Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Giới thiệu phương pháp ELISA ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA (Enzyme ImmunoAssay) kỹ thuật sinh hóa để phát kháng thể hay kháng nguyên mẫu xét nghiệm Hiện ELISA sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực nghiên cứu y học, nông nghiệp đặc biệt quy trình kiểm tra an toàn chất lượng sản phẩm sinh học Nguyên lý ELISA dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể gồm bước sau: (1) Kháng nguyên - antigen (KN) chưa biết gắn bề mặt; (2) Kháng thể - antibody (KT) biết trước "rửa" qua bề mặt Kháng thể gắn kết với enzyme; (3) Thêm vào chất (substance); enzyme biến đổi chất tạo tín hiệu xác định Đối với ELISA phát quang, ánh sáng phát từ mẫu chứa KN-KT Sự diện phức hợp KN-KT định cường độ sáng phát Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định có mặt hay mặt lượng KN mẫu nghiên cứu Để tiến hành ELISA cần phải có KT đặc hiệu cho KN chưa biết Thông thường KN cố định giếng vi phiếm (polystyrene microtiter plate) - Phương thức cố đinh không đặc hiệu: KN gắn trực tiếp vào bề mặt đĩa; - Phương thức gắn đặc hiệu ("sandwich" ELISA): KN gắn với kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên cần kiểm tra KT đặc hiệu thêm vào, phản ứng tạo phức hợp KT-KN sảy Nếu KT gắn trực tiếp với enzyme, tín hiệu quang học enzyme làm biến đổi chất giúp phát KN cần kiểm tra Trong trường hợp sử dụng KT thứ cấp (secondary antibody) gắn với enzyme thông qua liên kết cộng hóa trị phân tử sinh học (bioconjugation), KN cần xác định nhận biết qua KT thứ cấp Giữa bước ELISA, protein KT không đặc hiệu, KT không gắn với KN lấy nhờ loại dịch có tác dụng "rửa" Sau bước "rửa" cuối cùng, KT liên kết với KN giữ lại Sau thêm vào, chất chịu tác dụng enzyme liên kết với KT phức hợp KT-KN Phản ứng phát quang (biến đổi chất) sảy Trước chất tạo màu sắc sử dụng ELISA ngày chất phát quang dùng rộng rãi làm tăng tính đặc hiệu độ xác ELISA Lịch sử phát triển Vào năm 1960, Rosalyn Sussman Yalow Solomon Berson Prior mô tả phương pháp miễn dịch có gắn chất phóng xạ (radioimmunoassay) dùng để xác định KN, KT Trong phương pháp này, KT hay HN có gắn chất đánh dấu phóng xạ diện chúng xác định thông qua tín hiệu phóng xạ Tuy vậy, chất phóng xạ lại tiềm ẩn mối nguy hiểm người ta nghĩ đến phương pháp tín hiệu phát nhờ phóng xạ Khi người ta biết số loại enzyme peroxidase phản ứng với số chất định Tetramethylbenzidine hay 3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid phát màu Màu sinh từ phản ứng sử dụng làm tín hiệu nhận biết (tín hiệu thị) Tuy nhiên, để tín hiệu sử dụng chất phóng xạ radioimmunoassay, tín hiệu màu phát phải đồng nghĩa với có mặt KT hay KN Chính vậy, giải pháp đưa enzyme gắn với KN hay KT Kỹ thuật gắn kết enzyme với KN hay KT phát triển Stratis Avrameas G.B Pierce Tiếp sau đó, vào năm 1966, Wide Porath phát triển phương pháp gắn KN KT bề mặt rắn (bề mặt vi phiếm hay đĩa) nhờ mà KN hay KT không gắn kết dễ dàng rửa trôi Peter Perlmann Eva Engvall (Thụy Điển) với nhóm Anton Schuurs Bauke van Weemen (Hà Lan) công bố phương pháp đặt tên ELISA (EIA) dựa tất bước phát triển nói Phương pháp thức đời vào năm 1971 4,5 Ứng dụng Một số ứng dụng ELISA: - Xác định nồng độ KT huyết thanh; Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn - Kiểm tra có mặt KN; - Phát yếu tố có khả gây dị ứng thực phẩm; - Xác định có mặt dược phẩm; - Xác định hoạt tính hợp chất sinh học Các phương pháp ELISA ELISA gián tiếp (indirect ELISA) gồm bước chính: - Chuyển KN biết lên bề mặt cứng ( gọi chung đĩa) KN cố định bề mặt Nồng độ mẫu kháng nguyên dùng để thiết lập đường chuẩn cho việc tính nồng độ kháng nguyên mẫu chưa biết - Chuyển mẫu KN chưa biết vào giếng khác KN chưa biết hòa tan loại dung dịch đệm giống mẫu KN chuẩn Đĩa 96 giếng (microtiter) thường dùng cho ELISA - Thêm dung dịch protein không tương tác (non-interacting protein) albumin huyết bê (bovine serum albumin) hay casein vào tất mẫu (kể mẫu chuẩn) Bước gọi "blockin" protein huyết có tác dụng ngăn cản hấp phụ protein khác lên bề mặt đĩa - Rửa bề mặt đĩa sau chuyển kháng thể (biết trước) vào tất giếng đĩa KT kết hợp với KN cố định mà không kết hợp với protein huyết - Thêm KT thứ cấp (secondary antibody), KT thứ cấp kết hợp với KT dư (bước bỏ qua kháng thể dùng để phát KN gắn với enzyme) - Rửa đĩa, kháng nguyên gắn enzyme dư loại bỏ - Thêm chất Enzyme làm biến đổi chất làm sản sinh tín hiệu huỳnh quang hay tín hiệu điện hóa học (enzyme có tác dụng yếu tố khuyếch đại) Nhược điểm bản: Bước cố định KN tính đặc hiệu nên protein gắn với bề mặt đĩa KT (có nồng độ thấp) phải cạnh tranh với protein khác huyết gắn kết với bề mặt điwax Sandwich ELISA hạn chế nhược điểm Sandwich ELISA: Phương pháp sử dụng để phát KN mẫu nghiên cứu bao gồm bước sau (quy trình thay đổi nhiều trường hợp): (1) Chuẩn bị bề mặt (microtiter) có gắn KT (2) Khóa tất vị trí gắn kết không đặc hiệu bề mặt (3) Phủ mẫu chứa kháng KN cần xác định (4) Rửa đĩa, kháng KN không gắn kết bị rửa trôi (5) Thêm KT đặc hiệu cho KN cần chẩn đoán (6) Thêm KT thứ cấp gắn với enzym (KT thứ cấp đặc hiệu cho KT sơ cấp bước 5) (7) Rửa đĩa, phần không gắn kết bị rửa trôi (8) Thêm chất Enzym biến đổi chất tạo màu, phát quang hay tín hiệu hóa điện (9) Đo cường độ ánh sáng, tín hiệu huỳng quang, tín hiệu điện hóa qua xác định có mặt hàm lượng KT Các bước Sandwich ELISA (1) Phủ đĩa KT (2) Thêm mẫu cần xác định KN KN (nếu có) gắn với KT; (3) kháng thể dùng để phát thêm vào kết hợp với KN; (4) Thêm KT thứ cấp liên kết với enzyme KT thứ cấp gắn với KT dùng để phát hiện; (5) Thêm chất Enzym làm biến đổi chất phát tín hiệu phát đo Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn ELISA cạnh tranh: (1) "Ủ" KT không đánh dấu với KN (2) Đưa hỗn hợp vào giếng vi phiếm có chứa KN (3) Rửa đĩa, KT không gắn kết bị rửa trôi Lượng KN lớn, lượng KT gắn thành công với KN đĩa thấp "cạnh tranh" (4) Thêm KT thứ cấp (KT KT bước 1) KT thứ cấp gắn với enzym (5) Thêm chất Lượng enzym dư giải phóng tín hiệu hỳnh quang hay tín hiệu màu Trong phương pháp này, hàm lượng KN gốc cao, tín hiệu sản sinh yếu Một số trường hợp, enzym gắn với KN KT Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn