Nunc, 25 cm2) sao cho đạt mật độ 3.105 tế bào/cm2 ở điều kiện 370C, 5% CO2. Sau 48 giờ, các MSC bắt đầu bám dính trên bề mặt môi trường nuôi, thay môi trường để loại bỏ các tế bào không bám bao gồm các tế bào chết và các tế bào gốc tạo máu. Tiếp tục nuôi cho đến khi tế bào mọc đạt tỷ lệ 70-80% bề mặt đáy bình nuôi. Thường xuyên theo dõi và thay môi trường với chế độ 7 ngày/lần. 2.3 Nuôi cấy thứ cấp: cấy chuyền tăng sinh MSC Khi mật độ tế bào trong bình đạt tỉ lệ 70-80% diện tích đáy bình nuôi, ta tiến hành cấy chuyền để cung cấp chất dinh dưỡng và không gian sống cho tế bào. Quy trình cấy chuyền như sau: loại bỏ môi trường cũ và rửa Chủ đề 8: NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC TRONG GHÉP DA GVHD : Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Vũ Tú Anh Nguyễn Đăng Tình Phạm Thị Ngọc Anh Trần Thị Ngọc Kiều Trần Thị Thúy Nga NỘI DUNG I/ Đặt vấn đề V/ Ứng dụng tế bào gốc trung mô dây rốn II/ Giới thiệu tế bào gốc ghép da 1.Khái niệm 2.Phân loại Vai trò III/ Cấu trúc da nguyên bào sợi 3.Cấu trúc da 4.Nguyên bào sợi Thu nhận máu cuống rốn Giai đoạn nuôi cấy sơ cấp tế bào máu cuống rốn Giai đoạn nuôi cấy thứ cấp Biệt hoá MSC thành tế bào dạng nguyên bào sợi IV Cơ chế biệt hóa tế bào gốc thành biểu bì Giai đoạn nuôi cấy nguyên sợi bào da Ghép nguyên sợi bào kiểm tra thải loại VI/ Kết luận I Đặt vấn đề: Cháu bé cấy nguyên bào sợi bị bỏng nước sôi (Ảnh: VTV) II Giới thiệu khái niệm Tế bào gốc tế bào có khả biệt hóa trình phát triển để trở thành loại tế bào trung ương phần thiếu thể II Giới thiệu Phân loại tế bào gốc VAI TRÒ  Tế bào gốc tế bào có khả biệt hóa trình phát triển để trở thành loại tế bào trung ương  Về mặt lý thuyết, tế bào gốc từ phôi giữ khả phân chia tái phân chia suốt đời  Nguyên bào sợi tế bào đa năng, ứng dụng trong sản xuất vật liệu cấy ghép Sử dụng để nghiên cứu di truyền, y học, … III Nguyên bào sợi cấu trúc da  Nguyên bào sợi: Nguyên bào sợi tế bào quan trọng giai đoạn liền vết thương Được nuôi cấy nhằm mục đích thu nhận chủ động nguồn tế bào, ứng dụng trị bỏng  Cấu trúc da: lớp - Lớp biểu bì - Lớp trung bì - Lớp hạ bì Nuôi cấy thứ cấp: cấy chuyền tăng sinh MSC Cấy chuyền: - Loại bỏ môi trường cũ, rửa tế bào với 4-5 ml PBS có bổ sung Gentamycin (10mg/ml) - Loại bỏ dịch rửa bổ sung 4-5 ml trypsin/EDTA 0,05% - Sau 15s, đổ bỏ dung dịch Enzyme - Giữ lại 1ml, tiếp tục ủ tủ ấm 37 C, từ 23 phút - Trung hòa trypsin thừa 10ml IMDM, 10% FBS, li tâm - Huyền phù tế bào chia cho bình nuôi - Cấy chuyền 5-7 lần kiểm tra độ tinh Xác định mật độ tế bào/ml buồng đếm Neubauer Biệt hóa tế bào: Môi trường cảm ứng biệt hóa Môi trường bản: DMEM bổ sung 5% FBS 1% kháng sinh  Các bước biệt hóa Cấy tế bào đĩa nuôi mật độ 5000tb/cm Duy trì tế bào gốc trung mô môi trường nuôi cấy tế bào gốc Thay môi trường sau môi 2-3 ngày Khi tế bào bám ổn định vào bề mặt đĩa nhựa nuôi cấy hút bỏ môi trường tăng trưởng Tráng rửa tế bào đĩa nuôi PBS Duy trì tế bào đĩa nuôi môi trường nuôi cấy cảm ứng nguyên bào sợi Hàng ngày thay ½ môi trường đĩa môi trường Theo dõi phát triển biến đổi hình thái tế bào kính hiển vi Kiểm tra biểu số gen đặc trưng cho tế bào biểu mô RT-PCR : Thu nhận RNA tổng số tế bào biệt hóa Trizol Phản ứng RT-PCR thực kít AccessQuick TM RT-PCR ( Promega , Hoa Kỳ ) Phản ứng phiên mã ngược : 45 phút 45oC, kết thúc 95 OC phút Chu trình nhiệt PCR ( 35 chu kì ): 94 C 45 giây O 55-60 C 45 giây  72 C phút Sản phẩm PCR điện di gel Agarose 2% quan sát hệ thống chup gel tự động GelDoc It O Ủ 10 phút 72 C ( UVP, Hoa Kỳ) 35X Hình : Kết phân tích RT_PCR biểu gen CK18 (149bp), β1-integrin (640bp) , CK19 (460bp) p63 (611bp) 1: Tế bào đối chứng ; 2: tế bào biệt hóa sau tuần ; 3: tế bào biệt hóa sau tuần Trình Tự primer : CK18(149bp) F :TGGTACTCTCCTCAATCTGCTG R: CTCTGGATTGACTGTGGAAGT CK19(460bp) F:AGGTGGATTCCGCTCCGGGC R: ATCTTCCTGTCCCTCGAGCA P63 (611bp) F:CAGACTCAATTTAGTGAG R: AGCTCATGGTTGGGGCAC β1-Integrin (640bp) F: AATGTTTCAGTGCAGAGCC R: TTGGGATGATGTCGGGA Nuôi cấy nguyên bào sợi Chuẩn bị giá đỡ tế bào Cấy tế bào lên giá đỡ Theo dõi đánh giá tế bào nuôi cấy NUÔI CẤY THƯỜNG DIẾN RA TRONG VÒNG 14 NGÀY Hình ảnh nguyên bào sợi hình thành Ghép nguyên sợi bào kiểm tra thải loại KIỂM TRA THẢI LOẠI Kết phân tích western blot phát có mặt kháng nguyên HLA-G HLA-E dịch nghiền tế bào gốc trung mô màng dây rốn cho thấy tất biểu lộ HLA-E mẫu tế bào kháng nguyên HLA-G Click to edit Master text styles Second level Third level Fourth level Fifth level  Mức độ biểu HLA-DR chiếm 1,9 ± 1,53%  Mức độ biểu dấu ấn CD90 đặc thù tế bào gốc trung mô đạt tới 92,65 ± 6,3% Như vậy, tế bào gốc trung mô dây rốn có biểu cao dấu ấn CD90 đặc thù kháng nguyên hòa hợp tổ chức HLA -DR, HLA-E, HLA-G Tế bào gốc trung mô dây rốn có tính sinh miễn dịch thấp Trên 98% số tế bào thuộc quần thể TBGTM màng dây rốn nằm vùng M1 Trong đó, 92% số tế bào nằm vùng M2 phân tích với kháng thể kháng CD90 Điều tái khẳng định tế bào phân tích TBGTM Kết phân tích 15 mẫu TBGTM màng dây rốn cho mức độ biểu HLA mức 1,95 ± 1,53% VI Kết luận Thu nhận nuôi cấy thành công tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn người Tế bào gốc trung mô dây rốn có đặc tính sinh miễn dịch thấp Tế bào gốc trung mô dây rốn cảm ứng để biệt hóa thành nguyên bào sợi môi trường định hướng in vitro Ghép tế bào gốc trung mô màng dây rốn mô hình vết thương bỏng an toàn có tác dụng tích cực điều trị vết thương KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu việc đáp ứng miễn dịch người để nhanh chóng ứng dụng lâm sàng TÀI LIỆU THAM KHẢO Công nghệ sinh học người động vật – Phan Kim Ngọc Công nghệ tế bào gốc – Phan Kim Ngọc Đề tài “Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn người để điều trị vết thương bỏng nhiệt thực nghiệm” (Bác sĩ Phan Minh Hoàng – Học viện Quân Y Hà ... 49 TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, tập 73, số 4, năm 2012 NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ (MESENCHYMAL STEM CELL - MSC) TRONG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ ĐẠI - TRỰC TRÀNG TRÊN CHUỘT (SPRAGUE DAWLEY) Chế Thị Cẩm Hà 1,2 , Sabine François 2 , Marie-Elisabeth Forgue-Lafitte 2 , Alain Chapel 2 1 Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế 2 Viện Nghiên cứu Y học quốc gia Pháp, Đại học Paris VI Tóm tắt. Bài báo này giới thiệu một số kết quả nghiên cứu về tính năng của tế bào gốc trong liệu pháp miễn dịch ung thư nhờ những tế bào tạo ra từ tế bào gốc trên quá trình ung thư hóa đại trực - tràng ở chuột. Kết quả nghiên cứu cho thấy: Việc tiêm tế bào gốc trung mô ở liều 10 7 tế bào/ml có khả năng ức chế sự tăng sinh của các tế bào ung thư. Nhóm chuột được tiêm tế bào gốc trung mô với liều 10 7 tế bào/ml có số lượng các khối u ít hơn, với ý nghĩa thống kê (p <0,013). Nhóm chuột tế bào gốc được tiêm có ít khối u ác tính hơn những người không sử dụng tế bào gốc. 1. Đặt vấn đề Ở các nước phát triển tỷ lệ bệnh ung thư đại trực - tràng đứng thứ ba trong số các bệnh ung thư. Ở Việt Nam, gần đây bệnh này được nhắc đến nhiều hơn bởi sự thay đổi trong thói quen sinh hoạt hàng ngày là một trong những yếu tố khiến ung thư đại trực tràng ngày càng gia tăng một cách rõ rệt. Điều trị bệnh ung thư đang được tích cực nghiên cứu nhằm tìm ra phương pháp tối ưu để nâng cao chất lượng và tăng cường hiệu quả điều trị. Đến nay, việc sử dụng tế bào gốc trung mô đã được nghiên cứu trong nhiều lĩnh vực của y học tái tạo, tiểu đường, điều trị ung thư, điều trị các bệnh bẩm sinh, chấn thương cột sống, rối loạn thần kinh cơ và đặc biệt là tim mạch. Bài báo này giới thiệu một số kết quả nghiên cứu tìm hiểu về tính năng của tế bào gốc trong liệu pháp miễn dịch ung thư nhờ những tế bào tạo ra từ tế bào gốc trên mô hình ung thư hóa đại trực - tràng ở chuột. 2. Đối tượng và phương pháp 2.1. Đối tượng nghiên cứu: Là loài chuột cống trắng (Sprague Dawley) có khả năng miễn dịch. - Các chuột thí nghiệm có trọng lượng ban đầu từ 200±20 gram, đều là con đực 50 được 1 tháng tuổi, khỏe mạnh và được kiểm dịch trong 5 ngày trước khi thí nghiệm. - Lô chuột chuyển gen GFP được tiêm các tế bào gốc trung mô (MSC-GFP). Toàn bộ chuột được nuôi ở các lồng riêng biệt trong phòng ở nhiệt độ 25°C, có chế độ chiếu sáng 12 giờ mỗi ngày, được cho ăn trong cùng một chế độ dinh dưỡng, cùng điều kiện chăm sóc suốt quá trình nghiên cứu. - Các chuột thí nghiệm được phân thành 4 lô như sau:  Lô đối chứng sinh học: được đặt trực tiếp 200µl dung dịch sinh lý ở đại trực tràng Phương pháp dùng tế bào gốc trong điều trị bệnh tim mạch Phương pháp dùng tế bào gốc này là dùng tế bào nguồn để biệt hóa có thể sẽ tạo ra những thành phần cơ quan chức năng mới tương ứng để bổ xung hoặc thay thế cho những cơ quan đã hỏng mà không khắc phục được, đặc biệt là trong lĩnh vực bệnh động mạch vành. Đây thực sự là vấn đề thời sự và nóng bỏng hiện nay được quan tâm rất nhiều. Mặc dù đã có nhiều biện pháp trong điều trị bệnh ĐMV nhưng có tới 10% bệnh nhân là không thể chữa được. Do vậy, nếu ta dùng tế bào gốc đưa vào ĐMV hoặc cơ tim để tạo nên những mạch máu tân tạo mới có thể sẽ giải quyết được tận gốc về cơ chế bệnh tật. Đã có nhiều nghiên cứu dùng tế bào gốc trong điều trị bệnh ĐMV và cho kết quả ban đầu rất đáng khích lệ. Đây thực sự là một hướng đi quan trọng trong tương lai của ngành Tim mạch BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH PHÒNG SAU ĐẠI HỌC Tiểu luận môn công nghệ sinh học động vật Đề tài: ỨNG DỤNG TẾ BÀO GỐC TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG Giảng viên : TS Đỗ Minh Sĩ Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm K21 TP. HỒ CHÍ MINH, 04 – 2012 1 I. BỆNH NGUYÊN VÀ CÁC CHIẾN LƯỢC ĐIỀU TRỊ I.1. Sự cần thiết của các tế bào sản xuất insulin Bệnh tiểu đường là một rối loạn chuyển hoá liên tục và mãn tính. Bệnh này được đặc trưng bởi mức độ đường trong máu cao, nguyên nhân là do cơ thể mất khả năng sản xuất và / hoặc sử dụng insulin. Các tế bào ß (bê-ta) khỏe mạnh trong tuyến tụy sản xuất và giải phóng ra insulin để kiểm soát lượng đường trong máu. Số lượng các tế bào ß được duy trì qua quá trình sản sinh liên tục và thường xuyên. Tuy nhiên, ở bệnh nhân tiểu đường sự cân bằng bị mất đi. Vì vậy việc bảo vệ các tế bào còn lại và bổ sung một số lượng đủ các tế bào ß là trọng tâm của liệu pháp tế bào gốc đối với bệnh tiểu đường. Hiểu biết đầy đủ về bệnh tiểu đường là rất quan trọng, vì không kiểm soát được bệnh tiểu đường có thể dẫn đến các biến chứng nghiêm trọng như bệnh tim mạch, mù, suy thận, tổn thương thần kinh, hoại tử các chi (chân, tay). Hiện nay, có rất nhiều phương pháp điều trị thông thường đối với bệnh tiểu đường chẳng hạn như tiêm insulin và uống thuốc hạ đường huyết. Nhiều phương pháp điều trị có thể làm giảm hoặc trì hoãn sự khởi phát và phát triển của bệnh tiểu đường và các biến chứng liên quan. Tuy nhiên, các phương pháp này không giải quyết gốc rễ của vấn đề tức là nguyên nhân gây ra suy chức năng của tế bào beta tuyến tụy. Mục tiêu của điều trị tế bào gốc cho bệnh tiểu đường là bảo vệ các tế bào còn lại và bổ sung đầy đủ các tế bào beta. Phương pháp điều trị này cho phép bệnh nhân giảm hoặc thậm chí trong một số trường hợp ngưng sử dụng insulin và thuốc hạ đường huyết. Đồng thời làm giảm các biến chứng tiểu đường mãn tính. Mặc dù insulin được phát hiện 80 năm qua, nhưng các phiền toái của bệnh tiểu đường vẫn chựa được giải quyết hết. Mối quan hệ giữa mức glucose trong máu với các hậu quả về bệnh võng mạc, bệnh thận và bệnh thần kinh… đến nay 2 đã được xác định rõ. Một trong những con đường ngăn chặn các phiên toái nói trên là sử dụng liệu pháp thay thế tế bào bêta trong phương pháp cấy ghép. Hàng năm trung bình hơn 1000 ca phẩu thuật, cấy ghép tuyến tuỵ được tiến hành. Các cải tiến kĩ thuật cho việc cấy ghép cả một cơ quan, nhìn chung chỉ được bắt đầu vào năm 1980 lại đây, với một số kết qủa đáng khích lệ. Phải tới năm 2000, quy trình của Edmonton ra đời mới giúp đem lại các thành công lớn hơn. Nhờ quy trình này, việc chuẩn bị các tuỵ đảo tốt hơn, cấy