P NGUYÊN ĐẠI HỌC THÁI TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - - NGUYỄN ĐỨC VỊNH Tên đề tài: PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN CỦA GEN CHỊU HẠN GmCHS7 TRONG CÁC DÒNG NGÔ CHUYỂN GEN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2010 - 2014 Thái Nguyên, 2014 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - - NGUYỄN ĐỨC VỊNH Tên đề tài: PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN CỦA GEN CHỊU HẠN GmCHS7 TRONG CÁC DÒNG NGÔ CHUYỂN GEN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH – CNTP Khóa học : 2010 – 2014 Người hướng dẫn : PGS.TS Nguyễn Văn Đồng Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam TS Nguyễn Văn Duy Khoa CNSH - CNTP - ĐH Nông Lâm Thái Nguyên Thái Nguyên, 2014 LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu trường, toàn thể Thầy Cô Khoa Công Nghệ Sinh Học Công Nghệ Thực Phẩm Trường Đại học Nông Lâm - Thái Nguyên tạo điều kiện học tập tốt suốt trình học trường Đồng thời, định hướng xếp cho Em thực tập tốt nghiệp Viện Di truyền Nông Nghiệp Việt Nam để hoàn thiện chương trình học, củng cố kiến thức hoàn thành Khóa luận tốt nghiệp Đại học PGS.TS Nguyễn Văn Đồng giám đốc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công nghệ Tế bào thực vật Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để Em thực tập tốt nghiệp Phòng hoàn thành Khóa luận tốt nghiệp Đồng thời Em xin gửi lời cảm ơn tới anh Nguyễn Hữu Kiên, anh Lương Thanh Quang, anh Dương Tuấn Bảo toàn thể nhân viên, học viên nghiên cứu Phòng tận tình giúp đỡ bảo em trình thực tập Thầy giáo, giáo viên hướng dẫn TS Nguyễn Văn Duy giúp em định hướng, hướng dẫn giúp đỡ em hoàn thành Kháo luận tốt nghiệp Em xin cảm ơn đến toàn thể bạn bè, người thân, gia đình bên cạnh cổ vũ tinh thần, động viên khích lệ Em học tập hoàn thành Khóa luận tốt nghiệp Thái Nguyên, ngày…tháng…năm 2014 Sinh viên NGUYỄN ĐỨC VỊNH DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Giá trị dinh dưỡng ngô Bảng 2.2 Tình hình sản xuất ngô số nước đứng đầu giới từ năm 2004 - 20112 .8 Bảng 2.3 Tình hình sản xuất ngô năm gần .9 Bảng 2.4 Dự kiến diện tích, suất sản lượng ngô nước đến năm 2020 10 Bảng 3.1 Danh sách dòng ngô sử dụng nghiên cứu, đánh giá 19 Bảng 3.2 Các hóa chất sử dụng kĩ thuật lai Shouthern blot 20 Bảng 3.3 Trình tự mồi phân tích PCR 23 Bảng 3.4 Sơ đồ thí nghiệm đánh giá khả kháng hạn ngô chuyển gen GmCHS7 giai đoạn .24 Bảng 4.1 Kết PCR gen GmCHS7 dòng T0 30 Bảng 4.2 Kết đo chiều cao trung bình dòng ngô chuyển gen .32 hệ T1 lần thứ 32 Bảng 4.3 Kết đo chiều cao trung bình dòng ngô chuyển gen đối chứng lô số (tưới nước đầy đủ) 33 Bảng 4.4 Kết đo chiều cao trung bình dòng ngô chuyển gen sau xử lý hạn lần lần 35 Bảng 4.5 Các lựa chọn dòng để tiến hành phân tích Southern Blot 37 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 4.1 Kết điện di kiểm tra DNA tổng số dòng ngô nghiên cứu 28 Hình 4.2 Kết điện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt gen GmCHS7 hệ T0 29 Hình 4.3 Kết điện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt gen GmCHS7 dòng ngô chuyển gen hệ T1 31 Hình 4.4 Biểu đồ so sánh chiều cao trung bình dòng ngô chuyển gen đối chứng lô số tưới nước đầy đủ 34 Hình 4.5 Biểu đồ so sánh chiều cao trung bình dòng ngô chuyển gen .35 Hình 4.6 Kết lai Southern Blot sản phẩm cắt gen GmCHS7 với mẫu dò tương ứng từ dòng ngô chuyển gen hệ T1 .37 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CNSH : Công nghệ sinh học CTAB : Cetyltrimethylammonium Bromide DNA : Deoxyribonucleic Acid ĐC : Đối chứng GFP : Green Fluorescent Protein GMO : Genetically Modified Organism GMC : Genetically Modified Corn OD : Optical Density PCR : Polymerase Chain Reaction RNA : Ribonucleic Acid TB : Trung bình TGST : Thời gian sinh trưởng PEG : Polyetylenglycol TCN : Trước Công nguyên LEA : Late embryogenesis abundant MỤC LỤC Trang Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài .2 1.3 Yêu cầu đề tài 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài .3 Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung ngô 2.1.1 Nguồn gốc phân loại 2.1.2 Giá trị ngô 2.1.3 Đặc điểm thực vật ngô 2.1.4 Đặc tính sinh học giống ngô .6 2.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất ngô giới Việt Nam .8 2.2.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất ngô giới 2.2.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất ngô Việt Nam 2.2.3 Tình hình nghiên cứu sản xuất ngô chuyển gen giới Việt Nam 10 2.3 Các phương pháp chuyển gen thực vật 12 2.3.1 Phương pháp chuyển gen trực tiếp 12 2.3.1.1 Chuyển gen súng bắn gen 12 2.3.1.2 Chuyển gen xung điện 12 2.3.1.3 Chuyển gen PEG (Polyetylenglycol) 13 2.3.1.4 Chuyển gen phương pháp vi tiêm .13 2.3.2 Phương pháp chuyển gen gián tiếp 13 2.3.2.1 Chuyển gen thông qua virus .13 2.3.2.2 Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium 14 2.4 Tổng quan tính chịu hạn trồng gen chịu hạn GmCHS .15 2.4.1 Tính chịu hạn trồng tiêu đánh giá tính chịu hạn .15 2.4.1.1 Tính chịu hạn trồng 15 2.4.1.2 Các hình thức chịu hạn trồng 16 2.4.1.3 Các tiêu đánh giá tính chịu hạn trồng .16 2.4.2 Tổng quan gen chịu hạn GmCHS 17 Phần 19 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .19 3.1 Vật liệu nghiên cứu 19 3.1.1 Vật liệu thực vật 19 3.1.2 Hóa chất dụng cụ thí nghiệm 19 3.1.2.1 Hóa chất .19 3.1.2.2 Thiết bị thí nghiệm .21 3.2 Phạm vi, địa điểm thời gian nghiên cứu 21 3.2.1 Phạm vi nghiên cứu 21 3.2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 21 3.3 Nội dung nghiên cứu 21 3.4 Phương pháp nghiên cứu 21 3.4.1 Phân tích đánh giá có mặt gen GmCHS7 số dòng ngô sau chuyển gen phương pháp PCR 21 3.4.2 Phân tích biểu khả kháng hạn dòng ngô chuyển gen GmCHS7 giai đoạn 24 3.4.3 Phân tích đánh giá có mặt gen GmCHS7 dòng ngô sau chuyển gen phương pháp Southern blot 25 3.5 Phương pháp xử lý số liệu 27 Phần 28 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1 Kết Phân tích đánh giá có mặt gen GmCHS7 số dòng ngô sau chuyển gen phương pháp PCR 28 4.1.1 Kết tách chiết DNA tổng số .28 4.1.2 Kết phân tích có mặt gen GmCHS7 dòng ngô chuyển gen phương pháp PCR 29 4.2 Đánh giá khả kháng hạn ngô chuyển gen giai đoạn .31 4.2.1 Kết PCR kiểm tra có mặt gen chuyển GmCHS7 dòng ngô hệ T1 31 4.2.2 Kết đánh giá khả chịu hạn hệ T1 thông qua tiêu đo chiều cao điều kiện hạn .32 4.3 Kết phân tích, đánh giá có mặt gen GmCHS7 dòng ngô chuyển gen hệ T1 phương pháp lai Southern Blot 36 Phần 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 5.1 Kết luận 39 5.2 Kiến nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 I Tài liệu tiếng Việt 40 II Tài liệu tiếng Anh 41 Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cây ngô có tên khoa học Zea mays L., thuộc chi Maydeae, họ Graminaae, năm loại lương thực giới (ngô, lúa nước, lúa mì, sắn khoai tây) [3] Cây ngô biết đến từ kỷ 16 Columbus mang hạt giống từ châu Mỹ về, sau sản xuất ngô trở nên phổ biến khắp giới trở thành loại ngũ cốc quan trọng cung cấp lương thực cho người, cung cấp nguyên liệu chế biến thức ăn chăn nuôi[11] Sản lượng sản xuất ngô giới trung bình hàng năm từ 713,6 đến 789,8 triệu (năm 2005-2007) Trong nước Mỹ sản xuất 40,62% tổng sản lượng ngô lại 59,38% nước khác sản xuất Sản lượng ngô xuất giới trung bình hàng năm từ 82,6 đến 86,7 triệu Trong đó, Mỹ xuất 64,41 % tổng sản lượng nước khác chiếm 35,59 % [21] Ở Việt Nam ngô loại lương thực quan trọng thứ hai sau lúa, có phát triển rộng khắp, liên tục đạt đỉnh điểm năm 2005 Theo số liệu thống kê sản xuất ngô năm 2005 có tiến vượt bậc: Diện tích đạt 1039 nghìn ha, suất đạt 35,5 tạ/ha sản lượng đạt 3,69 triệu tấn, làm thay đổi tỉ trọng cấu sản lượng lương thực từ 5,7% năm 2000 lên 9% năm 2005 [1] Đến năm 2009 diện tích gieo trồng ngô tăng mạnh vượt ngưỡng triệu so với năm 1960 200 nghìn [2] So với nước có nông nghiệp phát triển suất ngô nước ta thuộc loại thấp số địa phương miền núi vùng sâu, vùng xa tỉnh Lai Châu, Sơn La, Hà Giang, Tuyên Quang, Lạng sơn, Phú Thọ, Thanh Hóa, Quảng Nam, Lâm Đồng… cộng đồng dân tộc người thường sử dụng giống ngô địa phương tập quán canh tác lạc hậu đặc biệt điều kiện khí hậu đất đai khắc nghiệt làm cho suất ngô thấp Đặc biệt hạn hán ảnh hưởng lớn tới sinh tưởng phát triển suất ngô tỉnh vùng cao Việt Nam Hạn hán tình trạng lượng nước tự nhiên thấp mức trung bình thời gian dài diện rộng mang tính khu vực Trong yếu tố bất lợi môi trường, hạn hán ảnh hưởng lớn đến suất trồng toàn giới [20] Hạn hán làm giảm sinh khối thân, suất ngô giới Việt Nam, vùng trồng ngô dựa vào nước tự nhiên Theo Viện 30 đường mang gen GmCHS7 Các đường lại: 7, 8, 9, 11, 13, 14, 15, 16, 18 20 tương ứng không xuất sản phẩm PCR, trùng hợp với đối chứng âm chứng tỏ dòng không mang gen chuyển GmCHS7 Kết chi thiết thể bảng 4.1: Bảng 4.1 Kết PCR gen GmCHS7 dòng T0 TT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Tên dòng CM8.ZC.1 CM8.ZC.5 CM8.ZC.6 CM8.ZC.12 CH9.ZC.3 CH9.ZC.10 CH9.ZC.25 CH9.ZC.26 CH9.ZC.27 VH1.ZC.1 VH1.ZC.2 VH1.ZC.4 VH1.ZC.5 VH1.15 VN106.ZC VN106.ZC.5 H9C8bc2.ZC.10 H9C8bc2.ZC.11 H9C8bc2.ZC.12 H9C8bc2.ZC.13 Dương tính + + + + + + Âm tính + + + + - (+): Mang gen GmCHS7; (-) Không mang gen GmCHS7 31 4.2 Đánh giá khả kháng hạn ngô chuyển gen giai đoạn 4.2.1 Kết PCR kiểm tra có mặt gen chuyển GmCHS7 dòng ngô hệ T1 Hạt dòng ngô hệ T0 có kết dương tính kiểm tra PCR (CM8.ZC.1, CM8.ZC.2, Vh1.ZC.1, Vh1.ZC.2) dòng gốc CM8, VH1 tạo chúng, lựa chọn ngẫu nhiên đưa vào gieo trồng để tiến hành đánh giá mức độ biểu dòng ngô chuyển gen đặc tính nông sinh học dòng ngô hệ T1 Các dòng ngô chuyển gen hệ T1 lấy mẫu ngẫu nhiên để tiến hành kiểm tra có mặt gen chuyển phương pháp PCR lần trước tiến hành thí nghiệm đánh giá mẫu dòng ngô chuyển gen GmCHS7 hệ T1 đưa vào đánh giá phương pháp PCR kết thể hình 4.3 đây: Hình 4.3 Kết điện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt gen GmCHS7 dòng ngô chuyển gen hệ T1 M: thang chuẩn DNA 1kp (Fermentas); (+): Plasmid CHS7; (-): H2O; đường chạy từ đến 16 tương ứng với dòng ngô chuyển gen hệ T1: C1:Vh1.1 (đối chứng); C2: C8H9 (đối chứng); Hình 4.3 cho thấy, đường chạy số đến 13 ứng với dòng: CM8.ZC.1.1, CM8.ZC.1.3, CM8.ZC.1.8, CM8.ZC.1.10, CM8.ZC.2.1, CM8.ZC.2.2, CM8.ZC.2.7, CM8.ZC.2.9, Vh1.ZC.1.1, Vh1.ZC.2.1, Vh1.ZC.2.5, VH1.ZC.2.8, VH1.ZC.2.9 đường chạy số 15 ứng với dòng Vh.ZC.2.10 xuất băng DNA rõ nét có kích thước 882bp tương ứng với kích thước sản phẩm PCR khuếch đại theo lý thuyết chứng tỏ dòng mang gen GmCHS7 Các dòng 14 16 (Vh1.ZC.2.2, Vh1.ZC.2.7) không xuất sản phẩm tương tự với mẫu đối chứng C1, C2 ứng với dòng CM8 VH1 không mang gen chứng tỏ mẫu không mang gen chuyển 32 4.2.2 Kết đánh giá khả chịu hạn hệ T1 thông qua tiêu đo chiều cao điều kiện hạn Trước đưa dòng ngô chuyển gen hệ T1 đối chứng vào xử lý hạn, dòng ngô chuyển gen tiến hành đo chiều cao giai đoạn có từ 4-6 thật (sau 12 ngày tính từ bắt đầu nhô lên khỏi mặt đất) Kết lần đo thứ trình bày bảng 4.2 Bảng 4.2 Kết đo chiều cao trung bình dòng ngô chuyển gen hệ T1 lần thứ (Đơn vị: cm) Chiều cao TB lần đo thứ TT Tên dòng CM8.1.1 12,5 CM8.ZC.1.1 12,6 CM8.ZC.2.1 12,5 Vh1.1.1 12,8 Vh1.ZC.1.1 12,7 Vh1.ZC.2.1 12,7 CM8.2.1 12,3 CM8.ZC.1.2 12,4 CM8.ZC.2.2 12,6 10 Vh1.2.1 12,4 11 Vh1.ZC.1.2 12,7 12 Vh1.ZC.2.2 12,6 Các dòng CM8.1.1, CM8.2.1, Vh1.1.1 Vh1.2.1 dòng đối chứng không chuyển gen, dòng lại dòng ngô chuyển gen chịu hạn GmCHS7 Từ số liệu bảng 4.2 cho thấy chiều cao trung bình dòng dao động khoảng 12,3 cm (CM8.2) đến 12,8 cm (Vh1.1), tập chung chủ yếu có chiều cao 12,5cm đến 12,7 cm Kết khẳng định giai đoạn ngô có 4-6 thật điều kiện tưới nước đầy đủ tất dòng ngô 33 chuyển gen có chiều cao tương đối đồng khác biệt đáng kể so với dòng không chuyển gen tương ứng Do dòng ngô chuyển gen hệ T1 đủ điều kiện để tiếp tục thực thí nghiệm khả chống chịu hạn dòng ngô chuyển gen dòng ngô không chuyển gen Để so sánh khả chống chịu hạn chuyển gen so với đối chứng (chiều cao – cm) giai đoạn 20 ngày 31 ngày tính từ nhô khỏi mặt đất Do thời gian thực tập có hạn nên thực đánh giá khả chịu hạn ngô giai đoạn đoạn sinh trưởng sinh dưỡng (1-40 ngày sau nảy mầm) Kết thể bảng 4.3 hình 4.4 Các dòng ngô chuyển gen xử lý hạn lần thứ lần thứ với kết trình bày bảng 4.3: Bảng 4.3 Kết đo chiều cao trung bình dòng ngô chuyển gen đối chứng lô số (tưới nước đầy đủ) Chiều cao (cm) TT Tên dòng Sau 20 ngày Sau 31 ngày CM8.1 14,9 17,0 CM8.ZC.1.1 15,2 17,3 CM8.ZC.2.1 15,1 17,3 Vh1.1 14,9 16,9 Vh1.ZC.1.1 15,2 16,9 Vh1.ZC.2.1 15,2 17,1 Các dòng CM8.1.1, Vh1.1.1 dòng đối chứng không chuyển gen, dòng lại dòng ngô chuyển gen chịu hạn GmCHS7 34 Hình 4.4 Biểu đồ so sánh chiều cao trung bình dòng ngô chuyển gen đối chứng lô số tưới nước đầy đủ Dòng CM8.1.1 (cột màu đỏ) Vh1.1.1(cột màu vàng) dòng đối chứng không chuyển gen, dòng lại dòng chuyển gen GmCHS7 Bảng 4.3 hình 4.4 cho thấy, sau 20 ngày 31 ngày tưới nước đầy đủ, chiều cao trung bình dòng chuyển gen Vh1.ZC có chiều cao trung bình 15,2 cm 17,0 cm cao so với dòng không chuyển gen tương ứng (dòng Vh1.1.1) Tương tự, dòng chuyển gen CM8.ZC có chiều cao trung bình 15,15 cm 17,30 cm sau 20 ngày 31 ngày tưới nước đầy đủ Chiều cao trung bình dòng chuyển gen cao so với dòng không chuyển gen tương ứng dòng CM8.1.1 Kết theo dõi cho phép khẳng định, điều kiện tưới nước đầy đủ, dòng ngô chuyển gen kháng hạn thể sinh trưởng, phát triển tốt chiều cao so với dòng không chuyển gen khác biệt không đáng kể 35 Song song với thí nghiệm trên, bố trí lô thí nghiệm so sánh khả sinh trưởng chuyển gen với đối chứng sau xử lý hạn nhân tạo lần lần tương ứng với giai đoạn sau 20 ngày 31 ngày tính từ bắt đầu nhô khỏi mặt đất Kết thể bảng 4.3 biểu đồ hình 4.5 Bảng 4.4 Kết đo chiều cao trung bình dòng ngô chuyển gen sau xử lý hạn lần lần TT Tên dòng Chiều cao (cm) Sau xử lý hạn lần 13,8 Sau xử lý hạn lần 15,2 CM8.2.2 CM8.ZC.1.2 14,8 16,8 CM8.ZC.2.2 14,7 16,8 Vh1.2.2 13,6 15,0 Vh1.ZC.1.2 14,7 16,5 Vh1.ZC.2.2 14,8 16,7 Dòng CM8.2.2 Vh1.2.2 dòng ngô đối chứng không chuyển gen, dòng lại dòng ngô chuyển gen GmCHS7 Hình 4.5 Biểu đồ so sánh chiều cao trung bình dòng ngô chuyển gen đối chứng qua giai đoạn xử lý hạn Dòng CM8.2.2 Vh1.2.2 dòng đối chứng không chuyển gen, dòng lại dòng chuyển gen chịu hạn GmCHS7 36 Bảng 4.4 hình 4.5 cho thấy, sau xử lý hạn lần lần 2, chiều cao trung bình dòng chuyển gen Vh1.ZC có chiều cao trung bình 14,75 cm 16,60 cm cao so với dòng không chuyển gen tương ứng (dòng Vh1.2.2) có chiều cao trung bình 13,60 cm 15,0cm Tương tự, dòng chuyển gen CM8.ZC có chiều cao trung bình 14,75 cm 16,80 cm sau đợt xử lý hạn Chiều cao trung bình dòng chuyển gen cao so với dòng không chuyển gen tương ứng dòng CM8.1.1 qua lần xử lý hạn 13,80 cm 15,20 cm Kết theo dõi cho phép khẳng định, điều kiện hạn, dòng ngô chuyển gen kháng hạn GmCHS7 thể sinh trưởng, phát triển tốt hẳn chiều cao so với dòng không chuyển gen tương ứng Từ kết đánh giá khả chịu hạn hệ T1 thông qua tiêu đo chiều cao điều kiện hạn giai đoạn thí nghiệm cho thấy: - Gen chịu hạn GmCHS7 trì tồn tiếp tục biểu dòng ngô chuyển gen hệ T1, gen biểu giúp dòng ngô chuyển gen sống phát triển tốt chiều cao so với dòng ngô gốc ban đầu điều kiện hạn Đồng thời khẳng định gen chuyển nằm hệ genome dòng ngô không làm ảnh hưởng tới trình sinh trưởng phát triển bình thường dòng ngô điều kiện nước tưới đầy đủ so với dòng ngô gốc không chuyển gen - Khẳng định thành công việc đưa gen chịu hạn GmCHS7 dòng ngô CM8 Vh1 Sự thành công bước đầu có ý nghĩa lớn nghiên cứu tai tương lai 4.3 Kết phân tích, đánh giá có mặt gen GmCHS7 dòng ngô chuyển gen hệ T1 phương pháp lai Southern Blot Các dòng ngô hệ T0 mang gen GmCHS7 đánh giá bước đầu phương pháp PCR, tiếp tục chăm sóc, thu hạt gieo trồng lặp lại hệ T1 Để xác định vị trí số copy gen GmCHS7 vào hệ genome cá dòng ngô chuyển gen, dòng ngô mang gen hệ T1 tiến hành lấy mẫu tách chiết ADN tổng số để tiến hành phân tích kĩ thuật lai Southern Blot với mẫu dò DIG 37 Bảng 4.5 Các lựa chọn dòng để tiến hành phân tích Southern Blot TT Tên Âm tính Dương tính CM8.ZC.1.3 + CM8.ZC.2.1 + CM8.ZC.2.2 + Vh1.ZC.1.1 + Vh1.ZC.1.5 + Vh1.ZC.2.2 + CM8.1.1 Vh1.1.1 C: Đối chứng âm; (+) Kết dương tính với PCR; (-) Kết âm tính với PCR DNA tổng số mẫu lấy từ bảng 4.5 cắt Enzyme giới hạn EcoRI Trong thiết kế vector chuyển gen, vector pZY101 ASC 35S: GmCHS7 mang gen GmCHS7 có vị trí cắt enzyme cắt giới hạn EcoRI trình tự gen GmCHS7 vị trí nhận biết enzyme Do đề tài nghiên cứu enzyme EcoRI sử dụng để cắt đoạn DNA mang gen GmCHS7 từ DNA tổng số ngô Kết lai Southern Blot trình bày hình 4.7 Hình 4.6 Kết lai Southern Blot sản phẩm cắt gen GmCHS7 với mẫu dò tương ứng từ dòng ngô chuyển gen hệ T1 Đường chạy M: Thang chuẩn DIG-labell Marker III; P: Platsmid CHS7; đường chạy từ đến mẫu: CM8.ZC.1.3, CM8.ZC.2.1, CM8.ZC.2.2, Vh1.ZC.1.1, Vh1.ZC.1.5 Vh1.ZC.2.2; đường chạy 7, mẫu CM8.1.1 Vh1.1.1 không chuyển gen 38 Hình 4.7 cho thấy, đường chạy số (dòng Vh1.ZC.1.5 ) (dòng Vh1.ZC.2.2) xuất tín hiệu lai vị trí khoảng 23100bp 2800bp kết luận có copy gen chuyển GmCHS7 hệ genome mẫu Vh1.ZC.1.5 Vh1.ZC.2.2 Đường chạy số (dòng CM8.ZC.2.2) số 4(dòng Vh1.ZC.1.1) xuất tín hiệu lai vị trí khoảng 23100bp kết luận dòng có copy gen GmCHS7 hệ genome Đường chạy số (dòng CM8.ZC.2.1) xuất tín hiệu lai không rõ ràng vị trí khoảng 23100bp, để kết luận xác cần phải thực lặp lại thí nghiệm dòng Các đường chạy lại: số (dòng CM8.ZC.1.3) không xuất tín hiệu lai tương tự đường chạy (2 dòng đối chứng CM8.1.1 Vh1.1.1 không chuyển gen) kết luận dòng tồn gen chuyển GmCHS7 hệ gen Trong trình tiến hành Southern bot chưa tối ưu hoàn toàn môi trường thời gian cắt Enzym cắt giới hạn nên đoạn DNA cắt không hoàn toàn tín hiệu lai xuất đoạn DNA có kích thước lớn Để khắc phục cần tối ưu hóa hoàn toàn môi trường thời gian cắt Enzyme giới hạn 39 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu thu được, đưa kết luận sau: Đã kiểm tra có mặt gen chịu hạn GmCHS7 20 dòng ngô chuyển gen hệ T0 phương pháp PCR Kết cho thấy 10/20 dòng ngô chuyển gen cho kết dương tính với gen chuyển GmCHS7 Chứng tỏ 10 dòng ngô chuyển gen cho kết dương tính mang gen chuyển GmCHS7 Từ dòng ngô cho kết dương tính với phản ứng PCR hệ T0 chọn ngẫu nhiên dòng để tiến hành gieo hạt để tạo T1 Kiểm tra có mặt gen chuyển GmCHS7 dòng hệ T1 phương pháp PCR cho thấy tất các dòng đem phân tích cho kết dương tính Dựa kết PCR hệ T1, Các mẫu tiếp tục tiến hành phân tích lai Southern Blot để khẳng định có mặt gen chuyển GmCHS7 dòng ngô chuyển gen hệ T1 Kết cho thấy dòng ngô chuyển gen xuất tín hiệu lai gen GmCHS7 mẫu dò, dòng xuất tín hiệu lai không rõ ràng cần phải tiến hành lặp lại thí nghiệm để có kết luận xác dòng nong lại không xuất tín hiệu lai Do quy trình Southern Blot chưa tối ưu nên xác định số đoạn T-DNA chèn vào hệ gen ngô dòng phân tích 5.2 Kiến nghị Tiếp tục đánh giá lại dòng ngô chuyển gen hệ T1 chưa đánh giá có mặt gen GmCHS7 phương pháp PCR để làm sở cho phân tích chuyển gen sau Không dừng lại đánh giá sinh trưởng phát triển dòng ngô chuyển gen thông qua tiêu đo chiều cao Cần mở rộng thêm phương pháp đánh giá đồng ruộng, phòng thí nghiệm để đánh giá sinh trưởng phát triển dòng ngô chuyển gen Tiếp tục tiến hành tối ưu phân tích Southern Blot để khẳng định chuyển gen GmCHS7 xác định số đoạn chèn gen vào hệ gen dòng ngô 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng Việt Báo cáo khoa học Hội nghị khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc 2013.Quyển Công nghệ sinh học Vi sinh, Công nghệ sinh học Thực vật.Nxb Khoa học tự nhiên Công nghệ Báo cáo “Định hướng giải pháp phát triển ngô vụ đông vụ xuân tỉnh phía bắc” - Bộ Nông Nghiệp Phát Triển Nông Thôn, cục Trồng Trọt, 2011 Bùi Mạnh Cường (2007) Công nghệ sinh học chọn tạo giống Ngô Nxb Nông Nghiệp Đường Hồng Dật (2000), “Cây ngô kỹ thuật thâm canh suất”, Nxb Lao Đông - Xã Hội” Trần Quốc Dung, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ (2006), Công nghệ chuyển gen (động vật, thực vật), Nxb ĐH Huế, Huế Cao Điểm Đắc (1988), Cây ngô, Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội Đào Xuân Học (chủ biên) (2002) Hạn hán giải pháp giảm thiệt hại Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Hoàng Thị Sản (2009), Phân loại học thực vật, Nxb Giáo Dục Quyết định số 11/2006/QĐ-TTg việc phê duyệt "chương trình trọng điểm phát triển ứng dụng công nghệ sinh học lĩnh vực nông nghiệp phát triển nông thôn đến năm 2020" 10 Nguyễn Đức Thành (2003), Chuyển gen thực vật, Nxb KHKT, Hà Nội 11 Ngô Hữu Tình, Trần Hồng Uy, Bùi Mạnh Cường, Võ Đình Long, Lê Quý Kha, Nguyễn Thế Hùng (1997) Cây ngô, nguồn gốc, đa dạng di truyền trình phát triển.Nxb Nông nghiệp 12 Ngô Hữu Tình (2003), “Cây ngô”, Nxb Nghệ An 13 Ngô Hữu Tình (2009), Chọn lọc lai tạo giống ngô, Nxb Nông nghiệp 14 Tổng cục thống kê (2010), Niên giám thống kê 2010, Nhà xuất thống kê Hà Nội, 2011 15 Viện Nghiên cứu Ngô (2009), Chiến lược phát triển ngô đến năm 2020 41 II Tài liệu tiếng Anh 16 A decade of EU-funded GMO research (2001-2010) (PDF) Directorate-General for Research and Innovation Biotechnologies, Agriculture, Food European Union 2010 doi:10.2777/97784 ISBN 978-92-79-16344-9 17 “Agrobacterium T-DNA integration: molecules and models” Tzvi Tzfira, Jianxiong Li, Benoı ˆt Lacroix and Vitaly Citovsky 2004, Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York 18 Bravo Angel A M., Hohn B., Tinland B (1998), “The omega sequence of vir D2 is important but not essential for efficient of the T-DNA by Agrobacterium tumefaciens”, Molecular Plant Microbe Interactions, 11, pp 57- 63 19 Clough, S.J., Tuteja, J.H., Li, M., Marek, L.F., Shoemaker, R.C., and Vodkin, L.O (2004) Features of a 103-kb gene-rich region in soybean include an inverted perfect repeat cluster of CHS genes comprising the I locus Genome47: 819-831 20 Environment J S Boyer (1982) “Plant Productivity and Environment Science” 21 FAOSTAT (2014) 22 Fromm, M., Taylor, L.P., and Walbot, V (1985), “Expression of gene transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation” Proc.Natl.Acad Sci.USA 82: 5824-5828 23 Gopalan, C., Rama Sastri, B.V and Balasubramanian, S.2007 Nutritive Value of Indian Foods, published by National Institute of Nutrition (NIN), ICMR 24 James, C (2011) "ISAAA Brief 43, Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2011" ISAAA Briefs Ithaca, New York: International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications (ISAAA) Retrieved 2012-06-02 25 Kazuo, N., Kazuko, Y.S 2005 Molecular studies on stress-responsive gene expression in Arabidopsis and improvement of stress tolerance in crop plants by regulon biotechnology JARQ39(4): 221- 229 26 Manuela M.C., João P.M., João S.P 2003 Understanding plant response to drought from genes to the whole plant Functional Plant Biology.30:239-264 42 27 McCabe, D.E., Swain, W.F., Martinell, B.J., and Christou, P (1988), “Stable transformation of soybean (Glycine max Merrill) by particle acceleration” Bio/Technol 6: 923-926 28 Napoli, C., Lemieux, C., and Jorgensen, R (1990) Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans Plant Cell 2: 279-289 29 National Academy of Sciences (2001) Transgenic Plants and World Agriculture Washington: National Academy Press 30 Parrott, W.A., Hoffman, L.M., Hildebrand, D.F., Williams and Collin G.B (1989), “Recovery of primary transformation of soybean” Plant Cell 2: 201-204 31 Petit, J.R., Jouzel, J., Raynaud, D., Barkov, N.I., Barnola, J.M., Basile, I., Bender, M., Chappellaz, J., Davis, M., Delaygue, G., Delmotte, M., Kotlyakov, V.M., Legrand, M., Lipenkov, V.Y., Lorius, C., Pespin, L., Ritz, C., Saltzman, E., Stivernard, M 1999 Climate and atmospheric history of the past 420,000 years from the Vostok ice core, Antarctica Nature 399: 429-436 32 Saghai Maroof, M A., K M Soliman, R A Jorgensen, and R W Allard, (1984), “Ribosomal DNA spacer-lengthpolymor phism in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location and population dynamics” Proc Natl Acad Sci USA 81, p.8014 - 8018 33 Senda, M., Masuta, C., Ohnishi, S., Goto, K., Kasai, A., Sano, T., Hong, J.-S., and MacFarlane, S (2004) Patterning of virus-infected soybean seed coat is associated with suppression of endogenous silencing of chalcone synthase genes Plant Cell 16: 807-818 34 TANAKA, Akira; YAMAGUCHI, Junichi (1972), “Dry Matter Production, Yield Components and Grain yield of the Maize Plant” 35 Tasuku, K., Atsushi, K., Makoto, T., Mineo, S 2011 Endogenous RNA interference of chalcone synthase genes in soybean: Formation of doublestranded RNA of GmIRCHS transcripts and structure of the 5′ and 3′ ends of short interfering RNAs Journal of Plant Physiology 168: 1264-1270 43 36 Townsend, J.A., and Thomas, L.A (1993), An improved method of Agrobacterium - mediated transformation of culture soybean cells Patent No WO94/02620 37 Tripayhi K.K, Dr O.P Govila, Dr Ranjini Warrier, Dr Vibha Ahuja, (2011) “BIOLOGY OF ZEA MAYS (MAIZE)”, Department of Biotechnology Ministry of Science & Technology & Ministry of Environment and Forests Govt Indian, 2011 38 Tuteja, J.H., Clough, S.J., Chan, W.C., and Vodkin, L.O (2004) Tissue-specific gene silencing mediated by a naturally occurring chalcone synthase gene cluster in Glycine max Plant Cell 16: 819-835 39 Tuteja, J.H., and Vodkin, L.O (2008) Structural features of the endogenous CHS silencing and target loci in the soybean genome Crop Sci 48:S49-S68 40 Wesseler, J and N Kalaitzandonakes (2011): Present and Future EU GMO policy In Arie Oskam, Gerrit Meesters and Huib Silvis (eds.), EU Policy for Agriculture, Food and Rural Areas Second Edition, Wageningen: Wageningen Academic Publishers 44 PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA MỘT SỐ DÒNG NGÔ CHUYỂN GEN THẾ HỆ T1 Ở GIAI ĐOẠN CÂY CON b Dòng ngô đối chứng a Dòng ngôchuyển gen chịu hạn GmCHS7 Hình 4.8 Một số dòng ngô mang gen xử lý hạn dòng ngô đối chứng tưới nước đầy đủ c Dòng ngô chuyển gen xử lý hạn d Dòng ngô chuyển gen tưới nước đầy đủ Hình 4.9 Một số dòng ngô mang gen chịu hạn xử lý hạn dòng ngô mang gen chịu hạn tưới nước đầy đủ e Dòng ngô chuyển gen xử lý hạn f Dòng ngô đối chứng xử lý hạn Hình 4.10 Một số dòng ngô mang gen đối chứng sau xử lý hạn [...]... trọng trong việc chọn, tạo các giống ngô biến đổi gen ở nước ta Các dòng ngô chuyển gen được tạo ra cần được đánh giá sự có mặt và biểu hiện của gen chuyển với mục đích khẳng định được khả năng chịu hạn so với giống ngô gốc Do vậy chúng tôi nghiên cứu đề tài: Phân tích đánh giá biểu hiện của gen chịu hạn GmCHS7 trong các dòng ngô chuyển gen 1.2 Mục tiêu của đề tài Phân tích và đánh giá sự có mặt của gen. .. Phân tích và đánh giá sự có mặt của gen GmCHS7 trong một số dòng ngô sau chuyển gen bằng phương pháp PCR Nội dung 2: Phân tích và đánh giá sự có mặt của gen GmCHS7 trong các dòng ngô sau chuyển gen bằng phương pháp Southern blot Nội dung 3: Phân tích biểu hiện khả năng kháng hạn của các dòng ngô chuyển gen GmCHS7 ở giai đoạn cây con 3.4 Phương pháp nghiên cứu 3.4.1 Phân tích và đánh giá sự có mặt của. .. đánh giá sự có mặt của gen chịu hạn GmCHS7 trong các dòng ngô chuyển gen bằng phương pháp PCR và Southern blot 3 Đánh giá sự biểu hiện của cây mang gen chịu hạn GmCHS7 ở giai đoạn cây con 1.3 Yêu cầu của đề tài Xác định được sự có mặt của gen chịu hạn GmCHS7 trong các dòng ngô chuyển gen bằng phương pháp PCR và Southern blot Xác định được sử biểu hiện chịu hạn của cây mang gen GmCHS7 ở giai đoạn cây con... được hiện lên dưới dạng các vạch sáng, ảnh điện di được chụp trên máy Bio-Rad với tia UV có bước sóng 312 -365nm 3.4.2 Phân tích biểu hiện khả năng kháng hạn của các dòng ngô chuyển gen GmCHS7 ở giai đoạn cây con Để đánh giá biểu hiện của gen chịu hạn GmCHS7 trong các dòng ngô chuyển gen, các dòng ngô này được tiến hành xử lý hạn để so sánh sự phát triển về chiều cao cây trong điều kiện hạn giữa các dòng. .. chỉnh Ba cây chuyển gen có chứa gen zein kích thước 15kD được hình thành Tuy nhiên, những cây chuyển gen này đều bị khảm và khi phân tích các cây ở thế hệ sau không thấy có một cây nào có chứa gen zein 15kD [30] 15 2.4 Tổng quan về tính chịu hạn của cây trồng và gen chịu hạn GmCHS 2.4.1 Tính chịu hạn của cây trồng và các chỉ tiêu đánh giá tính chịu hạn 2.4.1.1 Tính chịu hạn của cây trồng Hạn hán là... thực tiễn của đề tài - Ý nghĩa khoa học Thông qua kết quả nghiên cứu đề tài, đánh giá được sự có mặt và biểu hiện của gen chuyển GmCHS7 trong các dòng ngô chuyển gen Có được những đánh giá ban đầu về quá trình chuyển gen chịu hạn vào cây ngô Làm cơ sở cung cấp thông tin cho các nghiên cứu tiếp theo - Ý nghĩa thực tiễn Đề tài hoàn thành bước đầu khẳng định những ưu điểm về khả năng chống chịu trong điều... chống chịu trong điều kiện hạn của các dòng ngô chuyển gen so với dòng ngô địa phương, tiến tới đưa vào đánh giá, khảo nghiệm và sản xuất có hiệu quả các dòng ngô chuyển gen kháng hạn trên mọi kiểu hình thời tiết mà vẫn đem lại năng suất cao 4 Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về cây ngô 2.1.1 Nguồn gốc và phân loại Những nghiên cứu về nguồn gốc cây trồng của Vavilov (1926) đã cho rằng... IXUS 115HS) Ngoài ra còn các trang thiết bị khác của phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế Bào Thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp 3.2 Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu 3.2.1 Phạm vi nghiên cứu Đánh giá sự có mặt, tính ổn định của gen chuyển (gen chịu hạn GmCHS7) và khả năng chịu hạn, sinh trưởng phát triển, đặc điểm nông sinh học của các dòng ngô chuyển gen thế hệ T1 trong phạm vi phòng thí... Phương pháp chuyển gen gián tiếp 2.3.2.1 Chuyển gen thông qua virus Virus được sử dụng nhiều làm vectơ chuyển gen trong cây trồng do rất dễ xâm nhập và lây lan trong cơ thể thực vật Mặt khác, trong cấu tạo của virus cũng có sự có mặt của axit nuclêic làm cơ sở cho việc gắn các gen cần chuyển vào Tuy nhiên, để trở thành vectơ chuyển gen thì virus cần có những tiêu chuẩn sau [10]: + Genome của virus là... nghiệm đánh giá khả năng kháng hạn của các cây ngô chuyển gen GmCHS7 ở giai đoạn cây con Lô 1 Lô 2 (xử lý hạn) VH1.1 (Dòng đối chứng) VH1.2 (Dòng đối chứng) CM8.1 (Dòng đối chứng) CM8.2 (Dòng đối chứng) CM8.ZC.1.1 CM8.ZC.1.2 CM8.ZC.2.1 CM8.ZC.2.2 Vh1.ZC.1.1 Vh1.ZC.1.2 Vh1.ZC.2.1 Vh1.ZC.2.2 25 Các dòng ngô được trồng trên đất mùn, độ màu mỡ cao, dễ thoát nước, giữ ẩm tốt Trong thí nghiệm mỗi dòng được ... biểu gen chịu hạn GmCHS7 dòng ngô chuyển gen 1.2 Mục tiêu đề tài Phân tích đánh giá có mặt gen chịu hạn GmCHS7 dòng ngô chuyển gen phương pháp PCR Southern blot 3 Đánh giá biểu mang gen chịu hạn. .. sóng 312 -365nm 3.4.2 Phân tích biểu khả kháng hạn dòng ngô chuyển gen GmCHS7 giai đoạn Để đánh giá biểu gen chịu hạn GmCHS7 dòng ngô chuyển gen, dòng ngô tiến hành xử lý hạn để so sánh phát triển... 3.4.1 Phân tích đánh giá có mặt gen GmCHS7 số dòng ngô sau chuyển gen phương pháp PCR 21 3.4.2 Phân tích biểu khả kháng hạn dòng ngô chuyển gen GmCHS7 giai đoạn 24 3.4.3 Phân tích