Nghiên cứu số điều kiện tạo mô chồi Trinh nữ Hoàng Cung Agar : thạch CS : Cộng MS : Murashige & Skoog CNSH : Công nghệ sinh học HgCl2 : Chlorua thuỷ ngân 2,4D : 2,4 Dichlor phenoxy acetic acid IAA : Indol acetic acid NAA : - Naphtyl acetic acid BAP : Bezyl amino purine Kinetin : 6- fulfuryl amino purine AND : Acid Deoxyribo Nucleic ARN : Acid Ribo Nucleic TNHC : Trinh nữ Hoàng Cung Mục lục Trang Phầni: Đặt vấn đề Lê Thị Vân Anh - Lớp 98 - 02 CNSH 20 Nghiên cứu số điều kiện tạo mô chồi Trinh nữ Hoàng Cung Phần ii: Tổng quan tài liệu 2.1 Cây Trinh nữ Hoàng Cung 2.1.1 Đại cơng Trinh nữ Hoàng Cung 2.1.2 Giá trị dợc lý Trinh nữ Hoàng Cung 2.1.2.1 Thành phần hoá học 2.1.2.2 Tác dụng dợc lý 2.2 Nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.2.1 Lịch sử phát triển, ý nghĩa ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật Phần iii: 2.2.1.1 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.2.1.2 ý nghĩa ứng dụng 2.2.2 Các kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.2.3 Thành tựu nuôi cấy mô tế bào thực vật 10 2.2.4 Nuôi cấy mô sẹo tái sinh từ mô sẹo 11 2.2.4.1 Nuôi cấy mô sẹo 11 2.2.4.2 Tái sinh từ mô sẹo 12 2.2.5 Vai trò chất kích thích sinh trởng 13 2.2.5.1 Auxin 13 2.2.5.2 Cytokinin 13 2.2.5.3 ảnh hởng qua lại auxin cytokinin 14 2.2.6 Nhân giống Trinh nữ Hoàng Cung 14 Vật liệu phơng pháp 16 3.1 Vật liệu nghiên cứu 16 3.2 Phơng pháp nghiên cứu 16 3.3 Các tiêu theo dõi 17 Lê Thị Vân Anh - Lớp 98 - 02 CNSH 21 Nghiên cứu số điều kiện tạo mô chồi Trinh nữ Hoàng Cung Phần iv: kết thảo luận 19 4.1 Hiệu chế độ khử trùng 19 4.2 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy lên khả tạo 21 mô sẹo Trinh nữ Hoàng Cung 4.2.1 ảnh hởng auxin lên trình tạo mô sẹo 22 4.2.2 ảnh hởng tỷ lệ auxin/cytokinin lên trình 24 tạo mô sẹo 4.3 Nghiên cứu ảnh hởng chất kích thích sinh 26 trởng đến khả sinh trởng phát triển mô sẹo 4.4 Nghiên cứu ảnh hởng chất kích thích sinh 29 trởng lên trình phân hoá mô sẹo 4.5 Nghiên cứu ảnh hởng nớc dừa đến khả 31 phân hoá tạo chồi Trinh nữ Hoàng Cung Phần v: Phần vi: Kết luận đề nghị 35 5.1 Kết luận 35 5.2 Đề nghị 35 tài liệu tham khảo 36 Lê Thị Vân Anh - Lớp 98 - 02 CNSH 22 Nghiên cứu số điều kiện tạo mô chồi Trinh nữ Hoàng Cung phần i : đặt vấn đề Trinh nữ Hoàng Cung (Crinum latifolium L.) thuộc họ Thuỷ Tiên (Amaryllidaceae) Là thuốc đợc sử dụng nhiều y học dân gian ấn Độ, Trung Quốc Việt Nam Nó đợc sử dụng nh vị thuốc chữa xung huyết da, viêm loét mng mủ, sai bong gân, đắp mụn nhọt, áp xe Dịch Trinh nữ Hoàng Cung làm thuốc nhỏ chữa đau tai [2] Gần đây, tác dụng chữa ung th Trinh nữ Hoàng Cung đợc phát làm cho trở thành loại dợc liệu quý Các hợp chất Alcaloid dịch chiết Trinh nữ Hoàng Cung đặc biệt Lycorin có tác dụng tích cực điều trị số dạng ung th: tuyến tiền liệt, u nang buồng trứng, u xơ tử cung Hiện nay, nhiều dạng thuốc nh: chè tan, viên Panacrin đợc sản xuất từ Trinh nữ Hoàng Cung khiến cho nhu cầu số lợng chất lợng nguyên liệu để sản xuất ngày tăng Tuy nhiên, nguồn nguyên liệu khai thác từ tự nhiên thờng phân tán, manh mún cho chất lợng không đồng (do khác điều kiện sống, không đồng tuổi thọ thu hái ), trữ lợng có giới hạn bị cạn kiệt nhanh chóng nhiều nguyên nhân Việc nghiên cứu đa Trinh nữ Hoàng Cung vào trồng trọt quy mô công nghiệp nhằm cung cấp đủ nguồn nguyên liệu cho chế biến thuốc nhu cầu thiết Ngày nay, kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật mở tiềm lớn công tác chọn, tạo nhân nhanh giống trồng nhằm thu nhận đợc nguồn nguyên liệu ổn định, tăng hoạt chất sinh học Kỹ thuật nuôi cấy mô sẹo tái sinh từ mô sẹo đáp ứng đợc yêu cầu số lợng giống chất lợng nguyên liệu Để góp phần vào việc thu sinh khối nhằm phân tích chất có hoạt tính sinh học nhân nhanh Trinh nữ Hoàng Cung, tiến hành đề tài: Nghiên cứu số điều kiện tạo mô chồi Trinh nữ Hoàng Cung Lê Thị Vân Anh - Lớp 98 - 02 CNSH 23 Nghiên cứu số điều kiện tạo mô chồi Trinh nữ Hoàng Cung phần ii : tổng quan tài liệu 2.1 Cây Trinh nữ Hoàng Cung 2.1.1 Đại cơng Trinh nữ Hoàng Cung Cây Trinh nữ Hoàng Cung có thân hành to, hình cầu, đờng kính 1012cm, hình dải có bẹ mọc ốp vào thành thân giả ngắn, phiến mỏng, dài 60-90cm, rộng 6-11cm, gân song song, mép lợn sóng, mặt lõm thành rãnh, mặt dới có số rõ, đầu bẹ nơi sát đất có màu đỏ tía Hoa mọc thành tán gồm 6-12 hoa cán hoa, dài 3060cm Cánh hoa màu trắng phớt hồng, bao hoa cong dài 7-10cm, phiến hoa dài hình ống rộng tới 2,5cm có mỏ bao quanh hình tam giác dài 7cm [6] Trinh nữ Hoàng Cung mọc nhiều xứ nhiệt đới nh: Việt Nam, Lào, Campuchia, ấn Độ, Nhật Bản, Thái Lan, Philippin, Xrilanca, Malaixia [2] Là a nớc phát triển mạnh vào mùa ma vào mùa khô phát triển chậm lại, phát triển chậm, từ thân hành mọc nhiều củ tách để trồng riêng dễ dàng [13] 2.1.2 Giá trị dợc lý Trinh nữ Hoàng Cung Cây Trinh nữ Hoàng Cung thuốc quý đợc nghiên cứu nhiều Việt Nam có khả chữa đợc bệnh ung th tuyến tiền liệt, u nang buồng trứng, u xơ tử cung Bộ phận sử dụng chủ yếu đợc thu hái giai đoạn bánh tẻ Lá sau thu hái dùng tơi, phơi khô râm mát để dùng dần chiết xuất hoạt chất sinh học Ngoài sử dụng cán hoa, thân hành cây, thu hoạch quanh năm 2.1.2.1 Thành phần hoá học Theo kết phân tích thành phần hoá học Trinh nữ Hoàng Cung Việt Nam số tác giả có chứa Alcaloid, Saponin, Acid hữu cơ, Acid Lê Thị Vân Anh - Lớp 98 - 02 CNSH 24 Nghiên cứu số điều kiện tạo mô chồi Trinh nữ Hoàng Cung amin chất chống oxy hoá Trên sắc ký lớp mỏng, hỗn hợp Alcaloid có 11 vết, kết tinh đợc chất Saponin thuộc nhóm Steroid, phần genin có nhóm : -OH ; -CO ; -CH -CH2 Nhóm Acid amin có 11 chất, có Phenylalanin, L- leucin, DL-valin L- arginin monohydroclorid [1] Trên sắc ký khí ghép với khối phổ (GC-MS), từ dịch chiết Alcaloid toàn phần Trinh nữ Hoàng Cung tách đợc 18 vết xác định đợc vết Ambellin, Crinamidin 6- hydroxy-crinamidine [5] Phan Tống Sơn CS [3], [8] phân lập đợc Lycorin 1,2 didehydro-crinan-3-01 số Alcaloid khác Và theo kết nghiên cứu gần Alcaloid từ củ Trinh nữ Hoàng Cung trồng Việt Nam Phan Tống Sơn CS [10] Bằng phơng pháp sắc ký lỏng trung áp (MPLC) sắc ký cột nhanh (FC) phân lập khảo sát đợc cấu trúc 12 Alcaloid là: Hippadin, Protorinin, 6-hydroxy-undulatin, Ambellin, 6-hydroxy-buphanidrin, Augustamin, Crinamidin, Crinin, Lycorin, 1-0-acetyl-lycorin, Powellin 6-hydroxycrinamidin Alcaloid nhóm chất quan trọng Trinh nữ Hoàng Cung, bao gồm chủ yếu Lycorin, Hippadin, Ambellin dẫn suất chúng Hàm lợng Alcaloid tăng dần từ đầu mùa ma tháng 5, hàm lợng Alcaloid đạt cao vào trớc thời kỳ hoa đến đầu tháng 6, trổ hoa giảm đột ngột [9] Đặc biệt Alcaloid tìm thấy Trinh nữ Hoàng Cung số loài khác thuộc họ Amaryllidaceae mà không tồn họ khác [18] Điều nói lên tính độc đáo mặt hoá học nh giá trị độc tôn Trinh nữ Hoàng Cung 2.1.2.2 Tác dụng dợc lý Theo Ghosal CS [18], tác dụng dợc lý Trinh nữ Hoàng Cung chủ yếu tập trung Alcaloid đặc biệt Lycorin Hippadin Lê Thị Vân Anh - Lớp 98 - 02 CNSH 25 Nghiên cứu số điều kiện tạo mô chồi Trinh nữ Hoàng Cung Lycorin có tác dụng ức chế sinh tổng hợp protein ADN tế bào chuột, đồng thời ức chế sinh trởng in vivo tế bào u báng chuột Trong điều kiện in vitro, Lycorin giảm sức sống u cách đáng kể Nó làm đình trệ sinh tổng hợp tiền chất polyovirus thân polyovirus nh polyopeptidase đặc hiệu Vì vậy, có tác dụng kháng virus mạnh Lycorin ức chế sinh tổng hợp protein tế bào có nhân cách ngăn cản hình thành liên kết peptid Những tác dụng sinh học tơng tự đợc ghi nhận Dihydro lycorin, Pseudo lycorin Những Alcaloid triệt thoái sinh trởng tế bào Hela trình sinh tổng hợp protein tế bào u báng làm chậm trình sinh tổng hợp ADN Lycorin kìm hãm mạnh phát triển phân chia tế bào thực vật bậc cao, tảo men Song mặt khác Lycorin 1-0--D Glucozit lại xúc tiến mạnh phát triển rễ thực vật bậc cao Một số Crinum Alcaloid nh : (-)Lycorin, (-)-Augustamin, (+)- Crinamin thể hoạt tính chống ký sinh trùng sốt rét in vitro Lycorin -1-0-glucozit liều àg hoạt hoá phân bào lympho lách chuột với độc tính cấp thấp (> 200àg/kg ip-intraperitoneal), đợc xem nh chất kích thích miễn dịch tiềm tàng Dịch chiết nớc nóng từ Trinh nữ Hoàng Cung Việt Nam có tác dụng hoạt hoá, kích thích sinh sản tế bào lympho T [13] Hippadin gây ức chế tạm thời trình hình thành tinh trùng chuột đực, làm tăng đáng kể sức sống tế bào u báng S-180 thông qua chế ổn định màng tế bào, Khả kết hợp cấu trúc Steroid Hippadin đợc xem nh sở ổn định tế bào điều hoà trao đổi chất tế bào nồng độ 5àg/ml, 1,2- epoxyambellin kích thích nhẹ phân chia tế bào lympho lách chuột, nồng độ đó, hỗn hợp 1:1 Lê Thị Vân Anh - Lớp 98 - 02 CNSH 26 Nghiên cứu số điều kiện tạo mô chồi Trinh nữ Hoàng Cung Ambellin 1,2- epoxyambellin có tác dụng mạnh phân chia này, tơng đơng với tác nhân gây kích thích phân bào Concanavalin (Con A) Nh Alcaloid Trinh nữ Hoàng Cung vừa có tác dụng chống ung th vừa có tác dụng kích thích miễn dịch Tiếp thu kết nghiên cứu nớc kinh nghiệm chữa bệnh nhân dân, nhiều thầy thuốc Việt Nam sử dụng Trinh nữ Hoàng Cung để điều trị số dạng ung th có kết tốt Bệnh viện Hữu Nghị Hà Nội từ năm 1995 đến dùng Trinh nữ Hoàng Cung điều trị thành công cho hàng nghìn bệnh nhân từ 50-80 tuổi bị u xơ tiền liệt tuyến có định mổ tỷ lệ khỏi cao (97%) Viện Dợc Liệu (trong khuôn khổ đề tài cấp nhà nớc KH 11-05-02-02) kết hợp Trinh nữ Hoàng Cung với vài dợc liệu khác cho đời viên thuốc Panacrin có tác dụng ức chế hình thành khối u, hạn chế di kéo dài thời gian sống động vật thí nghiệm, thuốc Panacrin đợc dùng cho ba nhóm bệnh nhân: ung th dày, ung th gan, u lympho ác tính đợc kiểm chứng cho thấy thuốc đợc dung nạp tốt, tác dụng phụ, thuốc thời gian thử lâm sàng [7], [4] Tóm lại, Trinh nữ Hoàng Cung thuốc quý có giá trị điều trị số dạng ung th Để cung cấp nguyên liệu cho chế biến thuốc với quy mô công nghiệp cần phải nghiên cứu điều kiện nuôi trồng Trinh nữ Hoàng Cung 2.2 Nuôi cấy mô, tế bào thực vật Nuôi cấy mô, tế bào thực vật lĩnh vực nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn vi sinh vật môi trờng dinh dỡng nhân tạo điều kiện vô trùng tuyệt đối Lê Thị Vân Anh - Lớp 98 - 02 CNSH 27 Nghiên cứu số điều kiện tạo mô chồi Trinh nữ Hoàng Cung 2.2.1 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô, tế bào thực vật, ý nghĩa ứng dụng 2.2.1.1 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô, tế bào thực vật Haberlandt (1902) ngời đề xuất phơng pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật để chứng minh tính toàn tế bào Theo ông, tế bào thể sinh vật mang toàn lợng thông tin di truyền cần thiết đủ sinh vật đó, gặp điều kiện thích hợp tế bào phát triển thành thể hoàn chỉnh Ông làm thí nghiệm với tế bào khí khổng không thành công Năm 1922, Robbins Kotte thành công việc nuôi cấy đầu rễ 12 ngày Từ đầu rễ đợc sử dụng để nuôi hoàn thiện môi trờng nuôi cấy Từ năm 30 Thế kỷ hai mơi, phơng pháp nuôi cấy mô, tế bào mang nét nuôi cấy mô, tế bào đại không khác nhiều mặt kỹ thuật Trong thời gian này, White (Mỹ) Gautheret (Pháp) có nhiều đóng góp việc nghiên cứu môi trờng nuôi cấy Cho tới nay, nhiều môi trờng đợc sử dụng Từ năm 1931, phơng pháp nuôi cấy mô, tế bào coi nh đợc thức bắt đầu công trình White với việc nuôi cấy đầu rễ cà chua ông ngời mô phân sinh sinh trởng thời gian dài đợc cấy chuyển lên môi trờng dinh dỡng Cùng thời gian đó, Gautheret thành công nuôi cấy mô thợng tầng tìm đợc môi trờng thích hợp Sau đó, Miller Skoog nuôi cấy mô lõi thuốc xác định đợc vai trò kinetin kích thích phát triển mô Những thí nghiệm môi trờng dinh dỡng môi trờng dinh dỡng, tính chất vật lý, hoá học điều kiện quan trọng định thành công nuôi cấy mô, quan tế bào Những thành phần bắt buộc môi trờng gồm chất khoáng, từ muối khác nguyên tố đa Lê Thị Vân Anh - Lớp 98 - 02 CNSH 28 Nghiên cứu số điều kiện tạo mô chồi Trinh nữ Hoàng Cung lợng vi lợng, thành phần hydrocacbon đờng chất điều hoà sinh trởng Cũng từ năm 30 nuôi cấy mô, tế bào phát triển thành số hớng nh nuôi cấy phôi, nuôi cấy mô quan tách rời Những năm 60 trở lại đây, hớng nuôi cấy bao phấn, nuôi cấy tế bào đơn tế bào trần (protoplast) đợc phát triển mạnh Từ năm 70 đến nay, kỹ thuật lai soma dung hợp tế bào trần kỹ thuật chuyển gen đợc phát triển thu đợc thành tựu đáng kể [12] 2.2.1.2 ý nghĩa ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật a.ý nghĩa : Sự đời kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật mang lại ý nghĩa vô to lớn Nó chứng minh đợc tính toàn tế bào thực vật (tế bào thể mang toàn lợng thông tin di truyền cần thiết đủ sinh vật đó, gặp điều kiện thích hợp, tế bào phát triển thành thể hoàn chỉnh) Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật góp phần giải vấn đề lí thuyết thực tiễn, đặc biệt lĩnh vực nghiên cứu phát triển thực vật từ mức độ tế bào đến cấu trúc mô, đồng thời mở triển vọng tạo giống có suất cao, phẩm chất tốt Kỹ thật nhân nhanh giống in vitro cho hệ số nhân giống cao (36 ữ 1012 năm), không tốn diện tích (trên 1m để đợc tới 18.000 cây) tạo bệnh, vận chuyển thuận tiện (1 thùng 40.000 dâu tây nặng 15kg), dễ chăm sóc bảo quản, không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên chủ động kế hoạch hóa theo quy trình công nghệ Lê Thị Vân Anh - Lớp 98 - 02 CNSH 29 Nghiên cứu số điều kiện tạo mô chồi Trinh nữ Hoàng Cung mô sẹo môi trờng nuôi cấy MS + 2% đờng sucrose + 0,8% agar + 10% nớc dừa + 0,4mg/l IAA + 0,4g/l casein + 0,2g/l inositol + tổ hợp auxin cytokinin nồng độ khác Kết đợc trình bày bảng Sau tuần theo dõi có nhận xét: Mô sẹo (kích thớc 0,5x0,5cm) sau tuần nuôi cấy phục hồi phát triển trở lại Tỷ lệ auxin /cytokinin khác cho đặc điểm hình thái mô sẹo khác nhau, hầu hết công thức mô sẹo sinh trởng tốt nhng cho mô sẹo xốp, hàm lợng nớc cao, mô sẹo có màu nâu màu vàng nhạt, công thức PTM5, PTM7, PTM8 cho khả sinh trởng mô tốt, PTM7 (2mg/l NAA + 2mg/l BAP) cho tốc độ sinh trởng mô tốt nhất: ban đầu khối mô đợc phủ lớp mô hạt nhỏ li ti màu trắng tuyết, khối mô lớn dần có màu vàng vàng nhạt sau chuyển sang xanh, sau tuần nuôi cấy tạo đợc khối mô có đờng kính từ 15 20mm công thức PTM3 (bổ sung 2mg/l 2,4D + 2mg/lBAP) mô sẹo phát triển chậm, bề mặt mô phủ lớp dịch nhớt suốt, mô lớn dần, lớp dịch nhớt lại phía dới chân mô, mô tế bào nhỏ Lê Thị Vân Anh - Lớp 98 - 02 CNSH 48 Nghiên cứu số điều kiện tạo mô chồi Trinh nữ Hoàng Cung Bảng ảnh hởng chất kích thích sinh trởng đến khả sinh trởng phát triển mô sẹo Công 2,4D NAA Kinetin BAP Số mẫu Đặc điểm mô sẹo (sau tuần) thức PTM1 PTM2 PTM3 PTM4 PTM5 PTM6 PTM7 PTM8 (mg/l) 2 2 - (mg/l) 2 2 (mg/l) 4 - (mg/l) 4 cấy 10 10 10 10 10 10 10 10 Nâu xám, mô xốp, hàm lợng nớc cao Nâu nhạt, mô rời rạc, xốp, ớt Vàng nhạt, mô phủ lớp dịch nhớt, rắn chắc, hàm lợng nớc Sẫm màu, mô rời rạc, xốp,ớt Vàng đậm xanh, mô xốp, nhiều nớc Vàng nâu, mô nhão, xốp, nhiều nớc Trắng xanh, mô liền khối, xốp Vàng trắng xanh, xốp, hàm lợng nớc cao Lê Thị Vân Anh - Lớp 98 - 02 CNSH 19 Nghiên cứu số điều kiện tạo mô chồi Trinh nữ Hoàng Cung nhau, tế bào chất đậm đặc, liên kết tế bào chặt chẽ tạo thành khối mô rắn có màu vàng tơi (hình 3), hàm lợng nớc ít, khối mô cho khả tái sinh cao Nh vậy, tỷ lệ auxin/cytokinin mức cân có tác động tốt đến khả sinh trởng phát triển mô sẹo, BAP tác động lên phân chia tế bào mô sẹo mạnh kinetin Trên công thức PTM3 PTM7 cho mô sẹo sinh trởng phát triển tốt PTM3 (bổ sung 2mg/l 2,4D + 2mg/lBAP) cho mô sẹo sinh trởng chậm, mô khô PTM7 (bổ sung 2mg/lNAA + 2mg/l BAP) cho mô sẹo sinh trởng nhanh, mô xốp Hình Hình thái đặc điểm mô sẹo TNHC môi trờng khác nhau: Trái- môi trờng PTM7; phải- môi trờng PTM3 Lê Thị Vân Anh - Lớp 98 - 02 CNSH 19 Nghiên cứu số điều kiện tạo mô chồi Trinh nữ Hoàng Cung Hình Mô sẹo TNHC môi trờng sinh trởng phát triển mô (PTM7) 4.4 Nghiên cứu ảnh hởng chất kích thích sinh trởng lên trình phân hoá mô sẹo Theo Vuyl Stake (1989) tác dụng kích thích tạo chồi đạt đợc chủ yếu nhờ vào việc nuôi cấy môi trờng bổ sung với nồng độ cytokinin cao Nồng độ cytokinin thay đổi ảnh hởng đến trình phân hoá hình thành cấu trúc, hình thái dẫn đến việc tạo chồi, rễ hay lục hoá từ mô sẹo Vì tiến hành nghiên cứu khả phân hoá từ mô sẹo Trinh nữ Hoàng Cung môi trờng MS cải tiến + 10% nớc dừa + 0,8% agar + 2% đờng sucrose + 0,1% than hoạt tính + 0,2mg/l/l NAA + tổ hợp hợp BAP kinetin nồng độ khác Kết đợc trình bày bảng Lê Thị Vân Anh - Lớp 98 - 02 CNSH 20 Nghiên cứu số điều kiện tạo mô chồi Trinh nữ Hoàng Cung Bảng ảnh hởng nồng độ Kinetin BAP lên khả phân hoá mô sẹo Công BAP Kinetin Số mẫu thức TC1 TC2 TC3 TC4 TC5 TC6 TC7 TC8 (mg/l) 2 2 (mg/l) 2 2 cấy 20 20 20 20 20 20 20 20 Tỷ lệ phân hoá (%) Rễ Lục hoá Chồi 25 50 25 60 50 75 0 50 25 50 30 50 0 100 10 70 Qua bảng nhận thấy: BAP kinetin tác động tốt lên khả lục hoá mô sẹo Tuy nhiên, chất khác (BAP, kinetin) cho tỷ lệ lục hoá khác nồng độ chất khác cho tỷ lệ lục hoá khác Khi tăng nồng độ kinetin 4mg/l khả phân hoá mô sẹo tăng (tỷ lệ tạo rễ tăng từ 25% - 50%, tỷ lệ lục hoá tăng từ 50% 75%) Tiếp tục tăng nồng độ kinetin lên 5mg/l tỷ lệ lục hoá đạt 50% mô sẹo không rễ Đối với BAP thay đổi nồng độ từ - 4mg/l tỷ lệ lục hoá mô thay đổi (50% đến 100%), nồng độ 5mg/l BAP tỷ lệ lục hoá đạt 70% tỷ lệ rễ thấp (10%) Cả kinetin BAP nồng độ 4mg/l cho tỷ lệ mô sẹo lục hoá tốt công thức TC3 (2mg/l BAP + 4mg/l kinetin) cho tỷ lệ mô sẹo lục hoá 75%, TC7 (4mg/l BAP + 2mg/l kinetin) cho tỷ lệ lục hoá 100% Từ kết rút số nhận xét: Kinetin BAP có tác động tốt đến khả lục hoá mô sẹo nhng BAP có tác động mạnh kinetin Công thức TC7 (4mg/l BAP + 2mg/l kinetin) cho khả mô sẹo lục hoá tốt (100%) Lê Thị Vân Anh - Lớp 98 - 02 CNSH 21 Nghiên cứu số điều kiện tạo mô chồi Trinh nữ Hoàng Cung Hình Sự phân hoá mô TNHC môi trờng có nồng độ cytokinin khác nhau: Trái - Lục hoá (TC7); phải - Tạo rễ (TC3 4.5 Nghiên cứu ảnh hởng nớc dừa đến khả phân hoá tạo chồi Trinh nữ Hoàng Cung Theo nghiên cứu số tác giả nớc nớc dừa chất phụ gia quan trọng môi trờng nuôi cấy in vitro thực vật Nớc dừa chứa nhiều muối khoáng, axit amin, sinh tố, chất điều hoà sinh trởng cần thiết cho phát triển thực vật in vitro có tác dụng mạnh lên khả biệt hoá chồi Vì tiến hành nghiên cứu ảnh hởng nớc dừa lên khả phân hoá tạo chôì Trinh nữ Hoàng Cung môi trờng MS cải tiến + 2% đờng sucrose + 0,8% agar + 0,1% than hoạt tính + 0,2mg/l NAA + 2mg/l BAP + 2mg/l kinetin bổ sung nớc dừa nồng độ khác (10, 20, 30, 40, 50% ) Kết đợc trình bày bảng Lê Thị Vân Anh - Lớp 98 - 02 CNSH 22 Nghiên cứu số điều kiện tạo mô chồi Trinh nữ Hoàng Cung Bảng ảnh hởng nớc dừa lên khả phân hoá tạo chồi mô sẹo Công Nớc dừa Số mô thức TC9 TC10 TC11 TC12 TC13 (ml/l) 100 200 300 400 500 sẹo cấy 20 20 20 20 20 Tỷ lệ phân hoá mô sẹo (%) Rễ Lục hóa Chồi 25 50 50 70 0 75 100 80 20 40 Qua bảng nhận thấy : Khi bổ sung nớc dừa với nồng độ tăng dần ( 100-500 ml/l) Kết cho thấy tỷ lệ lục hoá mô sẹo tơng đối tốt (50 - 80%) Công thức TC12 tỷ lệ lục hoá thấp (40%) mô sẹo không tạo rễ công thức TC9 (tạo rễ 25%, lục hoá 50%), TC10 (tạo rễ 50%, lục hoá 70%), TC11 (mô sẹo không tạo rễ 75% lục hoá), TC12 mô sẹo tái sinh chồi (20%), mô sẹo lục hoá (80%) tất mô sẹo tạo rễ (100%) Nh vậy, nớc dừa có tác động tích cực thúc đẩy khả lục hoá tái sinh chồi từ mô sẹo Công thức TC12 (bổ sung 400ml/l nớc dừa) cho khả phân hoá mô tốt nhất, mô sẹo cho tỷ lệ lục hoá cao (80%) tái sinh thành (20%) Lê Thị Vân Anh - Lớp 98 - 02 CNSH 23 Nghiên cứu số điều kiện tạo mô chồi Trinh nữ Hoàng Cung Hình Chồi tái sinh từ mô sẹo TNHC môi trờng TC12 Lê Thị Vân Anh - Lớp 98 - 02 CNSH 24 Nghiên cứu số điều kiện tạo mô chồi Trinh nữ Hoàng Cung Hình Cây Trinh nữ Hoàng Cung tái sinh Lê Thị Vân Anh - Lớp 98 - 02 CNSH 25 Nghiên cứu số điều kiện tạo mô chồi Trinh nữ Hoàng Cung Phần V: kết luận đề nghị 5.1 Kết Luận Dựa vào kết thu đợc đa kết luận sau: Chế độ khử trùng tốt : chế độ (50 - 60 giây cồn 70% +10 phút HgCl2 0,1%) Môi trờng cho khả tạo mô sẹo tốt là: TM9: MS cải tiến + 2% đờng surose + 0,8% Agar + 10% nớc dừa + 0,4 g/l Casein + 4mg/l 2,4D + 1mg/l BAP + 1mg/l NAA Môi trờng cho khả sinh trởng phát triển mô tốt: PTM3 (MS cải tiến + 2% đờng sucrose + 0,8% agar + 10% nớc dừa + 0,2mg/l IAA + 0,4g/l casein + 0,2g/l inositol + 2mg/l 2,4D + 2mg/l BAP) cho mô sinh trởng chậm, mô khô PTM7 (MS cải tiến + 2% đờng sucrose + 0,8% agar + 10% nớc dừa + 0,2mg/l IAA + 0,4g/l casein + 0,2g/l inositol + 2mg/l NAA + 2mg/l BAP) cho mô sinh trởng nhanh, xốp Môi trờng cho khả mô sẹo lục hoá cao là: TC7: MS cải tiến + 2% đờng sucrose + 0,8% agar + 10% nớc dừa + 0,2mg/l NAA + 0,1% than hoạt tính + 4mg/l BAP + 2mg/l kinetin Môi trờng cho khả tái sinh là: TC12: MS cải tiến + 2% đờng sucrose + 0,8% agar + 40% nớc dừa + 0,2mg/l NAA + 0,1% than hoạt tính + 2mg/l BAP + 2mg/l kinetin 5.2 Đề Nghị Do thời gian thực tập có hạn nên dừng nghiên cứu đề tài Trinh Nữ Hoàng Cung loài dợc liệu quý đợc phát lại Đề nghị cần đợc tiếp tục nghiên cứu để thu đợc kết sâu tìm phơng pháp nuôi cấy để thu đợc hàm lợng hoạt chất sinh học cao Lê Thị Vân Anh - Lớp 98 - 02 CNSH 26 Nghiên cứu số điều kiện tạo mô chồi Trinh nữ Hoàng Cung Phần vi: tài liệu tham khảo A Phần tiếng Việt Nguyễn Văn Bằng, Nguyễn Hoàng, Vũ Đoan Trang, Nguyễn Thị Thu Hằng,1997 Bớc đầu nghiên cứu Hoàng Cung Trinh nữ (Crinum latfolium L.)- thuốc có khả chữa số bệnh ung th Tạp chí Dợc học,7-9 Võ Văn Chi, 1999 Từ điển thuốc Việt Nam NXB Y Học Hà Nội Trần Bạch Dơng, Nguyễn Thị Minh, Phan Tống Sơn,1999 Phân tích alcaloid Tỏi lơi rộng (Crinum latfolium L.) Việt Nambằng phơng pháp sắc ký cột nhanh Tạp chí Hoá học Công nghiệp hoá chất Số 5, 25-29 Nguyễn Bá Đức, Đoàn Hữu Nghị, Nguyễn Tuyết Mai, Phạm Quốc Đạt, Lê Thanh Đức, Ngô Bá Hng Phạm Kim Mãn, Nguyễn Thu Thuỷ, 2000 Viên Panacrin điều trị hỗ trợ bệnh nhân ung th gan, ung th dày u lympho ác tính bệnh viện K Tạp chí Thông tin y dợc, số chuyên đề ung th tháng 8, 313-318 Võ Thị Bạch Hụê, Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, Ngô Vân Thu, 1999 Khảo sát alkaloid chiết từ Trinh nữ Hoàng Cung (Crinum latifolium L Amaryllidaceae) kỹ thuật sắc ký khí ghép với khối phổ (GS-MS) Tạp chí Dợc học Số 4, 9-11 Đỗ Tất Lợi, 1999.Những thuốc vị thuốc Việt Nam NXB Y Học Hà Nội Phạm Kim Mãn, Nguyễn Minh Khai, Nguyễn Bích Thu, Vũ Kim Thu Trần Văn Yên, Nguyễn Thị Quỳ, Nguyễn Hiền Anh, 2001 Nghiên cứu Panacrin ức chế u dùng điều trị ung th Tạp chí Dợc liệu Phần I: Số 2+3 58-62 Phần II: Số 5, 152-156 Nguyễn Thị Minh, Trần Bạch Dơng, Nguyễn Tuấn Anh, Phan Tống Sơn, 1997 Đóng góp vào việc nghiên cứu alcaloid Tỏi lơi rộng Lê Thị Vân Anh - Lớp 98 - 02 CNSH 27 Nghiên cứu số điều kiện tạo mô chồi Trinh nữ Hoàng Cung (Crinum latifolium L.) Việt Nam Tạp chí Hoá học Công nghiệp hoá chất Số 3, 13-16 Tôn Nữ Quỳnh Nh, Võ Thị Bạch Huệ, 2000 Định lợng alkaloid từ Trinh nữ Hoàng Cung (Crinum latifolium L.) phơng pháp acid màu Tạp chí Dợc liệu Số 2, 38-42 10 Phan Tống Sơn, Trần Bạch Dơng, Phan Minh Quang, Nguyễn Thị Minh, Walter Taylor C ,2001 Nghiên cứu alcaloid từ củ Náng rộng (Crinum latifolium L.) Việt Nam Tạp chí Hoá học Số 3, 83-88 Số4, 90-94 11.Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch, Trần Văn Phẩm, 2000 Sinh lý tế bào thực vật NXBNN Hà Nội 12 Nguyễn Đức Thành, 2000 Nuôi cấy mô tế bào thực vật nghiên cứu ứng dụng NXB NN Hà Nội 13 Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Bảo Lộc, 2000 Khảo sát thực vật nuôi trồng thu hái Trinh nữ Hoàng Cung (Crinum latifolium L.) Tạp chí Dợc liệu Số 2, 21-22 14 Viện Dợc liệu, 1979 Kỹ thuật trồng thuốc NXB Y học 15 Vũ Văn Vụ, 1999 Sinh lý thực vật ứng dụng NXBGD-ĐHQG 16 Nguyễn Văn Uyển CS, 1994 CNSH số ứng dụng Việt Nam NXBNN TPHCM Tập B Phần tiếng nớc 17 Bhojwani S.S and Razdan M.K., 1983 Plant tissue culture Theory and Practice Elseviet Science Publishers, Amsterdam 18 Ghosal S , Saini KS ,Razdan S , 1985 Crinum alkaloid Their chemistry and biology Phytochemistry, 24(10), 2141-2156 19 http :// Error: Reference source not found 20 Murashige T , Skoog F ,1962 A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures Physiol Plant.15, 473-497 21 Nguyen Thi Ngoc Tram, Zvetkova E , Nikolova E ,Katzarova E., Kostov G , Yanchev L ,Baicheva O ,1995 A novel in vitro and in vivo TLê Thị Vân Anh - Lớp 98 - 02 CNSH 28 Nghiên cứu số điều kiện tạo mô chồi Trinh nữ Hoàng Cung lymphocyte activating factor in crinum latifolium (L.) aqueous extracts Experimental Pathology and Parasitology Bulgarian Academy of Sciences Số 3, 21-26 Lê Thị Vân Anh - Lớp 98 - 02 CNSH 29 Nghiên cứu số điều kiện tạo mô chồi Trinh nữ Hoàng Cung Phụ lục Môi trờng MS ( Murashige T and Skoog F , 1962) Các nguyên tố vi lợng CoCl.2 H2O 0.025mg/l CuSO4.5H2O 0.025 FeNaEDTA 36.70 H3BO3 6.20 KI 0.83 MnSO4.H2O 16.90 Na2MoO4.2H2O 0.25 ZnSO4.7H2O 8.60 Các nguyên tố đa lợng CaCl2 332.02mg/l KH2PO4 170.00 KNO3 1900.00 MgSO4 180.54 NH4NO3 1650.00 4302.09mg/l Vitamin Glycin Myo-inositol 2.00mg/l 100.00 axit nicotinic 0.50 Pyridoxine HCl 0.50 Thiamine HCl 0.10 4405.19mg/l Lê Thị Vân Anh - Lớp 98 - 02 CNSH 30 Nghiên cứu số điều kiện tạo mô chồi Trinh nữ Hoàng Cung Lê Thị Vân Anh - Lớp 98 - 02 CNSH 31 [...]... Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) = Số mẫu tạo mô sẹo Số mẫu sống Lê Thị Vân Anh - Lớp 98 - 02 CNSH x 100 39 Nghiên cứu một số điều kiện tạo mô và chồi ở cây Trinh nữ Hoàng Cung Tỷ lệ tái sinh cây (%) = Số mô sẹo tạo chồi Số mô sẹo cấy Trung bình số chồi trên mỗi mô Lê Thị Vân Anh - Lớp 98 - 02 CNSH = x 100 Tổng số chồi Số mô sẹo tạo chồi 40 Nghiên cứu một số điều kiện tạo mô và chồi ở cây Trinh nữ Hoàng Cung Phần... củ cây Trinh nữ Hoàng Cung Vì vậy, trong đề tài này chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số điều kiện tạo mô sẹo và chồi ở cây Trinh nữ Hoàng Cung góp phần bớc đầu vào Lê Thị Vân Anh - Lớp 98 - 02 CNSH 36 Nghiên cứu một số điều kiện tạo mô và chồi ở cây Trinh nữ Hoàng Cung việc nhân nhanh cây Trinh nữ Hoàng Cung nhằm so sánh hiệu quả giữa hai phơng pháp, tạo nguồn nguyên liệu rồi rào đáp ứng nhu cầu cây. .. cho mô sẹo sinh trởng chậm, mô khô chắc và PTM7 (bổ sung 2mg/lNAA + 2mg/l BAP) cho mô sẹo sinh trởng nhanh, mô xốp Hình 3 Hình thái và đặc điểm của mô sẹo cây TNHC ở các môi trờng khác nhau: Trái- môi trờng PTM7; phải- môi trờng PTM3 Lê Thị Vân Anh - Lớp 98 - 02 CNSH 19 Nghiên cứu một số điều kiện tạo mô và chồi ở cây Trinh nữ Hoàng Cung Hình 4 Mô sẹo cây TNHC trên môi trờng sinh trởng và phát triển mô. .. năng mô sẹo lục hoá tốt nhất (100%) Lê Thị Vân Anh - Lớp 98 - 02 CNSH 21 Nghiên cứu một số điều kiện tạo mô và chồi ở cây Trinh nữ Hoàng Cung Hình 5 Sự phân hoá của mô TNHC trên môi trờng có nồng độ cytokinin khác nhau: Trái - Lục hoá (TC7); phải - Tạo rễ (TC3 4.5 Nghiên cứu ảnh hởng của nớc dừa đến khả năng phân hoá và tạo chồi của cây Trinh nữ Hoàng Cung Theo nghiên cứu của một số tác giả trong và. .. mô [12] Lê Thị Vân Anh - Lớp 98 - 02 CNSH 33 Nghiên cứu một số điều kiện tạo mô và chồi ở cây Trinh nữ Hoàng Cung Nuôi cấy mô sẹo đợc ứng dụng chủ yếu để thu nhận sinh khối, tạo nguồn nguyên liệu ban đầu cho các nghiên cứu chọn, tạo và nhân nhanh giống cây trồng 2.2.4.2 Tái sinh cây từ mô sẹo Từ các khối mô sẹo có thể đa vào môi trờng nhân sinh khối thu lợng lớn mô sẹo Tuy nhiên khả năng tái sinh cây. .. đợc nuôi cấy trên môi trờng tạo mô sẹo (hình 1) Kết quả khử trùng đợc trình bày ở bảng 1 Lê Thị Vân Anh - Lớp 98 - 02 CNSH 41 Nghiên cứu một số điều kiện tạo mô và chồi ở cây Trinh nữ Hoàng Cung Hình 1 Mảnh lá cây TNHC cấy trên môi trờng tạo mô sẹo Bảng 1 ảnh hởng của các chế độ khử trùng đối với mẫu lá cây Trinh nữ Hoàng Cung Chế độ Cồn 70% HgCl2 0,1% Tỷ lệ nhiễm Tỷ lệ chết Tỷ lệ sống 1 2 3 4 5 (giây)... về nuôi cấy mô tế bào thực vật Lê Thị Vân Anh - Lớp 98 - 02 CNSH 31 Nghiên cứu một số điều kiện tạo mô và chồi ở cây Trinh nữ Hoàng Cung Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã thành công với hàng loạt các cây trông nh : cây ăn quả, cây lơng thực, cây công nghiệp, cây thuốc, cây hoa, cây cảnh, cây rừng và các loại cây quý hiếm có giá trị cao Kỹ thuật nhân nhanh in vitro cây cà phê bằng tạo phôi vô... 37 Nghiên cứu một số điều kiện tạo mô và chồi ở cây Trinh nữ Hoàng Cung Phần iii vật liệu và phơng pháp nghiên cứu 3.1 Vật liệu nghiên cứu: vật liệu sử dụng trong nghiên cứu là cây Trinh nữ Hoàng Cung (Crinum latifolium L.) thuộc họ Thuỷ tiên (Amarryllidaceae) do phòng Di truyền tế bào thực vật - Viện Công nghệ sinh học - Trung tâm Khoa học tự nhiên & Công nghệ Quốc gia cung cấp 3.2 Phơng pháp nghiên. .. nhỏ li ti, màu trắng tuyết rồi mô sẹo chuyển dần sang màu vàng trắng (hình 2), (hình 3) Kết quả về ảnh hởng của auxin lên thời gian và tỷ lệ tạo mô sẹo đợc trình bày ở bảng 2 Lê Thị Vân Anh - Lớp 98 - 02 CNSH 44 Nghiên cứu một số điều kiện tạo mô và chồi ở cây Trinh nữ Hoàng Cung Hình 2: Mô sẹo bắt đầu hình thành từ lá cây TNHC Bảng 2 ảnh hởng của Auxin lên tỷ lệ tạo mô sẹo sau 7, 9, 12 ngày Công thức... nghiên cứu khả năng phân hoá từ mô sẹo Trinh nữ Hoàng Cung trên môi trờng MS cải tiến + 10% nớc dừa + 0,8% agar + 2% đờng sucrose + 0,1% than hoạt tính + 0,2mg/l/l NAA + tổ hợp hợp BAP và kinetin ở các nồng độ khác nhau Kết quả đợc trình bày ở bảng 5 Lê Thị Vân Anh - Lớp 98 - 02 CNSH 20 Nghiên cứu một số điều kiện tạo mô và chồi ở cây Trinh nữ Hoàng Cung Bảng 5 ảnh hởng của nồng độ Kinetin và BAP lên ... 23 Nghiên cứu số điều kiện tạo mô chồi Trinh nữ Hoàng Cung Hình Chồi tái sinh từ mô sẹo TNHC môi trờng TC12 Lê Thị Vân Anh - Lớp 98 - 02 CNSH 24 Nghiên cứu số điều kiện tạo mô chồi Trinh nữ Hoàng. . .Nghiên cứu số điều kiện tạo mô chồi Trinh nữ Hoàng Cung Phần ii: Tổng quan tài liệu 2.1 Cây Trinh nữ Hoàng Cung 2.1.1 Đại cơng Trinh nữ Hoàng Cung 2.1.2 Giá trị dợc lý Trinh nữ Hoàng Cung. .. củ Trinh nữ Hoàng Cung Vì vậy, đề tài tiến hành nghiên cứu số điều kiện tạo mô sẹo chồi Trinh nữ Hoàng Cung góp phần bớc đầu vào Lê Thị Vân Anh - Lớp 98 - 02 CNSH 36 Nghiên cứu số điều kiện tạo