ghép tuỵ đảo nhiều hơn, và đặc biệt việc ức chế miễn dịch được cải thiện. Về nguyên tắc, các đảo tuỵ được đưa vào gan xuyên qua tĩnh mạch. Năm 2004, hơn 150 bệnh nhân khắp thế giới đã nhận cấy ghép theo phương pháp Edmonton, với kết quả tốt. Tuy nhiên, chừng hai năm, hầu hết các bệnh nhân quay về trạng thái bệnh tiểu đường dạng nhẹ, mặc dù sự kiểm soát bệnh dễ dàng hơn bởi việc sản xuất insulin vẫn tiếp diễn và phần lớn, bệnh nhân không bị giảm glucose huyết trầm trọng. I.2. Sự cung cấp giới hạn các tế bào sản xuất insulin Thành công này nhờ vào sự cung cấp các tế bào sản xuất insulin, tuy nhiên gần đây nguồn tế bào này nếu chỉ lấy từ các người cho (mà tim còn đập) là không đủ. Ở mĩ, hàng năm chỉ có 3000 tuỵ được hiến là còn sử dụng được . Để khắc phục tình trạng này, một số nguồn tế bào khác được quan tâm là tế bào gốc trưởng thành, tế bào gốc phôi ; hoặc tế bào chuyển biệt hoá thành tế bào sản xuất insulin. Bằng công nghệ sinh học, người ta còn tìm cách thay đổi các tế bào, phát triển các dòng tế bào người; sử dụng các tế bào bêta từ các loại khác như là dị ghép… để đưa vào ứng dụng. I.3. Các chiến lược điều trị Bệnh tiểu đường do rối loạn chuyển hoá carbohydrat, khi hormone insulin của tuỵ bị thiếu, hay giảm tác động trong cơ thể, biểu hiện bằng mức đường trong máu luôn cao. Ở giai đoạn mới ỨNG DỤNG MÁU CUỐNG RỐN TRONG GHÉP T Ế BÀO GỐC TẠO MÁU Nguyễn Hữu Toàn 1. Các nguồn tế bào gốc tạo máu sử dụng cho ghép Ghép tế bào gốc tạo máu (thường gọi là ghép tủy xương) ñã ñược áp dụng khoảng 30 năm gần ñây ñể ñiều trị bệnh nhân bị tổn thương tạo máu tại tủy xương. Tổn thương này có thể là nguyên phát, hoặc thứ phát sau hóa trị hoặc xạ trị các bệnh máu và ung thư ñặc. Hàng năm, có hàng trăm nghìn bệnh nhân bệnh máu và ung thư ñặc có nhu cầu ghép tế bào gốc tạo máu. Tế bào gốc tạo máu ñược truyền vào ñường tĩnh mạch bệnh nhân sẽ ñến cư trú tại tủy xương và phục hồi khả năng tạo máu của tổ chức này. - Trước kia, tế bào gốc tạo máu thường ñược thu hoạch từ tủy xương người cho bằng phương pháp chọc hút tại các gai chậu. Thủ thuật này khá nặng nề ñối với người cho tủy và phức tạp trong sử lý dịch ghép. Trước khi truyền vào bệnh nhân, dịch ghép ñược loại bỏ bớt thành phần mỡ và dịch tế bào không cần thiết. - Từ ñầu những năm 1980, người ta thấy rằng tại máu ngoại vi cũng tồn tại một lượng nhỏ tế bào gốc tạo máu CD34. Một số thuốc như cyclophosphamide, cytarabin, hoặc yếu tố kích thích tạo máu như G-CSF có thể có tác dụng huy ñộng tế bào gốc tạo máu từ tủy xương và phóng thích ra máu ngoại vi. Sử dụng các hệ thống máy tách tế bào tự ñộng như CS-3000 Plus, COPE, Hemonetics có thể thu hoạch ñược một lượng lớn tế bào gốc này, ñủ ñể thực hiện kỹ thuật ghép tế bào gốc tạo máu mà không cần ñến dịch tủy xương. Phương pháp thu hoạch tế bào gốc từ máu ngoại vi là một tiến bộ lớn của kỹ thuật ghép tủy xương, làm cho kỹ thuật ghép tủy xương ñồng loại trở lên thuận tiện và phổ biến hơn. - Tuy nhiên trong thực tiễn, một khó khăn kinh ñiển của kỹ thuật ghép tủy xương là làm sao lựa chọn ñược người cho tương ñồng HLA với bệnh nhân. Mặc dù nhiều trung tâm ghép tủy xương lớn trên thế giới ñã xây dựng ngân hàng tế bào gốc xác ñịnh sẵn kháng nguyên HLA ñể cung cấp cho các trung tâm ghép khác, nhưng cơ hội ñể bệnh nhân tìm ñược người cho tương ñồng HLA vẫn rất thấp. - Khoảng 15 năm gần ñây, máu cuống rốn bắt ñầu ñược sử dụng như một nguồn tế bào gốc tạo máu. Tỷ lệ tế bào gốc tạo máu CD34 chiếm 0,2- 0,4% tế bào có nhân, cao hơn hàng chục lần so với máu ngoại vi người trưởng thành. Tế bào gốc máu cuống rốn có khả năng tăng sinh cao, có thể tạo ra một số dòng tế bào khác như tế bào gốc trung mô, tế bào ñơn nhân và fibroblast trong nuôi cấy tế bào. Máu cuống rốn có một số ưu ñiểm ñể vận dụng vào kỹ thuật ghép tế bào gốc tạo máu: + Lượng tế bào gốc trong máu cuống rốn rất phong phú, ñặc biệt là tế bào tạo cụm hỗn hợp (CFU- Mix), có khả năng biệt hóa thành các dòng tế bào máu khác nhau. + Các tế bào miễn dịch của máu cuống rốn phần lớn ñang ở trạng thái "trinh nguyên", hiệu quả ñáp ứng miễn dịch thấp, ít nguy cơ gây ra bệnh lý mảnh ghép chống túc chủ (GVHD). + Nguồn máu [...]... tế bào được phân tích là TBGTM Kết quả phân tích 15 mẫu TBGTM màng dây rốn cho mức độ biểu hiện của HLA chỉ ở mức 1,95 ± 1,53% VI Kết luận Thu nhận và nuôi cấy thành công tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn người Tế bào gốc trung mô dây rốn có đặc tính sinh miễn dịch thấp Tế bào gốc trung mô dây rốn có thể cảm ứng để biệt hóa thành nguyên bào sợi trong môi trường định hướng in vitro Ghép tế bào gốc. .. tâm - Huyền phù tế bào được chia đều cho 3 bình nuôi mới - Cấy chuyền 5-7 lần kiểm tra độ tinh sạch Xác định mật độ tế bào/ ml bằng buồng đếm Neubauer 4 Biệt hóa tế bào: Môi trường cảm ứng biệt hóa Môi trường cơ bản: DMEM được bổ sung 5% FBS và 1% kháng sinh  Các bước biệt hóa Cấy tế bào trong đĩa nuôi ở mật độ 5000tb/cm 2 Duy trì tế bào gốc trung mô trong môi trường nuôi cấy tế bào gốc Thay môi trường...IV Cơ chế biệt hóa tế bào gốc thành biểu bì da V ỨNG DỤNG TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ MÁU CUỐNG RỐN Quy trình 1.Thu nhận máu cuống rốn 2.Giai đoạn nuôi cấy sơ cấp 3.Giai đoạn nuôi cấy thứ cấp 4 Biệt hoá MSC 5 Giai đoạn nuôi cấy nguyên sợi bào 6 Ghép nguyên sợi bào và kiểm tra và thải loại IV ỨNG DỤNG TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ MÁU CUỐNG RỐN 1 Thu nhận máu cuốn rốn - Máu... hiện dấu ấn CD90 đặc thù của tế bào gốc trung mô đạt tới 92,65 ± 6,3% Như vậy, tế bào gốc trung mô dây rốn có biểu hiện cao về dấu ấn CD90 đặc thù và các kháng nguyên hòa hợp tổ chức HLA -DR, HLA-E, HLA-G Tế bào gốc trung mô dây rốn có tính sinh miễn dịch thấp Trên 98% số tế bào thuộc quần thể TBGTM màng dây rốn nằm trong vùng M1 Trong khi đó, trên 92% số tế bào này nằm trong vùng M2 khi phân tích với... HCV… ở bệnh viện - Máu trong cuống rốn luôn chứa ba loại tế bào chính: • Tế bào gốc tạo máu (Hemapoietic Stem Cell_HSC) • • Tế bào máu