Đang tải... (xem toàn văn)
Bài dịch kỹ thuật chuyển đổi bacillus subtilis cho sản xuất ethanol lactate dehydrogenase đóng vai trò chìa khóa trong chuyển hóa lên men
Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh Khoa Sinh Học Ngành Cơng Nghệ Sinh Học ****** BÁO CÁO VI SINH Bài Dịch: KỸ THUẬT CHUYỂN ĐỔI BACILLUS SUBTILIS CHO SẢN XUẤT ETHANOL Lactate Dehydrogenase Đóng Vai Trị Chìa Khóa Trong Chuyển Hóa Lên Men Susana Romero,1 Enrique Merino,2 Francisco Bolívar,1 Guillermo Gosset,1 and Alfredo Martinez1 Giáo viên hướng dẫn: TS Võ Minh Trí Nhóm Thành phố Hồ Chí Minh KỸ THUẬT CHUYỂN ĐỔI BACILLUS SUBTILIS CHO SẢN XUẤT ETHANOL Lactate Dehydrogenase Đóng Vai Trị Chìa Khóa Trong Chuyển Hóa Lên Men TĨM TẮT Dạng hoang dại Bacillus subtilis lên men 20g/l glucose 48 giờ, sản xuất lactate butanediol, ethanol acetate Để xây dựng chủng B subtilis sản xuất ethanol, tái tổ hợp tương đồng sử dụng làm gián đoạn gen (ldh) tự nhiên tổng hợp enzyme dehydrogenase lactate (LDH) cách gắn chèn vào nhiễm sắc thể B subtilis gen decacboxylase pyruvate (pdc) gen dehydrogenase II ancohol (adhB) Zymomonas mobilis điều khiển promoter gen ldh tự nhiên Giá trị hoạt động enzym PDC ADHII nội bào chủng B subtilis BS35 thiết kế giống chủng E.coli sản xuất ethanol BS35 sản xuất ethanol butanediol Tuy nhiên, tăng trưởng tế bào mức tiêu thụ glucose bị giảm 70 65%, tương ứng, so với chủng ban đầu Để loại bỏ sản xuất butanediol, gen acetolactate synthase (alsS) bị làm bất hoạt Trong chủng BS36 (BS35_alsS), sản xuất ethanol nâng cao, với xuất cao (89% theo lý thuyết), nhiên, tăng trưởng tế bào mức tiêu thụ glucose thấp Điều thú vị, đặc tính động học enzyme LDH từ B subtilis cho thấy có khả oxi hóa NADH NADPH Sự biểu transhydrogenase mã hóa gen udhA từ E.coli cho phép khôi phục phần tốc độ tăng trưởng tế bào khởi đầu sớm sản xuất ethanol Ngoài chuyển đổi pyruvate thành lactate q trình oxi hóa NADH, bổ sung quan trọng vào vai trò sinh lý LDH cho trình tiêu thụ glucose điều kiện lên men đề nghị Nuôi cấy liên tục 8,9g/l đạt sử dụng chủng BS37 (BS37-alsS udhA) Cho đến nay, hàm lượng sản lượng ethanol cao báo cáo với chủng B subtilis GIỚI THIỆU CHUNG Ethanol sản xuất từ nguồn tái tạo, chẳng hạn sinh khối, lựa chọn đầy hứa hẹn để cạnh tranh thay nhiên liệu hóa thạch khơng thể phục hồi; có lợi đáng kể tính bền vững, phát thải khí nhà kính thấp hơn, giảm chi phí Hiện nay, nhiên liệu ethanol sản xuất cách sử dụng Saccharomyces cerevisiae loài mà lên men sucrose từ mía đường từ bột bắp thủy phân Tuy nhiên, số lượng lớn loại đường có sẵn sinh khối thực vật Sinh khối hỗn hợp phức tạp polymer carbohydrate, chủ yếu cellucose hemicellulose Sử dụng Cellulose đòi hỏi trước tiên phải phá vỡ enzyme để giải phóng đường glucose, nhiên, việc sử dụng cellulase làm tăng chi phí sản xuất ethanol Vi khuẩn gram dương có số đặc điểm khả chịu dựng độ pH tương đối thấp, nhiệt độ cao, đường cao, muối nồng độ cồn, điều kiện khắc nghiệt khác nhau, nên dùng để phát triển chất xúc tác sinh học tiên tiến nâng cao khả cạnh tranh thương mại nhiên liệu sản xuất ethanol Một số nhóm cố gắng phát triển vi khuẩn gram dương sản xuất ethanol, với thành cơng cịn bị hạn chế Những operon pet lý thuyết khác xây dựng cách sử dụng gen pdc adhB từ Zymomonas mobilis (vi khuẩn gram âm) cách sử dụng gen pdc từ Sarcina ventriculy (vi khuẩn gram dương) để biểu vector đơn dòng đa dòng vi khuẩn gram dương Trong số trường hợp, chức enzyme pyruvate decacboxylaza (PDC) alcohol dehydrogenase (ADH) phát hiện, sản lượng ethanol tạo thấp khơng có Bacillus subtilis nói chung cơng nhận an tồn, chuyển hóa nhiều loại đường tổng hợp hiệu nhiều proteinases, vận chuyển chúng hệ thống tiết Khả có tiềm sử dụng để xuất cellulases, phân hủy chất thải thực vật, phóng thích cellobiose glucose Do chủng B subtilis thiết kế tương lai tiêu thụ carbohydrate để sản xuất ethanol Thiết kế giúp giảm chi phí nhiên liệu sản xuất ethanol Tuy nhiên điều kiện lên men, B Subtilis sản xuất lactate, acetate, butanediol, lượng nhỏ ethanol từ glucose, amino acid, puryvate (Hình 1) HÌNH 1: Những đường lên men B subtilis Con đường phát sinh sử dụng nghiên cứu đánh dấu hình elip nét đứt PDC ADHII từ Z mobilis ALDC (acetolactate decarboxylase), AR ( acetone reductase), PDH ( pyruvate dehdrogenase), CoA ( coenzyme A), ALDH (acetaldehyde dehydrogenase), PTA ( phosphotransacetylase), ACK ( acetate kinase) Lactate sản xuất cách khử puryvate, phản ứng xúc tác lactate dehydrogenase (LDH), đồng thời với q trình oxy hóa phân tử NADH phân tử puryvate bị khử Trong nghiên cứu này, chuyển hóa lên men khơng đồng B subtilis cải biến để thu chủng vi khuẩn gram dương sản xuất ethanol sản phẩm lên men Bằng cách bất hoạt gen lactate dehydrogenase (ldh) thông qua gắn chèn vào nhiễm sắc thể gen pdc, adhB Z mobilis loại bỏ tổng hợp butadienol cách chèn gen udhA transhydrogenase E.coli vào vị trí alsS, kết chủng B subtilis tái tổ hợp sản xuất ethanol sản phẩm lên Sự bất hoạt LDH làm cho chủng B subtilis tăng trưởng khơng hồn hảo bất chấp bổ sung chất hóa học tương đương trình oxi hoa khử ( PDC- ADHII) Chúng ta nhận thấy LDH oxi hóa NADH thành NAD - NADPH thành NADP- Giá trị Km biểu kiến cofactor so sánh với giá trị Km cho NADH LDH vi khuẩn gram dương Do bổ sung quan trọng vào vai trò sinh lý LDH cho tiêu thụ glucose điều kiện lên men đề nghị Các kết thu vai trò sinh lý quan trọng LDH cho tiêu thụ glucose điều kiện lên men cần xem xét việc phát triển chủng B subtilis sản xuất ethanol VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Các chủng B subtilis plasmid sử dụng nghiên cứu liệt kê bảng 1, oligonucletide bảng Để tránh điều kiện TRp, tế bào B subtilis WB700 khả nạp, biến đổi cách sử dụng DNA nhiễm sắc thể từ chủng Trp-B.subtilis BSR1, dạng tổ hợp chọn lọc môi trường vô chứa glucose, chủng tự dưỡng đặt tên CH1 (bảng 1) Chủng B subtilis CH1 sử dụng để xây dựng chủng B subtilis sản xuất ethanol Trong xây dựng chủng plasmid, chủng phát triển môi trường agar Luria- Bertani (LB) có chứa kháng sinh thích hợp Các nồng độ kháng sinh cuối có sau: 5_g/ml chloramophenicol (Cm), 5_g/ml erythromycin (Ery), 5_g/ml lincomycin (Lâm), 100_g/ml spectinomycin(SPT), 10_g/ml tetracycline (Tc), 50_g/ml Kanamycin (Km), 100_g/ml ampicilin( Ap) (i) Thao tác gen Quy trình thơng thường sử dụng cho việc chuẩn bị plasmid, cắt hạn chế, nối, biến nạp, điện di gel agaroses E.coli XL1- Blue sử dụng vật chủ cho việc xây dựng plasmids tế bào tăng trưởng môi trường LB B subtilis biến đổi cách sử dụng phương pháp khả nạp tự nhiên Gắn chèn hay cắt đoạn nhiễm sắc thể xác nhận cách sử dụng kháng sinh đánh dấu thích hợp, phân tích PCR xét nghiệm sản phẩm lên men (ii) Bất hoạt ldh gắn chèn pdc, adhB Z mobilis vào nhiễm sắc thể Mồi đặc trưng thiết kế để khuếch đại pdc adhB (Bảng 2) Việc thiết kế mồi phải kể đến trình tự consensus Shine- Dalgarno B subtilis khỏang cách bảo tồn motif codon khởi đầu gen Gen pdc Z mobilis khuếch đại từ vetor pLOI276, sử dụng mồi 2, thu đoạn có kích thước 1.7 kb, sau tạo dịng pCR-TOPO, tạo thành vetor IpTOPO-pdc Gen adhB Z mobilis, theo sau terminator gen cryIIIA chủng Bacillus thuringiensis (cryIIIAt) khuếch đại Trong lần PCR đầu tiên, sử dụng mồi 4, gen adhB khuếch đại vetor pLOI284, chứa nửa cryIIIAt Trong PCR lần 2, sử dụng mồi 5, gen adhB theo sau terminator hoàn chỉnh, khuếch đại, phân đoạn PCR tạo dòng pCR-TOPO, tạo pTOPO-adh-term Gen pdc thu nhận từ đoạn gen dài 1.7 kb nằm EcoRV- AscI vetor IpTOPO-pdc Đoạn nối vào vị trí BamHI AscI xử lý đầu vị trí trước gen adhB pTOPO-adh-term, thu vector pTOPO-pdc-adh-term Gen pdc adhB thu nhận từ đoạn gen 2.88-kbp EcoRI NaeI từ vector pTOPO-pdc-adh-term Đoạn nối vào vị trí EcoRI HincII vector pSG- PLK, thu vector pSG-operon Plasmid chứa gen pdc adhB theo sau transcription terminator cryIIIAt cassette kháng chloramphenicol (cat) HÌNH 2: Các vector xây dựng để bất hoạt (A) gen ldh chủng B subtilis (ldhBs) cách gắn chèn gen pdc (pcdZm) adhB (adhBZm) Z mobilis vào nhiễm sắc thể; (B) gen alsSBm Stp cassette; (C) gen alsSBs cách gắn chèn gen udhA Stp cassette E coli vào nhiễm sắc thể Gen ldh B subtilis khuếch đại PCR, sử dụng đoạn mồi 7, tạo dịng vị trí HindII plasmid pUC19 để tạo thành pUC-ldh Gen pdc adhB thiếu promoter, cryIIIAt, cat thu nhận từ đoạn gen dài 4,5-kbp nằm AccI xử lý đầu từ vector operon-pSG nối vào vị trí EcoRV gen ldh pUC-ldh, thu plasmid pUCldh::operonCm(fig.2A) Những tế bào B subtilis CH1 khả nạp biến đổi cách đưa vào vector pUC-ldh::operonCm; từ đó, gen pdc adhB gắn chèn vào ldh gen chủng B subtilis CH1 việc tái tổ hợp tương đồng ldh vào gen B subtilis điều khiển promoter ldh B.subtilis tái tổ hợp chọn lọc Cmr nhận biết việc thiếu sản xuất lactate điều kiện lên men Chủng tạo thành BS35 (iii) Tạo dịng alsS khử hoạt tính Gen alsS khuếch đại từ gen B subtilis PCR sử dụng đoạn mồi Đoạn tạo dòng vào vector pCR-TOPO để tạo thành vector pTOPO-alsS Một đoạn 1,2kbp chứa Spt cassette cắt BamHIHindIII từ vector pCm::Spt (30) Sau đầu cuối Spt cassete xử lý đầu bằng, Spt cassete nối vào vi trí SspI gen alsS pTOPO-alsS, tạo plasmid pTOPOalsS::Spt (fig 2B) Sự bất hoạt gen alsS, cách chèn vào Spt cassete thu nhận plasmid này, chuyển đến vị trí alsS B subtilis cách tái tổ hợp gen tương đồng Kết thay đổi alsS chọn lọc môi trường kháng sinh Sptr nhận biết có mặt 2,3-butanediol sản sinh điều kiện lên men Chủng đặt tên BS36 Chủng đột biến alsS CH1 xây dựng để đánh giá Km biểu kiến LDH dịch chiết tế bào chủng B subtilis Plasmid pTOPO-alsS::Spt biến nạp vào tế bào khả nạp chủng CH1 Chủng đột biến alsS chọn lọc Sptr nhận biết có mặt 2,3-butanediol sản sinh điều kiện lên men (iv) Sự bất hoạt alsS việc kết hợp với nhiễm sắc thể transhydrogenase (udhA) Đoạn mồi thiết kế để khuếch đại gen udhA E.coli bao gồm nhân tố chuyển đổi giống sử dụng việc khuếch đại gen pdc adhB Sản phẩm PCR bao gồm gen udhA khuếch đại từ gen E.coli JM101 sử dụng đoạn mồi 10 11, nối vào pTOPO-alsS::Spt vị trí SalI Tạo thành pTOPO-alsS::UdhA_Spt (fig.2C) Plasmid biến nạp vào tế bào B subtilis BS35 khả nạp; cách gen udhA gắn chèn cách tái tổ hợp gen tương đồng alsS vào nhiễm sắc thể B subtilis BS35, điều khiển mồi alsS cho phép biểu gen udhA Chủng biến nạp chọn lọc đĩa agar môi trường LB-Spt B subtilis BS37 (BS35_alsS udhA_) xác định phương pháp PCR khuếch đại gen udhA từ gen chủng đột biến gen alsS nhận biết việc thiếu sản phẩm lactate butanediol điều kiện lên men HÌNH : Đồ thị mô tả chủng B subtilis điều kiện lên men mơi trường LB có chứa glucose (20g/l) Sự hình thành khối lượng tế bào (A), tiêu thụ glucose (B), lactate (C), butanediol (D), sản xuất ethanol (E) từ chủng B subtilis CH1 (□), BS35 (Δ), BS36 (Ο), BS37 (◊), B subtilis CH1 (■) kể đến mẫu đối chứng, sử dụng môi trường LB mà không bổ sung glucose Chuẩn bị vật liệu cấy chuyền điều kiện lên men Đĩa môi trường LB-glucose chứa 0.2% agar cấy tế bào bảo quản 70 0C glycerol ủ qua đêm 370C Những tế bào sử dụng để cấy vào lọ 500ml bao gồm 150ml nước cao thịt với 20g/l glucose Lọ ủ qua đêm 370C ly tâm 100vòng/ phút (rpm) Tế bào từ lọ ly tâm sử dụng để đo mật độ quang bước sóng 600nm(OD 600) Việc nuôi cấy thực cách nhân đôi lọ chứa nhỏ bao gồm 200ml môi trường LB bổ sung thêm 20g/l glucose Hoạt động điều kiện 350C, ly tâm 100vòng/phút , pH (điều chỉnh cách tự động thêm vào KOH 2N) Sự tăng trưởng giám sát cách đo bước sóng 600nm (Lambda 11; Perkin Elmer, Pomona, CA) Mẫu lấy cách định kỳ đem ly tâm; phần mặt sử dụng cho phân tích xác định Tế bào điều chỉnh bước sóng 600nm lấy sau 48h lên men, ly tâm, thử nghiệm hoạt tính enzym Phương pháp phân tích Việc đo sinh khối OD600 ghi lại để tính trọng lượng khơ tế bào (DCW) sử dụng cuver chuẩn (1 OD600 _ 0.35 g DCW/liter) Hoạt tính enzym PDC ADHII thử nghiệm 30 0C sau protocol biểu trước Hoạt tính LDH thử nghiệm cách sử dụng pyruvate, NADH, sử dụng dung dịch đệm cho thử nghiệm PDC Giá trị Km biểu kiến xác định dịch chiết tế bào B subtilis CH1_alsS, tế bào thu nhận sau 48h lên men B subtilis BS35 BS36 xem mẫu đối chứng âm Từ xác định giá trị Km biểu kiến, nồng độ khác NADH (0-0.5mM) NADPH (0-1.3mM) kiểm tra, với nồng độ pyruvate số (0.5mM), sử dụng chất đệm tương tự sử dụng cho thử nghiệm PDC 300C Nồng độ protein xác định việc sử dụng thuốc thử Bradford thương mại theo dẫn nhà sản xuất (Bio-Rad Laboratories, Inc., United States) Mức độ glucose, lactate, butanediol đo sắc ký lỏng áp suất cao mức ethanol sắc ký khí báo cáo trước KẾT QUẢ B subtilis sản xuất lactate butanediol điều kiện lên men B subtilis chuyển hóa glucose điều kiện lên men kỵ khí cho sản phẩm khác nhau, phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy, môi trường nuối cấy, cuối chất nhận điện tử cuối (7, 10, 26) Việc thể ranh giới chủng sinh vật sử dụng chất vô CH1 mô tả điều kiện kỵ khí, sử dụng mơi trường LB bổ sung thêm 20g/l glucose Trong 10h đầu nuôi cấy, B subtilis CH1 phát triển theo hàm mũ, tạo 0.6g/l khối lượng tế bào, sản xuất chủ yếu lactate (4.7g/l) 2,3-butanediol (1g/l) Bảng Những thông số động lực học chủng B subtilis CH1 dạng biến đổi phát triển lên men LB với 20g glucose/l Bảng đưa tóm tắt giới hạn động học xác định cho môi trường nuôi cấy Trong pha ổn định, lượng lớn lactate (14.5g/l) tích lũy (fig bảng 3) Tốc độ tiêu thụ glucose đặc trưng giảm 75% so với tốc độ pha theo hàm mũ (pha log), glucose dùng hết 48h Một lượng 0.5g/l 2,3butanediol tạo Ethanol, acetate, succinate, formate, aceton khơng tìm thấy q trình ni cấy B subtilis CH1 đưa mẫu đối chứng, sử dụng mơi trường khơng có glucose Tế bào CH1 phát triển theo hàm mũ, có 0.11g/l khối lượng tế bào 0.8g/l lactate (fig3) B subtilis bao gồm gen pdc adhB sản xuất ethanol, phân cắt ldh làm giảm tốc độ biểu tiêu thụ glucose Dựa vào khả sản xuất lactate cao pha log pha ổn định, promoter ldh xem la lựa chọn tốt sử dụng để truyền tín hiệu cho việc biểu gen khác điều kiện kỵ khí Vì vậy, promoter chọn lựa để truyền tín hiệu cho gen pdc adhB biểu nhiễm sắc thể B subtilis Sự biểu chủng BS35 (CH1 ldh::pdc-adhB) điều kiện kỵ khí gen pdc adhB khác loại biểu hiện, chủ yếu tổng hợp chức enzym Bảng Các hoạt tính đặc trưng enzyme PDC, ADH, LDH chủng B subtilis Bảng đưa tóm tắt xác định hoạt tính enzym PDC, ADHII, LDH chủng CH1 BS35 Thật thú vị , gián đoạn gen ldh làm suy yếu phát triển chủng BS35 (fig 3A), tốc độ phát triển giảm 70% so với chủng CH1, hệ việc giảm 65% tốc độ tiêu thụ glucose đặc trưng (fig.3B bảng 3) Trong so sánh với tốc độ đặc trưng chuẩn việc sản xuất butanediol chủng CH1, cuối tốc độ đặc trưng chuẩn việc sản xuất butanediol giảm mức không đáng kể chủng BS35, việc sản xuất lactate hoàn toàn bị hủy bỏ (bảng fig 3C D) Mặc dù tốc độ phát triển tiêu thụ glucose chủng BS35 bị làm giảm đi, sản xuất ethanol pha ổn định (fig 3E), với khả sản xuất đặc trưng 0.08g ethanol/g DCW/h (bảng 3) Thật thú vị, tích tụ ethanol dịch ni cấy tìm thấy sau 24h lên men, 0.95g/l thu nhận sau 48h Sự kìm hãm tổng hợp butanediol tăng khả sản xuất ethanol Sự tổng hợp aceton từ pyruvate bao gồm bước, xúc tác acetonlactate synthase (ALSS) acetonlatate decarboxylase (fig 1) Butanediol hình thành từ khử aceton (7) Theo cách đó, ALSS cạnh tranh với PDC để lấy pyruvate chủng BS35 Kể từ lúc tăng thêm pyruvate sẵn sàng, gen alsS bị gián đoạn mô tả phần vật liệu phương pháp Thêm vào bất hoạt gen alsS hoàn toàn hủy bỏ việc sản xuất butanediol (fig 3D) cho phép sản xuất mạnh mẽ ethanol 24h nuôi cấy (fig 3E) Tốc độ sản xuất ethanol đặc trưng chủng BS36 tăng lên 50% so với chủng BS35 (bảng 3) Phân tích tiêu thụ glucose sản xuất ethanol pha ổn định (từ 12-48h) cho 1.5g/l ethanol từ việc tiêu thụ 3g/l glucose Giá trị phù hợp đến 98% so với sản lượng lớn lý thuyết (0.51g ethanol/g glucose) Trong so sánh với tốc độ chủng CH1, tốc độ tiêu thụ glucose cịn yếu L-LDH B Subtilis dùng NADH NADPH cofactor Con đường sản xuất ethanol phát sinh chủng BS35 tương tự đường sản xuất lactate vốn có chủng CH1 điều kiện tái oxi hóa NADH Tuy nhiên, trình bày trên, mức độ phát triển tiêu thụ glucose bị giảm đường tạo lactate tương ứng bị thay đường ethanol Để xác định cofactor đặc trưng LDH, xác định NADPH có phải chất cho enzyme LDH B subtilis hay không Các thử nghiệm enzyme phân tích rỏ ràng NADH NADPH chất cho LDH Một kiểm tra tiến hành, dùng tế bào BS35 BS36, cho thấy vắng mặt LDH, khơng có sản xuất NADPH phát BẢNG Xác định hoạt động enzyme LDH chủng B subtilis hướng cofactor khác Hơn nữa, để kiểm tra có hoạt động LDH đóng vai trị cho oxi hóa NADPH ta xác định Km biểu kiến ( Michaelis_Meten affinity constant) tế bào thu nhận từ chủng B subtilis ldh_alS (chủng CH1 đột biến alsS) ( bảng 1) Giá trị Km biểu kiến LDH 0.13 mM dối với NADH 0.288 mM NADPH Sự biểu transhydrogenase làm tăng phát triển giảm thời gian khởi đầu cho việc sản xuất ethanol Gen udhA E coli mã hoá cho transhydrogenase Enzyme làm tăng tốc độ phản ứng ngược việc khử tương đương NADP - va NAD- theo cân sau: NADPH_NAD- NADP-_NADH Khơng có bật kì gen giả định mã hố cho transhydrogenase khơng có bật hệ thống enzyme có chức tương tự nhận diện gen B subtilis Để xác định LDH có đóng vai trị trì cân NADPH/NADP- hay khơng, gen udhA từ E coli chèn vào nhiễm sắc thể B sutilis BS35 làm gián đoạn gen alsS, lúc, chịu điều khiển của promoter alsS ( xem chi tiết Meterials nad Methods) Dưới điều kiện yếm khí, promoter alsS cảm ứng suốt pha tăng trưởng trì suốt pha ổn định Tốc độ phát triển tăng 22% mức độ tiêu thụ glucose tăng 10 59% pha tăng trưởng xác định ( Fig table 3); dự đốn, khơng có sản xuất butanediol Sự sản xuất ethanol bắt đầu sau 6h nuôi cấy, 2g/l ethanol sản xuất 48h, 4,1g glucose/l tiêu thụ suốt thời gian này, suất chuyển đổi cao từ glucose thành ethanol (giá trị cao theo lý thuyết 96%) B subtilis sản xuất lactate butanediol từ môi trường giàu dinh dưỡng Những kết với chủng CH1 ban đầu suấtt cao đạt so sánh với lượng glucose tiêu thụ, cho suất cao theo lý thuyết lactate butanediol từ glucose 1.0g lactate/g glucose 0.5g butanediol/g glucose Ngoài lactate chủng CH1 sản xuất môi trường LB khơng có glucose Những kết cho thấy thành phần từ môi trường giàu dinh dưỡng dùng để tích lũy sinh khối tế bào tổng hợp sản phẩm lên men Hơn nữa, môi trường LB bổ sung glucose phát sinh giảm lựơng chủng CH1, để tạo lượng lớn lactate nà butanediol Mặt khác, BS35 sản xuất 0.95g ethanol/l 3.8g butanediol/l Sau bất hoạt enzyme ALSS chủng BS36, khơng có butanediol có 1.5g ethanol/l sản xuất 48h; sản xuất ethanol chủng BS35 0.65g ethanol/l lượng lớn dự đoán, Dựa vào carbon, 2mol pyruvate dùng để sản xuất 1mol butanediol, dùng mol NADH So sánh, 2mol pyruvate NADH dùng để chuyển thành mol ethanol Do đó, điều kiện lượng giảm Mặc dù lượng lớn carbon có sẵn để sản xuất ethanol tồn chủng BS36, giảm lượng giới hạn sản xuất ethanol Từ kết đề xuất BS35 sản xuất butanediol từ nguồn carbon môi trường giàu dinh dưỡng với giảm lượng glucose Ngồi bất hoạt ldh làm giảm sinh khối tế bào, lượng nhỏ glucose tiêu thụ chuyển đổi thành ethanol chủng BS36 BS37 Trong trường hợp này, người ta cho thành phần từ môi trường LB dùng cho sinh khối tế bào BS37 mọc môi trường LB không glucose, sinh khối 0.19g/l (tương tự tìm thấy 12h mơi trường có glucose; khơng có ethanol sản xuất điều kiện Những kết cho thấy thành phần từ môi trường giàu dinh dưỡng dùng để tích lũy sinh khối tế bào, ethanol đạt đuợc chủng BS36 BS37 tổng hợp từ tiêu thụ glucose Pyruvate ngoại sinh chuyển đổi thành ethanol, tăng mức độ phát triển B subtilis phát triển chậm điều kịện yếm khí mơi trường glucose-MM Tuy nhiên, mơi trường glucose-MM bổ sung pyruvate amino acid, B subtilis phát triển điều kiện yếm khí, sản xuất lactate, acetate, butanediol Thông thường để kiểm tra pyruvate có sẵn hay hoạt động PDC ADHII giới hạn phát triển yếm khí BS37 mơi trường giàu dinh dưỡng( LB), môi trường LB-glucose bổ sung 2g pyruvate/l Người ta cho glucose pyruvate chuyển hóa suốt pha tăng trưởng Ở pha này, pyruvate glucose tiêu thụ mức độ Mức độ phát triển BS37 tăng lên từ 0.11 h_ 1(bảng 3) lên 0.27 h_1 pyruvate thêm vào ( fig and 4) Pyruvate dùng hết 12 giờ, trùng với kết thúc pha tăng trưởng 11 HÌNH 4: Đồ thị mô tả chủng B subtilis BS37 môi trường LB bổ sung glucose (20g/l) pyruvate (2g/l) điều kiện lên men Khối lượng tế bào (□), tiêu thụ glucose (Ο), tiêu thụ pyruvate ( ),và sản xuất ethanol (◊) HÌNH 5: Thời gian lên men B subtilis BS37 môi trường LB bổ sung glucose (20g/l) Khối lượng tế bào (□), tiêu thụ glucose (Ο), sản xuất ethanol (◊) Sự sản xuất ethanol bắt đầu sau nuôi cấy, mức độ sản xuất ethanol 0.9g ethanol/g DCW/h glucose pyruvate tiêu thụ đồng thời Mức độ tương tự với mức độ sản xuất ethanol sinh vật sản xuất ethanol E coli KO11 nấm men Trong điều kiện mol, tổng mức độ glucose pyruvate tiêu thụ tương đương với mức độ sản xuất ethanol (19 versus 22 mmmol ethnol/g DCW/h), mức PDC ADHII BS37 khơng giới hạn sản xuất ethanol; đó, mức độ biểu enzyme lý cho tiêu thụ glucose suy giảm tăng trưởng Sau pyruvate dùng hết, 3.5g glucose/l tiêu thụ, 1.6g ethanol/l sản xuất (năng suất lý thuyết 90%) Trong môi trường nuôi cấy liên tục, B subtilis BS37 sản xuất 8.9g/l ethanol từ glucose Sự phát triển tạo thành sản phẩm từ chủng BS37 biểu thị đặc điểm dịch môi trường LB với 2g/l glucose điều kiện yếm khí môi trường nuồi cấy liên tục Ở bốn ngày đầu tiên, BS37 sản xuất ethanol (3.6g/l) từ glucose (7.5g/l) với suất cao (95% theo lý thuyết) Mặc dù mức độ đặc trưng cho sản xuất ethanol thấp, không thay đổi suốt ngày môi trường mẻ Do đó, B sutilis BS37 sản xuất 8.9g ethanol/l từ 20.3g glucose/l, hiệu suất sản xuất ethanol thấp ngày cuối, nguyên nhân hiệu suất thấp ngày cuối bốc ethanol Sự tạo thành ethanol suốt ngày PDC ADHII có chức thời kì dài THẢO LUẬN Một vài nhóm nghiên cứu cố gắng phát triển vi khuẩn gram dương sản xuất ethanol kỹ thuật lên men vi khuẩn lactic lồi Corynebacteria Bacillus Tuy nhiên có khơng có ethanol sản xuất vi sinh vật tái tổ hợp Barbosa Iagram cố gắng biểu gen pdc adhB Z mobilis cách sử dụng vector đa dòng B subtilis Bằng cách sử dụng phương pháp phân 12 tích Western Blot, họ thấy hai loại protein tổng hợp B subtilis, khơng có hoạt tính enzyme việc sản xuất ethanol không diễn Talarico cộng xây dựng operon lý thuyết khác cách sử dụng gen pdc từ vi khuẩn gram dương gram âm, từ chủng Saccharomyces cerevisize, để biểu vector đa dòng Bacillus megaterium Họ cho mức độ hoạt động khác enzyme PDC nguồn cho biết tầm quan trọng khác cách sử dụng codon vi khuẩn gram dương vi khuẩn gram âm Mặc dù, enzyme PDC ADH có hoạt tính chủng B megaterium tái tổ hợp, việc sản xuất ethanol in vivo bị vô hiệu thử nghiệm in vitro cần thiết để chứng minh việc sản xuất ethanol từ pyruvate Enzyme LHD đóng vai trị phức tạp q trình chuyển hóa lên men B subtilis Người ta thấy bất hoạt gen ldh làm giảm tốc độ tăng trưởng B subtilic điều kiện lên men Trong nghiên cứu nay, với việc thay hoạt động kết hợp hai enzyme PDC ADH cho hoạt động enzyme LDH, cố gắng trì cân oxi hóa khử NADH/NAD - Tuy nhiên tiêu thụ glucose tốc độ tăng trưởng chủng B subtilis đột biến ldh bị làm giảm Hai giả thuyết giải thích tượng này: Thứ 1, mức độ hoạt động enzyme PDC ADHII không đủ khả để thay cho hoạt tính enzyme LDH ban đầu, vậy, cân oxi hóa khử NADH/NAD- chủng bị hạn chế Tuy nhiên, enzyme PDC ADH Z mobilis nhận thấy có chức B subtilis, với mức hoạt tính tương tự chủng E.coli sản xuất ethanol Việc bổ sung pyruvate làm tăng 32% mức tiêu thụ glucose Ngoài ra, người ta cho biết hoạt động enzyme sản xuất ethanol với tốc độ tương tự E.coli KO11 nấm men sản xuất ethanol báo cáo (0.9 g ethanol/g DCW/h) Điều giải thích tiềm việc sản xuất ethanol từ BS37 rút khả hoạt tính enzyme PDC ADH khơng đủ để hỗ trợ tăng trưởng điều kiện kị khí B subtilis Thứ 2, enzyme LDH B subtilis đóng góp vào việc trì cân oxi hóa khử NADPH/NADP- điều kiện lên men Người ta nhận thấy enzyme LDH B subtilis oxi hóa NADH thành NAD- Nhiều tài liệu chứng minh enzyme LDH B subtilis sử dụng NADH NADPH cofactor, giá trị Km biểu kiến enzyme LDH bắt buộc có tính ưu tiên NADH NADPH Giá trị Km cho NADH tương tự giá trị báo cáo Yoshida Giá trị Km enzyme LDH NADH vi khuẩn gram dương khác nằm dãy từ 0,001 đến 0,22mM Trong đó, enzyem LDH B subtilis có khoảng hoạt động rộng có mối quan hệ cao với NADH Giá trị Km cho NADPH enzyme LDH từ B subtilis tương tự giá trị Km cho NADH LDH từ Lactobacillus acidophilus Lactobacillus jensenii Vì vậy, enzyme LDH từ B subtilis có lực cần thiết cho NADPH, mà ảnh hưởng lên cân NADPH/NADP - phải định trình lên men B subtilis Một phần hoạt động enzyme transhydrogenase phục hồi lại tốc độ tăng trưởng bị giảm đi, chứng minh giả thuyết enzyme LDH có vai trị sinh lý điều tiết quan trọng, liên quan đến cân NADPH/NADP - Theo hướng này, không cân nồng độ cofactor gây bất hoạt enzyme LDH ảnh hưởng đến chuyển hóa B subtilis, làm giảm tiêu thụ 13 glucose B subtilis sản xuất ethanol- vai trò mà đường sản xuất ethanol đáp ứng Sự bất hoạt enzyme LDH Lactobacillus cảnh báo có tác động tiêu cực đến tốc độ tiêu thụ glucose phát triển tế bào tổ hợp tiền peptidoglycan Căn vào kết cơng trình trước người trình bày nghiên cứu này, người ta suy đốn vai trị enzyme LDH vài vi khuẩn gram dương phức tạp B subtilis, khơng trì chuyển đổi pyruvate thành lactate oxi hóa NADH -, mà cịn oxi hóa NADPH Do đó, phát triển vi sinh vật sản xuất ethanol xuất phát từ vi khuẩn gram dương B subtilis phải yêu cầu việc sử dụng hoạt tính enzyme khác, enzyme transhydrogenase tiến hóa trực tiếp protein để đạt enzyme ADH mà đáp ứng vai trị phức tạp enzyme LDH chuyển hóa vi khuẩn gram dương Sản xuất ethanol với sản lượng cao từ glucose chủng B subtilis Nghiên cứu cho biết kỹ thuật chuyển đổi B subtilis cho việc sản xuất ethanol sản phẩm lên men Kỹ thuật dựa thay hoạt động enzyme LDH hoạt động enzyme PDC ADHII Chủng tạo thành sản xuất ethanol, chủng ban đầu không sản xuất hợp chất điều kiện tăng trưởng tương tự Để đảm bảo hiệu biểu gen đến mức độ phiên mã dịch mã nghiên cứu này, người ta sử dụng promoter mạnh (ldhp) trình tự consesus B subtilis Shine-Dalgarno chủng B subtilis (AAGGAAG) đặt khoảng cách tối ưu từ codon khởi đầu ATG tính đến Ngồi ra, để tránh trao đổi chất liên tục có chủng di truyền ổn định, operon pet khác loài đồng cách làm gián đoạn gen ldh vốn có Đồng thời, gen ldh promoter (ldhp) làm cho gen pdc adhB biểu Sự kết hợp tất yếu tố cho phép hình thành chủng B subtilis với hoạt tính enzyme tương đối cao cho PDC ADHII Mức hoạt tính enzyme so sánh với E.coli KO11 sản xuất ethanol, phiên mã, dịch mã gấp cuộn protein tương ứng enzyme PDC ADHII B subtilis điều kiện kị khí Khi gen alsS bất hoạt, chủng B subtilis sản xuất ethanol tạo đạt sản lượng ethanol lên đến 88,8% theo giá trị lý thuyết tối đa từ glucose tiêu thụ 48h nuôi cấy mẻ, chủng B subtilis sản xuất ethanol tiêu thụ 3g/l suốt thời gian này; điều tốc độ đặc trưng tiêu thụ glucose chậm Điều thú vị, phục hồi phần tốc độ tăng trưởng với biểu gen udhA, thời gian bắt đầu sản xuất ethanol rút ngắn, tương tự thời gian bắt đầu sản xuất lactate chủng CH1 ban đầu Với chiến lược nói trên, chủng B subtilis BS37 sản xuất 9g/l ethanol với hiệu suất tạo ethanol từ nguồn glucose gần 90% suốt ngày lên men Những kết rõ ràng chứng tỏ sử dụng B subtilis để sản xuất ethanol sản phẩm lên men Tốc độ riêng việc sản xuất ethanol tương đối thấp liên quan chặt chẽ đến tốc độ riêng tiêu thụ glucose Tóm lại, lần chủng B subtilis tái tổ hợp sản xuất ethanol in vivo sản phẩm lên men với sản lượng ethanol lớn từ glucose Kết mở tiềm để phát triển quy trình mà dựa vào thuận lợi hệ thống tiết B subtilis cách sử dụng phức hệ chất phức cho việc sản xuất ethanol 14 15 ...KỸ THUẬT CHUYỂN ĐỔI BACILLUS SUBTILIS CHO SẢN XUẤT ETHANOL Lactate Dehydrogenase Đóng Vai Trị Chìa Khóa Trong Chuyển Hóa Lên Men TÓM TẮT Dạng hoang dại Bacillus subtilis lên men 20g/l... LDH chuyển hóa vi khuẩn gram dương Sản xuất ethanol với sản lượng cao từ glucose chủng B subtilis Nghiên cứu cho biết kỹ thuật chuyển đổi B subtilis cho việc sản xuất ethanol sản phẩm lên men Kỹ. .. lỏng áp suất cao mức ethanol sắc ký khí báo cáo trước KẾT QUẢ B subtilis sản xuất lactate butanediol điều kiện lên men B subtilis chuyển hóa glucose điều kiện lên men kỵ khí cho sản phẩm khác nhau,