Đang tải... (xem toàn văn)
Ly trích và tinh sạch bromelain từ khóm
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC TẬP PRÔTEIN & ENZYME MÃ HP: CS312 LY TRÍCH VÀ TINH SẠCH BROMELAIN TỪ KHÓM CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: T.S Võ Văn Song Toàn NHÓM 11B Cần Thơ - 11/2015 Mục Lục BÀI TRÍCH LY PROTEIN I Cơ sở lý thuyết: .1 II Dụng cụ thí nghiệm: .1 Nguyên liệu: trái khóm .1 Cách tiến hành: III Kết quả: IV Câu hỏi phúc trình: .2 BÀI PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ I Cơ sở lý thuyết: .5 Khái niệm: Nguyên tắc: II Dụng cụ - hóa chất: .7 III Cách tiến hành: .7 IV Kết thảo luận: 1.Kết quả: V Câu hỏi phúc trình: .11 Phương pháp trao đổi ion: 11 Trạng thái tích điện protein – enzyme ( pH 4, pH 6) ? Giải thích ? 11 Giá trị pH phân đoạn rữa giải Ý nghĩa thực tiễn trị số pH vừa xác định trình tinh 12 BÀI ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN .13 BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORD .13 I.Cơ sở lý thuyết: 13 II Thiết bị, dụng cụ - hóa chất: 14 Thiết bị, dụng cụ: 14 Hóa chất: 14 Đối tượng thí nghiệm 20 Nguyên tắc 20 2.2 Đơn vị hoạt tính bromelain 21 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm, hóa chất 21 II Cách tiến hành: 21 1.Dựng đường chuẩn Tyrosin .21 2.Xác định hoạt tính enzyme phương pháp Kunitz cải tiến 22 III Kết quả: .23 BÀI PHÂN TÍCH PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI TRÊN .27 GEL POLYACRYLAMIDE 27 I Mục đích: 27 II Giới thiệu: 27 III Nguyên tắc: 28 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm, hoá chất .29 1.Thiết bị: 29 2.Dụng cụ thí nghiệm: 29 3.Hóa chất: .29 V Tiến hành thí nghiệm 30 VI Kết thí nghiệm thảo luận: 32 Danh sách bảng Danh mục hình Thực tập Protein & Enzyme Nhóm – 11B BÀI TRÍCH LY PROTEIN I Cơ sở lý thuyết: Trích ly enzyme trình thu nhận enzyme thô từ nguồn nguyên liệu động vật, thực vật vi sinh vật để thực bước tinh nghiên cứu khác Trong thể sinh vật, enzyme có tế bào chất cấu tử (nhân , ty thể, ) Các phân tử enzyme khả di chuyển qua màng tế bào màng cấu tử tế bào Do đó, chiết rút enzyme nội bào cần phải phá vỡ cấu trúc tế bào Nguyễn Đức Lượng, 2004).Có thể tế bào biện pháp: Xay nhuyễn, nghiền: nghiền với bột thủy tinh bột cát, sóng siêu âm., sử dụng dung môi hữu như: Butylic, aceton, glycerine, Sau phá vỡ màng tế bào, enzyme tách chiết dung dịch muối trung tính Ngoài sử dụng biện pháp lắng, lọc, ly tâm, trích ly, (Nguyễn Đức Lượng, 2004) II Dụng cụ thí nghiệm: Cân điện tử, máy ly tâm lạnh, cối xoay, micropipette, đầu cole loại (200, 1000, 5000 µL), ống đong, ống eppendoft, dao, thớt, vải lọc, thùng đá lạnh… Nguyên liệu: trái khóm Cách tiến hành: ‒ Cắt khóm khoảng 1cm (vừa chạm phần mắt khóm) Sau cắt lát mỏng ‒ Xoay mẫu cối xoay Dùng vải lọc ép lấy dịch khóm ‒ Ly tâm 6000v/phút 40C 15 phút để thu nhận bromelain vỏ khóm ‒ Trữ mẫu - 200C: + ống eppendorf Mỗi ống 1ml dịch enzyme (để xác định hàm lượng protein, hoạt tính enzyme điện di SDS-PAGE sau) + 22 mL dịch enzyme/ bọc (để sử dụng cho sắc kí trao đổi ion) + Phần enzyme dư cho vào bọc khác để trữ lại Chú ý: Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học Đại Học Cần Thơ Thực tập Protein & Enzyme Nhóm – 11B ‒ Toàn trình cần thao tác nhanh, điều kiện lạnh 0C để enzyme không bị hoạt tính ‒ Cắt vỏ khóm nhỏ tốt ‒ Khi xay mẫu không xoay lâu xay lâu tạo nhiệt làm họat tính enzyme III Kết quả: Khối lượng mẫu (khóm) ban đầu: 473,3 g Khổi lượng vỏ khóm: 177,33 g Phần trăm vỏ khóm thu được: %Vỏ khóm = Khối lượng vỏ khóm *100/ khối lượng mẫu ban đầu = 177,33 * 100 = 37,5% 473,3 Thể tích dịch: + Trước ly tâm: 75 ml (113,32g) + Sau ly tâm:73 ml (84,05g) Hiệu xuất thu hồi (thể tích) dịch enzyme thô thu trái khóm sau trích ly Hiệu xuất thu hồi = (khối lượng dịch enzyme sau li tâm )/(khối lượng khóm ban đầu)*100 = (84,05/473,3)*100 = 17,76 % Cần phải xác định thông số đầu vào nguyên liệu vì: Biết tỉ lệ thành phần Để tính hiệu xuất thu hồi Hiểu công dụng, liều lượng trường hợp sử dụng Đạt hiệu trái cao sản xuất, tránh lãng phí nguyên liệu IV Câu hỏi phúc trình: Câu Lượng vỏ khóm thải bỏ từ nhà máy chế biến thực phẩm khóm đóng hộp nhà máy tỉnh, nước mùa vụ năm Tại Việt Nam (chủ yếu tỉnh miền Tây nam bộ) khóm trồng phổ biến, phân bố từ Phú Thọ đến Kiên Giang Tiền Giang tỉnh có sản lượng khóm đứng đầu nước Năm 2007, sản lượng khóm tỉnh Tiền Giang đạt 260.300 Tiếp theo Kiên Giang (85.000 tấn), Ninh Bình (47.400 tấn), Nghệ An (16.600 tấn), Long An (47.000 tấn), Hà Nam (23.400 tấn), Thanh Hoá (20.500 tấn) Tổng sản lượng nước năm 2007 Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học Đại Học Cần Thơ Thực tập Protein & Enzyme Nhóm – 11B đạt 529.100 Nhiều địa phương xây dựng thương hiệu đặc sản trái khóm khóm Đồng Giao (Tam Điệp - Ninh Bình), Kiên Giang, Tiền Giang có nhà máy chuyên sản xuất, chế biến thực phẩm từ trái khóm Tính đến ngày 24/11/2014, nông dân vùng chuyên canh dứa (khóm) Tân Phước (Tiền Giang) thu hoạch 14.195 Sản lượng dứa đạt 275.000 tấn, vượt tiêu 11,6% so kế hoạch năm, tăng gần 30.000 so với năm trước Đây mức tăng cao từ trước đến Tính tính trung bình có từ 30 – 40 % lượng vỏ khóm bỏ đi, tương đương với 103.125 tấn/ năm Câu Ý nghĩa Bromelain tinh sạch? (y dược, thực phẩm…) Trong Y học: Enzyme có vị trí quan trọng y học Đặc biệt phương pháp định lượng định tính enzyme hóa học lâm sàng phòng thí nghiệm chẩn đoán Do đó, y học xuất lĩnh vực gọi chẩn đoán enzyme, có nhiệm vụ: ‒ Phân tích xác định nồng độ chất glucose, ure, cholesterol, ‒ Xác định hoạt tính xúc tác enzyme mẫu sinh vật ‒ Xác định nồng độ chất với hỗ trợ thuốc thử enzyme đánh dấu Ngoài dùng enzyme làm thuốc, ví dụ protease làm thuốc tắc nghẽn tim mạch, tiêu mủ vết thương, làm thông đường hô hấp, chống viêm, làm thuốc tăng tiêu hóa protein, thành phần loại thuốc dùng da liễu mỹ phẩm… Trong y học protease dùng để sản xuất môi trường dinh dưỡng để nuôi cấy vi sinh vật sản xuất kháng sinh, chất kháng độc… Ngoài người ta dùng enzyme protease để cô đặc tinh chế huyết kháng độc để chữa bệnh Giảm đau: nhiều nghiên cứu khẳng định tác dụng Bromelain việc giảm sưng, bầm tím, đặc biệt đẩy nhanh thời gian phục hồi giảm đau nhanh sau phẫu thuật chấn thương vật lý khác Ở Đức, thị trường có sản phẩm chứa 90mg bromelain, 48mg trysin (enzyme nguồn động vật) 100mg rutin (một flavonoid bảo vệ mao mạch) Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học Đại Học Cần Thơ Thực tập Protein & Enzyme Nhóm – 11B Thử nghiệm nhằm so sánh sản phẩm tuần 90 người bị hư khớp háng với diclofenac (100mg/ngày) Và kết điều trị tốt diclofenac đau nhức hư khớp, tác dụng phụ Liền sẹo: nhiều nghiên cứu động vật Bromelain sử dụng da loại bỏ tế bào chết, hay gọi mở ổ, từ vết bỏng độ Trong thực phẩm: Làm mềm thịt: Bromelain có tác dụng thủy phân protein thành acid amin giúp dễ tiêu hóa hấp thụ Đông tụ sữa: để chế biến sản phẩm từ sữa người ta dùng remin, remin enzyme đông tụ sữa truyền thống Tuy nhiên, lượng remin sản xuất chưa đủ đáp ứng nhu cầu cung cấp sữa Gần người ta sử dụng enzyme thực vật vào chế biến sữa nghiên cứu Trong enzyme Bromelain quan tâm Trong công nghiệp dệt may: sản xuất tơ tằm người ta dùng protease để sản xuất tơ Với công đoạn xử lý enzyme sau xử lý dung dịch đệm xà phòng giúp lạu có tính đàn hồi tốt, bắt màu hồng dễ trang trí lụa Trong công nghiệp thuộc da: công nghiệp thuộc da, enzyme prtesae dùng để làm mềm da, làm da, rút ngắn thời gian, tránh ô nhiễm môi trường Việc xử lý tiến hành cách ngâm da dung dịch enzyme Bromelain, hay phất dịch enzyme lên bề mặt da Enzyme atch1 chất nhờn làm đức số liên kết phân tử collagen làm cho da mềm Câu Giá thành Bromelain thị trường: Nước uống đóng họp từ khóm 4.000 đồng/ họp Bromelain dạng nguyên chất 30 – 99$/ kilogram Nature’ s Plus Chewable Bromelain (40Mg) có giá 12,95$ Bromelain can used in Meat Tenderizer có giá 200$ Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học Đại Học Cần Thơ Thực tập Protein & Enzyme Nhóm – 11B BÀI PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ I Cơ sở lý thuyết: Khái niệm: Sắc ký trao đổi ion trình cho phép phân tách ion hay phân tử phân cực dựa tính chất chúng Nguyên tắc: Protein mang điện tích bề mặt, điểm pH trừ điểm đẳng điện, protein có mang điện tích tương ứng với điểm pH Tùy vào pH môi trường chúng tích điện dương hay âm, với pH < pI protein tích điện dương pH > pI protein tích điện âm Vì chọn loại gel thích hợp cho loại protein dựa vào pI độ bền pH protein Hệ thống sắc ký bao gồm hai pha: Pha động: Mẫu chứa chất cần phân tích, thường dòng chảy dung môi, di chuyển qua pha tĩnh Pha tĩnh: hạt mang sẵn điện tích định, hạt tương tác với phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng • Nếu hạt mang điện âm, tiến trình gọi sắc ký trao đổi ion dương, tương tác với phân tử mang điện tích dương • Ngược lại, hạt mang điện tích dương, gọi sắc ký trao đổi ion âm, tương tác với phân tử mang điện tích âm • Vì thế, protein dấu với cột chạy khỏi cột protein trái dấu bị giữ lại cột Sắc ký trao đổi ion dựa tượng trao đổi thuận nghịch ion linh động pha tĩnh với ion dung dịch cần phân tích cho dung dịch qua cột nạp đầy pha tĩnh Pha tĩnh trường hợp gọi chất trao đổi ion (ionit) Bản chất trình tách lực khác ion dung dịch trung tâm trao đổi ion ionit Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học Đại Học Cần Thơ Thực tập Protein & Enzyme Nhóm – 11B Đầu tiên, protein trạng thái tích điện bề mặt (tích điện dương hay âm phụ thuộc vào pH môi trường giá trị pI protein cần phân tách) tương tác với hạt gel thích hợp giữ lại cột sắc ký Khi thay đổi giá trị pH hay tăng nồng độ muối, protein tiếp tục tương tác với gel thay đổi điện tích ion muối cạnh tranh với protein tương tác với hạt gel, làm protein giải phóng Các protein (enzyme) khác đẩy phân đoạn khác Ví dụ, sắc ký trao đổi ion dương, ta thêm muối natri clorua hay muối khác dung dịch tách giải ion natri tranh bám vào cột với protein có điện tích dương, đó, protein mang điện tích dương phóng thích cột theo độ lớn điện tích Có loại gel trao đổi ion: • Gel trao đổi ion dương: có nhóm chức mang điện tích âm tương tác với protein mang điện tích dương • Gel trao đổi ion âm: có nhóm chức mang điện tích dương tương tác với protein mang điện tích âm Hình1 cột sắc kí trao đổi ion Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học Đại Học Cần Thơ Thực tập Protein & Enzyme Nhóm – 11B II Dụng cụ - hóa chất: Gel SP – Streamline, dung dịch đệm ammonium acetate 0,1M pH 4, đệm phosphate pH 6, hệ thống sắc ký lỏng, bơm nhu động, cốc thủy tinh, ống đong, ống epp, ống nghiệm nhỏ, khây đựng ống nghiệm… III Cách tiến hành: Bước 1: Chuẩn bị gel SP – Streamline: Cân 10gram gel SP – Streamline dung dịch đệm amonium acetate 0,1M pH=4 Bước Chuẩn bị cột gel SP – Streamline: Nhồi gel vào cột thủy tinh (2,0cm×9,0cm)(đường kính×chiều cao) Cân cột gel với dung dịch đệm ammonium acetate 0,1M pH (3 lần thể tích cột), tốc độ dòng chảy 1ml/phút Bước Load mẫu lên cột: Bơm 20 ml mẫu + 20 ml đệm ammonium acetate 0,1 M pH với tốc độ dòng chảy ml/ phút Bước 4: Rửa cột gel: Rửa cột gel dung dịch đệm ammonium acetate 0,1 M pH với tốc độ dòng chảy ml/ phút;theo dõi trình rữa cột qua sắc ký đồ thu mẫu vào ống nghiệm, phân đoạn protein không bám cột đẩy khỏi cột Chú ý: Khi rửa cột gel, cách phút chuyển ống nghiệm lần sau tiến hành đo OD bước sóng 280nm, vẽ sắc kí đồ trữ phân đoạn biết dừng rửa cột gel Quá trình kết thúc giá trị OD đo gần với giá trị OD đệm ban đầu không tăng Bước Rửa giải: Protein bám cột gel rửa giải dung dịch đệm phosphate 0,1 M pH=6 với tốc độ dòng chảy 1ml/ phút Thu dung dịch protein rữa giải vào ống nghiệm đem đo OD Theo dõi sắc ký đồ để xác định phân đoạn protein khác Quá trình dừng lại giá trị OD gần đệm ban đầu dừng lại Xác định phân đoạn tổng thể tích phân đoạn này, trữ mẫu điều kiện 40C Bước Thu phân đoạn trữ mẫu: Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học Đại Học Cần Thơ Thực tập Protein & Enzyme Nhóm – 11B Giải thích quy trình: Nguyên nhân mẫu đối chứng lại cho TCA vào trước cho Casein TCA tác nhân biến tính enzyme Bromelain, làm cho Bromelain không thủy phân Casein Đối với mẫu thật, TCA có vai trò dừng phản ứng để làm cho enzyme mẫu có thừoi gian hoạt động Nguyên nhân đo OD bước sóng 280nm dựa hấp thụ ánh sáng acid amin vòng thơm Tyrosine, Tryptophan Phenylalanine, acid amin có độ hấp thụ cực đại bước sóng 280nm Ghi nhận kết (thí nghiệm lặp lại lần), dựa vào phương trình đường chuẩn xác định hàm lượng Tyrosine sinh dịch thủy phân Lưu ý đo hàm lượng OD từ thấp đến cao III Kết quả: Bảng 10 Giá trị OD bước sóng 280 nm để dựng đường chuẩn Tyrosine Ống nghiệm Nồng độ Tyrosine (µg/ml) 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Trung bình giá trị OD 0.133 0.153 0.173 0.210 0.242 0.275 Trung bình giá trị OD trừ đối chứng 0.005 0.04 0.077 0.109 0.142 Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 23 Đại Học Cần Thơ Thực tập Protein & Enzyme Nhóm – 11B Hình Biểu đồ đường chuẩn Tyrosine thể tương quan tuyến tính giữ nồng độ Tyrosine mẫu giá trị OD 595nm Nhận xét: Đường chuẩn Tyrosine đường tuyến tính thể mối tương quan nồng độ Tyrosine (µM/ml) số OD bước sóng 280nm (bước sóng hấp thụ cực đại Tyrosine) Giá trị phương trình R2 = 0,9773 tức phương trình có độ tin cậy cao Tuy nhiên nồng độ 0,2 mang giá trị OD lệch xa so với đường chuẩn, làm R giảm Phương trình đường chuẩn Tyrosine là: y = 0,1513x – 0,0131 với x nồng độ Tyrosine (µM/ml) y giá trị OD trừ đối chứng bước sóng 280nm mẫu Các công thức tính toán Ta có phương trình đường chuẩn Tyrosine : y = 0,1513x – 0,0131 => Nồng độ Tyrosine (µmol/ml) ) = x = (y + 0,0131)/0,1513 với: Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 24 Đại Học Cần Thơ Thực tập Protein & Enzyme Nhóm – 11B y giá trị OD bước sóng 280nm mẫu (sau trừ đối chứng) Đơn vị hoạt tính enzyme 1ml dung dịch enzyme tính theo công thức: U=(a × Vt × K*)/( T × VE) Trong : U: Hoạt tính 1ml dung dịch enzyme (Tu/ml) a: Nồng độ Tyrosine dung dịch thủy phân (µM/ml) Vt : Thể tích tổng dung dịch phản ứng (1400µl) T: Thời gian phản ứng (10 phút) VE : Thể tích enzyme (20µl) K* : Hệ số pha loãng Hàm lượng protein xác định phương pháp Bradford Bảng 11 Kết sau tính nồng độ Tyrosine hoạt tính enzyme Nồng độ Mẫu ODtrung bình ODđối chứng ODTB - ODĐC Tyrosine ( μmol/ml) Hoạt tính enzyme (Tu/ml) Thô 1X 1.917 0.562 1.355 9.040 63,281 Thô 2X 1.493 0.538 0.955 6.399 89,580 UB 0.388 0.345 0.043 0.369 2,580 F1 0.386 0.483 -0.097 0 F2 0.371 0.495 -0.124 0 F3 0,392 0,484 -0,092 0 Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 25 Đại Học Cần Thơ Thực tập Protein & Enzyme Nhóm – 11B Bảng 12 Đánh giá trình tinh enzyme Tên Hàm lượng mẫu protein (mg) Thô 1X Thô 2X UB F1 F2 F3 0,909 0,707 0,0658 0,0204 0,0364 0,0506 Hoạt tính Hoạt tính enzyme enzyme tổng (U/ml) 63,281 89,580 2,580 0 (U/ml) 1,226 1,35 0,327 0 Hoạt tính đặc hiệu (U/mg) 0,0697 1,361 0,127 0 Nhận xét: Cả ba phân đoạn hoạt tính, điều có nghĩa là: Giả thuyết 1, phân đoạn diện Bromelain, Bromelain bị rửa cho UB Giả thuyết 2, trình làm thí nghiệm enzyme bị biến tính ban đầu mẫu trữ -4 0C sau rã đông lấy thể tích đợi khoảng thời gian … Nên trình Bromelain bị biến tính Theo kết điện di SDS page phân đoạn có band protein xác định Bromelain Vì vậy, theo nhóm enzyme bị biến tính nên hoạt tính UB có hoạt tính chứng tỏ có diện Bromelain Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 26 Đại Học Cần Thơ Thực tập Protein & Enzyme Nhóm – 11B BÀI PHÂN TÍCH PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI TRÊN GEL POLYACRYLAMIDE I Mục đích: Phương pháp điện di nhằm làm sáng tỏ đồng protein mẫu, cho thấy hiệu xuất tinh xác định trọng lượng phân tử protein cần tìm II Giới thiệu: Gel polyacrylamide hình thành dựa trùng hợp chất acrylamide (CH2=CH-CO-NH2) Tác nhân tạo liên kết phân tử acrylamide để tạo thành gel N,N’ methylene bisacrylamide (CH2=CH-CO-NH- CH2-NH-CO-CH=CH2) bisacrylamide bao gồm nối đôi nên phản ứng trùng hợp chúng liên kết chéo với chuỗi polyacrylamide kế bên Nếu trùng hợp mà không tác nhân liên kết chéo acrylamide tạo thành polymer dạng thẳng không tạo thành gel mong muốn Các phản ứng trùng hợp xảy chế gốc tự Người ta thường dung amonium persulfate (APS) tetramethylethylenediamine (TEMED) làm tác nhân xúc tác phản ứng polymer hóa acrylamide Kích thước lổ gel thay đổi cách thay đổi lượng monomer thay đổi liên kết chéo, với độ liên kết chéo cao cho lỗ gel nhỏ Tuy nhiên thực tế kích thước lỗ gel thường thay đổi cách giữ cố định độ liên kết chéo thay đổi số monomer để có kích thước lỗ gel phù hợp Chú ý: Acrylamide độc tố thần kinh mạnh hít vào làm mê mệt Nó có khả thấm qua da tiếp xúc trực tiếp Hiệu độc tố tích tụ dần Vì vậy, thực thí nghiệm cần đeo găng tay Tuy nhiên dạng polymer hóa lại không độc, tiếp xúc với nên mang găng tay bảo vệ lượng nhỏ acryamide chưa polymer hóa (Sambrook cộng sự, 2001) Bromophenol Blue số pH, chất nhuộm xuất màu xanh mạnh mẽ Nó thường sử dụng loại thuốc nhuộm theo dõi agarose gel polyacrylamide điện di Bromophenol blue có điện tích âm nhẹ di chuyển hướng với protein, cho phép người dùng theo dõi tiến phân tử di chuyển qua gel Tỷ lệ di cư khác với thành phần gel Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 27 Đại Học Cần Thơ Thực tập Protein & Enzyme Nhóm – 11B Coomassie Brilliant Blue thuốc nhuộm, có công thức hòa học hợp chất triphenylmethane disulfonated thường sử dụng chất để phát protein gel điện di Khả cảm ứng cao, xác định 0,5 mg / cm2 protein diện ma trận gel Trong môi trường acid Coomassie Brilliant Blue hình thành liên kết với nhóm amin proton protein tương tác tĩnh điện thể băng điện di III Nguyên tắc: Kỹ thuật điện di dựa nguyên tắc điện trường phân tử tích điện âm di chuyển phía cực dương ngược lại Tốc độ di chuyển phân tử phụ thuộc vào kích thước, hình dạng, khối lượng, điện tích lực điện trường Phương pháp SDS – PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate – polyacrylamide Gel electrophoresis) phương pháp điện di gel polyacrylamide có hiên diện Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) SDS chất khử cầu nối disulfide β – mercapthoethanol Các tác nhân làm biến tính protein từ cấu trúc bậc cao ( bậc 4, 3, 2) thành cấu trúc bậc làm cho tất protein tích điện âm Nhờ protein điện trường di chuyển từ cực âm sang cực dương tốc độ di chuyển phụ thuộc trọng lượng phân tử protein Các protein có trọng lượng phân tử lớn di chuyển điện trường chậm ngược lại Trong phương pháp gel gồm lớp: ‒ Gel tập trung: nằm phía nơi để tạo giếng bơm mẫu Có nồng độ gel từ - 5% Khi dòng điện chạy qua protein qua lớp gel tạo thành băng mỏng phía lớp gel kế tiếp, nhằm đưa protein vạch xuất phát ‒ Gel phân tích: nằm dười lớp gel tập trung có nồng độ gel cao gel tập trung Lớp gel chủ yếu có chức phân tách protein có trọng lượng kích thước khác thành băng khác từ hỗn hợp protein ban đầu Trong dung dịch đệm trộn mẫu có Bromophenol Blue, hợp chất có màu xanh dương dùng để nhận biết mức di chuyển protein gel Khi thấy vạch màu Bromophenol Blue chạy đến cuối gel ngắt dòng điện kết thúc trình chạy điện di Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 28 Đại Học Cần Thơ Thực tập Protein & Enzyme Nhóm – 11B Sau kết thúc gel nhuộm để thấy phân tách băng protein gel Comassie Brilliant Blue G250 thường chất sử dụng để nhuộm cho hầu hết loại protein IV Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm, hoá chất 1.Thiết bị: - Máy khuấy từ - Cân phân tích - Cân điện tử - Hệ thống điện di mini protein III (Bio-Rad) - Tủ hút 2.Dụng cụ thí nghiệm: -Bộ micropipette -Găng tay -Cốc thuỷ tinh -Chai bi -cốc nhựa -Hộp đựng gel -Bọc nylon -Đầu cole -Cá từ 3.Hóa chất: Dung dịch acrylamide – Bis 30% Dung dịch đệm Tris-HCl 1,5M pH=8,8 Dung dịch đệm Tris-HCl 0,6M pH=6,8 Ammonium persulphat (APS) SDS 10% Dung dịch Tetramethylethylenediamine (TEMED) Dung dịch điện di (1 lít) Dung dịch đệm chuẩn bị mẫu (sample buffer = 20 ml) chưa có bổ sung βMercaptoethanol Dung dịch nhuộm gel (100ml) Dung dịch rửa gel (1 lít) Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 29 Đại Học Cần Thơ Thực tập Protein & Enzyme Nhóm – 11B V Tiến hành thí nghiệm Bước Chuẩn bị hộp điện di Khuôn kính để đổ gel phải rửa nước cất cồn sau lau khô ráp thành khuôn để chuẩn bị đổ gel Chú ý: cần so mặt kính để gel không chảy Bước Chuẩn bị gel phân tích polyarcrylamide 10% gel tập trung 4% theo bảng sau: Bảng 12 Bảng công thức đổ gel điện di Thành phần Nước cất Dung dịch Arylamide 30% Tris-HCl SDS 10% APS 10% TEMED Gel phân tích 3,3 ml 4,0 ml 2,5 ml (pH = 8,8) 100 µl 100 µl µl Gel tập trung 2,7 ml 0,67 ml 0,50 ml (pH = 6,8) 40 µl 40 µl µl Đầu tiên, pha chế bơm gel phân tích vào khuôn gel cho mặt gel phân tích cách đáy lược 0,5 cm (không bơm nhanh để tránh tạo bọt khí Bơm nước cất lên bề mặt gel đến hết thể tích lại, để tạo cho bề mặt gel phẳng Đợi gel đông khoảng 30 phút Sau 30 phút, tiến hành pha chế gel tập trung không cho TEMED vào Tiếp theo, nghiêng đổ nước khỏi gel sử dụng giấy thấm để hút hết phần lại Thêm TEMED vào bơm gel vào khuôn, đặt lược vào gel đợi 30 phút Chú ý: ‒ Khi đến bước cuối cho dung dịch TEMED vào trước ta phải chuẩn bị trước micropipette điều chỉnh thể tích sẳn để thao tác nhanh cho TEMED vào trình polymer hóa xảy gel bắt đầu đông lại ‒ Trong suốt trình thao tác phải sử dụng bao tay trang ‒ Trước đổ gel tập trung ta phải dùng giấy thấm phần nước bề mặt gel phân tích, cẩn thận tránh làm bề mặt gel bị rách ‒ Khi đặt lược vào đặt đầu lược vào gel xéo gốc 45 sau ấn phần lại vào gel Bước Chuẩn bị mẫu protein: Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 30 Đại Học Cần Thơ Thực tập Protein & Enzyme Nhóm – 11B Bổ sung thêm 25µl β-mercaptoethanol vào dung dịch đệm chuẩn bị mẫu (sample buffer) trước sử dụng Phối trộn mẫu với dung dịch đệm chuẩn bị mẫu (sample buffer) ống tube eppendoft theo tỉ lệ sau: Bảng 13 Bảng tỉ lệ pha trộn mẫu điện di Mẫu (µl) Sample buffer(µl) Thô 20 20 UB 100 10 F1 100 10 F2 100 10 F3 100 10 Trộn micropipette Sau mang tất mẫu với protein chuẩn đun cách thủy 100oC 10 phút; để nguội 10 phút Chú ý: ‒ Để tiết kiệm thời gian bước bước thực song song Nhưng để gel tập trung vào khoảng 20 phút tiến hành nung cách thủy mẫu ‒ Trong trình nung, ống eppendorf bị bật nắp làm hao hụt thể tích mẫu nên ý để đậy nắp lại ‒ Thể tích mẫu thất thóat nung nên chuẩn bị dư lượng cần dùng Bước Bơm mẫu protein vào giếng ‒ Sau gel tập trung đông, lắp khung đổ gel vào hộp điện di ‒ Đổ đầy dung dịch chạy điện di vào hộp chạy điện di (ngập giếng gel) ‒ Tháo lượt khỏi gel điện di ‒ Bơm mẫu vào giếng tùy thuộc vào hàm lượng protein có mẫu Cụ thể: + Protein chuẩn: µl + Thô: 10 µl + UB: 20 µl + F1, F2, F3: 20 µl Chú ý: ‒ Ghi chép lại vị trí mẫu đưa vào giếng để dễ quan sát nhận xét ‒ Khi lấy lược phải lấy ngón tay phải thẳng để không làm hư giếng Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 31 Đại Học Cần Thơ Thực tập Protein & Enzyme Nhóm – 11B ‒ Load mẫu cẩn thận không tràn qua giếng kế bên Khi load mẫu để đầu tip nghiêng gốc 450 Đẩy thể tích mẫu vào giếng lấy đầu tip khỏi dung dịch thả micropipette để tránh mẫu bị hút ngược lại đầu tip Bước Chạy điện di Lắp gáp khung điện di Đậy nắp theo điện cưc Điều chỉnh cho dòng điện qua 30mA/gel Quan sát thấy protein di chuyển gần đáy gel điện di (dải băng màu xanh bromophenol blue R-250) kết thúc trình Bước Nhuộm gel Gel lấy khỏi hộp gel cẩn thận cho nhuộm với dung dịch nhuộm gel khoảng 40 phút Trong trình nhuộm màu , máy lắc sử dụng để giúp cho gel tiếp xúc với thuốc nhuộm đậy kính nắp Bước Tẩy màu Sử dụng dung dịch rửa để rửa gel Sau tiếp tục thay dung dịch rửa khỏang lần để qua đêm màu xanh rõ băng điện di chụp hình gel Bước Xác định trọng lượng phân tử protein gel điện di Dựa vào gel điện di, đo khoảng cách di chuyển band protein chuẩn gel so với vị trí xuất phát (mặt gel phân tích), từ để xác định phương trình tuyến tính tương quan trọng lượng phân tử protein di chuyển protein gel điện di Dựa vào phương trình tuyến tính để xác định trọng lượng phân tử protein mẫu phân đọạn VI Kết thí nghiệm thảo luận: Kết điện di: protein chuẩn đủ band, band điện di sáng, rõ thẳng hàng không bị lệch Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 32 Đại Học Cần Thơ Thực tập Protein & Enzyme Nhóm – 11B Chuẩn Thô UB F1 F2 F3 Hình băng điện di SDS – Page protein chuẩn, mẫu thô, UB, F1, F2, F3 Trọng lượng thang protein chuẩn hình sau: Hình9 Trọng lượng protein chuẩn sử dụng thí nghiệm Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 33 Đại Học Cần Thơ Thực tập Protein & Enzyme Nhóm – 11B Để đánh giá trọng lượng protein ta tiến hành dựng đường chuẩn vào xác định trọng lượng Bromelain Dựa vào hình để xây dựng đường tuyến tính ta phải chuyển trọng lượng protein dạng log sau: Bảng 14 bảng chuyển dạng trọng lượng phân tử protein chuẩn M (kDa) LogM D (cm) Rf = D/4,3 116 2,064 0,8 0,186 66,2 1,821 1,3 0,302 45 1,653 1,9 0,442 35 1,544 2,4 0,558 25 1,398 0,,698 18,4 1,265 3,8 0,884 14.4 1,158 4,3 Theo bảng ta có phương trình tuyến tính thể mối tương quan Rf Log M Hình 10 Đồ thị tương quan tuyến tính Rf LogM thang protein chuẩn Ta có phương trình hồi quy là: y = -0.9124x + 2.0074 với giá trị R2 = 0,9763 cao nên phương trình đáng tin Trong đó: (y): Giá trị LogM với M trọng lượng phân tử protein (x): Giá trị Rf tỉ số khoảng cách di chuyển protein khoảng cách di chuyển phẩm màu Bromophenol Blue Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 34 Đại Học Cần Thơ Thực tập Protein & Enzyme Nhóm – 11B Từ kết điện di phương trình hồi quy ta có bảng trọng lượng phân tử enzyme sau thực điện di SDS - PAGE Bảng 15 Trọng lượng phân tử protein Mẫu UB F1 F2, F3 R 2,8 2,9 3,4 2,9 3,5 Rf 0,651 0,674 0,79 0,674 0,814 logM 1,413 1,392 1,287 1,392 1,265 M 25,882 24,66 19,36 24,66 18,408 Nhận xét – thảo luận: Nhận xét chung: ‒ Band điện di đẹp, sáng rõ thẳng thao tác làm chuẩn, xác, độ tinh cao ‒ Mẫu thô xuất vệt dài màu xanh đậm không phân band cụ thể protein chưa tinh nên band điện di riêng lẽ Bên cạnh đó, Bromelain có nhiều tiểu đơn vị β-mercaptoethanol không cắt đứt cầu nối disulfit chúng, nên sản phẩm điện di có băng Các vấn đề đặt là: Mẫu UB lại xuất band protein Ba faction F1, F2, F3 cho band protein giống khác hàm lượng protein thể qua đậm nhạt band điện di Mỗi faction có band điện di band Bromelain, band lại gì? Có liên quan đến việc enzyme hoạt tính hay không? Thảo luận: Các vấn đề giải thích sau: Vì phân đoạn rửa protein không bám tinh protein phương pháp sắc kí 2, chiều cao cột gel thấp (7cm) với tốc độ bơm nhanh (do nhóm sử dụng chế mao dẫn thay cho máy bơm) không đảm bảo tốc độ 1ml/phút + Vậy nên protein cần hết vị trí bám gel vị trí liên kết gel protein bảo hòa Đó lí UB lại có band Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 35 Đại Học Cần Thơ Thực tập Protein & Enzyme Nhóm – 11B + Lượng gel cột sắc kí nên làm lượng protein liên kết với gel lỏng lẽo khác biệt rõ rệt phân đoạn Bên cạnh đó, nhóm không giữ lại ống đỉnh để điện di, mà hàm lượng protein có mẫu không lệch Vậy nên, điện di cho band protein giống Theo kết nghiên cứu Shoshi OTA et al., 1971 trọng lượng phân tử Bromelain trái khóm có loại A, B, C 18kDa, 20kDa, 19kDa Theo nghiên cứu khoa học sinh học ứng dụng khoa học vào tháng 12/2013 Bresolin cộng cho thấy Bromelain từ vỏ khóm có loại với trọng lượng phân tử 20 kDa 30kDa Dựa vào kết điện di ta thấy, band đậm màu F1, F2, F3 có trọng lượng phân tử 19,36 18,408 ta suy nghĩ theo hướng sau: ‒ Thứ nhất, Bromelain lệch trung bình khoảng 5,58% so với loại Bromelain từ vỏ có khối lượng 20kDa sai số mắt nhìn, hay làm tròn số việc tạo đường chuẩn bước tính trung gian…Do sai lệch chấp nhận ‒ Thứ hai, band protein Bromelain từ vỏ khóm mà trái khóm, trình lấy mẫu lấy nhiều phần vỏ cho phép (dày cm) Tuy nhiên so với kết từ nhóm bạn nhóm nghiêng cách thứ Tức xác định Bromelain Band nhạt màu có trọng lượng phân tử khoảng 24,66 kD phân đoạn UB có band cực nhạt khoảng 25,882 kD, Bromelain theo kết điện di sai lệch 5kD theo kết thí nghiệm logic TÀI LIỆU THAM KHẢO: Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 36 Đại Học Cần Thơ Thực tập Protein & Enzyme Nhóm – 11B Nguồn: http://vi.scribd.com/doc/211818188/SDS-PAGE http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b5525?lang=en®ion=VN http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S1516-89132013000600012&script=sci_arttext http://www.canthopromotion.vn/home/ https://vi.wikipedia.org/wiki/D%E1%BB%A9a Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 37 Đại Học Cần Thơ [...]... cần pH tăng lên hơn nữa thì mới đủ để thay đổi điện tích của chúng và bị đẩy ra khỏi cột Tóm lại có thể xác định được điện tích protein lớn hay nhỏ dựa vào giá trị pH Bảng 3 Giá trị pH của mỗi phân đoạn Phân đoạn pH UB 4 F1 4,5 F2 5 F3 6 Ý nghĩa: - UB: pH < pIbromelain nên bromelain chúng ta cần tinh sạch tích điện dương và bám được vào gel mang điện tích âm, còn các protein thu được trong giai đoạn... lên, ở pH 4,5 (vẫn nhỏ hơn pI bromelain) nên đây vẫn không phải là protein chúng ta cần tinh sạch - F2 vần còn sự hiện diện của pH 4 nên pH =5 - F3: pH của dung dịch ở 2 phân đoạn này là 6, lớn hơn pI bromelain, lúc này bromelain chuyển sang tích điện âm, không bám được vào gel mang điện tích âm nữa nên sẽ bị đẩy ra khỏi cột gel Rất có thể đây là protein chúng ta cần tinh sạch Viện Nghiên Cứu & Phát... trên gel polyacrylamide khi có sự hiên diện của Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) SDS và các chất khử cầu nối disulfide β – mercapthoethanol Các tác nhân này làm biến tính protein từ các cấu trúc bậc cao hơn ( bậc 4, 3, 2) thành cấu trúc bậc 1 và làm cho tất cả các protein tích điện âm Nhờ đó các protein trong điện trường sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương và tốc độ di chuyển chỉ phụ thuộc và trọng lượng... phần còn lại Thêm TEMED vào bơm gel vào khuôn, đặt lược vào gel đợi 30 phút Chú ý: ‒ Khi đến 1 bước cuối là cho dung dịch TEMED vào thì trước đó ta phải chuẩn bị trước 2 micropipette đã điều chỉnh thể tích sẳn để thao tác nhanh nhất có thể vì khi cho TEMED vào thì quá trình polymer hóa sẽ xảy ra gel bắt đầu đông lại ‒ Trong suốt quá trình thao tác trên luôn phải sử dụng bao tay và khẩu trang ‒ Trước... trắng và đục cho sữa, là một loại protein chiếm khoảng 78% - 85% protein sữa Trong sữa, casein tồn tại dưới dạng phức hợp các phân tử bao gồm phân tử casein, calcium, phosphate vô cơ và ion citrate Casein có điểm đẳng điện pI = 4,6 và có 4 dạng chính là: αS1-casein, αS2-casein, β-casein và K-casein - αS1-casein: là dạng phổ biến nhất trong casein của sữa bò và được cho là một tác nhân chống oxi hóa và. .. & Enzyme Nhóm – 11B V Tiến hành thí nghiệm Bước 1 Chuẩn bị hộp điện di Khuôn kính để đổ gel phải được rửa sạch bằng nước cất và cồn sau đó lau khô và ráp thành khuôn để chuẩn bị đổ gel Chú ý: cần so mặt kính đều và bằng để gel không chảy ra ngoài Bước 2 Chuẩn bị gel phân tích polyarcrylamide 10% và gel tập trung 4% theo bảng sau: Bảng 12 Bảng công thức đổ gel điện di Thành phần Nước cất Dung dịch Arylamide... sự hiện diện của Bromelain Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 26 Đại Học Cần Thơ Thực tập Protein & Enzyme Nhóm – 11B BÀI 5 PHÂN TÍCH PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI TRÊN GEL POLYACRYLAMIDE I Mục đích: Phương pháp điện di nhằm làm sáng tỏ sự đồng nhất protein trong mẫu, cho thấy hiệu xuất tinh sạch và xác định trọng lượng phân tử protein cần tìm II Giới thiệu: Gel polyacrylamide được... định 40C, 10 phút Ly tâm 10.000 vòng/phút, 10 phút, 250C Ly tâm 10.000 vòng/phút, 10 phút, 250C Đo độ hấp thụ ở 280nm Đo độ hấp thụ ở 280nm Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 22 Đại Học Cần Thơ Thực tập Protein & Enzyme Nhóm – 11B Giải thích quy trình: Nguyên nhân ở mẫu đối chứng lại cho TCA vào trước khi cho Casein là vì TCA là tác nhân biến tính enzyme Bromelain, làm cho Bromelain không... không có sự hiện diện của Bromelain, các Bromelain đã bị rửa cho ra UB Giả thuyết 2, quá trình làm thí nghiệm enzyme đã bị biến tính do ban đầu mẫu trữ ở -4 0C sau đó rã đông rồi lấy thể tích và đợi khoảng một thời gian nữa … Nên có thể trong quá trình này Bromelain đã bị biến tính Theo kết quả điện di SDS page thì các phân đoạn đều có band protein và xác định là Bromelain Vì vậy, theo nhóm thì enzyme... theo sắc ký đồ vẽ được từ số liệu mẫu OD280 ‒ Đồng nhất mỗi phân đoạn riêng biệt và xác định tổng thể tích của mỗi phân đoạn, giá trị pH ‒ Trữ mẫu ở - 200C: + 6 ống epp Mỗi ống chứa 1 ml dịch enzyme (để xác định hàm lượng protein, hoạt tính enzyme và điện di SDS – SPAGE trong các bài sau) + Phần dịch enzyme của mỗi phân đoạn còn dư cho vào một bọc khác để trữ lại IV Kết quả và thảo luận: 1 Kết quả: ... & Enzyme Nhóm – 11B BÀI TRÍCH LY PROTEIN I Cơ sở lý thuyết: Trích ly enzyme trình thu nhận enzyme thô từ nguồn nguyên liệu động vật, thực vật vi sinh vật để thực bước tinh nghiên cứu khác Trong... liệu: trái khóm Cách tiến hành: ‒ Cắt khóm khoảng 1cm (vừa chạm phần mắt khóm) Sau cắt lát mỏng ‒ Xoay mẫu cối xoay Dùng vải lọc ép lấy dịch khóm ‒ Ly tâm 6000v/phút 40C 15 phút để thu nhận bromelain. .. với năm trước Đây mức tăng cao từ trước đến Tính tính trung bình có từ 30 – 40 % lượng vỏ khóm bỏ đi, tương đương với 103.125 tấn/ năm Câu Ý nghĩa Bromelain tinh sạch? (y dược, thực phẩm…) Trong