trưởng thành Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal stem cell – MSC) 2 Nuôi cấy sơ cấp tế bào của máu cuống rốn: Chọn lọc MSC - Ly tâm trên gradient nồng độ Ficoll-paque (Sigma) ở tốc độ 2.500 vòng/phút, trong 5 phút - Thu nhận phân đoạn chứa các tế bào đơn nhân nằm giữa lớp... ngày Khi tế bào bám ổn định vào bề mặt đĩa nhựa nuôi cấy thì hút bỏ môi trường tăng trưởng Tráng rửa tế bào trong đĩa nuôi bằng PBS Duy trì tế bào trong đĩa nuôi bằng môi trường nuôi cấy cảm ứng nguyên bào sợi Hàng ngày thay thế ½ môi trường trong đĩa bằng môi trường mới Theo dõi sự phát triển cũng như biến đổi hình thái tế bào trên kính hiển vi Kiểm tra biểu hiện 1 số gen đặc trưng cho tế bào biểu... 1: Tế bào đối chứng ; 2: tế bào biệt hóa sau 1 tuần ; 3: tế bào biệt hóa sau 3 tuần Trình Tự primer : CK18(149bp) F :TGGTACTCTCCTCAATCTGCTG R: CTCTGGATTGACTGTGGAAGT CK19(460bp) F:AGGTGGATTCCGCTCCGGGC R: ATCTTCCTGTCCCTCGAGCA P63 (611bp) F:CAGACTCAATTTAGTGAG R: AGCTCATGGTTGGGGCAC β1-Integrin (640bp) F: AATGTTTCAGTGCAGAGCC R: TTGGGATGATGTCGGGA 5 Nuôi cấy nguyên bào sợi Chuẩn bị giá đỡ tế bào Cấy tế bào. .. đỡ Theo dõi và đánh giá tế bào nuôi cấy NUÔI CẤY THƯỜNG DIẾN RA TRONG VÒNG 14 NGÀY Hình ảnh nguyên bào sợi được hình thành 6 Ghép nguyên sợi bào và kiểm tra thải loại KIỂM TRA THẢI LOẠI Kết quả phân tích bằng western blot phát hiện sự có mặt của các kháng nguyên HLA-G và HLA-E trong dịch nghiền tế bào gốc trung mô màng dây rốn cho thấy tất cả đều biểu lộ và HLA-E các mẫu tế bào cả kháng nguyên HLA-G... rốn trên mô hình vết thương bỏng là an toàn và có tác dụng tích cực trong điều trị vết thương KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu việc đáp ứng miễn dịch đối với người để nhanh chóng ứng dụng trên lâm sàng TÀI LIỆU THAM KHẢO Công nghệ sinh học trên người và động vật – Phan Kim Ngọc Công nghệ tế bào gốc – Phan Kim Ngọc Đề tài “Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn người để điều trị vết thương... trưng cho tế bào biểu mô bằng RT-PCR : Thu nhận RNA tổng số của tế bào biệt hóa bằng Trizol Phản ứng RT-PCR thực hiện bằng bộ kít AccessQuick TM RT-PCR ( Promega , Hoa Kỳ ) Phản ứng phiên mã ngược : 45 phút ở 45oC, kết thúc ở 95 OC trong 2 phút Chu trình nhiệt PCR ( 35 chu kì ): 0 94 C trong 45 giây O 55-60 C trong 45 giây  0 72 C trong 1 phút Sản phẩm PCR được điện di trên gel Agarose 2% và quan ... I/ Đặt vấn đề V/ Ứng dụng tế bào gốc trung mô dây rốn II/ Giới thiệu tế bào gốc ghép da 1.Khái niệm 2.Phân loại Vai trò III/ Cấu trúc da nguyên bào sợi 3.Cấu trúc da 4.Nguyên bào sợi Thu nhận... loại tế bào trung ương phần thiếu thể II Giới thiệu Phân loại tế bào gốc 3 VAI TRÒ  Tế bào gốc tế bào có khả biệt hóa trình phát triển để trở thành loại tế bào trung ương  Về mặt lý thuyết, tế. .. rốn chứa ba loại tế bào chính: • Tế bào gốc tạo máu (Hemapoietic Stem Cell_HSC) • • Tế bào máu trưởng thành Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal stem cell – MSC) Nuôi cấy sơ cấp tế bào máu cuống rốn: